JP2684238B2 - アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 - Google Patents
アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床生化学検査、食品検査などにおけるア
シル−Ｌ−カルニチンの測定に有用な新規アシルカルニ
チンエステラーゼおよびその製造法に関する。
シル−Ｌ−カルニチンの測定に有用な新規アシルカルニ
チンエステラーゼおよびその製造法に関する。
Ｌ−カルニチンは、ビタミンBTとも呼ばれており、生
体内において、脂肪酸のミトコンドリア膜内への輸送に
必須の物質である。一方、生体内にはＬ−カルニチンの
アシル体であるアシル−Ｌ−カルニチンも存在してお
り、血液中のアシル−Ｌ−カルニチン量を測定すること
は生体内筋肉のエネルギー障害の判定のためのミトコン
ドリアの機能障害のモニタリングなどに極めて重要であ
り、また尿中にもアシル−Ｌ−カルニチンは排出されて
いる。
体内において、脂肪酸のミトコンドリア膜内への輸送に
必須の物質である。一方、生体内にはＬ−カルニチンの
アシル体であるアシル−Ｌ−カルニチンも存在してお
り、血液中のアシル−Ｌ−カルニチン量を測定すること
は生体内筋肉のエネルギー障害の判定のためのミトコン
ドリアの機能障害のモニタリングなどに極めて重要であ
り、また尿中にもアシル−Ｌ−カルニチンは排出されて
いる。
従来、アシル−Ｌ−カルニチンは、被検液中のアシル
−Ｌ−カルニチンをアルカリを用いて加水分解し、生成
するＬ−カルニチンを定量することにより測定されてい
た。このときの加水分解の条件としてはPearsonらの方
法〔Methods in Enzymology,Vol.14,621（1969）〕、Bi
eberらの方法〔Methods in Enzymology,Vol.72,276（19
81）〕、Paceらの方法〔Clin.Chem.,24,32（1978）〕な
どがある。
−Ｌ−カルニチンをアルカリを用いて加水分解し、生成
するＬ−カルニチンを定量することにより測定されてい
た。このときの加水分解の条件としてはPearsonらの方
法〔Methods in Enzymology,Vol.14,621（1969）〕、Bi
eberらの方法〔Methods in Enzymology,Vol.72,276（19
81）〕、Paceらの方法〔Clin.Chem.,24,32（1978）〕な
どがある。
しかしながら、これらの加水分解条件は、すべて高濃
度のアルカリ溶液（水酸化カリウム溶液）を加え30分間
以上加水分解した後に酸で中和して被検液としているた
めに、危険である上に時間がかかりサンプルが希釈され
てしまうという大きな欠点を有していた。
度のアルカリ溶液（水酸化カリウム溶液）を加え30分間
以上加水分解した後に酸で中和して被検液としているた
めに、危険である上に時間がかかりサンプルが希釈され
てしまうという大きな欠点を有していた。
かかる欠点を克服するためには、酵素法、すなわちア
シルカルニチンエステラーゼの利用が考えられる。アシ
ルカルニチンエステラーゼとしてはラットの肝臓由来の
ものが知られている〔S.Mahadevan ＆ F.Sauer,J.Biol,
Chem.,244,4448−4453（1969）〕。しかし、当該アシル
カルニチンエステラーゼ、ヒト血清中に多量に存在する
低級アシル−Ｌ−カルニチンであるアセチル−Ｌ−カル
ニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンに対して全
く活性を示さないばかりか、例えばデカノイル−Ｌ−カ
ルニチンに対して3.2×10-3M、パルミトイル−Ｌ−カル
ニチンに対して５×10-3Mと長鎖アシル−Ｌ−カルニチ
ンに対しても高いKm値を示しているために完全に加水分
解するには多量の酵素が必要であった。さらにこのよう
に多量の酵素が必要であるにもかかわらずラットの肝臓
50g（約１匹分）からは、たかだか3.7Uの酵素が採取で
きたにすぎないものであった。
シルカルニチンエステラーゼの利用が考えられる。アシ
ルカルニチンエステラーゼとしてはラットの肝臓由来の
ものが知られている〔S.Mahadevan ＆ F.Sauer,J.Biol,
Chem.,244,4448−4453（1969）〕。しかし、当該アシル
カルニチンエステラーゼ、ヒト血清中に多量に存在する
低級アシル−Ｌ−カルニチンであるアセチル−Ｌ−カル
ニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンに対して全
く活性を示さないばかりか、例えばデカノイル−Ｌ−カ
ルニチンに対して3.2×10-3M、パルミトイル−Ｌ−カル
ニチンに対して５×10-3Mと長鎖アシル−Ｌ−カルニチ
ンに対しても高いKm値を示しているために完全に加水分
解するには多量の酵素が必要であった。さらにこのよう
に多量の酵素が必要であるにもかかわらずラットの肝臓
50g（約１匹分）からは、たかだか3.7Uの酵素が採取で
きたにすぎないものであった。
従って、低級アシル−Ｌ−カルニチンに対して活性を
示し、基質である長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに対する
Km値の低い、充分な安定性を有する低級乃至長鎖アシル
カルニチンエステラーゼおよび生体中のアシル−Ｌ−カ
ルニチンの感度の高い定量法の開発が望まれていた。
示し、基質である長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに対する
Km値の低い、充分な安定性を有する低級乃至長鎖アシル
カルニチンエステラーゼおよび生体中のアシル−Ｌ−カ
ルニチンの感度の高い定量法の開発が望まれていた。
そこで、本発明者らは、上記要件を満たすアシルカル
ニチンエステラーゼを、種々の微生物培養物中からスク
リーニングすることに着目して種々研究を続けた結果、
アルカリゲネス属に属する微生物が、低級乃至長鎖アシ
ル−Ｌ−カルニチンに対して活性を示し、活性の高いア
シルカルニチンエステラーゼを生産すること、さらにこ
れを用いれば検体中のアシル−Ｌ−カルニチンの高感度
定量が可能となることを見出し、本発明を完成した。
ニチンエステラーゼを、種々の微生物培養物中からスク
リーニングすることに着目して種々研究を続けた結果、
アルカリゲネス属に属する微生物が、低級乃至長鎖アシ
ル−Ｌ−カルニチンに対して活性を示し、活性の高いア
シルカルニチンエステラーゼを生産すること、さらにこ
れを用いれば検体中のアシル−Ｌ−カルニチンの高感度
定量が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は少なくともアセチル−Ｌ−カルニ
チンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群よ
り選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖アシ
ル−Ｌ−カルニチンであるパルミトイル−Ｌ−カルニチ
ンに基質特異性を有し、当該低級乃至長鎖アシル−Ｌ−
カルニチンの１モルと水分子の１モルから１モルの脂肪
酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応を触媒する
低級乃至長鎖アシルカルニチンエステラーゼを提供する
ものである。また本発明は、アルカリゲネス属に属する
低級乃至長鎖アシルカルニチンエステラーゼ生産菌を培
地にて培養し、得られた培養物から低級乃至長鎖アシル
カルニチンエステラーゼを採取することを特徴とする当
該アシルカルニチンエステラーゼの製造法を提供するも
のである。
チンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群よ
り選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖アシ
ル−Ｌ−カルニチンであるパルミトイル−Ｌ−カルニチ
ンに基質特異性を有し、当該低級乃至長鎖アシル−Ｌ−
カルニチンの１モルと水分子の１モルから１モルの脂肪
酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応を触媒する
低級乃至長鎖アシルカルニチンエステラーゼを提供する
ものである。また本発明は、アルカリゲネス属に属する
低級乃至長鎖アシルカルニチンエステラーゼ生産菌を培
地にて培養し、得られた培養物から低級乃至長鎖アシル
カルニチンエステラーゼを採取することを特徴とする当
該アシルカルニチンエステラーゼの製造法を提供するも
のである。
本発明のアシルカルニチンエステラーゼ生産菌として
は、アルカリゲネス属に属し、低級乃至長鎖アシルカル
ニチンエステラーゼ生産能を有するものであれば特に限
定されないが、例えば本発明者らが分離したNo.981菌株
が挙げられ、この菌株は本発明に最も有効に使用される
菌株の一例であって、本菌株の菌学的性質を示すと次の
通りである。
は、アルカリゲネス属に属し、低級乃至長鎖アシルカル
ニチンエステラーゼ生産能を有するものであれば特に限
定されないが、例えば本発明者らが分離したNo.981菌株
が挙げられ、この菌株は本発明に最も有効に使用される
菌株の一例であって、本菌株の菌学的性質を示すと次の
通りである。
尚、本菌株の同定に当たっては、同定実験は医学細菌
同定の手引き（第２版）、Microbiological Methods
（３巻）に準じて行い、実験結果をBergey's Manual of
Determinative Bacteriology（８版）、Bergey's Manu
al of Systematic Bacteriology Vol.1（1984）、同誌,
Vol.2（1986）などと対比して同定を行った。
同定の手引き（第２版）、Microbiological Methods
（３巻）に準じて行い、実験結果をBergey's Manual of
Determinative Bacteriology（８版）、Bergey's Manu
al of Systematic Bacteriology Vol.1（1984）、同誌,
Vol.2（1986）などと対比して同定を行った。
（ａ）形態的特徴 普通寒天培地上、18〜24時間、28〜30℃で培養し、観
察した所見は次の通りである。
察した所見は次の通りである。
端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で、単
独、二連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。大きさ
は0.4〜0.6×1.2〜2.5μｍで周毛で運動する。多形性な
し。
独、二連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。大きさ
は0.4〜0.6×1.2〜2.5μｍで周毛で運動する。多形性な
し。
（ｂ）各培地における生育状態 各種培地上で、18〜24時間、28〜30℃で培養し、観察
した所見は次の通りである。
した所見は次の通りである。
普通寒天斜面培地 生育良好で線状（filiform）に生育する。湿潤で光沢
を有する。黄土色を呈するが、可溶性色素は産生しな
い。
を有する。黄土色を呈するが、可溶性色素は産生しな
い。
普通寒天平面培地 円型、丘状（convex）、全縁の集落を形成する。表面
は滑らかで湿潤。黄土色ないし淡黄土色を呈する。可溶
性色素は産生しない。
は滑らかで湿潤。黄土色ないし淡黄土色を呈する。可溶
性色素は産生しない。
液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。長時間（40時間以上）培
養では菌膜を形成する。
養では菌膜を形成する。
BCPミルク培地 ４〜５日後、アルカリになる。
（ｃ）生理的性質〔＋；陽性、（＋）；弱陽性；−；陰
性〕 グラム染色 − KOH反応 ＋ カプセル形成 − 抗産生染色 − OFテスト （Hugh−Leifson） 変化なし OFテスト （Ｎ源にNH4H2PO4） Ｏ（酸化） 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 41℃ − 37℃ ＋ 15℃ ＋ 耐塩性 ０％ ＋ ５％ ＋ ７％ − 生育pH 4.6 − 5.4 ＋ 8.9 ＋ 9.8 − ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 − カゼインの分解 − エスクリンの分解 − セルロースの分解 − チロシンの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ LV反応 − ウレアーゼ産生（SSR） − ウレアーゼ産生（Chris） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（K2HPO4） − アセトイン産生（NaCl） − MRテスト − 硝酸塩還元テスト ガス検出 ＋ NO2 -の検出 − NO3 -の検出 − シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 （＋） プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース （＋） セロビオース − ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン （＋） イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール − マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）ラムノース − Ｄ−リボース − サリシン − Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 − サッカロース − トレハロース ＋ キシロース − ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積 − （ｄ）炭素源の利用性 炭素源5g、NaCl5g、MgSO4・7H2O0.2g、NH4H2PO41.0
g、蒸留水１を含む液体培地（pH7.0）での各炭素源の
利用性を試験した結果は次の通りである。
性〕 グラム染色 − KOH反応 ＋ カプセル形成 − 抗産生染色 − OFテスト （Hugh−Leifson） 変化なし OFテスト （Ｎ源にNH4H2PO4） Ｏ（酸化） 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 41℃ − 37℃ ＋ 15℃ ＋ 耐塩性 ０％ ＋ ５％ ＋ ７％ − 生育pH 4.6 − 5.4 ＋ 8.9 ＋ 9.8 − ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 − カゼインの分解 − エスクリンの分解 − セルロースの分解 − チロシンの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ LV反応 − ウレアーゼ産生（SSR） − ウレアーゼ産生（Chris） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（K2HPO4） − アセトイン産生（NaCl） − MRテスト − 硝酸塩還元テスト ガス検出 ＋ NO2 -の検出 − NO3 -の検出 − シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 （＋） プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース （＋） セロビオース − ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン （＋） イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール − マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）ラムノース − Ｄ−リボース − サリシン − Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 − サッカロース − トレハロース ＋ キシロース − ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積 − （ｄ）炭素源の利用性 炭素源5g、NaCl5g、MgSO4・7H2O0.2g、NH4H2PO41.0
g、蒸留水１を含む液体培地（pH7.0）での各炭素源の
利用性を試験した結果は次の通りである。
グルコース ＋ Ｌ（＋）アラビノース − フラクトース ＋ マンニトール − マンノース ＋ グルコネート ＋ アセテート ＋ アジペート − ピメレート ＋ スベレート ＋ タートレート ＋ 以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陰性の桿状細
菌で、周毛で運動、カタラーゼ、オキシダーゼを産生
し、ペプトンを含む培地（Hugh−Leifson）ではグルコ
ースより酸を産生しないが、グルコースを酸化的に分解
し、酸を産生する。芽胞は形成せず、多形性なし。好気
性である。
菌で、周毛で運動、カタラーゼ、オキシダーゼを産生
し、ペプトンを含む培地（Hugh−Leifson）ではグルコ
ースより酸を産生しないが、グルコースを酸化的に分解
し、酸を産生する。芽胞は形成せず、多形性なし。好気
性である。
グラム陰性桿菌で好気性、周毛で運動する菌属は、ア
ルカリゲネス属、クロモバクテリウム属およびフラボバ
クテリウム属の３属である。クロモバクテリウム属は紫
色、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生するが、
本菌株は色素を産生しないことから判断してアルカリゲ
ネス属に属する菌株であることは明らかである。
ルカリゲネス属、クロモバクテリウム属およびフラボバ
クテリウム属の３属である。クロモバクテリウム属は紫
色、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生するが、
本菌株は色素を産生しないことから判断してアルカリゲ
ネス属に属する菌株であることは明らかである。
そこで、本菌株がアルカリゲネス属のどの種に属する
か否かを同定するため、Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology,Vol.1（1984）に記載されている３菌
種、即ちAlcaligenes faecalis（以下、「Ｆ」と略記す
ることがある）、Alcaligenes denitrificans subsp.de
nitrificans（以下、「Ｄ」と略記することがある）お
よびAlcaligenes denitrificans subsp.xylosoxidans
（以下「Ｘ」と略記することがある）と対比した結果
は、次の通りである。
か否かを同定するため、Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology,Vol.1（1984）に記載されている３菌
種、即ちAlcaligenes faecalis（以下、「Ｆ」と略記す
ることがある）、Alcaligenes denitrificans subsp.de
nitrificans（以下、「Ｄ」と略記することがある）お
よびAlcaligenes denitrificans subsp.xylosoxidans
（以下「Ｘ」と略記することがある）と対比した結果
は、次の通りである。
尚、Ｆ、ＤおよびＸで示される「＋」は90％以上の陽
性率、「−」は90％以上が陰性率、「ｄ」は「＋」でも
「−」でもどちらでもないことを示す。
性率、「−」は90％以上が陰性率、「ｄ」は「＋」でも
「−」でもどちらでもないことを示す。
以上対比した結果によれば、本菌株No.981の諸性状は
Alcarigenes subsp.xylosoxidansと一致した点が多い
が、OF培地での酸産生能およびキシロースより酸を産生
しない点での性状が異なる。
Alcarigenes subsp.xylosoxidansと一致した点が多い
が、OF培地での酸産生能およびキシロースより酸を産生
しない点での性状が異なる。
よって、本菌株を公知のものと区別するため、アルカ
リゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）No.981と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研
条寄第2570号（FERM BP−2570）として寄託した。
リゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）No.981と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研
条寄第2570号（FERM BP−2570）として寄託した。
本発明アシルカルニチンエステラーゼを製造するに
は、先ずアルカリゲネス属に属するアシルカルニチンエ
ステラーゼ生産菌が適当な培地に培養される。
は、先ずアルカリゲネス属に属するアシルカルニチンエ
ステラーゼ生産菌が適当な培地に培養される。
上記のアシルカルニチンエステラーゼ生産菌として
は、前述のアルカリゲネス・エスピーNo.981が挙げられ
るが、細菌の一般的性状として菌学上の性質は変異し得
るものであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外
線照射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタ
ンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異
し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、アルカリ
ゲネス属に属し、アシルカルニチンエステラーゼを生産
する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用すること
ができる。
は、前述のアルカリゲネス・エスピーNo.981が挙げられ
るが、細菌の一般的性状として菌学上の性質は変異し得
るものであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外
線照射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタ
ンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異
し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、アルカリ
ゲネス属に属し、アシルカルニチンエステラーゼを生産
する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用すること
ができる。
上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件に
よって行うことができるが、本菌株の培養にあたって
は、アシルカルニチンエステラーゼがアシル−Ｌ−カル
ニチンによって誘導的に生成される誘導酵素であること
から、アシル−Ｌ−カルニチンを含む培地で培養するこ
とが好ましい。当該アシル−Ｌ−カルニチンとしては、
例えば安価なオクタノイル−Ｌ−カルニチン（培地に対
して0.1〜１％）を用いるのが好ましい。
よって行うことができるが、本菌株の培養にあたって
は、アシルカルニチンエステラーゼがアシル−Ｌ−カル
ニチンによって誘導的に生成される誘導酵素であること
から、アシル−Ｌ−カルニチンを含む培地で培養するこ
とが好ましい。当該アシル−Ｌ−カルニチンとしては、
例えば安価なオクタノイル−Ｌ−カルニチン（培地に対
して0.1〜１％）を用いるのが好ましい。
培地としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得
る窒素源、さらには必要に応じ、無機塩などを含有させ
た栄養培地が使用される。
る窒素源、さらには必要に応じ、無機塩などを含有させ
た栄養培地が使用される。
同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、サッカロース、シュクロース、糖蜜、オリーブ油な
どが単独または組み合わせて用いられる。消化し得る窒
素源としては、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーン・スチープ・リカー、塩化コリンなどが単独
または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、
ナトリウム塩、その他、鉄、マンガンなどの種々の重金
属塩などが使用される。上記以外に公知の同化し得る炭
素源、消化し得る窒素源が使用できることはいうまでも
ない。
ス、サッカロース、シュクロース、糖蜜、オリーブ油な
どが単独または組み合わせて用いられる。消化し得る窒
素源としては、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーン・スチープ・リカー、塩化コリンなどが単独
または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリ
ン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、
ナトリウム塩、その他、鉄、マンガンなどの種々の重金
属塩などが使用される。上記以外に公知の同化し得る炭
素源、消化し得る窒素源が使用できることはいうまでも
ない。
培養は、通常振とうまたは通気撹拌培養などの好気的
条件下で行うのがよく、工業的には深部通気撹拌培養が
好ましい。培養温度はアシルカルニチンエステラーゼ生
産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得
るが、通常は15〜37℃、特に28℃付近が好ましい。培養
時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最高力価に
達する時期を見計らって適当な時期に培養を停止すれば
よいが、通常は１〜３日間程度である。
条件下で行うのがよく、工業的には深部通気撹拌培養が
好ましい。培養温度はアシルカルニチンエステラーゼ生
産菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得
るが、通常は15〜37℃、特に28℃付近が好ましい。培養
時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最高力価に
達する時期を見計らって適当な時期に培養を停止すれば
よいが、通常は１〜３日間程度である。
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速
度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部
の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜
調節、選択されることは言うまでもない。液体培養にお
いて発泡があるときは、シリコン油、植物油などの消泡
剤が適宜使用される。
度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部
の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜
調節、選択されることは言うまでもない。液体培養にお
いて発泡があるときは、シリコン油、植物油などの消泡
剤が適宜使用される。
このようにして得られたアシルカルニチンエステラー
ゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた培養
物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、この
菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスビーズ
処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾリーム等
の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合
わせて、精製のアシルカルニチンエステラーゼ含有液が
得られる。
ゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた培養
物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、この
菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスビーズ
処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾリーム等
の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合
わせて、精製のアシルカルニチンエステラーゼ含有液が
得られる。
この粗製のアシルカルニチンエステラーゼ含有液から
公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いることに
よりさらに精製されたアシルカルニチンエステラーゼを
得ることができる。例えば粗製のアシルカルニチンエス
テラーゼ含有液に硫安、硫酸ナトリウム、リン酸カリウ
ム、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法により本酵素
を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種
のクロマトグラフィー法、電気泳動法あるいは超遠心分
析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて精製すれば
よく、その精製手段としては、目的とするアシルカルニ
チンエステラーゼの性質を利用した手段を用いればよ
く、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に溶解した
後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにDEAE−セル
ロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファロース、DEAE
−セファデックスＡ−50（ファルマシア社製）、DEAE−
トヨパール（東洋曹達社製）等のイオン交換樹脂や、セ
ファデックスＧ−100、Ｇ−75、セファクリルＳ−200等
のゲル濾過剤による分子篩クロマトを行えばよく、また
これらの手段を適宜組み合わせて用いて精製すればよ
く、その後必要に応じて糖類、例えばマンニトール、サ
ッカロース、ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタ
ミン酸、グリシン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛
血清アルブミン等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理
により精製されたアシルカルニチンエステラーゼの粉体
を得ることができる。
公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いることに
よりさらに精製されたアシルカルニチンエステラーゼを
得ることができる。例えば粗製のアシルカルニチンエス
テラーゼ含有液に硫安、硫酸ナトリウム、リン酸カリウ
ム、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法により本酵素
を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種
のクロマトグラフィー法、電気泳動法あるいは超遠心分
析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて精製すれば
よく、その精製手段としては、目的とするアシルカルニ
チンエステラーゼの性質を利用した手段を用いればよ
く、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に溶解した
後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにDEAE−セル
ロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファロース、DEAE
−セファデックスＡ−50（ファルマシア社製）、DEAE−
トヨパール（東洋曹達社製）等のイオン交換樹脂や、セ
ファデックスＧ−100、Ｇ−75、セファクリルＳ−200等
のゲル濾過剤による分子篩クロマトを行えばよく、また
これらの手段を適宜組み合わせて用いて精製すればよ
く、その後必要に応じて糖類、例えばマンニトール、サ
ッカロース、ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタ
ミン酸、グリシン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛
血清アルブミン等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理
により精製されたアシルカルニチンエステラーゼの粉体
を得ることができる。
以上の如くして得られた本発明アシルカルニチンエス
テラーゼの性状は以下の通りである。
テラーゼの性状は以下の通りである。
（１）酵素作用 下記式に示すように、アシル−Ｌ−カルニチンを加水
分解してＬ−カルニチンと遊離脂肪酸を生成する反応を
触媒する。
分解してＬ−カルニチンと遊離脂肪酸を生成する反応を
触媒する。
アシル−Ｌ−カルニチン＋H2O →脂肪酸＋Ｌ−カルニチン （２）分子量 63,000±7,000 トーソー社製TSKゲルG3000SW（0.75×60cm）による
値、溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）、標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用した。
値、溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）、標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用した。
M.W. 12,400 シトクロムＣ M.W. 32,000 アデニレートキナーゼ M.W. 67,000 エノラーゼ M.W. 142,000 ラクテートデヒドロゲナーゼ M.W. 290,000 グルタメートデヒドロゲナーゼ （３）等電点 pH5.1±0.5 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動により
４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各画
分の酵素活性を測定した。
４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各画
分の酵素活性を測定した。
（４）Km値 100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中で以下に示した各
アシルカルニチンをそれぞれ１×10-5M、２×10-5M、３
×10-5M、５×10-5M、10×10-5M、20×10-5M、40×10-5
Mになるように調製し、それぞれのアシルカルニチンに
対するKm値を測定した。なお、それぞれのアシルカルニ
チンは市販のものを用いるか、Ｌ−カルニチン（シグマ
社製）を用いてBohmer ＆ Bremerの方法〔Biochim.Biop
hys.Acta,152,559−567（1968）〕を用いて自家調製し
た。
アシルカルニチンをそれぞれ１×10-5M、２×10-5M、３
×10-5M、５×10-5M、10×10-5M、20×10-5M、40×10-5
Mになるように調製し、それぞれのアシルカルニチンに
対するKm値を測定した。なお、それぞれのアシルカルニ
チンは市販のものを用いるか、Ｌ−カルニチン（シグマ
社製）を用いてBohmer ＆ Bremerの方法〔Biochim.Biop
hys.Acta,152,559−567（1968）〕を用いて自家調製し
た。
アセチル−Ｌ−カルニチン 約４×10-5M プロピオニル−Ｌ−カルニチン 約３×10-5M ヘキサノイル−Ｌ−カルニチン 約２×10-5M オクタノイル−Ｌ−カルニチン 約２×10-5M デカノイル−Ｌ−カルニチン 約２×10-5M ラウロイル−Ｌ−カルニチン 約２×10-5M ミリストイル−Ｌ−カルニチン 約２×10-5M パルミトイル−Ｌ−カルニチン 約５×10-5M ステアロイル−Ｌ−カルニチン 約５×10-5M （５）基質特異性 100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）中で各々のアシルカ
ルニチンが0.5mMになるように調製し、37℃、10分間の
反応で生成されるＬ−カルニチン量を後述のＬ−カルニ
チン測定法を用いて測定し、比較した。その結果、オク
タノイル−Ｌ−カルニチンに対して最も高い活性を示し
た。また、ラットの肝臓由来のアシルカルニチンエステ
ラーゼはアセチル−Ｌ−カルニチンとプロピオニル−Ｌ
−カルニチンに対して活性を示さないが本発明の酵素は
充分な活性を示した。
ルニチンが0.5mMになるように調製し、37℃、10分間の
反応で生成されるＬ−カルニチン量を後述のＬ−カルニ
チン測定法を用いて測定し、比較した。その結果、オク
タノイル−Ｌ−カルニチンに対して最も高い活性を示し
た。また、ラットの肝臓由来のアシルカルニチンエステ
ラーゼはアセチル−Ｌ−カルニチンとプロピオニル−Ｌ
−カルニチンに対して活性を示さないが本発明の酵素は
充分な活性を示した。
アセチル−Ｌ−カルニチン 17％ プロピオニル−Ｌ−カルニチン 46％ ヘキサノイル−Ｌ−カルニチン 85％ オクタノイル−Ｌ−カルニチン 100％ デカノイル−Ｌ−カルニチン 72％ ラウロイル−Ｌ−カルニチン 60％ ミリストイル−Ｌ−カルニチン 61％ パルミトイル−Ｌ−カルニチン 41％ ステアロイル−Ｌ−カルニチン 11％ （６）至適pH 100mM酢酸緩衝液（pH4.5〜6.0）、100mMリン酸緩衝液
（pH6.5〜80）、100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.
0）、100mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜1
0.0）の各緩衝液中で0.5mMになるようにオクタノイル−
Ｌ−カルニチンを調製し、37℃、10分間の反応の後に生
成されたＬ−カルニチンを測定した。測定した結果は図
１に示す通りであって、pH8.0付近が至適pHであるが、p
H6.5〜9.5までの広い範囲にわたって90％以上の活性を
示した。
（pH6.5〜80）、100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.
0）、100mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜1
0.0）の各緩衝液中で0.5mMになるようにオクタノイル−
Ｌ−カルニチンを調製し、37℃、10分間の反応の後に生
成されたＬ−カルニチンを測定した。測定した結果は図
１に示す通りであって、pH8.0付近が至適pHであるが、p
H6.5〜9.5までの広い範囲にわたって90％以上の活性を
示した。
図１中の説明 酢酸緩衝液 −△− リン酸緩衝液 −○− トリス塩酸緩衝液 −●− グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 −□− （７）pH安定性 本酵素を100mM酢酸緩衝液（pH4.5〜6.0）、100mMリン
酸緩衝液（pH6.5〜8.0）、100mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0〜9.0）、100mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（p
H9.0〜10.0）を用いて0.1U/mlに調製し、60℃、30分間
加熱処理した後の残存活性を測定した。測定した結果は
図２に示す通りであって、pH7.5のリン酸緩衝液からpH
8.5のトリス塩酸緩衝液中で安定であった。また、pH5.5
の酢酸緩衝液からpH10.0のグリシン水酸化ナトリウム緩
衝液までのpHの広い範囲にわたって90％以上の活性を保
持していた。
酸緩衝液（pH6.5〜8.0）、100mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0〜9.0）、100mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（p
H9.0〜10.0）を用いて0.1U/mlに調製し、60℃、30分間
加熱処理した後の残存活性を測定した。測定した結果は
図２に示す通りであって、pH7.5のリン酸緩衝液からpH
8.5のトリス塩酸緩衝液中で安定であった。また、pH5.5
の酢酸緩衝液からpH10.0のグリシン水酸化ナトリウム緩
衝液までのpHの広い範囲にわたって90％以上の活性を保
持していた。
図２中の説明 酢酸緩衝液 −△− リン酸緩衝液 −○− トリス塩酸緩衝液 −●− グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 −□− （８）至適温度 0.5mMオクタノイル−Ｌ−カルニチンを含んだpH8.0の
100mMトリス塩酸緩衝液を用いて50℃、55℃、60℃、65
℃、70℃、75℃の各温度で10分間反応させた後に生成さ
れたＬ−カルニチン量を測定した結果は図３に示す通り
であって70℃で最大の活性を示した。
100mMトリス塩酸緩衝液を用いて50℃、55℃、60℃、65
℃、70℃、75℃の各温度で10分間反応させた後に生成さ
れたＬ−カルニチン量を測定した結果は図３に示す通り
であって70℃で最大の活性を示した。
（９）熱安定性 本酵素を100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を用いて0.
1U/mlに調製し、55℃、60℃、65℃、70℃で30分間加熱
処理をした後の残存活性を測定した結果は図４に示す通
りであって60℃までは安定であった。
1U/mlに調製し、55℃、60℃、65℃、70℃で30分間加熱
処理をした後の残存活性を測定した結果は図４に示す通
りであって60℃までは安定であった。
（10）アシルカルニチンエステラーゼ活性の測定法 ．反応液組成 100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0） 0.5mMオクタノイル−Ｌ−カルニチン ．測定法 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イ
ンキュベイトした後に、適当に希釈した酵素液0.05mlを
添加して37℃で15分間インキュベイトした後に、直ちに
沸騰水浴中で15秒間インキュベイトして反応を停止し、
被検液とする。生成されたＬ−カルニチンを下記のＬ−
カルニチンの測定法を用いて測定し、アシルカルニチン
エステラーゼの活性を求める。
ンキュベイトした後に、適当に希釈した酵素液0.05mlを
添加して37℃で15分間インキュベイトした後に、直ちに
沸騰水浴中で15秒間インキュベイトして反応を停止し、
被検液とする。生成されたＬ−カルニチンを下記のＬ−
カルニチンの測定法を用いて測定し、アシルカルニチン
エステラーゼの活性を求める。
．計算式 21.7;分子吸光度係数cm2/μmole 15;反応時間 .L−カルニチンの測定法（以下、Ｌ−カルニチン測定
法Ａと略す） イ反応液組成 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0） 1mM NAD+ 5U ジアフォラーゼ（東洋醸造社製） 15U Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ （アルカリゲネス・エスピーNo.981由来、 東洋醸造社製） 100mM KCl 0.025％ NBT（和光純薬工業社製） 0.5％ ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオ
レ エート（和光純薬工業社製） ロ測定法 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イ
ンキュベイトした後に、被検液0.05mlを添加し、２分間
インキュベイトした後に0.1N塩酸2mlを添加しA550nmを
測定した吸光度A1を測定する。被検液を添加しないで同
様にしてブランクA0を求める。
法Ａと略す） イ反応液組成 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0） 1mM NAD+ 5U ジアフォラーゼ（東洋醸造社製） 15U Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ （アルカリゲネス・エスピーNo.981由来、 東洋醸造社製） 100mM KCl 0.025％ NBT（和光純薬工業社製） 0.5％ ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオ
レ エート（和光純薬工業社製） ロ測定法 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イ
ンキュベイトした後に、被検液0.05mlを添加し、２分間
インキュベイトした後に0.1N塩酸2mlを添加しA550nmを
測定した吸光度A1を測定する。被検液を添加しないで同
様にしてブランクA0を求める。
ハ生成されたＬ−カルニチン量の計算式 〔発明の効果〕 本発明のアシルカルニチンエステラーゼはラット肝臓
由来のものと比べて少なくともアセチル−Ｌ−カルニチ
ン及びプロポオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選
ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチンに、基質特異性を有
するという特徴を有し、かつ種々のアシル−Ｌ−カルニ
チンに対するKm値も低い上に安定性にも優れているの
で、これを用いる優れたアシルカルニチン測定法を提供
することができた。また、本発明により、微生物由来で
あり、熱安定性に優れていることから精製も容易であ
り、大量培養により容易に充分な量を供給できる有利な
アシルカルニチンエステラーゼの製造法を提供できた。
由来のものと比べて少なくともアセチル−Ｌ−カルニチ
ン及びプロポオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選
ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチンに、基質特異性を有
するという特徴を有し、かつ種々のアシル−Ｌ−カルニ
チンに対するKm値も低い上に安定性にも優れているの
で、これを用いる優れたアシルカルニチン測定法を提供
することができた。また、本発明により、微生物由来で
あり、熱安定性に優れていることから精製も容易であ
り、大量培養により容易に充分な量を供給できる有利な
アシルカルニチンエステラーゼの製造法を提供できた。
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、
これにより本発明を限定するものではない。
これにより本発明を限定するものではない。
実施例１ アルカリゲネス エスピーNo.981の培養 KH2PO40.2％、K2HPO40.4％、MgSO4・7H2O0.05％、FeS
O4・7H2O0.002％、MnSO4・nH2O0.002％、酵母エキス
（極東製薬社製）0.1％を含む液体培地（pH7.0）100ml
を500ml容三角フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅
菌した後に、濾過滅菌しておいた10％オクタノイル−DL
−カルニチン（シグマ社製）を5ml無菌的に添加し、こ
れに、アルカリゲネス エスピーNo.981の１白金耳を接
種し28℃、120r.p.m.の振とう培養器で72時間培養し
た。三角フラスコ５本で培養し、培養物470mlを得た。
O4・7H2O0.002％、MnSO4・nH2O0.002％、酵母エキス
（極東製薬社製）0.1％を含む液体培地（pH7.0）100ml
を500ml容三角フラスコに分注し、120℃、20分間加熱滅
菌した後に、濾過滅菌しておいた10％オクタノイル−DL
−カルニチン（シグマ社製）を5ml無菌的に添加し、こ
れに、アルカリゲネス エスピーNo.981の１白金耳を接
種し28℃、120r.p.m.の振とう培養器で72時間培養し
た。三角フラスコ５本で培養し、培養物470mlを得た。
実施例２ 本発明アシルカルニチンエステラーゼの分離精製 470ml分の培養液を遠心分離して、集菌し、100mMトリ
ス緩衝液（pH8.0）50mlに懸濁した。これを超音波破砕
器（クボタ社製）を用いてホモジネイトした後に15,000
r.p.m.で10分間遠心分離して上清45ml（0.3U/ml）を得
た。得られた粗酵素液を60℃、30分間加熱処理した後に
15,000r.p.m.で上清44ml（0.3U/ml）を得た。得られた
酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したD
EAE−セファロースCL−6B（ファルマシア社製）20mlの
カラムに通し、0.1M KClを含んだ50mMトリス緩衝液（pH
8.0）100mlを流した後に、0.25M KClを含んだ50mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、酵素液25ml（0.47U/m
l）を得た。得られた酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液（p
H8.0）５に対して一晩、５℃で透析し酵素液28ml（0.
41U/ml、回収率85％）を得た。次いで、その20mlを凍結
乾燥して粉末80mg（0.1U/mg）を得た。
ス緩衝液（pH8.0）50mlに懸濁した。これを超音波破砕
器（クボタ社製）を用いてホモジネイトした後に15,000
r.p.m.で10分間遠心分離して上清45ml（0.3U/ml）を得
た。得られた粗酵素液を60℃、30分間加熱処理した後に
15,000r.p.m.で上清44ml（0.3U/ml）を得た。得られた
酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したD
EAE−セファロースCL−6B（ファルマシア社製）20mlの
カラムに通し、0.1M KClを含んだ50mMトリス緩衝液（pH
8.0）100mlを流した後に、0.25M KClを含んだ50mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、酵素液25ml（0.47U/m
l）を得た。得られた酵素液を50mMトリス塩酸緩衝液（p
H8.0）５に対して一晩、５℃で透析し酵素液28ml（0.
41U/ml、回収率85％）を得た。次いで、その20mlを凍結
乾燥して粉末80mg（0.1U/mg）を得た。
参考例１ Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産のためのアルカリ
ゲネス エスピーNo.981の培養 DL−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、KH2PO40.2
％、K2HPO40.4％、MgSO4・7H2O0.05％、FeSO4・7H2O0.0
02％、MnSO4・nH2O0.001％を含む液体培地（pH7.0）100
mlを500ml容三角フラスコに分注し、120℃で20分間加熱
滅菌した後、これにアルカリゲネス エスピーNo.981の
１白金耳を接種し、28℃で120r.p.m.の振とう培養器で4
0時間培養して種母95ml（酵素活性1.2U/ml）を得た。
ゲネス エスピーNo.981の培養 DL−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、KH2PO40.2
％、K2HPO40.4％、MgSO4・7H2O0.05％、FeSO4・7H2O0.0
02％、MnSO4・nH2O0.001％を含む液体培地（pH7.0）100
mlを500ml容三角フラスコに分注し、120℃で20分間加熱
滅菌した後、これにアルカリゲネス エスピーNo.981の
１白金耳を接種し、28℃で120r.p.m.の振とう培養器で4
0時間培養して種母95ml（酵素活性1.2U/ml）を得た。
一方、DL−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、酵母
エキス（極東製薬社製）0.1％、K2HPO40.054％、KH2PO4
0.746％、MgSO4・7H2O0.05％、CaCl2・2H2O0.002％、Fe
SO4・7H2O0.002％、MnSO4・nH2O0.002％およびディスフ
ォームCB442（日本油脂社製）1ml/を含む液体培地（p
H7.0）20を、30容ジャーファーメンターに仕込み、
加熱滅菌した後、これに前記で得た種母90mlを移植し、
培養温度28℃、通気量20／分、内圧0.4kg/cm2、撹拌
速度200r.p.m.、培養時間27時間の培養条件で通気撹拌
培養し、培養物19（酵素活性3.0U/ml）を得た。
エキス（極東製薬社製）0.1％、K2HPO40.054％、KH2PO4
0.746％、MgSO4・7H2O0.05％、CaCl2・2H2O0.002％、Fe
SO4・7H2O0.002％、MnSO4・nH2O0.002％およびディスフ
ォームCB442（日本油脂社製）1ml/を含む液体培地（p
H7.0）20を、30容ジャーファーメンターに仕込み、
加熱滅菌した後、これに前記で得た種母90mlを移植し、
培養温度28℃、通気量20／分、内圧0.4kg/cm2、撹拌
速度200r.p.m.、培養時間27時間の培養条件で通気撹拌
培養し、培養物19（酵素活性3.0U/ml）を得た。
参考例２ Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの分離精製 参考例１で得た培養物19を遠心分離で集菌し、これ
に0.1％リゾチームおよび15mMエチレンジアミン四酢酸
ジナトリウム塩（EDTA・2Na）を含む40mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.0）５を加え、37℃で１時間可溶化処理し
た。処理液を遠心分離して沈澱物を除去し、上清4500ml
（比活性10.3U/ml）を得た。この上清に硫安1100gを溶
解し、生じた沈澱物を遠心分離して除去し、得られた上
清に再び硫安700gを溶解した。この処理液を遠心分離し
て得た沈澱物40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）500mlで溶
解した溶液（比活性84.1U/ml）を40mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た酵素液
を40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE−
セファロースCL−6B（ファルマシア社製）200mlのカラ
ムに通し、0.1M KClを含む40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0）１を流した後、次いで0.3M KClを含む40mMトリス
塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、酵素液300ml（比活性12
0.5U/ml）を得た。得られた酵素液を40mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た酵
素液を40mMトリス塩酸緩衝液で緩衝化したハイドロキシ
ルアパタイト（KOKEN社製）100mlのカラムに通し、40mM
トリス塩酸緩衝液（pH8.0）200mlを流した後、2mMリン
酸緩衝液（pH7.0）100mlで溶出し、酵素液100ml（比活
性331U/ml）を得た。得られた酵素液を20mMリン酸緩衝
液（pH7.5）５に対して透析し、酵素液95ml（比活性3
31U/ml、回収率67.8％）を得た。
に0.1％リゾチームおよび15mMエチレンジアミン四酢酸
ジナトリウム塩（EDTA・2Na）を含む40mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.0）５を加え、37℃で１時間可溶化処理し
た。処理液を遠心分離して沈澱物を除去し、上清4500ml
（比活性10.3U/ml）を得た。この上清に硫安1100gを溶
解し、生じた沈澱物を遠心分離して除去し、得られた上
清に再び硫安700gを溶解した。この処理液を遠心分離し
て得た沈澱物40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）500mlで溶
解した溶液（比活性84.1U/ml）を40mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た酵素液
を40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE−
セファロースCL−6B（ファルマシア社製）200mlのカラ
ムに通し、0.1M KClを含む40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0）１を流した後、次いで0.3M KClを含む40mMトリス
塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、酵素液300ml（比活性12
0.5U/ml）を得た。得られた酵素液を40mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た酵
素液を40mMトリス塩酸緩衝液で緩衝化したハイドロキシ
ルアパタイト（KOKEN社製）100mlのカラムに通し、40mM
トリス塩酸緩衝液（pH8.0）200mlを流した後、2mMリン
酸緩衝液（pH7.0）100mlで溶出し、酵素液100ml（比活
性331U/ml）を得た。得られた酵素液を20mMリン酸緩衝
液（pH7.5）５に対して透析し、酵素液95ml（比活性3
31U/ml、回収率67.8％）を得た。
本精製Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ中のNADHオキ
シダーゼ活性は0.0001U/ml以下であった。
シダーゼ活性は0.0001U/ml以下であった。
以上の如くして得られたＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼの性状は以下の通りである。
ーゼの性状は以下の通りである。
（１）酵素作用 下記式に示すように、少なくともＬ−カルニチンおよ
びNADから３−デヒドロカルニチンおよびNADHを生成す
る反応を触媒する。
びNADから３−デヒドロカルニチンおよびNADHを生成す
る反応を触媒する。
（２）基質特異性 Ｌ−カルニチン 100％ コリン ０ グリシンベタイン ０ グルコース ０ リジン ０ （３）分子量 51000±6000 トーソー社製TSKゲルG3000SW（0.75×60cm）による
値、溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）、標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用。
値、溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）、標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用。
M.W. 12,400 シトクロムＣ M.W. 32,000 アデニレイトキナーゼ M.W. 67,000 エノラーゼ M.W. 142,000 ラクテートデヒドロゲナーゼ M.W. 290,000 グルタメートデヒドロゲナ （４）等電点 pH5.3±0.6 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によ
り４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各
画分の酵素活性を測定した。
り４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各
画分の酵素活性を測定した。
（５）Km値 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）、 5Uジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT（和光純薬工業社製）、 １％Tween80（和光純薬工業社製）、 50mM Ｌ−カルニチン を含む反応液中でNAD+の濃度を変化させて、NAD+に対す
るKm値を測定した結果では、0.141mMという値を示し
た。
るKm値を測定した結果では、0.141mMという値を示し
た。
一方、前記反応液中で50mM Ｌ−カルニチンの代わり
に1mM NAD+を添加し、Ｌ−カルニチンの濃度を変化させ
てＬ−カルニチンに対するKm値を測定した結果では、9.
3mMという値を示した。
に1mM NAD+を添加し、Ｌ−カルニチンの濃度を変化させ
てＬ−カルニチンに対するKm値を測定した結果では、9.
3mMという値を示した。
（６）熱安定性 本酵素液（1.00U/ml）を20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0）で調製し、１時間の加熱処理後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果、酵素活性は
少なくとも45℃までは安定であった。
0）で調製し、１時間の加熱処理後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果、酵素活性は
少なくとも45℃までは安定であった。
（７）至適温度 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）を用い、５℃におけ
る２週間の保存安定性を測定した。その結果、前記３株
のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ産生公知属菌より得
られたＬ−カルニチンデヒドロエナーゼは、１週間後の
残存活性が53〜40％、２週間後には残存活性が45％以下
になっている。特にシュードモナス アエルギノーサIF
O13130由来の酵素は21％と特に安定性が悪いものであっ
た。これに対し、本発明のＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼは、１週間後の残存活性が96％で、２週間後の残存
活性は82％であり、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼは
産生公知属菌由来の酵素より格段に安定性の良い性質を
有している。また、この保存安定性試験において0.05mM
のNAD+を共存させた時には、その残存活性が１週間後で
は99.7％、２週間後では95.1％とより安定性が良くなっ
ており、NAD+の安定性効果があることが分かった。
る２週間の保存安定性を測定した。その結果、前記３株
のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ産生公知属菌より得
られたＬ−カルニチンデヒドロエナーゼは、１週間後の
残存活性が53〜40％、２週間後には残存活性が45％以下
になっている。特にシュードモナス アエルギノーサIF
O13130由来の酵素は21％と特に安定性が悪いものであっ
た。これに対し、本発明のＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼは、１週間後の残存活性が96％で、２週間後の残存
活性は82％であり、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼは
産生公知属菌由来の酵素より格段に安定性の良い性質を
有している。また、この保存安定性試験において0.05mM
のNAD+を共存させた時には、その残存活性が１週間後で
は99.7％、２週間後では95.1％とより安定性が良くなっ
ており、NAD+の安定性効果があることが分かった。
（11）Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの酵素活性測定
法 反応液組成 50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）、 1mM NAD+、 5Uジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT（和光純薬工業社製）、 100mM塩化カリウム、 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオオエ
ート（和光純薬工業社製）、 100mM L−カルニチン（シグマ社製）、 酵素活性測定 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イ
ンキュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02mlを
添加して撹拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の
後に、0.1N塩酸2.0mlを添加して撹拌し、反応を停止し
て、A550nmを測定して吸光度A1を求める。上記反応液よ
りＬ−カルニチンを除いた反応液を用いて同様の測定を
行い、その吸光度A0を求める。
法 反応液組成 50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）、 1mM NAD+、 5Uジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT（和光純薬工業社製）、 100mM塩化カリウム、 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオオエ
ート（和光純薬工業社製）、 100mM L−カルニチン（シグマ社製）、 酵素活性測定 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イ
ンキュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02mlを
添加して撹拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の
後に、0.1N塩酸2.0mlを添加して撹拌し、反応を停止し
て、A550nmを測定して吸光度A1を求める。上記反応液よ
りＬ−カルニチンを除いた反応液を用いて同様の測定を
行い、その吸光度A0を求める。
計算式 21.7;分子吸光係数cm2/μmole Z;希釈倍数 参考例３ 本発明アシルカルニチンエステラーゼを用いたオクタ
ノイル−Ｌ−カルニチンの加水分解と水酸化カリウム溶
液を用いた加水分解の比較。
ノイル−Ｌ−カルニチンの加水分解と水酸化カリウム溶
液を用いた加水分解の比較。
0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mMになるように50m
Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）でオクタノイル−Ｌ−カル
ニチンを調製し、それぞれ1mlを小試験管に分注し、37
℃、５分間インキュベイトした後に実施例２の酵素液
（0.41U/ml）を0.1ml添加し15分間インキュベイトした
後に予め1mlを小試験管で37℃にインキュベイトしてお
いたＬ−カルニチンの測定法Ａの反応液に0.05mlずつ添
加し２分間インキュベイトした後に0.1N塩酸溶液2mlを
添加し、A550nmを測定した。また同様のオクタノイル−
Ｌ−カルニチン溶液1mlに10Nの水酸化カリウム1mlを添
加し、37℃、２時間インキュベイトした後に、10Nの塩
酸1mlを添加して中和し、その0.15mlをＬ−カルニチン
の測定法Ａの反応液1mlに添加し、同様にしてA550nmを
測定した。その結果を図５に示した。本酵素によって、
オクタノイル−Ｌ−カルニチンが完全に加水分解されて
いるのがわかる。
Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）でオクタノイル−Ｌ−カル
ニチンを調製し、それぞれ1mlを小試験管に分注し、37
℃、５分間インキュベイトした後に実施例２の酵素液
（0.41U/ml）を0.1ml添加し15分間インキュベイトした
後に予め1mlを小試験管で37℃にインキュベイトしてお
いたＬ−カルニチンの測定法Ａの反応液に0.05mlずつ添
加し２分間インキュベイトした後に0.1N塩酸溶液2mlを
添加し、A550nmを測定した。また同様のオクタノイル−
Ｌ−カルニチン溶液1mlに10Nの水酸化カリウム1mlを添
加し、37℃、２時間インキュベイトした後に、10Nの塩
酸1mlを添加して中和し、その0.15mlをＬ−カルニチン
の測定法Ａの反応液1mlに添加し、同様にしてA550nmを
測定した。その結果を図５に示した。本酵素によって、
オクタノイル−Ｌ−カルニチンが完全に加水分解されて
いるのがわかる。
図５中 本発明アシルカルニチンエステラーゼを用いた値−○− 水酸化カリウムを用いた値 −△− 理論値 −●− 参考例４ ラット肝臓からのアシルカルニチンエステラーゼの精製 アルカリゲネス属細菌由来の本発明アシルカルニチン
エステラーゼと比較するために、S.Mahadevan ＆ F.Sau
erらの方法〔J.Biol.Che.,244 No.16,4448−4453（196
9）〕によりラットの肝臓より酵素の精製を行った。50g
の肝臓からホモジネイト、DEAE−セルロース（Whatman
DE−52）、セファデックスＧ−200（ファルマシア社
製）を用いて精製し、凍結乾燥品101.6mg（0.0364U/m
g）を得た。
エステラーゼと比較するために、S.Mahadevan ＆ F.Sau
erらの方法〔J.Biol.Che.,244 No.16,4448−4453（196
9）〕によりラットの肝臓より酵素の精製を行った。50g
の肝臓からホモジネイト、DEAE−セルロース（Whatman
DE−52）、セファデックスＧ−200（ファルマシア社
製）を用いて精製し、凍結乾燥品101.6mg（0.0364U/m
g）を得た。
参考例５ 参考例４の酵素を用いてアセチル−Ｌ−カルニチン、
プロピオニル−Ｌ−カルニチン、オクタノイル−Ｌ−カ
ルニチン、デカノイル−Ｌ−カルニチン、パルミトイル
−Ｌ−カルニチンに対する相対活性比とKm値を測定した
結果を表１に示した。アセチル−Ｌ−カルニチンおよび
プロピオニル−Ｌ−カルニチンの低級アシル−Ｌ−カル
ニチンには活性を示さず、他の中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
−カルニチンに対して作用し、そのKm値はすべて文献通
りに10-3M台の大きな値を示した。
プロピオニル−Ｌ−カルニチン、オクタノイル−Ｌ−カ
ルニチン、デカノイル−Ｌ−カルニチン、パルミトイル
−Ｌ−カルニチンに対する相対活性比とKm値を測定した
結果を表１に示した。アセチル−Ｌ−カルニチンおよび
プロピオニル−Ｌ−カルニチンの低級アシル−Ｌ−カル
ニチンには活性を示さず、他の中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
−カルニチンに対して作用し、そのKm値はすべて文献通
りに10-3M台の大きな値を示した。
実施例３ 参考例４の酵素を用いて熱安定性の検討を行った。
100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を用いて0.1U/mlに
調製し、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃で30分間
加熱処理をした後の残存活性を測定した結果は図６に示
した通りであって、50℃ですでに61％まで活性は低下し
ている。
調製し、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃で30分間
加熱処理をした後の残存活性を測定した結果は図６に示
した通りであって、50℃ですでに61％まで活性は低下し
ている。
図６中 ラット肝臓由来 −●− 本発明酵素 −○− 実施例４ 実施例２の本発明酵素と参考例４のラット肝臓由来の
酵素の添加量を変えて0.02mMのオクタノイル−Ｌ−カル
ニチンを含んだ100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）1mlを3
7℃、15分間の反応で加水分解したときの生成されるＬ
−カルニチン量を測定した結果は図７に示した通りで本
発明酵素は0.01U/mlでほぼ反応は完了しているが、ラッ
ト肝臓由来の酵素は0.6U/mlでも反応は完了していな
い。
酵素の添加量を変えて0.02mMのオクタノイル−Ｌ−カル
ニチンを含んだ100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）1mlを3
7℃、15分間の反応で加水分解したときの生成されるＬ
−カルニチン量を測定した結果は図７に示した通りで本
発明酵素は0.01U/mlでほぼ反応は完了しているが、ラッ
ト肝臓由来の酵素は0.6U/mlでも反応は完了していな
い。
図１は本発明アシルカルニチンエステラーゼの至適pHを
示す図面であり、図２は本発明アシルカルニチンエステ
ラーゼのpH安定性を示す図面であり、図３は本発明アシ
ルカルニチンエステラーゼの至適温度を示す図面であ
り、図４は本発明アシルカルニチンエステラーゼの熱安
定性を示す図面である。図５は、本発明アシルカルニチ
ンエステラーゼ（○）及び水酸化カリウム（△）のオク
タノイル−Ｌ−カルニチンの加水分解能を示す図面であ
る。図６はラット肝臓由来のアシルカルニチンエステラ
ーゼ（●）および本発明アシルカルニチンエステラーゼ
（○）の熱安定性を示す図面である。図７はラット肝臓
由来のアシルカルニチンエステラーゼ（●）と本発明ア
シルカルニチンエステラーゼ（○）のオクタノイル−Ｌ
−カルニチンに対する活性を示す図面である。
示す図面であり、図２は本発明アシルカルニチンエステ
ラーゼのpH安定性を示す図面であり、図３は本発明アシ
ルカルニチンエステラーゼの至適温度を示す図面であ
り、図４は本発明アシルカルニチンエステラーゼの熱安
定性を示す図面である。図５は、本発明アシルカルニチ
ンエステラーゼ（○）及び水酸化カリウム（△）のオク
タノイル−Ｌ−カルニチンの加水分解能を示す図面であ
る。図６はラット肝臓由来のアシルカルニチンエステラ
ーゼ（●）および本発明アシルカルニチンエステラーゼ
（○）の熱安定性を示す図面である。図７はラット肝臓
由来のアシルカルニチンエステラーゼ（●）と本発明ア
シルカルニチンエステラーゼ（○）のオクタノイル−Ｌ
−カルニチンに対する活性を示す図面である。
Claims (3)
- 【請求項１】少なくともアセチル−Ｌ−カルニチンおよ
びプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれ
た低級アシル−Ｌ−カルニチン並びに長鎖アシル−Ｌ−
カルニチンであるパルミトイル−Ｌ−カルニチンに基質
特異性を有し、当該低級乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチ
ンの１モルと水分子の１モルから１モルの脂肪酸と１モ
ルのＬ−カルニチンを生成する反応を触媒し、下記の理
化学的性質を有する低級乃至長鎖アシルカルニチンエス
テラーゼ。 （１）分子量:63000±7000（ゲル濾過法） （２）等電点:pH5.1±0.5 （３）Km値:4×10-5M（アセチル−Ｌ−カルニチンに対
し）、３×10-5M（プロピオニル−Ｌ−カルニチンに対
し）、３×10-5M（パルミトイル−Ｌ−カルニチンに対
し） （４）至適pH:pH8付近 （５）pH安定性:60℃、30分間の条件において、少なく
ともpH7.5〜8.5で安定である （６）至適温度:pH8.0の100mMトリス塩酸緩衝液条件に
おいて、70℃付近で最大活性を有する - 【請求項２】アルカリゲネス属に属する低級乃至長鎖ア
シルカルニチンエステラーゼ生産菌を培地にて培養し、
得られた培養物から低級乃至長鎖アシルカルニチンエス
テラーゼを採取することを特徴とする請求項１記載のア
シルカルニチンエステラーゼの製造法。 - 【請求項３】アルカリゲネス属に属する低級乃至長鎖ア
シルカルニチンエステラーゼ生産菌が、アルカリゲネス
・エスピーNo.981〔微工研条寄第2570号（FERM BP−257
0）〕である請求項２記載のアシルカルニチンエステラ
ーゼの製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2270784A JP2684238B2 (ja) | 1990-10-09 | 1990-10-09 | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 |
| EP91309212A EP0480676B1 (en) | 1990-10-09 | 1991-10-08 | Acyl carnitine esterase, production thereof and method for analyzing acyl carnitines |
| DE69118641T DE69118641T2 (de) | 1990-10-09 | 1991-10-08 | Acyl-carnitin-Esterase, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Analyse von Acyl-carnitinen |
| AT91309212T ATE136584T1 (de) | 1990-10-09 | 1991-10-08 | Acyl-carnitin-esterase, verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur analyse von acyl- carnitinen |
| US07/774,221 US5385829A (en) | 1990-10-09 | 1991-10-09 | Method of assaying for acyl-L-carnitines and short-chain acyl-carnitines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2270784A JP2684238B2 (ja) | 1990-10-09 | 1990-10-09 | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 |
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|---|---|---|---|
| JP9049985A Division JP2827002B2 (ja) | 1997-03-05 | 1997-03-05 | アシルカルニチンの測定法 |
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| JPH04148681A JPH04148681A (ja) | 1992-05-21 |
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| JP2270784A Expired - Fee Related JP2684238B2 (ja) | 1990-10-09 | 1990-10-09 | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 |
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