JP2672845B2

JP2672845B2 - Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法

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Publication number: JP2672845B2
Application number: JP63241537A
Authority: JP
Inventors: 守高橋; しのぶ長沢; 茂生田; 一男松浦
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1988-09-27
Filing date: 1988-09-27
Publication date: 1997-11-05
Anticipated expiration: 2012-11-05
Also published as: US5116748A; EP0365158B1; DE68913128D1; DE68913128T2; JPH0292280A; EP0365158A1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規なＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ（Ｌ
−Alaninedehydrogenase）の製造法に関する。

〔従来の技術〕

Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼは、Ｌ−アラニンに特
異的に作用し、下記式〔Ｉ〕の反応を触媒する酵素とし
て知られている。

故に、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼはNADHの減少を
測定することにより直接ピルビン酸あるいはアンモニウ
ムイオンを定量するのに利用され、またはピルビン酸等
を原料として有用なアミノ酸であるアラニンの製造に利
用されてきた（特開昭60−184393号公報、特開昭62−36
196号公報）。従来のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの
製造法としては、サーマス属に属する菌株を使用した製
造法（特開昭58−212782号公報、特開昭59−55186号公
報）、バチルス属に属する菌株を使用した製造法（特開
昭60−180580号公報、特開昭60−180590号公報）、スト
レプトミセス属に属する菌株を使用した製造法（特開昭
59−132889号公報）が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点及びその手段〕

本発明者らは、より安定性の優れた製造効率の良いＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼの製造方法について鋭意研
究したところ、まず熊本県の温泉地の泉源周辺の土壌よ
り分離したスポロラクトバチルス属に属する新菌株を見
出し、また該新菌株を培養し、その培養物を精製するこ
とによって製造効率の非常に良いＬ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼの製造法を見出した。

すなわち本発明は、スポロラクトバチルス属に属する
Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、
その培養物からＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とするＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製
造法に関するものである。

まず、本発明のスポロラクトバチルス属に属する新菌
株について詳細な菌学的性質は以下の通りである。

A.形態学的特徴形および配列端の丸いまっすぐ又はやや曲がった桿菌で、単独又は
二連、たまに短連鎖する。

大きさ 0.6〜0.8×2.0〜4.0μｍ。

運動性周毛で運動する。

芽胞形成するが、芽胞によって菌体は膨らまない。

多形成 15〜20時間の培養でTadpole−like cell（オタマジャ
クシ状細胞）が出現し、培養を続けると桿状細胞と球状
細胞が混在する。

B.肉眼的観察 52℃、１〜３日間培養した結果は次の通りであった。

普通寒天斜面培地生育は弱く、線状（filiform）に生育し、透明で黄土
色を呈する。可溶性色素は産生しない。

普通寒天平面培地円形で全縁水平から丘状（flat〜convex）で滑らか
な、小さなコロニーを形成する。透明で黄土色を呈す
る。可溶性色素は産生しない。

液体培地生育は弱く、一様に混濁する。

BCPミルク培地変化なし。

C.生理学的生化学的性質〔＋：陽性、−：陰性、（＋）：弱陽性〕グラム染色＋ KOH反応 − 抗酸性染色 − カプセル形成 − OFテスト（Hugh Leifson）変化なし好気での生育（＋）嫌気での生育 − 生育温度 52℃ ＋ 45℃ ＋ 40℃ − 耐塩性 NaCl濃度％０％＋ 2.0％＋ 3.5％ − 生育pH pH9.8 − pH9.0 ＋ pH5.2 ＋ pH4.1 − カタラーゼ産生 − オキシターゼ産生 − ウレアーゼ産生 − ゼラチン分解変化なしデンプン分解 − カゼイン分解変化なしエスクリン分解＋セルロース分解 − インドール産生 − 硫化水素産生 − アセトイン産生 − MRテスト − 硫酸塩還元 − （利用性テスト）クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − （糖より酸の産生）アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース − セロビオース − ヅルシトール − メソ−エリスリトール − フラクトース＋ガラクトース（＋）グルコース＋グリセリン（＋）イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース＋マンニトール − マンノース（＋）メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）ラムノース − Ｄリボース＋サリシン − Ｌソルボース − ソルビトール − デンプン＋サッカロース＋キシロース（＋）トレハロース＋グルコースより産生する主たる酸乳酸、酢酸尚、以上に用いた各培地および培養方法は次の通りで
ある。

・基礎培地：トリプトソイブロス（Difco 0370−01−
１）に酵母エキス0.5％添加。

・生育温度:40℃、45℃、52℃で静置培養。

・生育pH:振盪培養。

・ゼラチン分解：基礎培地＋ゼラチン0.4％＋寒天1.5％
を用いシャーレで培養。

・BCPミルク培地：基礎培地＋スキムミルク10％BCP（0.
2％水溶液）１％を用いて振盪培養。

・カゼイン分解：基礎培地＋スキムミルク10％＋寒天1.
5％を用いシャーレで培養。

・エスクリン分解：基礎培地＋エスクリン1.0％＋寒天
1.5％＋クエン酸鉄アンモニウム（10％液）1.0％を用い
スラント培養。

・セルロース分解：基礎培地に濾紙片を入れ振盪培養。

・アセトイン産生：基礎培地＋グルコース1.0％を用い
振盪培養。

・MRテスト：アセトイン産生培地でpH測定（MRpH試験
紙）。

・硫化水素産生：基礎培地で静置培養、検出には酢酸鉛
紙を用いた。

・硝酸塩の還元：基礎培地＋NaNO₃ 0.1％で振盪培養。

・有機酸塩の利用：基礎培地＋有機酸塩0.3％で振盪培
養、pHメーターでpH測定。

・糖より酸の産生：トリプトン（Trypton）1.7％、ソイ
トン（Soyton）0.3％、NaCl 0.5％、酵母エキス（Yeast
ex）0.5％（pH7.0）の培地に各々の糖を1.0％添加し振
盪培養、pHメーカーでpH測定。

・ウレアーゼ産生：基礎培地に濾過滅菌した尿素を添加
し振盪培養。

上記の菌学的性質から、本発明の新菌株の菌学的特徴
は、グラム陽性の微好気性の桿菌で、カタラーゼ陰性、
グルコースより主に乳酸・酢酸を産生する特徴を有し、
かつ少なくとも前記培地条件では40℃で生育せず、45
℃、52℃生育する高温性の菌であるといえる。

バージーズマニュアルシステマティックバクテ
リオロジー（Bergey′s Manual Systematic Bacteriolo
gy）第２巻によれば、芽胞を形成する細菌は６属記載さ
れており、それら各属の性状は以下の特徴を有する。

バチルス（Bacillus）属：好気又は通性嫌気性でカタ
ラーゼ陽性の桿菌スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus属：微好
気性でカタラーゼ陰性の桿菌クロストリジウム（Clostridium）属：嫌気性でカタ
ラーゼ陰性の桿菌デスルホトマクラム（Desulfotomaculum）属：嫌気性
でカタラーゼ陰性の桿菌スポロサルシナ（Sporosarcina）属：好気性でカタラ
ーゼ陽性の球菌オシロスピラ（Oscillospira）属：嫌気性の大型桿菌従って、前述の菌学的特徴を有する本菌株は、好気条
件では生育が悪く、微好気性であり、カタラーゼ陰性の
桿菌であることから、スポロラクトバチルス（Sporolac
tobacillus）属に属するものと判定される。スポロラク
トバチルス属に属する菌種は、Bergey′s Manual Syste
matic Bacteriology第２巻にはスポロラクトバチルス・
イヌリヌス（Sporolactobacillus・inulinus）の一種が
記載されているのみであり、また1988年第１巻までに出
版されたインターナショナルジャーナルオブシス
テマティックバクテリオロジー（International Jour
nal of Systematic Bacteriology）に新種の報告はな
い。

そこで、Sporolactobacillus・inulinus（Ｓ・inulin
us）と本菌株の菌学的性質を比較すると次の通りであ
る。

以上の比較から、本菌株とＳ・inulinusとは、生育温
度において明白な特徴的差異を有し、さらにグルコース
より産生する酸の種類について異なっている。よって本
菌株をスポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属
に属する新菌株と同定し、スポロラクトバチルス・エス
ピー（Sporolactobacillus・sp）78−３と命名し、工業
技術院微生物工業技術研究所に「微工研菌寄第10273号
（FERM P−10273）、微工研条寄第2517号（FERM BP−25
17,移管日平成元年７月14日）本発明のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法にお
いて使用されるスポロラクトバチルス属に属するＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼ生産菌としては、上記のスポロ
ラクトバチルス・エスピー78−３はその一例であり、こ
の菌株に限らず、スポロラクトバチルス属に属するＬ−
アラニンデヒドロゲナーゼを製造する菌または採取しう
る量でＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを生産し得る能力
を有する変異株はすべて本発明のＬ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼの製造において使用できる。

本発明のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを製造する方
法においては、スポロラクトバチルス属に属するＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼ生産菌を使用することができ、
例えば前述のスポロラクトバチルス属に属する新菌株を
生産菌として挙げることができる。スポロラクトバチル
ス属に属するＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌の培
養にあたっては、抗生物質および酵素等の生産に使用さ
れる通常の方法で培養することができる。その培養の形
態は液体培養でも固体培養でもよいが、工業的にはスポ
ロラクトバチルス属に属するＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼ生産菌をその生産用培地に接種し、深部通気撹拌培
養を行うのが望ましい。

培地の栄養源としては、該生産菌の培養に通常用いら
れるものを広く使用することができる。炭素源としては
同化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、サッカロース、ラクトース、ガラストース、マルト
ース、マンニトール、ソルビトール、デキストリン、糖
蜜、可溶性澱粉等の炭水化物類、各種有機酸類、等を使
用できる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えば、ペプトン、粉末酵母エキス、肉エキ
ス、大豆粉、カゼイン、等を使用できる。その他、リン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲン等の種々の塩類また
は各種ビタミン類等が必要に応じて使用される。

培養温度は、スポロラクトバチルス属に属するＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼ生産菌が発育し、本酵素を生産
する範囲内で適宜変更し得るが、45〜60℃、特に52℃付
近が好ましい。培養時間は培養条件によって異なるが、
本酵素が最高力価に達する時期を見計らって適当な時期
に培養を終了すればよく、１〜３日間が好ましい。

かくして得られたスポロラクトバチルス属に属するＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌の培養物からＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼを採取するのであるが、本酵素
はその菌体内に含有されるので、得られた培養物から濾
過または遠心分離等の手段により集菌し、この菌体を超
音波処理しフレンチプレス処理、ガラスビーズ処理、凍
結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾチーム等の酵素的
破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合わせて、
粗製のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ含有液が得られ
る。

次いで、この粗製のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ含
有液から公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用い
ることによりさらに精製されたＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼを得ることができる。例えば、粗製のＬ−アラニ
ンデヒドロゲナーゼ含有液に、アセトン、メタノール、
エタノール、イソプロパノール等の有機溶媒を添加する
分別沈澱法、硫安、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、
アルミニウム等を添加する塩析沈澱法により本酵素を回
収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種のク
ロマトグラフィー法、電気泳動法あるいは超遠心分析法
を適宜組合せ用いて、必要に応じて精製すればよく、そ
の精製手段としては、目的とするＬ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼの性質を利用した手段を用いればよく、例えば
上記の沈澱物を水または緩衝液に溶解した後、必要に応
じて半透膜にて透析し、さらにDEAE−セルロース、DEAE
−セファセル、DEAE−セファロース、DEAE−セファデッ
クスＡ−50（ファルマシア社製）、DEAE−トヨパール
（東洋曹達社製）等のイオン交換樹脂や、セファデック
スＧ−100,G−75、セファクリルＳ−200等のゲル濾過剤
による分子篩クロマトを行えばよく、またこれらの手段
を適宜組み合わせて用いて精製すればよく、その後必要
に応じて糖類、例えばマンニトール、サッカロース、ソ
ルビトール等、アミノ酸、例えばグルタミン酸、グリシ
ン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛血清アルブミン
等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理により精製され
たＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの粉体を得ることがで
きる。このようにして得られたＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼは、溶液中でも非常に安定なものであった。

以上の如くして得られたＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼの性状は以下の通りである。

分子量;245,000±25,000［ポリビニルゲル（商品名:T
SK3000SW（0.75×60cm）東洋曹達（株）社製）のカラム
を用い、0.2MNaClを含む50mMリン酸カリウムバッファー
（pH6.5）を移動層とするゲル濾過法により測定］等電点;pH4.6±0.5（キャリアアンフォライトを用い
る焦点電気泳動法により４℃、700Vの定電圧で40時間通
電した後、各画分の酵素活性を測定した） Km値;0.84mM（ピルビン酸の測定の場合） 11.0μＭ（NADHの測定の場合）熱安定性；本酵素液（1.0U/ml）を20mMトリス−塩酸
バッファー（pH8.0）で調整し、15分間の各熱処理後そ
の残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した結
果、第１図の結果が得られ、酵素活性は少なくとも65℃
までは安定であった。

至適温度；後記の酵素活性測定法に従い、第２図に示
す各温度での反応におけるNADHの減少を波長340nmで吸
光度測定した結果は第２図に示す通りであり、65℃で最
大の活性を有していた。

pH安定性；本酵素液（1.0U/ml）を、40mMの酢酸バッ
ファー（pH5.0〜6.0、第３図の−△−）、リン酸バッフ
ァー（pH6.0〜8.0、第３図の−○−）、トリス−塩酸バ
ッファー（pH7.5〜9.0、−●−）、グリシン−NaOHバッ
ファー（pH8.5〜9.5、−□−）の各バッファーで調整
し、80℃で15分間加熱処理した後、その残存活性を後記
の酵素活性測定法に従って測定した結果、第３図の結果
が得られ、酵素活性はpH6.0〜7.5の範囲で安定であっ
た。

至適pH;後記の酵素活性測定法に従い、バッファーと
して40mMのリン酸バッファー（pH6.5〜7.5、第４図の−
○−）、トリス−塩酸バッファー（pH7.5〜9.0、第４図
の−●−）、グリシン−NaOHバッファー（pH9.0〜10.
5、第４図の−□−）の各バッファーを用い、NADHの減
少を波長340nmで吸光度測定した結果は第４図の通りで
あって、至適pHはpH9.0付近であった。

尚、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌として本発
明の新菌株であるスポロラクトバルチス・エスピー78−
３を使用して、本発明の製造方法により得られるＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼの生産力価を測定したところ、
高活性であり培養・精製が非常に容易であった。尚、本
発明の製造方法により得られるＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼの活性測定法は次の通りである。

〔反応液組成〕

〔活性測定〕上記の反応液1mlを1ml容石英セルに入れ、37℃・５分
間プレインキュベートした後、50mMトリエタノールアミ
ンバッファー（pH8.5）で適当に希釈した酵素液0.02ml
を添加して撹拌し反応を開始する。次いで反応における
NADHの減少を経時的に波長340nmにて吸光度測定し、グ
ラフの直線部分について、以下の計算式で活性を求め
た。

T;反応時間（分）X;希釈倍以上の通り、本発明はスポロラクトバチルス属に属す
るＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ生産菌による生産効率
の非常に良い安定したＬ−アラニンデヒドロゲナーゼゲ
ナーゼの製造方法を提供するものである。

さらに、本発明で得られたＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼを下記の酵素反応を利用して各種の分析・定量に用
いることができる。

尚、上記反応の酸化的脱アミノ化反応（）の最適pH
はpH10.5であり、還元的アミノ化反応（）の最適pHは
pH9.0である。

上記反応から明らかなように、本発明で得られるＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼの基質であるアラニンをNA
DHの生成を吸光度測定することにより定量できる。ま
た、上記の反応から明らかなように、本発明で得られ
るＬ−アラニンデヒドロゲナーゼによってピルビン酸あ
るいはアンモニウムイオンを、NADHの減少を吸光度測定
することにより定量できる。故に、直接ピルビン酸、あ
るいはアンモニウムイオンを測定できるばかりでなく、
例えばその前駆反応でアンモニウムイオンがピルビン酸
を生成する酵素の酵素活性または、その前駆反応に関与
する基質の定量を対応する気質の存在下で測定すること
ができる。このような酵素についてアンモニウムイオン
を生成するものとしては以下に挙げる酵素が例示でき
る。

EC.3.5.1.1 アスパラギナーゼ（Asparaginase） EC.3.5.1.2 グルタミナーゼ（Glutaminase） EC.3.5.1.3 ω−アミダーゼ（ω−Amidase） EC.3.5.1.4 アミダーゼ（Amidase） EC.3.5.1.5 ウレアーゼ（Urease） EC.3.5.1.6 β−ウレイドプロピナーゼ（β−Ureidopr
opinase） EC.3.5.1.7 ウレイドプロピナーゼ（Ureidopropinas
e） EC.3.5.1.12 ビオチニダーゼ（Biotinidase） EC.3.5.1.19 ニコチンアミダーゼ（Nicotinamidase） EC.3.5.1.20 シトルリナーゼ（Citrullinase） EC.3.5.1.29 α−（アセトアミドメチレン）スクシネ
ートヒドラーゼ（α−（Acetamidometylene）succinate
hydrolase） EC.3.5.1.30 ５−アミノバレルアミダーゼ（５−Amino
valeramidase） EC.3.5.1.35 Ｄ−グルタミナーゼ（Ｄ−Glutaminase） EC.3.5.1.38 グルタミン−（アスパラギン）アーゼ（G
lutamin−（asparagin）ase） EC.3.5.1.42 ニコチンアミドヌクレオチドアミダーゼ
（Nicotinamidenucleotide amidase） EC.3.5.1.43 ペプチジル−グルタミナーゼ（Peptidyl
−glutaminase） EC.3.5.1.44 ウルタミニル−ペプタイドグルタミナー
ゼ（Glutaminyl−peptide glutaminase） EC.3.5.1.45 ウレアーゼ（Urease） EC.3.5.3.5 ホルムイミノアスパルテイトデイミナーゼ
（Formiminoasparartate deiminase） EC.3.5.3.6 アルギニンデイミナーゼ（Argininedeimin
ase） EC.3.5.3.7 グアニジノブチラーゼ（Guanidinobutyras
e） EC.3.5.3.9 アラントエイトデイミナーゼ（Allantoate
deiminase） EC.3.5.4.1 シトシンデイミナーゼ（Cytosine deamina
se） EC.3.5.4.2 アデノシンデアミナーゼ（Adenine deamin
ase） EC.3.5.4.3 グアノシンデアミナーゼ（Guanine deamin
ase） EC.3.5.4.4 アデノシンデアミナーゼ（Adenosine deam
inase） EC.3.5.4.5 シチジンデアミナーゼ（Cytidine deamina
se） EC.3.5.4.6 AMPデアミナーゼ（AMP deaminase） EC.3.5.4.7 ADPデアミナーゼ（ADP deaminase） EC.3.5.4.8 アミノイミダゾラーゼ（Aminoimidazolas
e） EC.3.5.4.11 プテリンデアミナーゼ（Pterin deaminas
e） EC.3.5.4.12 dCMPデアミナーゼ（dCMP deaminase） EC.3.5.4.13 dCTPデアミナーゼ（dCTP deaminase） EC.3.5.4.14 デオキシシチジンデアミナーゼ（Deoxycy
tidine deaminase） EC.3.5.4.15 グアノシンデアミナーゼ（Guanosine dea
minase） EC.3.5.4.17 アデノシン（ホスフェート）デアミナー
ゼ（Adenosine（Phosphate）deaminase） EC.3.5.4.18 ATP デアミナーゼ（ATP deaminase） EC.3.5.4.20 ピリチアミンデアミナーゼ（Pyrithiamin
deaminase） EC.3.5.4.21 クレアチニンデアミナーゼ（Creatinine
deaminase） EC.3.5.4.22 １−ピロリン 4−ヒドロキシ 2−カルボ
キシレートデアミナーゼ（１−Pyrroline 4−hydroxy 2
−carboxylate deaminase） EC.3.5.4.23 ブラスチシジン−Ｓ−デアミナーゼ（Bla
sticidin−S deaminase） EC.3.5.4.24 セピアプテリンデアミナーゼ（Sepiapter
in deaminase） EC.3.5.5.1 ニトリラーゼ（Nitrilase） EC.3.5.5.2 リシニンニトリラーゼ（Ricinine nitrila
se） EC.3.5.5.3 シアネートヒドラーゼ（Cyanate hydorola
se）例えば、EC.3.5.4.4 アデノシンデアミナーゼ（Aden
osine deaminase）の酵素活性を測定する場合、従来は
以下の酵素反応に基づいて生成するアンモニウムイオン
をChaney ＆ Marbachの方法およびアンモニウムイオン
をグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC1.4.1.3）反応に
導き、NADHの減少を測定することにより行っていたが、
その際、生成するアンモニウムイオンを本発明により得
られるＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの酵素反応に導
き、NADHの減少を波長340nmで測定することによりアデ
ノシンデアミナーゼ（Adenosine deaminase）の酵素活
性を測定することが可能である。

また、その酵素反応において尿素を生成する酵素の酵
素活性を測定する場合は、生成される尿素にウレアーゼ
を作用させ、その生成物であるアンモニウムイオンをＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼ反応の系に導き直接定量す
ることにより測定することが可能である。

酵素反応において尿素を生成する酵素としては以下の
酵素が例示できる。

EC.3.5.2.1 バルビツラーゼ（Barbiturase） EC.3.5.3.1 アルギナーゼ（Arginase） EC.3.5.3.2 グリコシアミナーゼ（Glycocyaminase） EC.3.5.3.3 クレアチナーゼ（Creatinase） EC.3.5.3.4 アラントイカーゼ（Allantoicase） EC.3.5.3.7 グアニジノブチラーゼ（Guanidinobutyras
e） EC.3.5.3.10 Ｄ−アルギナーゼ（Ｄ−Arginase） EC.3.5.3.11 アグマチナーゼ（Agmatinase） EC.3.5.3.14 アミジノアスパルテイト（Amidinoaspart
ase）例えば、EC.3.5.3.1アルギナーゼ（Arginase）の酵素
活性を測定する場合、以下の酵素反応に基づいて生成す
る尿素にウレアーゼを作用させ、その生成物であるアン
モニウムイオンを本発明のＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼ反応の系に導き、NADHの減少を波長340nmで測定すれ
ばよい。

アルギニン＋H₂O→リシン＋尿素以上の如くＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いて種
々の分析・定量が可能である。

〔実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
本発明は何ら実施例によって限定されるものではない。

実施例１スポロラクトバチルス・エスピー78−３の培養（ｉ）ペプトン（極東製薬） 1.0 ％酵母エキス（極東製薬） 0.5 ％グルコース 1.0 ％アラニン 2.0 ％ KH₂PO₄ 0.3 ％ MgSO₄・7H₂O 0.05％ CaCl₂・2H₂O（pH7.0） 0.02％上記組成からなる液体培地100mlを500ml容三角フラス
コに注ぎ、120℃で20分間加熱滅菌した後、これにスポ
ロラクトバチルス・エスピー78−３一白金耳を接種し、
50℃・120r.p.mの振盪培養で24時間培養し、培養物100m
lを得た（培養活性50U/ml）。

（ii）ポリペプトン（武田薬品） 1.0 ％酵母エキス（極東製薬） 0.2 ％可溶性デンプン 1.0 ％アラニン 2.0 ％ KH₂PO₄ 0.3 ％ MgSO₄・7H₂O 0.05％ CaCl₂・2H₂O（pH7.0） 0.02％上記組成からなる液体培地20を30容のジャーファ
メンターに注ぎ、各熱滅菌した後、これに前記（ｉ）の
前培養で得た培養物100mlを種母として移植し、50℃・
通気量20／分・内圧0.2kg/cm²・撹拌速度150r.p.mの
条件で16時間培養し、培養物19を得た。

実施例２酵素の精製実施例１の培養（ii）で得た培養液19を遠心分離で
集菌した後、40mMリン酸バッファー（pH7.0）,0.1％リ
ゾチーム５を加え、37℃・30分間で可溶化した後に、
pHを7.0に調整し、70℃・30分間加熱処理を行った。直
ちに冷却し、沈殿物を遠心除去した上清4500mlを得た
（培養活性304U/ml）。上清に当容量のアセトンを添加
撹拌し、遠心除去した沈殿を得た。沈殿に40mMリン酸バ
ッファー（pH7.0）１を添加撹拌した後に沈殿物を遠
心分離した上清を得た。40mMリン酸バッファー（pH7.
0）で緩衝化したDEAEセファロースCL−6B（ファルマシ
ア社製）500mlにこの上清を流した後、0.2M KClを含む4
0mMリン酸バッファー（pH7.0）500mlで溶出された酵素
液に156gの硫安を添加撹拌し、後に遠心分離して沈殿を
得た。沈殿を40mMリン酸バッファー（pH7.0）200mlで溶
解した溶液に35gの硫安を溶解し30％飽和硫安溶液と
し、これを30％飽和硫安で緩衝化しておいたオクチルセ
ファロースCL−4B100ml（ファルマシア社製）に流し、
同様のバッファー500mlでカラムを洗浄した後に20％飽
和硫安溶液200mlを流し、得た酵素液を40mMリン酸バッ
ファー（pH7.0）10に対して一昼夜２回透析を繰り返
し、酵素液250ml（培養活性2750U/ml、回収率50.3％）
を得た。

参考例１Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いたアンモニウムイ
オンの定量反応液組成トリス塩酸バッファー（pH8.5） 50mM NADH（オリエンタル酵母（株）製） 0.2mM ピルビン酸ナトリウム 10mM Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ 3.75U 上記反応液1mlに10mM NH₄Clをそれぞれ１μ（第５
図の−□−）,2.5μ（第５図の−△−）,5μ（第５
図の−●−）,10μ（第５図の−○−）添加し、経時
的に波長340nmの減少を測定した（第５図）。７分目か
ら８分目の１分間の波長340nmの減少を第６図に示した
が、原点を通る直線が得られた。

参考例２Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いた尿素の定量反応液組成トリス塩酸バッファー（pH8.5） 50mM NADH（オリエンタル酵母（株）製） 0.2mM ピルビン酸ナトリウム 10mM Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ 5.0U ウレアーゼ（jack bean製） 25U 上記反応液3mlに50mg/dl尿素をそれぞれ４μ,8μ
,12μ,20μ,40μ添加し、経時的に波長340nmの
減少を測定し、７分目から８分目の１分間の波長340nm
の減少を第７図に示したが、原点を通る直線が得られ
た。

参考例３Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを用いたアデノシンデア
ミナーゼ活性の測定反応液組成トリス塩酸バッファー（pH8.5） 50mM NADH（オリエンタル酵母（株）製） 0.2mM ピルビン酸ナトリウム 10mM Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ 20.0U 上記反応液1mlにアデノシンデアミナーゼをそれぞれ
0.4mU,0.8mU,2mU添加し、37℃・10分間インキュベート
の後、1mMアデノシン100μを添加し、波長340nmの減
少を経時的に測定し，その結果を第８図に示した。16分
目から17分目の１分間の波長340nmの減少を第９図に示
したが、よい直線性を示した。

尚、反応液のpHは８〜10、好ましくは8.5〜9.5の緩衝
液である。NADHの濃度は0.01mM〜0.6mM、好ましくは0.2
〜0.3mMである。ピルビン酸の濃度は0.5mM〜0.5M、好ま
しくは５〜20mMである。Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ
は0.1〜500U/ml、好ましくは10〜30U/ml、時によっては
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）阻害剤、例えばオキザミ
ン酸、シュウ酸等を10〜70mM添加すると血清中LDHの影
響を受けにくい。

〔発明の効果〕

本発明によれば、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼが高
力価に生産されるので、本酵素の醗酵法による製造法と
して有効な方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の製造法で得られるＬ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼの熱安定性を示し、第２図は本酵素の至適
温度を示し、第３図は本酵素のpH安定性を示し、第４図
は本酵素の至適pHを示す。また第５図はアンモニウムイ
オンを定量する場合、NH₄Cl濃度を変化させた場合のレ
イトアッセイを示し、第６図はアンモニウムイオンの定
量曲線を示す。第７図は尿素の定量曲線を示す。第８図
はアデノシンデアミナーゼの酵素活性を測定する場合、
アデノシンデアミナーゼ濃度を変化させた場合のレイト
アッセイを示し、第９図はアデノシンデアミナーゼの標
準曲線を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】スポロラクトバチルス属に属するＬ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養
物からＬ−アラニンデヒドロゲナーゼを採取することを
特徴とするＬ−アラニンデヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項２】スポロラクトバチルス属に属するＬ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ生産菌がスポロラクトバチルス・
エスピー（Sporolactobacillus・sp）78−３である特許
請求の範囲第１項記載の製造法。