JPH04148681A - アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 - Google Patents

アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法

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JPH04148681A JP2270784A JP27078490A JPH04148681A JP H04148681 A JPH04148681 A JP H04148681A JP 2270784 A JP2270784 A JP 2270784A JP 27078490 A JP27078490 A JP 27078490A JP H04148681 A JPH04148681 A JP H04148681A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床生化学検査、食品検査などにおけるアシ
ル−Ｌ−カルニチンの測定に有用な新規アシルカルニチ
ンエステラーゼ、その製造法およびそれを用いたアシル
−Ｌ−カルニチンの測定法に関する。
〔従来の技術〕
Ｌ−カルニチンは、ビタミンロアとも呼ばれており、生
体内において、脂肪酸のミトコンドリア膜内への輸送に
必須の物質である。一方、生体内にはＬ−カルニチンの
アシル体であるアシル−し−カルニチンも存在しており
、血液中のアシル−Ｌ−カルニチン量を測定することは
生体内筋肉のエネルギー障害の判定のためのミトコンド
リアの機能障害のモニタリングなどに極めて重要であり
、また尿中にもアシル−Ｌ−カルニチンは排出されてい
る。
従来、アシル−し−カルニチンは、被検液中のアシル−
Ｌ−カルニチンをアルカリを用いて加水分解し、生成す
るＬ−カルニチンを定量することにより測定されていた
。このときの加水分解の条件としてはＰｅａｒｓｏｎら
の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＢｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　　Ｖｏｌ、１４．　６２１（１９６９））　、Ｂｉｅ
ｂｅｒらの方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、７２．２７６（１９８１）　］、
Ｐａｃｅらの方法［Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　２４゜
３２（１９７８））などがある。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかしながら、これらの加水分解条件は、すべて高濃度
のアルカリ溶液（水酸化カリウム溶液）を加え３０分間
以上加水分解した後に酸で中和して被検液としているた
めに、危険である上に時間がかかりサンプルが希釈され
てしまうという大きな欠点を有していた。
かかる欠点を克服するためには、酵素法、すなわちアシ
ルカルニチンエステラーゼの利用が考えられる。アシル
カルニチンエステラーゼとしてはラットの肝臓由来のも
のが知られている〔Ｓ。
Ｍａｈａｄｅｖａｎ　＆　Ｆ、　５ａｕｅｒ、　Ｊ、　
Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍｏ、　２４４゜４４４８−４４５
３（１９６９）　］。しかし、当該アシルカルニチンエ
ステラーゼは、ヒト血清中に多量に存在するアセチル−
Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンに
対して全く活性を示さないばかりか、例えばデカノイル
−Ｌ−カルニチンに対して３．２Ｘ　１０−５Ｍ、バル
ミトイル−Ｌ−カルニチンに対して５　ｘ　１Ｇ−５Ｍ
と長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに対しても高いＫｍ値を
示しているために完全に加水分解するには多量の酵素が
必要であった。
さらにこのように多量の酵素が必要であるにもかかわら
ずラットの肝臓５０ｇ（約１匹分）からは、たかだか３
．７ｕの酵素が採取できたにすぎないものであった。
従って、低級アシル−Ｌ−カルニチンに対して活性を示
し、基質に対するにｍ値の低い、充分な安定性を有する
アシルカルニチンエステラーゼおよび生体中のアシル−
Ｌ−カルニチンの感度の高い定量法の關発が望まれてい
た。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者らは、上記要件を満たすアシルカルニ
チンエステラーゼを、種々の微生物培養物中からスクリ
ーニングすることに着目して種々研究を続けた結果、ア
ルカリ土類金属に属する微生物が、低級アシル−し−カ
ルニチンに対して活性を示し、活性の高いアシルカルニ
チンエステラーゼを生産すること、さらにこれを用いれ
ば検体中のアシル−Ｌ−カルニチンの高感度定量が可能
となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は少なくともアセチル−し−カルニチ
ンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より
選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異性を有
し、当該低級アシル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子
の１モルから１モルの低級脂肪酸と１モルのＬ−カルニ
チンを生ａする反応を触媒するアシルカルニチンエステ
ラーゼを提供するものである。また本発明は、アルカリ
土類金属に属するアシルカルニチンエステラーゼ生産菌
を培地に培養し、得られた培養物からアシルカルニチン
エステラーゼを採取することを特徴とするアシルカルニ
チンエステラーゼの製造法を提供するものである。さら
には、本発明アシルカルニチンエステラーゼを用いて被
検液中のアシル−Ｌ−カルニチンを加水分解することに
より被検液中のアシル−Ｌ−カルニチンを測定する方法
を提供するものである。
本発明のアシルカルニチンエステラーゼ生産菌としては
、アルカリ土類金属に属し、アシルカルニチンエステラ
ーゼ生産能を有するものであれば特に限定されないが、
例えば本発明者らが分離したに９８１菌株が挙げられ、
この菌株は本発明に最も有効に使用される菌株の一例で
あって、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。
尚、本菌株の同定に当たっては、同定実験は医学細菌同
定の手引き（第２版） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
（３巻）に準じて行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ　ｓ　
Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（８版）　、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１（１９８４）、同誌。
Ｖｏｌ、　２（１９８６）などと対比して同定を行った
。
（ａ）形態的特徴 普通寒天培地上、１８〜２４時間、２８〜３０℃で培養
し、観察した所見は次の通りである。
端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で、単独
、二連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。大きさは
０．４〜０．６Ｘ１．２〜２．５趨で周毛で運動する。
多形性なし。
（ハ）各培地における生育状態 各種培地上で、１８〜２４時間、２８〜３０℃で培養し
、観察した所見は次の通りである。
■普通寒天斜面培地 生育良好で線状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）に生育する。湿潤
で光沢を有する。黄土色を呈するが、可溶性色素は産生
乙ない。
■普通寒天平面培地 円型、丘状（ｃｏｎｖｅｘ）、金縁の集落を形成する。
表面は滑らかで湿潤。黄土色ないし淡黄上包を呈する。
可溶性色素は産生じない。
■液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。長時間（４０時間以上）培
養では菌膜を形成する。
■肛Ｐミルク培地 ４〜５日後、アルカリ１こなる。
（Ｃ）生理的性質〔＋；陽性、（＋） 陰性〕 ダラム染色 に叶反応 カプセル形成 抗産生染色 ；弱陽性； 好気での生育 嫌気での生育 生育温度　４１℃ ３７℃ １５℃ 耐塩性　　０％ ５％ ７％ 生育ｐ）ｌ　　４．６ ５．４ ８．９ ９．８ ゼラチンの分解 澱粉の分解 カゼインの分解 エスクリンの分解 セルロースの分解 チロシンの分解 カタラーゼ産生 オキシダーゼ産生 ＬＶ反応 ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） インドール産生 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） アセトイン産生（Ｋ、ＨＰＯ，） アセトイン産生（ＮａＣｆ） ＭＲテスト 硝酸塩還元テスト ガス検出 ＮＯ２−の検出 Ｎ０ｓ−の検出 シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 グルコースよりガスの産生 各種糖類より酸の産生 （＋） アドニトール しく＋）アラビノース セロビオース ヅルシトール メン・エリスリトール フラクトース ガラクトース グルコース グリセリン イノシトール イヌリン ラクトース マルトース マンニトール マンノース メレジトース メリビオース ラフィノース Ｌ（＋）ラムノース ローリボース （＋） （＋） サリシン し−ソルボース ソルビトール 澱粉 サツカロ−ス トレハロース キシロース ＋ （６）炭素源の利用性 炭素源５　ｇ　５ＮａＣ１５ｇ　５Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２
ｏ　ｏ、　２ｇ　。
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１，Ｏｇ、蒸留水１１を含む液体培地
（ｐＨ７，０）での各炭素源の利用性を試験した結果は
次の通りである。
グルコース　　　　　　　　　　　　＋Ｌ（＋）アラビ
ノース フラクトース　　　　　　　　　　＋ マンニトール マンノース　　　　　　　　　　　　＋グルコネート　
　　　　　　　　　＋ アセテート　　　　　　　　　　　＋ アジベート ピメレート　　　　　　　　　　　　＋スベレート　　
　　　　　　　　　＋ タートレート　　　　　　　　　　　＋以上の通り、本
菌株の主性状は、ダラム陰性の桿状細菌で、周毛で運動
、カタラーゼ、オキシダーゼを産生じ、ペプトンを含む
培地（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ）ではグルコースより
酸を産生じすいが、グルコースを酸化的に分解し、酸を
産生ずる。芽胞は形成せず、多形性なし。好気性である
。
ダラム陰性桿菌で好気性、周毛で運動する菌属は、アル
カリ土類金属、クロモバクテリウム属およびフラボバク
テリウム属の３属である。クロモバクテリウム属は紫色
、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生ずるが、本
菌株は色素を産生じないことから判断してアルカリ土類
金属に属する菌株であることは明らかである。
そこで、本菌株がアルカリ土類金属のどの種に属するか
否かを同定するため、８ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、　Ｖａｔ、［１９８４）に記載されている３菌種、
即ち＾ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　（以下
、「Ｆ」と略記することがある）、＾１ｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　５ｕｂｓｐ。
ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　　（以下、ｒＤＪと略記
することがある）および＾ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｄｅ
ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　５ｕｂｓｐ。
ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ（以下「ｘ」と略記すること
がある）と対比した結果は、次の通りである。
尚、ＦＳＤおよびＸで示される「＋」は９０％以上の陽
性率、「−」は９０％以上が陰性率、ｒｄＪは「十」で
も「−」でもどちらでもないことを示す。
オキシダーゼ産生 硝酸塩還元 亜硝酸塩還元 ゼラチンの分解 ＯＦ培地での酸産生 キシロース グルコース ペプトン不合培地での酸産生 ＦＤＸ　　重囲 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ 一十 ＋ キシロース　　　　　　　　　　　＋ グルコース　　　　　　　　　　　＋　＋炭素源の利用
性 グルコース　　　　　　　−　−十＋ しく＋）アラビノース フラクトース　　　　　　−−ｄ　　十マンニトール　
　　　　　−− マンノース　　　　　　　−−ｄ＋ グルコネート　　　　　　−十千十 アセテート　　　　　　　＋　＋＋＋ 以上対比した結果によれば、本菌株Ｎ［Ｌ９８１の諸性
状は＾ｌｃａｒｉｇｅｎｅｓ　５ｕｂｓｐ、　ｘｙｌｏ
ｓｏｘｉｄａｎｓと一致した点が多いが、叶培地での酸
産生能およびキシロースより酸を産生しない点での性状
が異なる。
よって、本菌株を公知のものと区別するため、アルカリ
ゲネス・エスピー（＾ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、）
　ｋｇ８１と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所
ニ受託番号微工研条寄第２５７０号（ＦｆｌＲＭ　ＩＩ
ＩＰ−２５７０）　トして寄託した。
本発明アシルカルニチンエステラーゼを製造するには、
先ずアルカリ土類金属に属するアシルカルニチンエステ
ラーゼ生産菌が適当な培地に培養される。
上記のアシルカルニチンエステラーゼ生産菌としては、
前述のアルカリゲネス・エスピーＮ１９８１が挙げられ
るが、細菌の一般的性状として開学上の性質は変異し得
るものであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外
線照射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタ
ンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異
し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、アルカリ
土類金属に属し、アシルカルニチンエステラーゼを生産
する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用すること
ができる。
上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件によ
って行うことができるが、本菌株の培養にあたっては、
アシルカルニチンエステラーゼがアシル−Ｌ−カルニチ
ンによって誘導的に生成される誘導酵素であることから
、アシル−Ｌ−カルニチンを含む培地で培養することが
好ましい。当該アシル−し−カルニチンとしては、例え
ば安価なオクタノイル−Ｌ−カルニチン（培地に対して
０．１〜１％）を用いるのが好ましい。
培地としては、アシル−Ｌ−カルニチンを添加する以外
に微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さら
には必要に応じ、無機塩などを含有させた栄養培地が使
用される。
同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース
、サッカロース、シ二クロース、糖蜜などが単独または
組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、
例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカーなどが単独または組み合わせて用いられる
。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その他、鉄、マ
ンガンなどの種々の重金属塩などが使用される。上記以
外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒素源が使用
できることはいうまでもない。
培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培養温度はアシルカルニチンエステラーゼ生産
菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得る
が、通常は１５〜３７℃、特に２８℃付近が好ましい。
培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最高力
価に達する時期を見計らって適当な時期に培養を停止す
ればよいが、通常は１〜３日間程度である。
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、
通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条
件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節
、選択さ−れることは言うまでもない。液体培養におい
て発泡があるときは、シリコン油、植物油などの消泡剤
が適宜使用される。
このようにして得られたアシルカルニチンエステラーゼ
は、主として菌体内に含有されるので、得られた培養物
から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、この菌
体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピーズ処
理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾチーム等の
酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合わ
せて、粗製のアシルカルニチンエステラーゼ含有液が得
られる。
この粗製のアシルカルニチンエステラーゼ含有液から公
知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いることによ
りさらに精製されたアシルカルニチンエステラーゼを得
ることができる。例えば粗製のアシルカルニチンエステ
ラーゼ含有液に硫安、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム
、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法により本酵素を
回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩、各種の
クロマトグラフィー法、電気泳動法あるいは超遠心分析
法を適宜組み合わせ用いて、必要に応じて精製すればよ
く、その精製手段としては、目的とするアシルカルニチ
ンエステラーゼの性質を利用した手段を用いればよく、
例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に溶解した後、必
要に応じて半透膜にて透析し、さらにＤＲＡＢ−セルロ
ース、ＧＲＡＢ−セファセル、ＤＥＡＢ−セファロース
、ＤＥＡＲ−セファデックス＾−５０（ファルマシア社
製）　、　ＤＥＡＲ−トヨパール（東洋曹達社製）等の
イオン交換樹脂や、セファデックスＧ−１００、Ｇ−７
５、セファクリルＳ−２００等のゲル濾過剤による分子
篩クロマトを行えばよく、またこれらの手段を適宜組み
合わせて用いて精製すればよく、その後必要に応じて糖
類、例えばマンニトール、サッカロース、ソルビトール
等、アミノ酸、例えばグルタミン酸、グリシン等、ペブ
タイドまたは蛋白質として牛血清アルブミン等の安定剤
を添加し、凍結乾燥等の処理により精製されたアシルカ
ルニチンエステラーゼの粉体を得ることができる。
以上の如くして得られた本発明アシルカルニチンエステ
ラーゼの性状は以下の通りである。
（１）酵素作用 下記式に示すように、アシル−Ｌ−カルニチンを加水分
解してＬ−力ルニテンと遊離脂肪酸を生成する反応を触
媒する。
アシル−し−カルニチン＋ｌ’ｌＪ→ 脂肪酸＋Ｌ−カルニチン （２）分子量 ６３、０００±７．０００ トーソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（０，７５Ｘ
　６０ｃｍ　）による値、溶出液；　０．２Ｍ　ＮａＣ
１含有０．１Ｍリン酸麿衝液（ｐＨ７，０）、標準品は
オリエンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使用した
。
Ｍ、Ｗ、　　　１２，４００　　シ）りＤＡＣ賛、Ｗ、
３２．０００　　アデニレートキナーゼＭ、Ｗ、　　　
６７．０００　　エノラーゼＭ、１１．　１４２．００
０　　ラクテートデヒドロゲナーゼＭ、Ｗ、　　２９０
．０００　　グルタメートデヒドロゲナーゼ （３）等電点 ｐＨ５，１±０．５ キャリアアンフオライトを用いる焦点電気泳動により４
℃、７００ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し、
各両分の酵素活性を測定した。
（４）Ｋｍ値 １００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で以下
に示した各アシルカルニチンをそれぞれＩ　Ｘ　１０−
５Ｍ。
２　ｘｌＯ−５Ｍ、　３　ｘｌＯ−５Ｍ、　５　ｘｌＯ
−５Ｍ、　１０ｘｌＯ−５Ｍ、　２０Ｘ　１０−５Ｍ、
　４０Ｘ　１０−５Ｍになるように調製し、それぞれの
アシルカルニチンに対するにｍ値を測定した。なお、そ
れぞれのアシルカルニチンは市販のものを用いるか、Ｌ
−カルニチン（シグマ社製）を用いてＢｏｈｍｅｒ　＆
　Ｂｒｅｍｅｒの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１５２．５５９−５６
７（１９６８）　３を用いて自家調製した。
アセチル−Ｌ−カルニチン プロピオニル−Ｌ−カルニチン ヘキサノイル−Ｌ−カルニチン オクタノイルーＬ−カルニチン デカノイル−Ｌ−カルニチン ラウロイル−Ｌ−カルニチン ミリストイル−し一カルニチン バルミトイル−Ｌ−カルニチン ステアロイルーＬ−カルニチン （５）基質特異性 １００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で各々
のアシルカルニチンが０．５ｍＭになるように調製し、
３７℃、１０分間の反応で生成されるＬ−カルニチン量
約４　Ｘ　１０−５Ｍ 約３　Ｘ　１０−５Ｍ 約２　ｘ　１０−５Ｍ 約２　Ｘ　１０−５Ｍ 約２　Ｘ　１（１−５Ｍ 約２　Ｘ　１０−５Ｍ 約２　Ｘ　１０−５Ｍ 約３　ｘ　１０−５Ｍ 約５　Ｘ　１０−５Ｍ を後述のＬ−カルニチン測定法を用いて測定し、比較し
た。その結果、オクタノイル−Ｌ−カルニチンに対して
最も高い活性を示した。また、ラットの肝臓由来のアシ
ルカルニチンエステラーゼはアセチル−Ｌ−カルニチン
とプロピオニル−し−カルニチンに対して活性を示さな
いが本発明の酵素は充分な活性を示した。
アセチル−Ｌ−カルニチン　　　　１７％プロピオニル
−Ｌ−カルニチン　　４６％ヘキサノイル−Ｌ−カルニ
チン　　８５％オクタノイル−Ｌ−カルニチン　１００
％デカノイル−Ｌ−カルニチン　　　７２％ラウロイル
−Ｌ−カルニチン　　　６０％ミリストイル−Ｌ−カル
ニチン　　６１％バルミトイル−Ｌ−カルニチン　　４
１％ステアロイル−Ｌ−カルニチン　　１１％（６）至
適ｐＨ １００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ）１４．５〜６．０）、１０
０ｍＭリン酸！ｌ衝液（ｐ）１６．５〜８．０）、１０
０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐ）１８．０〜９．０）、
１００ｍＭグリシン水酸化ナトリラム緩衝液（ｐｆ１９
．０〜１０．０）の各緩衝液中で０．５ｍＭになるよう
にオクタノイル−Ｌ−カルニチンを調製し、３７℃、１
０分間の反応の後に生成されたＬ−カルニチンを測定し
た。測定した結果は図１に示す通りであって、ｐＨ８，
０付近が至適ｐａｌであるが、ｐＨ６，５〜９．５まで
の広い範囲にわたって９０％以上の活性を示した。
図１中の説明　酢酸緩衝液　　　　−△リン酸緩衝液　
　　−〇− トリス塩酸緩衝液　−〇 （７）ｐ）！安定性 本酵素を１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５〜６．０）
、１００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐｔ１６．５〜８．０）
、１００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０〜９．０
）、１００ｍＭグリシン水酸化す）　＋Ｊウム緩衝液（
ｐ）１９．Ｏ〜１０．０）を用いて０、ＩＵ／ｍｌに調
製し、６０℃、３０分間加熱処理した後の残存活性を測
定した。測定した結果は図２に示す通りであって、ｐ）
１７．５のリン酸緩衝液からｐＨ８，５のトリス塩酸緩
衝液中で安定であった。また、ｐ）１５．５の酢酸緩衝
液からｐ）１１０．０のグリシン水酸化ナトリウム緩衝
液までのｐＨの広い範囲にわたって９０％以上の活性を
保持していた。
図２中の説明　酢酸緩衝液　　　　−八−リン酸緩衝液
　　　−〇− トリス塩酸緩衝液　−・− （８）至適温度 ０、５ｍＭオクタノイル−Ｌ−カルニチンを含んだｐＨ
８，０の１００ｍＭ　）リス塩酸Ｍ衡液を用いて５０℃
、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃の各温度で
１０分間反応させた後に生成されたＬ−カルニチン量を
測定した結果は図３に示す通りであって７０℃で最大の
活性を示した。
（９）熱安定性 本酵素を１００ｍＭ　）リス塩酸Ｍ衝液（ｐＨ，０）を
用いて０．１１Ｊ／ｒｎｌに調製し、５５℃、６０℃、
６５℃、７０℃で３０分間加熱処理をした後の残存活性
を測定した結果は図４に示す通りであって６０℃までは
安定であった。
αＱアシルカルニチンエステラーゼ活性の測定法■９反
応液組成 １００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）０、５ｍ
Ｍオクタノイル−Ｌ−カルニチン■、測定法 上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７℃で５分間
インキュベイトした後に、適当に希釈した酵素液０．０
５ｍ１！を添加して３７℃で１５分間インキュベイトし
た後に、直ちに沸騰水浴中で１５秒間インキュベイトし
て反応を停止し、被検液とする。生成されたＬ−カルニ
チンを下記のＬ−カルニチンの測定法を用いて測定し、
アシルカルニチンエステラーゼの活性を求める。
■、計算式 ％式％ ■、Ｌ−カルニチンの測定法（以下、Ｌ−カルニチン測
定法人と略す） ■反応液組成 １００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）１ｍＭ　
　ＮＡ［ｌ″″ ５υ　ジアフォラーゼ（東洋醸造社製）１００ｍＭ　　
ＫＣＩ！ ０、０２５％　ＮＢＴ（和光純薬工業社製）◎測定法 上記の反応液１ｍｊ？を小試験管に入れ、３７℃で５分
間インキュベイトした後に、被検液０．０５ｍ１！を添
加し、２分間インキュベイトした後に０．ＩＮ塩酸２ｍ
ｌ！を添加しＡｓｓ。、を測定して吸光度Ａ１を測定す
る。被検液を添加しないで同様にしてブランク＾。を求
める。
６生成されたＬ−カルニチン量の計に式２式％ 上記の如く、本発明のアシルカルニチンエステラーゼは
、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンだけでなく、従
来のアシルカルニチンエステラーゼが活性を示さなかっ
た低級アシル−Ｌ−カルニチンに対しても活性を有する
。従って、ヒト血清などのアシル−Ｌ−カルニチンを含
有する被検液に、本発明の低級、中鎖乃至長鎖のいずれ
のアシル−Ｌ−カルニチンに対しても活性を有するアシ
ルカルニチンエステラーゼを作用せしめ、次いで化成し
た脂肪酸または／およびＬ−カルニチンを定量すれば、
当該被検液中のアシル−Ｌ−カルニチンを測定すること
ができる。被検液中にアシル−Ｌ−カルニチン以外に遊
離のＬ−カルニチンが存在する場合、あらかじめ遊離Ｌ
−カルニチンのみを後述する手段にて定量するか；遊離
Ｌ−カルニチンを還元型補酵素、例えばＮＡＤ）Ｉを酸
化型に変換する系とし、加温ないし加熱して分解消去し
た後アシル−ム−カルニチンのみを定量するか；あるい
はアシル−Ｌ−カルニチンを本発明アシルカルニチンエ
ステラーゼにてＬ−カルニチンとし、被検液に存在した
遊離のＬ−カルニチンとアシル−Ｌ−カルニチンとの総
量として定量してもよい。
以下余白 このような被検液と本発明アシルカルニチンエステラー
ゼとの反応は、被検液中のアシル−Ｌ−カルニチンが充
分加水分解される条件であれば特に制限されないが、例
えば３７℃、５〜３０分間インキュベイトすればよい。
また反応の停止は８０℃以上に加熱して行うのが好まし
い。
かかる反応により、脂肪酸とＬ−カルニチンが生成する
が、当該脂肪酸の定量法としては、常法、例えば液体ク
ロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等が挙げら
れる。また、Ｌ−カルニチンの定量法としては、カルニ
チンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　、アセチ
ルＣｏ＾および５．５゛−ジチオビス−２−二トロ安息
香酸（口ＴＮＢ）を用いた比色定量法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、　２３８．２５０９（１９６３）。
Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　５．１８４−
１８７（１９６４）　］　　；〔Ｉ４Ｃ〕または〔３旧
標識アセチルＣｏＡとＣＡＴを用いたラジオアイソトー
プ法［Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ。
３７、２３５−２４３（１９７２）、　Ｊ、　Ｌｉｐｉ
ｄ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１７゜２７７−２８Ｈ１９
７６）　］　　；カカルニチンデヒドロゲナーゼＮＡＤ
を用いたカルニチンデヒドロゲナーゼ法［Ｂｕｒｏｐｅ
ａｎ　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　６．　１９６−２０
Ｈ１９６８）　　］およびアセチルＣｏ＾、ＣＡＴおよ
びＮ−（ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）−フェニル】
−マレイミド（ＢＩＰＭ）を用いた蛍光法〔厚生省神経
病患研６１年度研報、３１５−３１８（１９８６）　Ｅ
などの方法が挙げられ、これらのうち、カルニチンデヒ
ドロゲナーゼ法が好ましい。具体的には、反応液にＬ−
カルニチンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ類またはチオＮＡ
Ｄ類、および必要に応じて非イオン性界面活性剤を含有
する試薬を作用せしめて、反応にて生成する還元型ＮＡ
Ｄ類または還元型チオＮＡＤ類の量を測定することによ
り行われる。ここでＮＡＤ類としては、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジン
アデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、ニコチン
アミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡΩ
）が挙げられ、また、チオＮＡＤ類としてはチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオ
ニコチンアミドヒボキサンチンジヌクレオチドが挙げら
れる。
ここで、反応にて生成する還元型ＮＡＤ類または還元型
チオＮＡｌ類の定量は、直接吸光度を測定することによ
り実施してもよいが、次の反応式で示されるホルマザン
生成系に変換させることにより測定するのが好ましい。
■　Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＬＣ口）反応系 ■　変換反応系 本発明で用いられるし一カルニチンデヒドロゲナーゼは
公知の酵素であるが、細菌由来のＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼ生産菌の産生ずる酵素が動用される。このよ
うなし−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産菌の例として
は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｉ
ＦＯ１３１３０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ＋ｄ
ａＥｌ−０７８１（Ｆｆ！ＲＭ　Ｐ−５６６４）　　、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａＩＦ　０３７３
８などのシュードモナス属細菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ　ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ　ＩＦＯｌ：］５５８など
のキサントモナス属細菌などが挙げられる。上記の細菌
由来のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼはＥｕｒｏｐｅ
ａｎ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６．１９６−２０１
（１９６８）、同誌。
１０、５６−６０（１９６９）、＾ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１
．Ｃｈｅｍ、　、　５２（１）。
２４９−２５０　（１９８８）などに記載の方法により
上記生産菌を培養し、該培養物から分離精製することに
よって製造される。また上記生産菌から得られたし一カ
ルニチンデヒドロゲナーゼ遺伝子を遺伝子組み換え技術
によって得られた宿主細胞を培養し、精製することによ
っても製造される〔＾ｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　５２（３）、　８５１−８
５２（１９８ｇ）　）　、また、アルカリゲネス　エス
ピーＮ１１９８１もし一カルニチンデヒドロゲナーゼを
産生ずる。なお、このとき培地にはカルニチンを含有さ
せて培養するのが好ましい。
本測定法で用いられる電子伝達剤としては、後記のテト
ラゾリウム塩、ＮＡＤＨ類（またはチオＮＡｌ類）およ
びＨ＋からホルマザンおよびＮ＾０４類（またはチオＮ
ＡＤ“類）に変換することのできる試薬であり、例えば
ジアホラーゼ、フェナジン誘導体が挙げられる。
ジアホラーゼは公知の酵素であり、市販品を入手するこ
とができる。
フェナジン誘導体としては、フェナジンメトサルフェー
ト、メルトラブル−、メトキシフェナジンメトサルフェ
ートなどが挙げられる。
本測定法で用いられるテトラゾリウム塩としては３．３
’−（３，３°−ジメトキシ−４，４°−ビフェニレン
）−ビス［２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル
−テトラゾリウムクロライド］　〔別名；ニトロテトラ
ゾリウム（ＮＴＢ）　）　、３．３°−（３，３’−ジ
メＦキシー４．４°−ビフェニレン）−ビス〔２，５−
ビス（ｐ−ニトロフェニル）−テトラゾリウムクロライ
ド１．３．３°−（３，３°−ジメトキシ−４，４゜−
ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−テトラゾ
リウムクロライド、２−（ｐ−ニトロフェニル）−３−
（ｐ−ヨードフェニル）−５−フェニル−テトラゾリウ
ムクロライド（ＩＮＴ）　、３−　（４，５−ジメチル
−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリ
ウムクロライド（４，５−ＮＴＴ）、３−（４，５−ジ
メチル−２−トリアゾリル）−２，４−ジフェニル−テ
トラゾリウムクロライド（ＮＴＴ）　、２゜２°、５，
５°−テトラ−（ｐ−ニトロフェニル）−３゜３′−（
３−ジメトキシ−４−ジェフニレン）−ジテトラゾリウ
ムクロライド（ＴＮＢＴ）、２．３．５−）リフェニル
ーテトラゾリウムクロライド（ＴＴ）、ネオテトラゾリ
ウムクロライド（ＮＴ）などが挙げられる。
この反応系に添加される非イオン性界面活性剤としては
、この反応系の反応を阻害するような悪影響を与えず、
且つ）ＩＬＢ約１０以上の水溶性の非イオン性界面活性
剤が用いられる。好ましくは約１１〜１７のＨＬＢを有
する非イオン性界面活性剤を使用するのが望ましい。例
えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキ
シエチレン七チルエーテル、ポリオキシエチレンステア
リルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、
ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテル、ポリオヰシ
エチレントリデシルエーテルなどのポリオキシエチレン
アルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテ
ルなどのポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル
；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン七チルエー
テルなどのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエ
ーテル；ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリオ
キシエチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンモノ
オレエートなどのポリオキシエチレンアルキルエステル
；ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテ
ート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリス
テアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセ
スキオレエート、ソルビタントリオレエート；グリセリ
ンモノステアレート、プロピレングリコールモノステア
レート、グリセリンモノオレエートなどのグリセリン・
プロピレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタン
トリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
オレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエ
ートなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ
ル；ポリオキシエチレンソルビトールモノラウレート、
ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエート、ポ
リオキシエチレンソルビトールヘキサステアレートなど
のポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；ポ
リオキシエチレングリセリンモノステアレートなどのポ
リオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリオキ
シエチレンステアリルアミンなどのポリオキシエチレン
アルキルアミン；ポリオキシエチレンステアリルアミド
などのポリオキシエチレンアミド；ラウリン酸ジェタノ
ールアミド、ヤシ油脂肪酸ジェタノールアミドなどの脂
肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油誘導体などのポリオキシエチレンヒマシ油誘導体；
アルカノール（地竜化工業社製）などの第１級アルコー
ルエトキシレート；アデカトール（地竜化工業社製）な
どの第２級アルコールエトキシレート；テトロニック（
地竜化工業社製）などのエチレンジアミンのポリオキシ
プロピレンポリオキシエチレンエーテルなどが挙げられ
るが、プロニックＦ−６８（地竜化工業社製）などのポ
リオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、ニラ
コールＴＯ−１０（日光ケミカルズ社製）、ポリオキシ
エチレン（イ）ソルビタンモノオレエート（和光純薬社
製）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ
ル、ソルビタン脂肪酸エステル、アデカトール（地竜化
工業社製）などの第２級アルコールエトキシレートが好
ましい一例である。上記の非イオン性界面活性剤は１種
単独で使用してもよいし、また２種以上を組み合わせて
使用してもよい。
反応液中のＬ−カルニチン量の測定を実施するための酵
素および必要な試薬の濃度は、一般的には、次の濃度の
範囲で適宜決定し、本反応系の反応を行わせるのが望ま
しい。
緩衝剤 り一カルニチンデヒドロゲナーゼ １〜３００／ｍｌ！ ＮＡＤ”類（またはチオＮＡＤ＋類） ０．１〜５ｍＭ ジアホラーゼ　　　　　　０．５〜５０ロ／１ｎ１テト
ラゾリウム塩　　　０．０１〜０．１９１１ｉ非イオン
性界面活性剤　０．１〜５％ 上記の酵素および必要な試薬は、同一系または２以上か
らなる系として、水溶液状に保存してもよいし、また乾
燥した粉末状に保存してもよい。
特に凍結乾燥により乾燥保存することが有利である。上
記の酵素および必要な試薬を安定に保存するためには、
安定性に悪影響を与えないような成分と共に保存するの
が好ましい。例えばＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼと
非イオン性界面活性剤、ＮＡＤ”類またはチオＮへ〇＋
類とテトラゾリウム塩、電子伝達剤とテトラゾリウム塩
、非イオン性界面活性剤とテトラゾリウム塩は互いにで
きるだけ同一系で長期保存しない方が望ましい。
本反応系の反応を行うに当っては、通常３７℃付近で１
分以上反応させればよい。上記反応において、にごりが
生じる場合には、反応液のにごりを除去する目的でＫＣ
ｊ！、　ＮａＣ１などの添加物を適宜添加して反応を行
ってもよい。
上記反応系におけるＬ−カルニチンの測定は、反応によ
って生じたホルマザンの特異的吸収波長である吸収波長
域、例えば５００〜５５０ｎｍ付近における極大吸収波
長域に基いて比色定量することにより求められる。
また、Ｌ−カルニチンの測定は、Ｌ−カルニチン含有反
応液に、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ、Ａ、および
８．を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式、 ６２Ｂ。
（式中、＾１はチオＮ人口類またはＮＡＤ類を示し、Ａ
。
はＡ、の還元型生成物を示し、Ｂ、は＾、がチオＮ人口
類のときは還元型ＮＡＤ類を、＾１がＮ＾口類のときは
還“元型チオＮ人口類を示し、８．はＢ、の酸化型生成
物を示す）で表わされるサイクリング反応を形成せしめ
、該反応によって変化する＾、またはＢ１の量を測定す
ることによっても行うことができる。この反応系は感度
が極めて高く、特に好ましい。
本反応系においては＾、がチオＮ人口類である場合はＢ
１がＮＡＤ）ｌ類であり、また＾、がＮへ〇類である場
合はＢ、がチオＮ＾口Ｈ類であり、少なくとも一方がチ
オ型補酵素であることが必要である。
島およびＢ１の量は被検体中のＬ−カルニチンの量に比
較して過剰量であり、またＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼの＾、およびＢ、それぞれに対するＫｍ値に比較し
ても過剰量であることが必要であり、特にＬ−カルニチ
ン量の２０〜１００００倍モルが好ましい。
本反応系に用いるＬ−カルニチン測定用試薬においては
、＾、およびＢ＋の濃度は０．０２〜１００ｍＭ　、特
に０．０５〜３０ｍＭが好ましく、Ｌ−カルニチンデヒ
ドロゲナーゼの濃度は５〜２０００／ｍｆｆ、特に１０
〜１５００／ｍｉ！が好ましいが、これ以上の量を用い
ることもできる。
かかるＬ−カルニチン測定用試薬の調製にあたって、使
用できるし一カルニチンデヒドロゲナーゼに関しては、
例えば補酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡＤまたは
チオＮＡ［］）を用いて、基質となるＬ−カルニチンに
対する反応性を有するものであればよく、これらの補酵
素と基質とを用いることにより確認できるものである。
例えば、アルカリゲネス　エスピー（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ　ｓｐ、）　Ｎ（Ｌ９８１の生産スるＬ−カルニ
チンデヒドロゲナーゼ（東洋醸造製）は、Ｌ−カルニチ
ンを基質とした場合、１００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ９，０）においては、補酵素にチオＮＡＤを用いた
時のＮＡＤを用いた時に対する相対活性は１５％程度で
ある。また、同様の条件下でＬ−カルニチン、ＮＡＤ　
、チオＮＡＤに対するにｍ値はそれぞれ９．３ｍＭ　、
　０．１４ｍＭ、　０．４０ｍＭである。
反応液組成については、使用するし一カルニチンデヒド
ロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考慮して２種の
補酵素を適宜選択し、その後止反応と逆反応の至適ｐＨ
の間のｐＨ条件を適宜調整して、正反応／逆反応の反応
速度比が１に近づくようにｐＨ条件を設定すればよい。
尚、本発明においてＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼは
単独でも、適宜２種以上を組み合わせて用いてもよい。
斯くして、調製された本反応系のＬ−カルニチン測定用
試薬によって反応液中のＬ−カルニチン量を測定するに
は、例えば上記成分■〜■を含有する試薬に反応液０．
００１〜０．５ｄを加え、約３７℃の温度にて反応させ
、反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、
例えば３分後と４分後の１分間または３分後と８分後の
５分間における生成されたＡ、の量または消費されたＢ
、の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化に
よって測定すればよい。また同様に、反応開始後、一定
時間後（例えば１０分後）に酵素反応を停止させ、しか
る後に吸光度の変化を測定してもよい。例えば、＾、が
チオＮへ〇）Ｉ、　Ｂ、がＮ＾ＯＨの場合、＾、の生成
を４００ｒｖの吸光度〔分子吸光係数：　１１２００Ｍ
−’ｃ＋＊−’（Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　　５５　Ｐ、２６１（１９７９
））　）の増加により測定するか、あるいはＢ。
の消費を３４０ｎｍの吸光度〔分子吸光係数：６２２０
Ｍ−’ａａ−りの減少により測定し、既知濃度のＬ−カ
ルニチンを用いて測定したときの値と比較すれば、被検
液中のＬ−カルニチンをリアルタイムで算出することが
できる。
また、本反応系による定量法は、反応液中のし−カルニ
チンそのものを酵素サイクリング反応に導くものであり
、反応液中の共存物質の影響を受けにくいため、反応液
のブランク測定を省略することができ、レイトアッセイ
による簡便な測定を成し得る。
尚、本反応系においてはＡ、またはＢ、の測定に当り、
吸光度測定の代りに他の公知酵素測定法を使用して定量
を行うこともできる。
また、本発明アシルカルニチンエステラーゼはアセチル
−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−Ｊルニチン
の低級アシル−Ｌ−カルニチンに対して活性を有するの
で、従来のアシルカルニチンエステラーゼと本発明アシ
ルカルニチンエステラーゼを組み合わせて用いれば、被
検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチン−のみを測定する
ことができる。すなわち、 （ａ）アセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−
Ｌ−カルニチンを基質とせず、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
−カルニチンに基質特異性を有し、当該中鎖乃至長鎖ア
シル−ト−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１
モルの脂肪酸と１モルのし一カルニチンを生成する反応
を触媒するアシルカルニチンエステラーゼ（以下、長鎖
アシルカルニチンエステラーゼと略す）を被検液に作用
せしめて生成した脂肪酸または／およびＬ−カルニチン
を定量する工程、＄よび （ハ）本発明アシルカルニチンエステラーゼを被検液に
作用せしめ、次いで生成した脂肪酸または／およびＬ−
カルニチンを定量する工程を行い、（Ｃ）次いで、工程
（ａ）と工程（６）との定量値の差異を測定することに
より被検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチンが測定でき
る。
本測定法の工程（ａ）で用いられる長鎖アシルカルニチ
ンエステラーゼとしては、特に限定されないが、ラット
由来のアシルカルニチンエステラーゼ等が挙げられる。
本測定法の工程（ａ）および工程ら）は、いずれも前記
と同様にして行われる。工程（ａ）と工程（ハ）の定量
値の差異を求めれば、当該差異が被検液中の低級アシル
−し−カルニチン量である。
また、（α）被検液に長鎖アシルカルニチンエステラー
ゼを作用せしめ、生成したＬ−カルニチンにＬ−カルニ
チンデヒドロゲナーゼおよびＡ１（但し＾、はチオＮＡ
Ｄ類またはＮＡＤ類を示す）を作用せしめてＡ１をｌｔ
　（＾、はＡ１の還元型生成物を示す）となし、次いで
生成したＡ２を分解せしめ、（β）得られた反応液に本
発明アシルカルニチンエステラーゼを作用せしめ、次い
で当該反応によって生成したＬ−カルニチンを定量する
ことによっても被検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチン
を測定することができる。
本測定法の工程（α）の反応は、前述と同様にして行う
ことができる。また工程（α）におけるＡ２の分解は、
例えば酸性条件下３７℃程度の加温ないしそれ以上の加
熱により行われ、これにより前処理すべきＬ−カルニチ
ン相当量を分解消去できる。かかるＡ２の分解により、
反応液中には、被検液中の遊離Ｌ−カルニチンおよび中
鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチン由来のＬ−カルニチ
ンが存在せず、低級アシル−し−カルニチンのみが残存
している。従って、当該反応液に工程（β）を行えば、
被検液中の低級アシル−Ｌ−カルニチンが測定できる。
なお、工程（β）の反応は前記と同様に行うことができ
る。
〔発明の効果〕
本発明のアシルカルニチンエステラーゼはラット肝臓由
来のものと比べて少なくともアセチル−Ｌ−カルニチン
及びプロポオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ば
れた低級アシル−Ｌ−カルニチンに、基質特異性を有す
るという特徴を有し、かつ種々のアシル−し−カルニチ
ンに対するＫｍ値も低い上に安定性にも優れているので
、これを用いる優れたアシルカルニチン測定法を提供す
ることができた。また、本発明により、微生物由来であ
り、熱安定性に優れていることから精製も容易であり、
大量培養により容易に充分な量を供給できる有利なアシ
ルカルニチンエステラーゼの製造法を提供できた。
〔実施例〕
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明を限定するものではない。
実施例１ アルカリゲネス　エスピー漱９８１の培養にＨ，ＰＯ，
０，２％、　に、ＰＯ，０，４％、　ＭｇＳ口、・　７
Ｈ２００，０５％、Ｆｅ５Ｏ＝　・７Ｈ２（１０，００
２％、Ｍｎ５Ｏｎ　・ｎ）ＩＪｏ、　００２％、酵母エ
キス（極東製薬社製）０．１％を含む液体培地（ｐ）１
７．０）　１００ｍ１！を５０〇−容三角フラスコに分
注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した後に、濾過滅菌
しておいた１０％オクタノイル−０Ｌ−カルニチン（シ
グマ社製）を５ｍｌ’ｍｌ的に添加し、これに、アルカ
リゲネス　エスピーＮα９８１の１白金耳を接種し２８
℃、１２Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、の振とう培養器で７２時間
培養した。三角フラスコ５本で培養し、培養物４７０ｍ
１’を得た。
実施例２ 本発明アシルカルニチンエステラーゼの分離精製 ４７〇ｍｆ分の培養液を遠心分離して、集菌し、１１０
０ｒｎ　）リス緩衝液（ｐＨ８，０）５０艷に懸濁した
。これを超音波破砕器（クボタ社製）を用いてホモシネ
イトした後に１５．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、で１０分間
遠心分離して上清４５ｍ　（０，３１Ｊ／ｍｆ）を得た
。得られた粗酵素液を６０℃、３０分間加熱処理した後
に１５．００Ｏｒ、　ｐ９ｍ。
で上清４４ｍ１（０，３０／ｒｎ１）を得た。得られた
酵素液を５０ｍＭ）！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で
緩衝化したＤＢＡＢ−セファロースＣＬ−６８（ファル
マシア社製）２０ｍｌ！のカラムに通し、０．１ＭにＣ
１を含んだ５０ｍＭ　）リス緩衝液（ｐ）１８．　Ｏ）
　１００ｍ１！を流した後に、０．２５ＭＫＣｌを含ん
だ５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で溶出し
、酵素液２５ｍｊｌ！　（０，４７［１／ｍｊりを得た
。得られた酵素液を５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）　５１に対して一晩、５℃で透析し酵素液２８
ｍ１！　（０，４１１１／ｍｌ！、回収率８５％）を得
た。次いで、その２０ｍ１！を凍結乾燥して粉末８０ｍ
ｇ　（０，１０／　ｍｇ　）を得た。
参考例Ｉ Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産のためのアルカリ
ゲネス　エスピーＮｏ、９８１の培養口し一塩化力ルニ
チン（シグマ社製）３％、ＫＨ２Ｐ０．０．２％、Ｋ、
ＨＰＯ，０，４％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％、
　ＦｅＳＯ４”　　７Ｈｉロ　０．００２％、　Ｍｎ５
Ｏ＜　・　ｎＨＪｏ、０（１％を含む液体培地（ｐＨ７
，０）　１００−を５００　ｍｌ！容三角フラスコに分
注し、１２０℃で２０分間加熱滅菌した後、これにアル
カリゲネス　エスピーＮＩＬ９８１の１白金耳を接種し
、２８℃で１２Ｏｒ、　ｐｌｍ、の振とう培養器で４０
時間培養して種母９５−（酵素活性１．２［１／ｍｇ）
を得た。
一方、口し一塩化力ルニチン（シグマ社製）３％、酵母
エキス（極東製薬社製）０．１％、に、ＨＰＯ。
０、０５４％、ＫＬＰｏ、　０．７４６％、Ｍｇ５Ｏ＜
・７）１２００．０５％、　ＣａＣ１、・　２Ｈ，ロ　
０．００２％、　Ｆｅ５０．　・　７１（，００，００
２％、ＭｎＳＯ４・ｎＨＪ　Ｏ，００２％およびデイス
フオームＣＢ４４２　（日本油脂社製）１ｍ１２／ｊ！
を含む液体培地（ｐＨ７，０）２０１を、３０１容ジャ
ーファーメンタ−に仕込み、加熱滅菌した後、これに前
記で得た種母９０ｍｆを移植し、培養温度２Ｂ’Ｃ１通
気量２０１／分、内圧０．４ｋｇ／　ｃｍ２、攪拌速度
２００ｒ、ｐ、ｍ、　、培養時間２７時間の培養条件で
通気攪拌培養し、培養物１９１（酵素活性３．Ｏ１ｌ／
ｉｆ）を得た。
参考例２ Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの分離精製参考例１で
得た培養物１９１を遠心分離で集菌し、これに０．１％
リゾチームおよび１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナ
トリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を含む４０ｍＭ）リス
塩酸緩衝液（ｐｆ１８．０）　５１を加え、３７℃で１
時間可溶化処理した。処理液を遠心分離して沈澱物を除
去し、上清４５００−（比活性１０．３１／−）を得た
。この上清に硫安１１００ｇを溶解し、生じた沈澱物を
遠心分離して除去し、得られた上清に再び硫安７００ｇ
を溶解した。この処理液を遠心分離して得た沈澱物４０
ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　５００−で溶
解した溶液（比活性８４．ＩＵ／ｒｎりを４０ｍＭ　）
リス塩酸Ｎ衝液（ｐＨ８，０）１０１に対して透析した
。
透析して得た酵素液を４０ｍＭ）！Ｊス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で緩衝化したＤＢＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ　（ファルマシア社製）２００ｍｆ！のカラムに通
し、Ｏ，ＩＭ　ＫＣ７！を含む４０ｍＭ　）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）　１１を流した後、次いで０．３Ｍ
ＫＣｌを含む４０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
テ溶出し、酵素液３００ｍＡ’　（比活性１２０．５１
１／ｍｌりを得た。得られた酵素液を４０ｍＭ）！Ｊス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，Ｏ）　１０１に対して透析した。
透析して得た酵素液を４０ｍＭ）！Ｉス塩酸緩衝液で緩
衝化したハイトロキシルアパタイト（に０ＫＢＮ社製）
１００−のカラムに通し、４０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液
（ｐ）１８．０＞　２００−を流した後、２ｍＭリン酸
緩衝液（ｐｔ（７，０）　１００ｍ１で溶出し、酵素液
１００−（比活性３３１１１／ｍｌ）を得た。得られた
酵素液を２０ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）５１
に対して透析し、酵素液９５−（比活性３３１１Ｊ／ｉ
１回収率６７．８％）を得た。
本精製し一カルニチンデヒドロゲナーゼ中のＮＡＤＨオ
キシダーゼ活性は０．０００１１１／−以下であった。
以上の如くして得られたし一カルニチンデヒドロゲナー
ゼの性状は以下の通りである。
（１）酵素作用 下記式に示すように、少なくともＬ−カルニチンおよび
ＮＡＤから３−デヒドロカルニチンおよびＮＡＤＨを生
成する反応を触媒する。
以下余白 一００ＣＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｎ”（Ｃ１１，）　３＋ ＮＡＤ” Ｈ ３−デヒドロカルニチン （２）基質特異性 り一力ルニチン　　　　　　　　　１００％コリン　　
　　　　　　　　　　０ グリシンベタイン　　　　　　　　　０グルコース　　
　　　　　　　　　　０リジン　　　　　　　　　　　
　　０ （３）分子量 ５１０００±６０００ トーソー社製ＴＳにゲル’Ｇ３０００ＳＷ　（０，７５
Ｘ　６０ｃｍ　）による値、溶出液：　０．２Ｍ　Ｎａ
Ｃｊ！含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、標準
品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使用
。
ＭＪ、　　　１２．４００　　シトクロムＣＭ、Ｗ、　
　３２．０００　　アゾニレイトキナーゼＭ、Ｗ、６７
．０００　　エノラーゼ Ｍ、Ｗ、　　１４２．０００　　ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ Ｍ、Ｗ、２９０．０００　　グルタメートデヒドロゲナ
ゼ （４）等電点 ｐ）１５．３±０．６ キャリアアンフオライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、７００ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画し
、各両分の酵素活性を測定した。
（５）Ｋｍ値 １００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）、５Ｕジ
アフオラーゼ（東洋醸造社製）、０、０２５％ＮＢＴ（
和光紬薬工業社製）、１％Ｔｗｅｅｎ８０　（和光紬薬
工業社製）、５０ｍＭ　　Ｌ−カルニチン を含む反応液中でＮＡＤ＋の濃度を変化させて、ＮＡＤ
＋に対するＫｍ値を測定した結果では、０．１４１ｍＭ
という値を示した。
一方、前記反応液中で５０ｍＭ　　Ｌ−カルニチンの代
わりに１　ｍＭ　ＮＡＤ”を添加し、Ｌ−カルニチンの
濃度を変化させてＬ−カルニチンに対するＫｍ値を測定
した結果では、９．３ｍＭという値を示した。
（６）熱安定性 本酵素液（１，０ｏｌｆ／　−）を２０ｍＭ　）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で調製し、１時間の加熱処理後
、その残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定し
た結果、酵素活性は少なくとも４５℃までは安定であっ
た。
（７）至適温度 １００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）を用い、
５℃における２週間の保存安定性を測定した。その結果
、前記３株のし一カルニチンデヒドロゲナーゼ産生公知
属菌より得られたＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼは、
１週間後の残存活性が５３〜４０％、２週間後には残存
活性が４５％以下になっている。
特にシニードモナス　アエＪレギノーサＩＦ０１３１３
０由来の酵素は２１％と特に安定性が悪いものであった
。これに対し、本発明のＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼは、１週間後の残存活性が９６％で、２週間後の残存
活性は８２％であり、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ
産生公知属菌由来の酵素より格段に安定性の良い性質を
有している。また、この保存安定性試験において０．０
５ｍＭのＮＡ［］”を共存させた時には、その残存活性
が１週間後では９９．７％、２週間後では９５．１％と
より安定性が良くなっており、ＮＡＤ＋の安定性効果が
あることが分かった。
Ｑｌ）Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの酵素活性測定
法 ■反応液組成 ５０ｍＭ　）リス塩ｉ１２緩衝液（ｐＨ９，０）、１　
　ｍＭ　　ＮＡＤ” ５Ｕジアフオラーゼ（東洋醸造社製）、０、０２５％Ｎ
ＢＴ　（和光紬薬工業社製）、１００ｍＭ塩化カリウム
、 １００ｍＭ　Ｌ−カルニチン（シグマ社製）、■酵素活
性測定 上記の反応液１−を小試験管に入れ、３７℃で５分間イ
ンキコベートした後に、適当に希釈した酵素液０．０２
−を添加して攪拌し、反応を開始する。
正確に１０分間反応の後に、０．ＩＮ塩酸２．０ｍｌ！
を添加して攪拌し、反応を停止して、Ａｓｓ。７１を測
定して吸光度Ａ、を求める。上記反応液よりＬ−カルニ
チンを除いた反応液を用いて同様の測定を行い、その吸
光度式〇を求める。
■計算式 ％式％ 本発明アシルカルニチンエステラーゼを用いたオクタノ
イル−Ｌ−カルニチンの加水分解と水酸化カリウム溶液
を用いた加水分解の比較。
０．１ｍＭ　、　０．２ｍＭ　、　０．３ｍＭ　、　０
．４ｍＭ　、　０．５ｍＭになるように５０ｍＭ　）リ
ス塩酸Ｍ衡液（ｐＨ８，０＞でオクタノイル−Ｌ−カル
ニチンを調製し、それぞれｌ−を小試験管に分注し、３
７℃、５分間インキュベイトした後に実施例２の酵素液
（０，４１１１／ｍｆ）を０．１ｍ！添加し１５分間イ
ンキニベイトした後に予め１ｉを小試験管で３７℃にイ
ンキコベイトしておいたＬカルニチンの測定法＾の反応
液に０．０５−ずつ添加し２分間インキコベイトした後
に０．ＩＮ塩酸溶液２ｉを添加し、ＡＳＳｌｌｎｍを測
定した。また同様のオクタノイル−Ｌ−カルニチン溶液
１−にＩＯＮの水酸化カリウム１ｍＩ！、を添加し、３
７℃、２時間インキコベイトした後に、ｌＯＨの塩酸１
献を添加して中和し、その０．１５ｍ１！をＬ−カルニ
チンの測定法への反応液１ｍ７！に添加し、同様にして
Ｉ’ｉｓｓ。、を測定した。その結果を図５に示した。
本酵素によって、オクタノイル−Ｌ−カルニチンが完全
に加水分解されているのがわかる。
水酸化カリウムを用いた値　−へ一 理論値　　　　　　　　　　−・一 実施例４ 血清中のアシル−Ｌ−カルニチンの測定まず健常人男子
５名の血清の遊離のＬ−カルニチンをＬ−カルニチンの
測定法Ａを用いて測定した。同様の血清１ｍｌにＩＯＮ
の水酸化カリウム１ｍｊ！を添加して、３７℃、２時間
インキュベイトした後にＩＯＮの塩酸１−を添加して中
和し、これを用いて総カルニチン量を測定した。また別
に血清１ｒｄに本発明アシルカルニチンエステラーゼ１
　ｍｇ（０，ＩＩＩ／ｍｇ）を添加し３７℃、１５分間
インキユヘイトした後に、これを用いて総カルニチン量
を測定した。これらの結果を表１に示した。本発明酵素
を用いることで、高濃度の水酸化カリウムを使用したの
と同様にアシル−Ｌ−カルニチンが加水分解されている
のがわかる。
以下余白 表 参考例３ ラット肝臓からのアシルカルニチンエステラーゼの精製 アルカリ土類金属細菌由来の本発明アシルカルニチンエ
ステラーゼと比較するために、ＳｏＭａｈａｄｅｖａｎ
　＆　Ｆ、５ａｕｅｒらの方法［Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、　２４４　　Ｎ（Ｌｉ２．４４４８−４４
５３（１９６９）　］によりラットの肝臓より酵素の精
製を行った。５０ｇの肝臓からホモシネイト、ＤＥＡε
−セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ０８−５２）　、セファ
デックスＧ−２００（ファルマシア社製）を用いて精製
し、凍結乾燥品１０１．６■（０，０３６４１１／　ｍ
ｇ　）　’ｌｒ　Ｗｐ　だ。
参考例４ 参考例３の酵素を用いてアセチル−Ｌ−カルニチン、プ
ロピオニル−Ｌ−カルニチン、オクタノイル−Ｌ−カル
ニチン、デカノイル−し−カルニチン、バルミトイル−
Ｌ−カルニチンに対する相対活性比とにｍ値を測定した
結果を表２に示した。
アセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カ
ルニチンの低級アシル−Ｌ−カルニチン：こは活性を示
さず、他の中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに対し
て作用し、そのにｍ値はすべて文献通りに１０−５Ｍ台
の大きな値を示した。
以下余白 表 実施例５ 参考例３の酵素を用いて熱安定性の検討を行った。
１００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐｌ（８，０）を用い
て０．１ｔｌ／−に調製し、４５℃、５０℃、５５℃、
６０℃、６５℃、７０℃で３０分間加熱処理をした後の
残存活性を測定した結果は図６に示した通りであって、
５０℃ですでに６１％まで活性は低下している。
図６中　ラット肝臓由来　　　−・− 本発明酵素　　　　　−〇一 実施例６ 実施例２の本発明酵素と参考例３のラット肝臓由来の酵
素の添加量を変えて０．０２ｍＭのオクタノイル−Ｌ−
カルニチンを含んだ１００ｍＭ　）　！Ｊス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）　１−を３７℃、１５分間の反応で加水
分解したときの生成されるＬ−カルニチン量を測定した
結果は図７に示した通りで本発明酵素は０．ＯＩＵ／−
でほぼ反応は完了しているが、ラット肝臓由来の酵素は
０．６１１／ｒａｔ！でも反応は完了していない。
実施例７ 本発明酵素とラットの肝臓より精製した酵素を用いてア
シル−Ｌ−カルニチンの分別定量を試みた。
アセチル−、プロピオニル−ヘキサノイル−オクタノイ
ル−、デカノイル−、ラウロイル−ミリストイル−、バ
ルミトイル−、ステアロイルーツ各アシル−Ｌ−カルニ
チン１ｍＭを含有する１００ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）　１−に本発明酵素を０．１０　（１ｍｇ
）添加し、３７℃、３０分間インキュベイトした。また
別にラットの肝臓より精製した酵素を１０（２７，５■
）添加し３７℃、３０分間インキュベイトした。それぞ
れの反応液０．０１ｍ１を予め３７℃、５分間インキュ
ベイトしておいたＬ−カルニチンの測定法人の反応液１
−に添加し３７℃、２分間インキュベイトの後にＯ，Ｉ
Ｎ塩酸２ｍｌを添加し、Ａｓｓ。、を測定し生成された
Ｌ−カルニチンを測定した。次にこのときラットの肝臓
の酵素で処理した反応液に続けて本発明酵素を０．１ｕ
添加し３７℃、３０分間インキュベイトした後にその反
応液０．０１ｒｎｌ。
を用いて前述と同様にしてＡｓｓ。７．を測定し生成さ
れたＬ−カルニチンを測定した結果を表３に示した。そ
の結果、本発明酵素を用いて全てのアシル−し−カルニ
チンが理論量完全に加水分解されていると考えられる。
また、ラットの肝臓より精製した酵素を用いた結果は特
異性通りにアセチル−プロピオニル−以外のアシル−Ｌ
−カルニチンは完全に加水分解していると考えられ、次
に本発明酵素を添加することによって残されたアセチル
−プロピオニル−Ｌ−カルニチンが完全に加水分解され
ていると考えられた。
表　　３ 実施例８ 血清中のアシル−Ｌ−カルニチンの分別定量を本発明酵
素およびラットの肝臓の酵素を用いて試みた。
健常人男子（実施例４表中のサンプル１）の血清１ｍｉ
’にラットの肝臓より精製した酵素をＩｔｌ（２７，５
ｍｇ）添加し３７℃、３０分間インキュベイトし加水分
解反応液１を調製した。予め３７℃で５分間インキュベ
イトしておいたＬ−カルニチンの測定法への反応液１艷
に加水分解反応液１をＯ，１ｍｌ！添加し３７℃、５分
間のインキュベイトの後に＾３．。、。
を測定した（Ａ３．。、、＝０．１２１）。次に加水分
解反応液１０．９艷に本発明酵素０．０９０（０，９ｍ
ｇ）を添加し３７℃、３０分間インキュベイトし加水分
解反応液２を調製した。加水分解反応液１と同様にして
加水分解反応液２０．１−を用いてＡｓｓ。０．を測定
した（Ａｓｓ、ａｍ＝０．１４２）。
この結果実験に供した男子ｌの血清中のカルニチンのプ
ロフィールは表４のようになると考えられる。
表　　４ 実施例９ （反応液） ［Ｉａ］ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐ）１８．０） ［Ｉｂ） ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８，０） （Ｉｃ） ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐ）１８．０） 〔■〕 ００ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣｆ （ｐＨ９，５） ８ｍＭ チオＮＡＤ （シグマ社製） ０、２ｍＭ ＡＤＩＩ （オリエンタル酵母社製） 実施例８に用いたのと同じ健常人男子サンプル１の血清
２５−に予め、３７℃にて予備加温しである〔Ｉａ〕液
０．５ｍｌ！と［ＩＩ］液０．５ｍｆ！を加え３７℃に
て加温した。［ＩＩ）液添加後の３分目と５分目の４０
０ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を計算した（Ａ
（ｓＡｂｉ＋）。同様の操作を〔Ｉｂ〕液についても実
施し、吸光度差を求めた（Ｂ）。血清の代わりに、それ
ぞれ蒸留水、５０μＭＬ−カルニチン標準溶液を用い［
Ｉ　ａ〕を用いて、同様の操作を実施し、Ｒ，、Ｓを得
た。
以上の結果より遊離Ｌ−カルニチン、総カルニチン濃度
を以下の計算式により求めた。
（１）遊離Ｌ−カルニチン（μＭ） （２）　　４ｍカルニチン（μＭ） 更に、アセチル−およびプロピオニル−Ｌ−カルニチン
には作用しないラット肝臓由来のアシル−Ｌ−カルニチ
ンエステラーゼを含む〔ＩＣ〕液０、５ｍｌに前記血清
２５ｍ１を添加し、３７℃、３０分間加温ジアセチル−
、フロピオニル−Ｌ−カルニチン以外のアシル−Ｌ−カ
ルニチンを水解させた後、〔■〕液を０．５−加えて３
７℃に加温し、〔■〕液液添加後分目と５分目の４００
ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を求めた（Ｃ）。
アセチル−およびプロピオニル−Ｌ−カルニチンを含ま
ない総カルニチン濃度を次式により算出した。
Ｓ−Ｒ。
また、アセチル−およびプロピオニル−Ｌ−カルニチン
は次式により算出した。
それぞれの結果を下表にまとめた。この結果、サンプル
１の血清カルニチンのプロフィールは、実施例８の結果
とほぼ一致した。
４００ｎｍにおける３分目と５分目の吸光度差以下余白 実施例１０ 反応液 ４０ｍＭ　　）リス塩酸緩衝液（ｐ）１８．０）０．５
％　ポリオキシエチレン■ソルビタンモノオレエート（
和光紬薬工業社製） ５　ｍＭ　　ＮＡＤ” ５００　Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（アルカリゲ
ネス　エスピー、Ｎα９８１由来、東洋醸造社製） ０、１ｍＭアセチル−Ｌ−カルニチン ０、１ｍＭオクタノイル−Ｌ−カルニチン操作と結果 上記、反応液１−を小試験管に分取し、３７℃、５分間
インキュベイトした後にラットの肝臓から精製したアシ
ルカルニチンエステラーゼをＩＵ（２７，５ｍｇ）添加
し、３７℃で３０分間インキュベイトした後にＡ３４１
１ｎｍを測定した（＾、４ｏ、、＝　ｏ、　５６１）。
ここに５Ｎの塩酸を０．０２５−添加し、３７℃で１５
分間インキュベイトした後に５Ｎ水酸化カリウム０、０
２５ｍｅを添加して中和しＡ３４゜、、ヨを測定した（
Ａｓ４ｏｌ、−＝　０．０８）　。この反応液に新たに
５００ｍＭＮＡ［］＋をＯ，０ｌ−１５０００１１／ｍ
ＩＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼをＯ，０１ｌｎｌ、
及び本発明酵素を０．１１（１ｍｇ）添加し、３７℃、
３０分間インキュベイトした後にＡ３４゜７．を測定し
たくＡ５．。イ、＝　ｏ、　５９４）。
このように、まずラットの肝臓出来の酵素を用いてオク
タノイル−Ｌ−カルニチンを加水分解し。
生成されたＬ−カルニチンをＬ−カルニチンデヒドロゲ
ナーゼとＮＡＤ＋を用いてデヒドロカルニチンとＮＡＤ
旧こ変換した後に、生成されたＮＡ叶を塩酸を用いて酸
分解して消去した後に、新たにし一カルニチンデヒドロ
ゲナーゼとＮＡＤ＋、及び本発明酵素を添加することで
アセチル−Ｌ−カルニチンを良好に測定することができ
た。
実施例１１ く反応液組成〉 ５０ｍＭ　　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ１０，０
）５ｍＭ　　チオーＮＡＤ（シグマ社製）３０１／ｍＩ
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（アルカリゲネス　エ
スピーＮα９８１由来、東洋醸造社製） ０．５％　ポリオキシエチレン（イ）ソルビタンモノオ
レエート（和光紬薬社製） ０、１Ｍ　　塩化ナトリウム 各々２５０μＭのＬ−カルニチンとアセチル−Ｌカルニ
チンの混合溶液を５０ｍＭＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で調製した。このものを同じ＜　５０ｍＭ　）　リ
ス塩酸緩衝液（ｐ）１８．０）で５段階に希釈したもの
をサンプルとした。これら、５種類のサンプルをそれぞ
れ２本の試験管に０．５−ずつ分注し、３７℃にて予備
加温し、一方に実施例２のアシルカルニチンエステラー
ゼ酵素液（０，４１１１／ｍｌりを０．０５ｍ１！加え
（酵素処理したもの）、他方には蒸留水を０．０５ｍｊ
！添加しく酵素処理しないもの）、３７℃１５分間加温
した。予め３７℃にて予備加温しである上記組成の反応
液１−の中に、酵素処理したもの（図８中−〇−）、酵
素処理しないもめ（図８中−・−）それぞれにつき０．
１ｒｎｉずつを添加して３７℃１０分間加温したのち４
００ｎｍにおける吸光度を測定した。
サンプルの代わりに５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐｉ（
８．０）を用いたものをブランクとしてそれぞれの吸光
度からブランクの吸光度を差し引いた値を図８に示した
。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明アシルカルニチンエステラーゼの至適ｐＨ
を示す図面であり、図２は本発明アシルカルニチンエス
テラーゼのｐＨ安定性を示す図面であり、図３は本発明
アシルカルニチンエステラーゼの至適温度を示す図面で
あり、図４は本発明アシルカルニチンエステラーゼの熱
安定性を示す図面である。図５は、本発明アシルカルニ
チンエステラーゼ（○）及び水酸化カリウム（△）のオ
クタノイル−Ｌ−カルニチンの加水分解能を示す図面で
ある。図６はラット肝臓由来のアシルカルニチンエステ
ラーゼ（・）および本発明アシルカルニチンエステラー
ゼ（○）の熱安定性を示す図面である。凹７はラット肝
臓由来のアシルカルニチンエステラーゼ（・）と本発明
アシルカルニチンエステラーゼ（○）のオクタノイル−
Ｌ−カルニチンに対する活性を示す図面である。図８は
Ｌ−カルニチンとアセチル−し−カルニチンの混合溶液
における定量曲線を示す図面である。 以 上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピ
    オニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれた低級ア
    シル−Ｌ−カルニチンに基質特異性を有し、当該低級ア
    シル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１
    モルの低級脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する
    反応を触媒するアシルカルニチンエステラーゼ。 ２、下記の理化学的性質を有する請求項１記載のアシル
    カルニチンエステラーゼ。 （１）分子量：６３０００±７０００（ゲル濾過法） （２）等電点：ｐＨ５．１±０．５ （３）Ｋｍ値：４×１０＾−＾５Ｍ（アセチル−Ｌ−カ
    ルニチンに対し）、３×１０＾−＾５Ｍ（プロピオニル
    −Ｌ−カルニチンに対し） （４）至適ｐＨ：ｐＨ８付近 （５）ｐＨ安定性：６０℃、３０分間の条件において、
    少なくともｐＨ７．５〜８．５で安定である （６）至適温度：ｐＨ８．０の１００ｍＭトリス塩酸緩
    衝液条件において、７０℃付近で最大活性を有する３、
    アルカリゲネス属に属するアシルカルニチンエステラー
    ゼ生産菌を培地に培養し、得られた培養物からアシルカ
    ルニチンエステラーゼを採取することを特徴とするアシ
    ルカルニチンエステラーゼの製造法。 ４、アルカリゲネス属に属するアシルカルニチンエステ
    ラーゼ生産菌が、アルカリゲネス・エスピーＮｏ．９８
    １〔微工研条寄第２５７０号（ＦＢＲＭＢＰ−２５７０
    ）〕である請求項３記載のアシルカルニチンエステラー
    ゼの製造法。 ５、被検液に、少なくともアセチル−Ｌ−カルニチンお
    よびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ば
    れた低級アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異性を有し、
    当該低級アシル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１
    モルから１モルの低級脂肪酸と１モルのＬ−カルニチン
    を生成する反応を触媒するアシルカルニチンエステラー
    ゼを作用せしめ、次いで生成した脂肪酸または／および
    Ｌ−カルニチンを定量することを特徴とする被検液中の
    アシル−Ｌ−カルニチンの測定法。 ６、被検液中のアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピ
    オニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれた少なく
    とも１種の低級アシル−Ｌ−カルニチンの測定において
    、 （ａ）アセチル−Ｌ−カルニチン及びプロピオニルＬ−
    カルニチンを基質とせず、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カ
    ルニチンに基質特異性を有し、当該中鎖乃至長鎖アシル
    −Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１モル
    の脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応を触
    媒するアシルカルニチンエステラーゼを被検液に作用せ
    しめて生成した脂肪酸または／およびＬ−カルニチンを
    定量する工程、および （ｂ）少なくともアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロ
    ピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれた低級
    アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異性を有し、当該低級
    アシル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから
    １モルの低級脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成す
    る反応を触媒するアシルカルニチンエステラーゼを被検
    液に作用せしめ、次いで生成した脂肪酸または／および
    Ｌ−カルニチンを定量する工程を行い、 （ｃ）次いで、工程（ａ）と工程（ｂ）との定量値の差
    異を測定することを特徴とする、被検液中のアセチルＬ
    −カルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンから
    なる群より選ばれた少なくとも１種の低級アシル−Ｌ−
    カルニチンの測定法。 ７、工程（ａ）に使用するアセチル−Ｌ−カルニチンお
    よびプロピオニル−Ｌ−カルニチンを基質とせず、中鎖
    乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異性を有し、
    当該中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ−カルニチンの１モルと水
    分子の１モルから１モルの脂肪酸と１モルのＬ−カルニ
    チンを生成する反応を触媒するアシルカルニチンエステ
    ラーゼが、ラット由来のアシルカルニチンエステラーゼ
    である請求項６記載の測定法。 ８、生成したＬ−カルニチンの定量が、反応液にＬ−カ
    ルニチンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ類またはチオＮＡＤ
    類、および必要に応じて非イオン性界面活性剤を含有す
    る試薬を作用せしめて、反応にて生成する還元型ＮＡＤ
    類または還元型チオＮＡＤ類の量の測定である請求項５
    または請求項６記載の測定法。 ９、生成したＬ−カルニチンの定量が、反応液にＬ−カ
    ルニチンデヒドロゲナーゼ、Ａ＿１およびＢ＿１を含有
    する試薬を作用せしめて、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し式中、Ａ＿１はチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類を示
    し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生成物を示し、Ｂ＿１はＡ
    ＿１がチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤ類をＡ＿１が
    ＮＡＤのときは還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２はＢ
    ＿１の酸化型生成物を示す）で表わされるサイクリング
    反応を形成せしめて、当該反応によって消費されるＢ＿
    １または／および生成するＡ＿２の量の測定である請求
    項５または請求項６記載の測定法。 １０、生成した脂肪酸の定量が、液体クロマトグラフィ
    ーまたはガスクロマトグラフィーにより行われるもので
    ある請求項５または請求項６記載の測定法。 １１、被検液中のアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロ
    ピオニル−Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれた少な
    くとも１種の低級アシル−Ｌ−カルニチンの測定におい
    て、 （α）アセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル−
    Ｌ−カルニチンを基質とせず、中鎖乃至長鎖アシル−Ｌ
    −カルニチンに基質特異性を有し、当該中鎖乃至長鎖ア
    シル−Ｌ−カルニチンの１モルと水分子の１モルから１
    モルの脂肪酸と１モルのＬ−カルニチンを生成する反応
    を触媒するアシルカルニチンエステラーゼを被検液に作
    用せしめ、生成したＬ−カルニチンにＬ−カルニチンデ
    ヒドロゲナーゼおよびＡ＿１（但しＡ＿１はチオＮＡＤ
    類またはＮＡＤ類を示す）を作用せしめてＡ＿１をＡ＿
    ２（Ａ＿２はＡ＿１の還元型生成物を示す）となし、つ
    いで生成したＡ＿２を分解せしめ、 （β）得られた反応液に、少なくともアセチル−Ｌ−カ
    ルニチンおよびプロピオニル−Ｌ−カルニチンからなる
    群より選ばれた低級アシル−Ｌ−カルニチンに基質特異
    性を有し、当該低級アシル−Ｌ−カルニチンの１モルと
    水分子の１モルから１モルの低級脂肪酸と１モルのＬ−
    カルニチンを生成する反応を触媒するアシルカルニチン
    エステラーゼを作用せしめ、次いで当該反応によって生
    成したＬ−カルニチンを定量することを特徴とする、被
    検液中のアセチル−Ｌ−カルニチンおよびプロピオニル
    −Ｌ−カルニチンからなる群より選ばれた少なくとも１
    種の低級アシル−Ｌ−カルニチンの測定法。 １２、工程（β）にて生成したＬ−カルニチンの定量が
    、反応液にＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ類
    またはチオＮＡＤ類、および必要に応じて非イオン性界
    面活性剤を含有する試薬を作用せしめて、反応にて生成
    する還元型ＮＡＤ類または還元型チオＮＡＤ類を測定す
    ることにより行われるものである請求項１１記載の測定
    法。 １３、工程（β）にて生成したＬ−カルニチンの定量が
    、反応液にＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ、Ａ＿１お
    よびＢ＿１を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し式中、Ａ＿１チオＮＡＤ類またはＮＡＤ類を示し
    、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿
    １がチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１が
    ＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２は
    Ｂ＿１の酸化型生成物を示す）で表わされるサイクリン
    グ反応を形成せしめて、当該反応によって消費されるＢ
    ＿１または／およびＡ＿２の量を測定することにより行
    われるものである請求項１１記載の測定法。
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