JPH0337B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は特定の芳香族アシルアミノ酸を特異的
に分解する新規なアミノアシラーゼに関するもの
である。 アミノアシラーゼは各種のものが知られている
が、そのほとんどは脂肪族アシルアミノ酸に対し
て高分解活性を示し、芳香族アシルアミノ酸を分
解するものは微生物起源のものがいくか知られて
いるにすぎない。 本発明者は、サルコイド−シスの診断などに利
用されるアンジオテンシン変換酸素の活性測定法
（特公昭58−23080号など）、あるいはカルボキシ
ペプチダーゼＡの活性測定法（特願昭57−193466
号など）にアミノアシラーゼを利用するために、
芳香族アシルアミノ酸を分解する活性の高いアミ
ノアシラーゼを取得するべく広く微生物を探索
し、先にコリネバクテリウム・エクイ
（Corynebacterium equi）Ｈ−７株がＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−アラニンに高分解活性を有するアミノ
アシラーゼを産生することを見出した（特開昭57
−86292号）。そして、さらに研究を進め、今回Ｎ
−ベンゾイルグリシンに高分解活性を有する新規
なアミノアシラーゼをシユードモナス属に属する
細菌が産生することを見出し、これに基いて本発
明を完成するに至つた。 本発明のアミノアシラーゼはＮ−ベンゾイルグ
リシン及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンを分解
し、Ｎ−ベンゾイルグリシンを分解する活性がＮ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニンを分解する活性より
大きく、かつＮ−アセチルグリシン及びＮ−ベン
ゾイル−Ｄ−アラニンを分解する活性がいずれも
Ｎ−ベンゾイルグリシンを分解する活性の1/20以
下のものである。 実施例で得られた精製酵素標品の理化学的性質
を次に示す。 (1) 作用 本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンを加水分解し
て安息香酸とグリシンを生成する。 (2) 基質特異性 各種アミノ酸のＮ−アシル誘導体を基質として
酵素活性を測定した結果を第１表に示す。表中の
酵素活性はＮ−ベンゾイルグリシンに対する活性
を100とした相対活性で表示してある。この表に
示すように本酵素はＮ−ベンゾイルグリシン、Ｎ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニン、Ｎ−ベンゾイル−
DL−２−アミノ酢酸及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−
フエニルアラニンを分解するＮ−アセチルグリシ
ン、Ｎ−ベンゾイル−DL−メチオニン及びＮ−
ベンゾイル−Ｄ−フエニルアラニンを実質的に分
解しない。特に、Ｎ−ベンゾイルグリシン及びＮ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニンをよく分解し、とり
わけＮ−ベンゾイルグリシンを分解する活性が大
きく、かつＮ−アセチルグリシンを分解する活性
がＮ−ベンゾイルグリシンを分解する活性の1/10
０以下である。

【表】 (3) 至適PH及び安定PH範囲 Ｎ−ベンゾイルグリシンを基質として、0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液PH6.0〜8.0（白丸）、0.2M
ホウ酸緩衝液PH8.0〜9.0（黒丸）及び0.1M炭酸緩
衝液PH9.0〜10.0（三角）を用いて、37℃で10分間
反応させて至適PHを測定した結果を第１図に示
す。図から明らかなように本酵素の至適PHは7.0
〜8.0にある。 次に、本酵素を0.1M酢酸緩衝液PH4.0〜5.5（三
角）、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液PH6.0〜8.0（白
丸）、0.2Mホウ酸緩衝液PH8.0〜9.5（黒丸）及び
0.1M炭酸緩衝液PH9.0〜10.5（四角）の各緩衝液中
で37℃１時間加熱し、残存する酸素活性を測定し
た結果を第２図に示す。本酵素はPH6.0〜7.0の範
囲において最も安定である。 (4) 力価の測定法 酵素液0.05mlに100ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（PH8.0）0.45mlを加え、37℃で５分間予熱し
た後、10ｍＭ Ｎ−ベンゾイルグリシン溶液1.0
mlを加えて37℃で10分間反応させる。反応液にト
リクロル酢酸1.0mlを加えて反応を停止させ、生
成したグリシンをニンヒドリン法で定量する。 ニンヒドリン法による定量はムーアらの方法
（S.Moore and W.H.Stein，J.Biol.Chem.，
vol.211，P907（1954））に準じて下記のように行
なつた。すなわち、反応液を遠心分離し、その上
清1.0mlにニンヒドリン試乗0.2mlを加え煮沸水浴
中で15分間加熱し、ただちに50％エタノール2.0
mlを加える。水冷後、575nmで比色し、同様にし
て求めたグリシンの標準曲線からグリシンの生成
量を定量した。 酵素活性は、１分間に1μmolのグリシンを生成
する酵素量を１単位とした。 (5) 作用適温の範囲 各温度において、力価の測定方法に準じて酵素
活性を測定した結果を第３図に示す。図から明ら
かなように、本酵素の作用適温の範囲は20〜50℃
であり、至適温度は50℃付近にある。 (6) PH、温度などによる失活の条件 本酵素は、第２図に示したように、37℃１時間
の処理でPH４以下及びPH10.5以上でほぼ完全に失
活し、PH５及びPH９では活性がほぼ半分になる。 次に、本酵素を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液PH7.0中で各温度で30分間加熱後、残存活性を
測定した結果を第４図に示す。図に示すように、
本酵素は50℃30分間の加熱では失活しないが、60
℃30分間の処理で70％が失活し、70℃30分間の処
理でほぼ完全に失活する。 (7) 阻害、活性化及び安定化 各種金属イオン、金属キレート剤及びSH阻害
剤を終濃度が第２表に示す濃度になるように反応
液に加えたときの本酵素の活性に及ぼす影響を第
２表にまとめて示す。この表の相対活性は無添加
の場合の活性を100として表示してある。尚、表
には示していないが、本酵素はクロルイオンの存
在によつて安定化される。

【表】

【表】 (8) 精製方法 培養後、菌体から酵素を抽出した液を、0.1M
塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩
衝液で平衡化したジエチルアミノエチルセルロー
スに流して酵素を吸着させ、0.25M塩化ナトリウ
ムを含む同緩衝液で溶出し、活性区分を集める。
この活性区分に硫酸アンモニウムを40％飽和にな
るように加え、生成した沈澱を集める。この沈澱
を少量の0.1M塩化ナトリウムを含む同緩衝液に
溶解し、同緩衝液に対して一夜透析する。透析物
0.1M塩化ナトリウム及び５ｍＭメルカプトエタ
ノールを含む同緩衝液で平衡化したセフアロース
CL−6Bのカラムを用いてゲル過を行ない、活
性画分を集めてそれに硫酸アンモニウムを20％飽
和になるように加える。生成した沈澱物を遠心し
て除去し、上清液にさらに硫酸アンモニウムを40
％飽和になるように加えて生成した沈澱物を集め
る。この沈澱物を少量の0.1M塩化ナトリウム及
び５ｍＭメルカプトエタノールを含む0.0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液に溶解後同緩衝液に対して
一夜透析し、精製酵素標品を得る。 (9) 分子量 ゲル過法によつて求めた分子量は18万であつ
た。 (10) 等電点 PH3.5〜10.0のキヤリアアンホラインを用いた
アイソエレクトリツクフオーカシング法によつて
測定した等電点は4.3であつた。 以上の理化学的性質のうち、本酵素は特に基質
特異性が従来のアミノアシラーゼと異なる。すな
わち、従来のアミノアシラーゼのほとんどは脂肪
族アシルアミノ酸に対してのみ高分解活性を示
し、芳香族アシルアミノ酸を分解するものは微生
物起源のもにいくつか知られているにすぎない。
そして、この芳香族アシルアミノ酸を分解するも
のはいずれもアシル−Ｄ−アミノ酸をも分解す
る。 一方、本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンなどの
芳香族アシルアミノ酸に対しては高分解活性を示
すがＮ−アセチルグリシンなどの脂肪族アシルア
ミノ酸をほとんど分解せず、Ｎ−ベンゾイル−Ｄ
−アラニンなどのアシル−Ｄ−アミノ酸に対する
分解活性も低い。 また、本発明者らの既出願のものは芳香族アシ
ルアミノ酸に対して高分解活性を有するが、この
酵素はそのうちで特にＮ−ベンゾイル−Ｌ−アラ
ニンに対する分解活性が高く、Ｎ−ベンゾイルグ
リシンに対する活性はあまり大きくない。しかる
に、本酵素は、芳香族アシルアミノ酸のなかでも
特にＮ−ベンゾイルグリシンに対する分解活性が
大きく、このような酵素は従来知られていなかつ
たのであるから、本酵素は明らかに新規である。 本発明の酵素は、例えば本発明者らが北海道の
土壌から分離した微生物シユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）No.C692−３から産生さ
せることができる。このシユードモナス・ブチダ
No.C692−３は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第7082号（FERM−P7082）として
寄託されている。 シユードモナス・プチダNo.C692−３の菌学的
性質を次に示す。 １ 形態（肉汁寒天培地、28℃24時間培養） (1) 細胞の形及び大きさ 細胞は桿状（0.8〜1.0×1.3〜1.6ミクロン）
であり、多形性は示さない。 (2) 運動性あり。鞭毛は単極鞭毛であり、複数
本形成する。 (3) 胞子：形成しない (4) グラム染色性：陰性 ２ 生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 コロニーは円板状で、全縁、半透明、軟質で
あり、表面は光沢がある。可溶性色素は産生しな
い。コロニーの大きさは直径1.8〜2.2mmである。 (2) 肉汁寒天斜面培養 線状に良好に生育し、軟質である。表面は光
沢がある。凝縮水でも良く生育する。可溶性色素
は産生しない。 (3)肉汁液体培養 適度に生育し、混濁する。沈渣を生ずる。膜
は形成しない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 表層部分で増殖するが液化しない。沈渣を生
ずる。 (5) リトマスミルク 液化及び凝固しない。PHは微アルカリ性。 ３ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸塩の利用：陽性 (9) 無機窒素源の利用：硝酸塩及びアンモニウ
ム塩のいずれも利用する。 (10) 色素の生成：キングＢ培地で黄色螢光色素
を培地中に生成する。 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育温度：４〜39℃ 最適生育温度：25〜30℃ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) OF試験：酸化型 (17) 糖からの酸の生成 Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトー
ス及びＤ−マンノースから酸を生成するが、
マルトース、トレハロース、シヨ糖、イノシ
トール、Ｄ−マンニトール、乳糖、Ｄ−ソル
ビトール及び可溶性デンプンからは酸を生成
しない。 以上の諸性質をバージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey′s Mannual of Determinative
Bacteriology）第８版、1974版の記載と照合し
た結果、本菌はシユードモナス属に属し、そのな
かでシユードモナス・プチダの性質と極めてよく
一致するところから、本菌をシユードモナス・プ
チダと同定した。 このような微生物を培養して本発明の酵素を産
生させる方法は微生物を培養する一般的な方法に
準じて行なうことができる。すなわち、培地には
炭素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質な
どを含有するものを用いる。炭素源としては、グ
ルコース、麦芽糖のような糖類、グリセロールの
ようなアルコール類を使用できるが、馬尿酸とか
Ｎ−ベンゾイルアラニンのような本酵素の誘導基
質が特に効果的である。窒素源としては硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムな
どの無機態のものでもよく、酵母エキス、肉エキ
ス、ペプトンのような有機態のものでもよい。無
機塩類としては塩化ナトリウムのほかには、リン
酸１カリウム、リン酸２ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等の通常の無機塩を使用することができ
る。 培養方法としては、通常は液体培養が好まし
く、15〜37℃、好ましくは25〜35℃で、PH５〜８
で10〜50時間好気的条件下で培養する。この培養
によつて本酵素の大部分は菌体内で蓄積される。 培養終了後は培養物をそのまま酵素源として利
用してもよいが、通常は分離精製を行なう。分離
方法としては、まず菌体を遠心等の常法により分
離し、磨砕、リゾチーム等の溶菌酵素による溶
菌、超音波処理、圧力シヨツク法、自己消化法等
によつて菌体を破壊し、酵素を抽出する。破壊し
た菌体残渣を分離して酵素抽出液を得、硫酸アン
モニウム等を用いる塩析法、アセトン、エタノー
ル等を用いる溶媒沈澱法、セフアデツクス、セフ
アロースゲル等を用いるゲル過法、イオン交換
樹脂等を用いる吸着法等を適宜組合せて精製を行
ない、目的とする純度の酵素標品を得る。 本発明の酵素はＮ−ベンゾイルグリシン及びＮ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニンをよく分解するとこ
ろに特徴があり、アンジオテンシンエ変換酵素の
活性測定法及びカルボキシペプチダーゼＡの活性
測定法などに有用である。 以下実施例を示す。 実施例 グルコース１％、ペプトン１％、肉エキス0.5
％、塩化ナトリウム0.3％、酵母エキス0.25％、
リン酸２カリウム0.05％及び硫酸マグシウム0.05
％からなるPH7.0培地200mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃で20分間加熱して滅菌した。
冷却後、シユードモナス・プチダNo.C692−３（微
工研菌寄第7082号）を接種し、28℃で20時間振盪
培養して種培養液とした。 本培養の培地として、馬尿酸１％、酵母エキス
0.3％、硝酸ナトリウム0.2％、リン酸２カリウム
0.1％、塩化ナトリウム0.05％及び硫酸マグネシ
ウム0.05％からなるPH7.0の培地60を90容ジ
ヤーフアーメンターに仕込み、120℃で20分間滅
菌した。冷却後、種培養液1.2を接種し、28℃
で20時間通気撹拌培養を行なつた。その後、通気
量は0.5vvmとし、撹拌羽根の回転数は300rpmと
した。 培養終了後、培養液を遠心して700ｇの湿菌体
を得た。この菌体を0.1M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）３に
懸濁し、ダイノーミル（KDL型）を用いて
3000rpm、流量30ml／minで菌体を破砕した。遠
心して菌体残渣を除き、酵素抽出液3.5を得た。 0.1M塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム
緩衝液PH7.0で平衡化したDEAEセルロース１Kg
をこの酵素抽出液に加え、６℃で２時間撹拌して
酵素を吸着させた。このDEAEセルロースを同緩
衝液で充分に洗浄し、0.25M塩化ナトリウム及び
５ｍＭメルカプトエノールを含むリン酸ナトリウ
ム緩衝液（PH7.0）２で本酵素を溶出した。溶
出液に硫酸アンモニウムを40％飽和になるように
加え、生じた沈澱を集めた。この沈澱を、少量の
0.1M塩化ナトリウム及び５ｍＭメルカプトエタ
ノールを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH
7.0）に溶解し、同緩衝液に対して一夜透析した。
透析物を同緩衝液で平衡化したセフアロースCL
−6Bのカラムに流してゲル過を行なつた。得
られた活性区分に硫酸アンモニウムを20％飽和に
なるように加え、生じた沈澱を遠心して除去し
た。上清にさらに硫酸アンモニウムを40％飽和に
なるように加え、生じた沈澱を遠心分離した。こ
の沈澱を少量の同緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に
対して一夜透析して、比活性560単位／mg（蛋白）
の精製酵素標品470000単位を収率60％で得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適PHを示す曲線を表わした
ものであり、第２図はPH安定性を示す曲線を表わ
したものである。第３図は作用適温を、そして第
４図は熱安定性をそれぞれ示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の性質を有するアミノアシラーゼ (1) 作用 本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンを加水分解し
   て安息香酸とグリシンを生成する。 (2) 基質特異性 本酵素はＮ−ベンゾイルグリシン、Ｎ−ベンゾ
   イル−Ｌ−アラニン、Ｎ−ベンゾイル−DL−２
   −アミノ酪酸及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−フエニル
   アラニンを分解するがＮ−アセチルグリシン、Ｎ
   −ベンゾイル−DL−メチオニン及びＮ−ベンゾ
   イル−Ｄ−フエニルアラニンを実質的に分解しな
   い。 (3) 至適PH及び安定PH範囲 本酵素の至適PHは7.0〜8.0にあり、PH6.0〜7.0
   の範囲において最も安定である。 (4) 至適温度 本酵素の至適温度は50℃付近にある。 (5) 分子量 18万（ゲル濾過法）