JP2000093196A - カイロイノシトールの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 少なくともミオイノシトール及びカイロイノ
シトールを含有する被検液中のカイロイノシトールを、
実質的にミオイノシトールの影響を受けることなく、正
確、簡便、安価に定量するための定量法を提供する。 【解決手段】 少なくともミオイノシトール及びカイロ
イノシトールを含有する被検液に、カイロイノシトール
よりもミオイノシトールに特異性が高いデヒドロゲナー
ゼを作用せしめて、ミオイノシトールをミオイノソース
２となし、次いで少なくともカイロイノシトールに作用
するデヒドロゲナーゼを用いてカイロイノシトールを定
量する定量方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、少なくともミオイ
ノシトールとカイロイノシトールを含有する液体に、カ
イロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性の高
いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミオイノシトール
をミオイノソース２となすことを特徴とする、カイロイ
ノシトールの定量方法、定量用組成物、純化方法に関す
る。

【０００２】本発明を更に詳しく言えば、少なくともミ
オイノシトールとカイロイノシトールを含有する被検液
に、カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異
性の高いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミオイノシ
トールをミオイノソース２となし、次いで少なくともカ
イロイノシトールに作用する酵素を用いてカイロイノシ
トールを定量することを特徴とするカイロイノシトール
の定量方法及び、定量用組成物、さらに少なくともミオ
イノシトールとカイロイノシトールを含有する液体に、
カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性の
高いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミオイノシトー
ルをミオイノソース２となすことを特徴とするカイロイ
ノシトールの純化方法に関し、臨床生化学検査、食品検
査などにおけるカイロイノシトールの測定に有用な定量
分析法及び定量用組成物、及びカイロイノシトールの簡
便、安価な純化方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】生体中のカイロイノシトールの定量は、
糖尿病状態の診断に有用であり、特にＩＩ型糖尿病をは
じめとする耐糖能障害の原因であるインスリン抵抗性の
指標になると考えられている〔Ｌａｒｎｅｒ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，３
７３−３７８（１９９０）、特表平４−５０４００１号
公報（国際公開番号ＷＯ９０／１０７１１）、特表平４
−５０５２１８号公報（国際公開番号ＷＯ９１／１２３
３５）〕。またカイロイノシトールは、インスリン非依
存性糖尿病の治療薬、または予防薬として注目されてい
る（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ，４，６３７
−６３８，１９９３）。

【０００４】カイロイノシトールを測定する意義につい
て、前記の特表平４−５０４００１号公報および特表平
４−５０５２１８号公報には、糖尿病前期におけるイン
スリン抵抗性を把握するに当たり、体液（血液、尿）中
のカイロイノシトールの定量が有用であることが示され
ており、酵素を用いた還元／酸化分析、ペーパークロマ
トグラフィーによる分離について示唆しているが、何ら
具体的方法は提案されていない。

【０００５】カイロイノシトールを定量する方法に関し
て、以下の（ａ）、（ｂ）が知られている。 （ａ）ＧＣ−Ｍａｓｓにて定量した報告〔Ｔｏｓｈｉｍ
ｉｔｓｕ Ｎｉｗａ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ，２２７（１９８３），２５−３９，Ｔｏｓｈｉｍｉ
ｔｓｕ Ｎｉｗａ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ，３３６（１９８４），３４５−３５０〕 （ｂ）カイロイノシトールに特異的な抗体を用いた免疫
測定法（特開平８−２１８３５号公報） 前記（ａ）の方法は前処理が必要で、しかも操作が煩雑
であるために、多検体処理が困難である。また、前記
（ｂ）の免疫化学的な方法は、高感度な反面、酵素を用
いた生化学的な測定法に比べ再現性、生体中に多量に存
在する低分子の影響、単位時間あたりの検体処理能力、
コスト等の点で問題がある。

【０００６】精度が高く、簡便かつ安価なカイロイノシ
トールの定量方法を提供する上で酵素法は最も適切な方
法の一つであると考えられる。しかし、生体中に存在す
るカイロイノシトールの濃度は非常に低く、一方カイロ
イノシトールの立体異性体に相当するミオイノシトール
は比較的多量に存在すること〔Ｌａｒｎｅｒ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３，３
７３−３７８（１９９０）〕が知られており、さらに、
糖尿病を発症すれば、生体中のカイロイノシトールは減
少し、ミオイノシトールは増加すること〔Ｌａｒｎｅｒ
Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，
３２３，３７３−３７８（１９９０）〕が知られてお
り、ミオイノシトールの影響を回避してカイロイノシト
ールのみを正確に定量することが重要である。

【０００７】また、カイロイノシトールを得る方法とし
ては次の（ｃ）〜（ｇ）が知られている。 （ｃ）ピニトールを含有する植物から、適当な溶媒でピ
ニトールを抽出し、次に脱メチル化を行いカイロイノシ
トールを得る方法、及びカイロイノシトールを微量含有
する植物からカイロイノシトールを抽出精製する方法
（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，３２，１２
８９−１２９１，１９８４）。

【０００８】（ｄ）カスガマイシンを酸で加水分解し、
カイロイノシトールを得る方法（米国特許第５，０９
１，５９６号明細書、特開平７−５３４２５号公報）。 （ｅ）化学合成にてカイロイノシトールを合成する方法
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５８，２３３１−２３３
３，１９９３、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ
Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，７４１−７４３，１９９
３）。

【０００９】（ｆ）ミオイノシトールをカイロイノシト
ールに変換する方法（Ｍｏｎａｔｃｈ．Ｃｈｅｍ．，１
０２，４５９〜４６４，１９７１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２６７，１６９０４〜１６９１０，１９９
２）。 （ｇ）ミオイノシトールからカイロイノシトールを含む
ミオイノシトール立体異性体の混合物を得る方法（Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６６，１
７１〜１８０，１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１２，４７０５−４７１２，１９７３、特開平９−１４
０３８８号公報）。

【００１０】前記（ｃ）に記載の方法は、植物中に於け
る含有量が少ないために、抽出、精製が困難で収率が低
く、（ｅ）に記載の化学的な合成法は立体特異的な合成
が必要とされるため、反応収率が低く、何れも工業的規
模の製造には必ずしも満足しうるものではない。また前
記（ｄ）に記載のカスガマイシンを酸で加水分解し、カ
イロイノシトールを得る方法は精製工程が煩雑である。

【００１１】一方前記（ｆ）、（ｇ）に記載のミオイノ
シトールをカイロイノシトールに変換する方法、及びミ
オイノシトールからカイロイノシトールを含むミオイノ
シトール立体異性体の混合物を得る方法を用いれば、安
価なミオイノシトールからカイロイノシトールを安価に
製造することが可能となると考えられるが、多量に含ま
れる原料のミオイノシトールと生成したカイロイノシト
ールを分離する必要がある。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、少なくとも
ミオイノシトールとカイロイノシトールを含有する被検
液に、カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特
異性の高いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミオイノ
シトールをミオイノソース２となし、次いで少なくとも
カイロイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼを用い
て、カイロイノシトールを正確、簡便、安価に定量する
定量用組成物およびその定量方法、さらに、少なくとも
ミオイノシトールとカイロイノシトールを含有する液体
に、カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異
性の高いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミオイノシ
トールをミオイノソース２となし、簡便、安価にカイロ
イノシトールを純化しうるカイロイノシトールの純化方
法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
めには、カイロイノシトールよりもミオイノシトールに
特異性の高いデヒドロゲナーゼ、好ましくは実質的にカ
イロイノシトールに作用せずに、少なくともミオイノシ
トールに作用するデヒドロゲナーゼを用いて、少なくと
もミオイノシトールとカイロイノシトールを含む液体中
のミオイノシトールを選択的にミオイノソース２に変換
すれば良い。そこで本発明者らは、鋭意検討を重ね、自
然界より幅広く酵素をスクリーニングした結果、静岡県
三島市壱町田付近の土壌より採集したクレブシーラ・ニ
ューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）属に属するクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６５０６）株由来のデヒドロゲナーゼが
カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性が
高く、実質的にカイロイノシトールに作用せずに少なく
ともミオイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼであ
ることを見出した。

【００１４】また、少なくともミオイノシトールとカイ
ロイノシトールを含む液体に、本酵素を作用せしめて、
ミオイノシトールをミオイノソース２となし、次いで少
なくともカイロイノシトールに作用するデヒドロゲナー
ゼを用いてカイロイノシトールを測定することによりミ
オイノシトールの影響を小さくして正確にかつ簡便にカ
イロイノシトールが測定できること、さらに少なくとも
ミオイノシトールとカイロイノシトールを含む液体に、
本酵素を作用せしめて、ミオイノシトールをミオイノソ
ース２となすことにより、簡便にカイロイノシトールを
純化できることを見出した。

【００１５】加えて酵素反応で生じたミオイノソース２
はアルカリ性、高温、酸化剤の存在下分解することか
ら、カイロイノシトールの測定系がミオイノソース２の
影響を受ける場合、特にイノシトールとイノソースの間
で酵素サイクリング反応を形成せしめる高感度測定法
〔特願平９−０７２８７８号（１９９７年３月２８日出
願）〕を用い、かつサイクリング反応がミオイノソース
２の影響を受ける場合にも、特異的にカイロイノシトー
ルを測定できること、またカイロイノシトールの純化法
に於いて、カイロイノシトールの純化をさらに簡便な方
法を用いて行えることを見出し、本発明の完成に至っ
た。

【００１６】すなわち、本発明は、少なくともミオイノ
シトールとカイロイノシトールを含有する被検液に、カ
イロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性の高
いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミオイノシトール
をミオイノソース２となし、次いで少なくともカイロイ
ノシトールに作用するデヒドロゲナーゼを用いてカイロ
イノシトールを定量することを特徴とする定量法、ま
た、カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異
性の高いデヒドロゲナーゼ、及び、少なくともカイロイ
ノシトールに作用するデヒドロゲナーゼを含有してなる
定量用組成物、更にまた少なくともミオイノシトールと
カイロイノシトールを含有する液体に、カイロイノシト
ールよりもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲ
ナーゼを作用せしめて、ミオイノシトールをミオイノソ
ース２となすことを特徴とするカイロイノシトールの純
化方法に関する。

【００１７】以下、この発明の構成及び好ましい形態に
ついて更に詳しく説明する。本発明において、ミオイノ
シトールをミオイノソース２となすデヒドロゲナーゼ
は、カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異
性が高い、好ましくは実質的にカイロイノシトールに作
用しない、少なくともミオイノシトールに作用するデヒ
ドロゲナーゼであれば何れのものでも使用できるが、そ
の具体例としてクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６５０６）が生産する酵素が挙げられる。

【００１８】またカイロイノシトール定量に使用するデ
ヒドロゲナーゼとしては、少なくともカイロイノシトー
ルに作用するデヒドロゲナーゼであれば何れのものでも
使用できるが、その具体例としては上記の特願平９−０
７２８７８号に記載のバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｐ．）Ｎｏ．３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８
１）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１２１５（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６２７０）が生産する酵素が挙げられ
る。

【００１９】クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６５０６）由来の酵素は、ミオイノシトール
に作用し、かつ実質的にカイロイノシトールに作用しな
いことから、臨床化学検査、食品検査等において、少な
くともミオイノシトールとカイロイノシトールを含有す
る被検液に、カイロイノシトールよりもミオイノシトー
ルに特異性の高いデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ミ
オイノシトールをミオイノソース２となし、次いで少な
くともカイロイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼ
を用いてカイロイノシトールを定量することを特徴とす
る定量法及び定量用組成物に適し、ミオイノシトール及
びカイロイノシトールの少なくとも両成分を含有する生
体液等の被検液中のカイロイノシトールの定量に好適で
あり、更にまた、少なくともミオイノシトールとカイロ
イノシトールを含有する液体に、カイロイノシトールよ
りもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲナーゼ
を作用せしめて、ミオイノシトールをミオイノソース２
となすことを特徴とするカイロイノシトールの純化方法
に適している。

【００２０】なお、クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株
は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６５０６（受託日；平成１０年９月１７
日）として寄託されており、バチルス・エスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｎｏ．３は通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５
８８１（受託日；平成９年３月１９日）として寄託され
ている。またアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１２１
５株は、茨城県つくば市観音台２丁目１番２号所在の農
林水産省農業生物資源研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）の菌株リスト番号ＭＡＦＦ３０
１７２６であり、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７０（受託日；平成１
０年２月２６日）として寄託されている。

【００２１】クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ６５０６）株の菌学的性質は、下記に示す通り
である。 試験項目 結果 形態 短桿菌 グラム染色 − 胞子 − 運動性 − 酸素に対する態度 通性嫌気性 オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ ＯＦ Ｆ 乳糖からのガス生成 ＋ 集落の色調 特徴的集落色素を生成せず オルニチンデカルボキシラーゼ − アルギニンジヒドロラーゼ − リジンデカルボキシラーゼ ＋ ウレアーゼ ＋ リパーゼ − β−グルコシダーゼ ＋ Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ − β−ガラクトシダーゼ ＋ α−グルコシダーゼ − α−ガラクトシダーゼ ＋ β−グルクロニダーゼ − α−マルトシダーゼ − Ｌ−アスパラギン酸アリルアミダーゼ −

【００２２】 酸の生成 Ｌ−アラビトール − Ｄ−ガラクツロン酸 ＋ ５−ケトグルコン酸カリウム − ピルビン酸ナトリウム − Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−マルトース ＋ グルコース ＋ シュークロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−アラビトール ＋ トレハロース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ イノシトール ＋ アドニトール ＋ パラチノース ＋ Ｄ−セロビオース ＋ Ｄ−ソルビトール ＋ インドールの生成 − マロン酸の利用 −

【００２３】本菌はグラム陰性の短桿菌で、胞子を形成
しない通性嫌気性菌であること、運動性がないこと、乳
糖からのガス生成があること等から大腸菌群であり、カ
タラーゼ産生、ウレアーゼ産生等の酵素産生能、糖から
の酸の生成等から、クレブシーラ・ニューモニエ・サブ
エスピー・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）と同定され、本菌株をクレブシーラ・ニューモニエ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ
２４株と命名した。

【００２４】バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）Ｎｏ．３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８１）の菌
学的性質を下記に示す。 （ａ）形態学的な特徴 端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で大きさ
は０．５〜０．７×１．５〜３．５μｍで周毛で運動す
る。端または亜端に０．８×１．０〜２．０μｍの楕円
から卵形の芽胞を形成し、芽胞によって菌体は膨張す
る。多形性なし。

【００２５】（ｂ）各培地における生育状態 各種培地上で、１〜２日、５０〜５２℃で培養、観察し
た所見を下記に示す。 １）普通寒天平板培地 円形で丘状（ｃｏｎｖｅｘ）の集落を形成する。表面は
滑らかで縁は丸い。黄土色〜淡黄土色を呈するが、可溶
性色素は産生しない。 ２）普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。黄土色〜淡黄土色を呈するが、
可溶性色素は産生しない。 ３）液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。 ４）リトモスミルク培地 ４〜５日後、弱酸性になる。 ＤＮＡのＧＣモル％：４１．９％（ＨＰＬＣ法） 主たるイソプレノイドキノン：ＭＫー７

【００２６】（ｃ）生理的、生化学的性質〔＋；陽性、
（＋）；弱陽性、−；陰性、ＮＴ；未実験〕 グラム染色 ＋ ＫＯＨ反応 − カプセル形性 − 抗酸性染色 − ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ） ＮＴ ＯＦテスト（Ｎ源にＮＨ₄ Ｈ₂ ＰＯ₄ ） Ｆ 好気での生育 ＋

【００２７】 ゼラチンの分解 − 澱粉の分解 （＋） カゼインの分解 − エスクリンの分解 ＋ チロシンの分解 − アルギニンの分解 − セルロースの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） − ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ） − アセトイン産生（ＮａＣｌ） − ＭＲテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （ＮＯ₂ ^- の検出） − （ＮＯ₃ ^- の検出） ＋

【００２８】シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 − クリステンゼン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 − マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 ＋ グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 −

【００２９】各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース − セロビオース ＋ ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース ＋ フコース ＋ ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン ＋ ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフィノース − ラムノース ＋ Ｄ−リボース ＋ サリシン ＋ Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 ＋ サッカロース ＋ トレハロース ＋ キシロース −

【００３０】以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陽
性の桿状細菌で、大きさは、０．５〜０．７×１．５〜
３．５μｍ、周毛で運動、芽胞形成、多形性なし、グル
コースを発酵的に分解し、酸を産生する。カタラーゼ・
オキシダーゼ産生。高温性の通性嫌気性であり、これら
のグラム陽性桿菌で芽胞を形成し、好気で生育する特徴
から、バチルス属に属すると判断された。

【００３１】そこで、本菌株がバチルス属のどの種に属
するか否かを同定した。即ち、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２によれば、高温（５０℃）で
生育する菌種はバチルス・アシドカルダリウス（Ｂ．ａ
ｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・サブチリス
（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・バジウス（Ｂ．
ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉ
ｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・パントセンチカス（Ｂ．
ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ）、バチルス・シェゲリ
（Ｂ．ｓｃｈｅｇｅｌｌｉ）、バチルス・ステアロサー
モフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）の９菌種が記載されている。

【００３２】これらの内で、嫌気下で生育する菌種はバ
チルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ；以
下、「Ｃ」と略記する事がある）とバチルス・リケニフ
ォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ；以下、
「Ｌ」と略記する事がある）の２菌種のみである。すな
わち、ＣおよびＬと本菌とを対比した結果は、次の通り
である。

【００３３】尚、Ｃ、Ｌおよび本菌で示される「＋」は
陽性、「（＋）」は弱陽性、「−」は陰性、「ｄ」は菌
株によって異なる、ＮＤはデーター無しであることを示
す。 Ｃ Ｌ 本菌 オキシダーゼ産生 − ｄ ＋ 芽胞による膨張 ｄ − ＋ 嫌気生育 ＋ ＋ ＋ アセトイン産生 ＋ ＋ − グルコース（酸） ＋ ＋ ＋ Ｌ・アラビノース（酸） ＋ ＋ ＋ キシロース ｄ ＋ − マンニット（酸） ｄ ＋ ＋ カゼイン分解 ｄ ＋ − ゼラチン分解 ｄ ＋ − デンプン分解 − ＋ （＋） クエン酸塩利用 ＋ ＋ − プロピオン酸塩利用 ｄ ＋ − チロシン分解 − ＋ − ＬＶ反応 − ＋ −

【００３４】 インドール産生 − ＋ − 食塩耐性 ２％ ＋ ＋ ＋ ５％ − ＋ − ７％ − ＋ − １０％ − ＮＤ − 生育温度 ４０℃ ＋ ＋ ＋ ５０℃ ＋ ＋ ＋ ５５℃ ＋ ＋ ＋ ６０℃ ＮＤ ＮＤ ＋ ７０℃ − − − 硝酸塩還元 ｄ ＋ − ＤＮＡのＧＣモル％ 44.5 46.4 41.9 （Type) (Type) 44.3 42.9 〜50.3 〜49.9

【００３５】以上対比した結果によれば、本菌株の諸性
状はバチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎ
ｓ）に近いと考えられるが、アセトイン産生能、ＤＮＡ
のＧＣモル％、また上記対比表には載せていないが、リ
トモスミルク培地での反応も違っている。よって、本菌
株を公知のものと区別するため、バチルス・エスピー
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｎｏ．３と命名した。

【００３６】純粋な酵素の取得は、上記のクレブシーラ
属に属する、カイロイノシトールよりもミオイノシトー
ルに特異性の高いデヒドロゲナーゼ生産菌、好適にはク
レブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５
０６）株、及びバチルス属、アグロバクテリウム属に属
する少なくともカイロイノシトールに作用するデドロゲ
ナーゼ生産菌、好適にはバチルス・エスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｎｏ．３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８
１）株、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１２１５株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７０）を適当な培地で培養し、
公知の蛋白質、酵素等の単離、精製手段を用いることに
より得られる。

【００３７】本発明に使用した生産菌としては、上記の
クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
５０６）株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）Ｎｏ．３（ＦＥＲＭＢＰ−５８８１）株、アグ
ロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１２１５株が挙げられる
が、細菌の一般的性状として菌学上の性質は変異しうる
ものであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外線
照射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタ
ンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異し
うる人工変異株は勿論、自然変異株も含め、クレブシー
ラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、ミオイノシトー
ルよりもカイロイノシトールに特異性の高いデヒドロゲ
ナーゼを生産する能力を有する菌株、また、バチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、少なくともカイロイ
ノシトールに作用するデヒドロゲナーゼを生産する能力
を有する菌株は、すべて本発明に使用することができ
る。

【００３８】また上記デヒドロゲナーゼを発現する遺伝
子を、微生物に導入した形質転換微生物も使用できる。
上記の培養は、細菌の培養に一般的に用いられる条件に
よって行うことができる。培地としては微生物が同化し
うる炭素源、消化しうる窒素源、さらには必要に応じ、
無機塩などを含有させた栄養培地が使用される。同化し
うる炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッ
カロース、イノシトール、などが単独または組み合わせ
て用いられる。消化しうる窒素源としては、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、等が単独または組み合わ
せて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、
その他、鉄、マンガン等の種々の重金属塩等が使用され
る。また上記以外に公知の同化しうる炭素源、消化しう
る窒素源が使用できる。

【００３９】培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行うのが良く、工業的には深部通気
攪拌培養が望ましい。培養温度は生産菌が発育し、前記
の酵素を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は２
０〜６０℃、バチルス・エスピーＮｏ．３株では、特に
５０℃付近が、クレブシーラ・ニューモニエＴＫ２４
株、アグロバクテリウム・リゾゲネス１２１５株は特に
３０℃付近が好ましい。培養時間は培養条件によって異
なるが、前期酵素が高力価に達する時期を見計らって適
当な時間培養すればよいが、通常は１〜２日程度であ
る。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速
度、通気性等に応じて好ましい結果が得られるように適
宜調節、選択される。また液体培養において発泡がある
場合は、シリコン油、植物油、等の消泡剤が適宜使用さ
れる。

【００４０】このようにして得られたデヒドロゲナーゼ
は、主として菌体内に含有されるので、得られた培養物
から濾過または遠心分離の手段により集菌し、この菌体
を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスビーズ処
理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やリゾチーム等の
酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合わ
せて、粗精製の酵素含有液が得られる。

【００４１】精製は、例えば、硫安、硫酸ナトリウム等
を添加する塩析沈殿法や、分子篩い、各種の樹脂を用い
たクロマトグラフィー、各種電気泳動、超遠心分離法、
各種脱塩法、加熱や化学薬品による処理、等を適宜組み
合わせて行う。例えばクロマトグラフィーとしては陽イ
オン、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルパーミエ
ーションクロマトグラフィー、分配、吸着クロマトグラ
フィー、順相、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等が使用でき
る。

【００４２】精製後の保存は液状、もしくは凍結乾燥品
を、冷蔵、凍結等の条件にて保存できる。また液状の保
存の場合、酵素を安定に保存する目的で、凍結乾燥時に
は溶解時の溶解性や溶解後の安定性を保つ目的で各種安
定化剤を例えば０．１〜５０％添加しても良い。安定化
剤としては糖類、例えばマンニトール、サッカロース、
ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタミン酸、グリ
シン等、ペプチドまたは蛋白質、例えばアルブミン等、
２価の金属イオン、例えば塩化マグネシウム等が挙げら
れる。

【００４３】精製されたクレブシーラ・ニューモニエ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ
２４株由来のカイロイノシトールよりもミオイノシトー
ルに特異性の高いデヒドロゲナーゼの性状は以下の通り
である。 （１）活性測定法 ＜反応液組成＞ １００ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５） ２０ｍＭ ミオイノシトール（シグマ社製、米国） ２ｍＭ ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） ５Ｕ／ｍｌ ジアフォラーゼ（旭化成工業社製、日本国） ０．０２５％ ニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＴＢと略す；和光純薬 社製、日本国）

【００４４】１．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１
００（和光純薬社製、日本国）上記反応液１ｍｌを小試
験管に入れ、３７℃で５分間インキュベート後に、適当
に希釈した酵素液２０μｌを添加して攪拌し、反応を開
始する。正確に５分間の反応後に０．１ＮのＨＣｌ（２
ｍｌ）を添加して攪拌し反応を停止する。５５０ｎｍに
於ける吸光度を測定し、Ａ１を求め、また上記反応液よ
りミオイノシトールを除いた反応液を用いて同様の測定
を行いその吸光度Ａ０を求める。酵素活性は下記の式よ
り算出する。

【００４５】 １８．３ ； ＮＴＢの分子吸光係数 ５ ； 反応時間 ３．０２； 総反応液量 ０．０２； 酵素液量 Ｂ ； 希釈倍率

【００４６】（２）酵素作用 少なくともミオイノシトールおよび補酵素（例示として
ＮＡＤとした）の存在下、ミオイノソース２及び還元型
補酵素を生成する下式の反応を触媒する。

【００４７】

【化１】 上記の補酵素に関しては、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類（以下ＮＡＤ類と略する）、例えば、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡ
Ｄ）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
（デアミノＮＡＤ）、ピリジンアルデヒドアデニンジヌ
クレオチド（アルデヒドＮＡＤ）、ピリジンアルデヒド
ヒポキサンチンジヌクレオチド（アルデヒドデアミノＮ
ＡＤ）が挙げられる。

【００４８】下記の相対活性測定法を用いた場合の酵素
反応の初速度、および、ＮＡＤの代わりにそれぞれ同濃
度の補酵素を用いた場合の酵素反応の初速度は、ＮＡ
Ｄ；９３ｍＡｂｓ／ｍｉｎ、アセチルＮＡＤ；６．１ｍ
Ａｂｓ／ｍｉｎ、デアミノＮＡＤ；５５．１ｍＡｂｓ／
ｍｉｎ、アルデヒドＮＡＤ；４．１ｍＡｂｓ／ｍｉｎで
あった。（ＮＡＤ；オリエンタル酵母社製、日本国、ア
セチルＮＡＤ、アルデヒドＮＡＤ、デアミノＮＡＤ；以
上シグマ社製、米国）

【００４９】＊相対活性測定法＊ ＜反応液組成＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ１０．０） 基質 ２０ｍＭ ミオイノシトール 補酵素 ２ｍＭ ＮＡＤ（オリエンタル酵母社
製、日本国） 上記の反応液１ｍｌを石英セルにとり、３７℃に温度コ
ントロールされている分光光度計にセットする。５分以
上インキュベートし、約１．０Ｕ／ｍｌの酵素溶液を２
０μｌを添加、攪拌する。それぞれの還元型補酵素に特
有な波長の、１分間当たりの吸光度変化より初速度を求
める。

【００５０】またミオイノシトールを基質とした場合の
反応生成物は、ペーパークロマトグラフィー（Ｊ．Ｂ．
Ｃ．，２４１，Ｎｏ４，８００−８０６，１９６６）お
よびミオイノソース２を用いた逆反応の確認にてミオイ
ノソース２が反応生成物であることを確認した。逆反応
の確認条件を下記に示す。

【００５１】＜反応液組成＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ１０．０） 基質 ２０ｍＭ ミオイノソース２（シグマ社
製、米国） 補酵素 １ｍＭＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社製、
日本国） 上記の反応液１ｍｌを石英セルにとり、３７℃に温度コ
ントロールされている分光光度計にセットする。５分以
上インキュベートし、約２０ｍＵ／ｍｌの酵素溶液を２
０μｌを添加、攪拌する。ＮＡＤＨに特有な３４０ｎｍ
の波長の、１分間当たりの吸光度変化より反応性を確認
する。

【００５２】（３）基質特異性 前記の相対活性測定法に従い、反応液中の２０ｍＭミオ
イノシトールに変えて同一濃度のＤ−マンノース、ラク
トース、スクロース、キシリトール、Ｄ−フルクトー
ス、Ｄ−ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、
グリセロール、Ｄ−カイロイノシトール、エピイノシト
ール、サイロイノシトールを測定した。ミオイノシトー
ルに対する反応初速度を１００とした場合の各基質にお
ける酵素活性を表１に示すが、本酵素は、カイロイノシ
トールよりもミオイノシトールに特異性が高く、実質的
にカイロイノシトールに作用しないデヒドロゲナーゼで
あることが明らかである。

【００５３】基質としては、Ｄ−マンノース、スクロー
ス、キシリトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、Ｄ−
カイロイノシトール（以上、和光純薬社製、日本国）、
ミオイノシトール、エピイノシトール、サイロイノシト
ール（以上、シグマ社製、米国）ラクトース；（ナカラ
イテスク；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製、日本
国）を用いた。

【００５４】

【表１】

【００５５】（４）至適ｐＨ １０付近（基質；ミオイノシトール） 前記の相対活性測定法を用い、反応液中の１００ｍＭの
ｐＨ１０．０グリシン緩衝液にかえて１００ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０，−□−）及び１００ｍＭ
グリシン緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０，−○−）の各
緩衝液を用いて測定した。各ｐＨにおける活性は図１に
示した通りであって、ｐＨ１０付近で最大の活性を示し
た。

【００５６】（４）分子量 ７５０００±１５０００ ＴＳＫゲルＧ３００ＳＷ（０．７５φ×６００ｍｍ）、
溶離液；５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）＋０．２
Ｍ Ｎａ₂ ＳＯ₄ ＋０．０５％ＮａＮ₃ 、分子量マーカ
ーはオリエンタル酵母社製（日本国）を使用した。クロ
マトグラフィー装置は島津社製装置（日本国）を使用し
た。ＵＶ２８０ｎｍ及びフラクションの活性測定にて検
出した。

【００５７】（５）熱安定性 本酵素液、約５Ｕ／ｍｌに１５分間の加熱処理を行っ
た。残存活性は前記の酵素活性測定法にて測定した。ま
た市販のミオイノシトールデヒドロケナーゼ〔シグマ社
製、米国 エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来〕の熱安定
性も同様に測定を行った。各温度の処理後の残存活性は
図２に示した通りで、本酵素は４０℃の処理まで安定で
あり（−□−）、市販酵素は熱処理に対し不安定であっ
た（−○−）。この市販のミオイノシトールデヒドロゲ
ナーゼもカイロイノシトールよりもミオイノシトールに
特異性が高いものであり、本発明に使用できるものであ
る。

【００５８】（６）Ｋｍ値 前記の相対活性測定法を用い、２０ｍＭのミオイノシト
ールの濃度及び、２ｍＭのＮＡＤの濃度を変化させそれ
ぞれのＫｍ値を測定した。 ミオイノシトールに対するＫｍ値；４９．６±５．０ｍＭ ＮＡＤに対するＫｍ値 ；１．５±０．２ｍＭ 次いで、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．）Ｎｏ．３株（以下Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３と略すること
がある）、及びアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１２
１５株（以下Ａ．ｒ．１２１５と略することがある）由
来の、少なくともカイロイノシトールに作用するデヒド
ロゲナーゼの性状は以下の通りである。

【００５９】（１）活性測定法 クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のデヒドロゲナ
ーゼ酵素活性測定法に於いて、２０ｍＭミオイノシトー
ルを同濃度のカイロイノシトール（和光純薬社製、日本
国）にかえて行う。

【００６０】（２）酵素作用 少なくともカイロイノシトールおよび補酵素の存在下、
還元型補酵素を生成する反応を触媒する。上記の補酵素
については、例えばＮＡＤ、アセチルＮＡＤ、アルデヒ
ドＮＡＤ、デアミノＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（チ
オＮＡＤＰ）が挙げられる。各補酵素を用いた場合の相
対活性比（ＮＡＤを補酵素として用いた場合を１００％
とする）は下記の表２に示すとおりである。

【００６１】また相対活性の測定はクレブシーラ・ニュ
ーモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）ＴＫ２４株由来のデヒドロゲナーゼと同じ方法に於
いて、２０ｍＭミオイノシトールを同濃度のＤ−カイロ
イノシトール（和光純薬社製、日本国）にかえて行い、
補酵素利用性は２ｍＭ ＮＡＤを同濃度の各補酵素に変
えて行った。（ＮＡＤ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮ
ＡＤＰ；以上オリエンタル酵母社製、日本国、アセチル
ＮＡＤ、アルデヒドＮＡＤ、デアミノＮＡＤ；以上シグ
マ社製、米国）。

【００６２】

【表２】

【００６３】（３）基質特異性 基質特異性は下記表３に示すとおりである。

【００６４】

【表３】

【００６５】基質特異性の測定は、下記の反応試薬を用
い、クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のデヒドロ
ゲナーゼと同様の方法で行った。基質はミオイノシトー
ルの代わりに同濃度のＤ−カイロイノシトール、サイロ
イノシトール、エピイノシトール、マンノース、フルク
トース、ソルビトール、マンニトール、グリセロールを
用い測定し、Ｄ−カイロイノシトールに対する活性を１
００％として計算を行った。Ｄ−カイロイノシトール、
マンノース、フルクトース、ソルビトール、マンニトー
ル、（以上和光純薬社製、日本国）ミオイノシトール、
サイロイノシトール、エピイノシトール（以上シグマ社
製、米国）

【００６６】 ＜＜反応液組成＞＞ ＜Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３由来＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液 ｐＨ９．８ 基質 ２０ｍＭ Ｄ−カイロイノシトール 補酵素 ２ｍＭ チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本） ＜Ａ．ｒ．１２１５由来＞ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液 ｐＨ８．５ 基質 ２０ｍＭ Ｄ−カイロイノシトール 補酵素 ２ｍＭ チオNADP（オリエンタル酵母社製、日本国）

【００６７】 （４）分子量 Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ．３由来；１３５、０００±１０、０００ Ａ．ｒ．１２１５由来 ；１０５、０００±１０、０００ クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のデヒドロゲナ
ーゼと同じ方法に於いて、基質ミオイノシトールをＤ−
カイロイノシトールに置き換えて測定した。

【００６８】（５）至適ｐＨ Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３由来；１１．０付近 Ａ．ｒ．１２１５由来；１０．０付近 クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のデヒドロゲナ
ーゼと同じ方法に於いて、基質ミオイノシトールを同濃
度のＤ−カイロイノシトールに置き換えて測定した。

【００６９】（６）熱安定性 Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３由来；６０℃、１５分の処理でほぼ１
００％の残存活性を有する。 Ａ．ｒ．１２１５由来；４０℃、１５分の処理でほぼ１
００％の残存活性を有する。 クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のデヒドロゲナ
ーゼと同じ方法に於いて、基質ミオイノシトールを同濃
度のＤ−カイロイノシトールに置き換えて測定した。

【００７０】（７）Ｋｍ値 Ｄ−カイロイノシトールに対するＫｍ値を示す。 Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３由来；５．２±０．５ｍＭ Ａ．ｒ．１２１５由来；２８．９±３．０ｍＭ Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３由来の酵素の補酵素に対するＫｍ値を
示す。 ＮＡＤ；０．５±０．１ｍＭ チオＮＡＤ；０．９±０．１ｍＭ Ｋｍ値の測定はクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来
のデヒドロゲナーゼと同じ方法に於いて、下記の反応試
薬を用いて測定した。

【００７１】 ＜＜反応液組成＞＞ ＜Ｂ．ｓｐ．Ｎｏ３由来＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液 ｐＨ１１．０ 基質 １０ｍＭ Ｄ−カイロイノシトール 補酵素 １ｍＭ ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） ＜Ａ．ｒ．１２１５由来＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液 ｐＨ１０．０ 基質 ２０ｍＭ Ｄ−カイロイノシトール 補酵素 ２ｍＭ チオNADP（オリエンタル酵母社製、日本国）

【００７２】本発明のカイロイノシトールの定量法、定
量用組成物、およびカイロイノシトールの純化法に用い
ることのできる、カイロイノシトールよりもミオイノシ
トールに特異性の高いデヒドロゲナーゼは、少なくとも
補酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡＤ）を用い、ミ
オイノシトールをミオイノソース２となすものであり、
カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性の
高い性質を有するデヒドロゲナーゼで有れば良く、本発
明の知見に基づき、これらの補酵素と基質を用いて確認
できるものである。

【００７３】さらにまた本発明のカイロイノシトールの
定量法、定量用組成物に用いることのできる少なくとも
カイロイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼは、少
なくともＮＡＤ（Ｐ）類〔好ましくはＮＡＤ（Ｐ）〕を
用い、カイロイノシトールに作用して、還元型補酵素を
生成するもので有れば良く、本発明の知見に基づき、こ
れらの補酵素と基質を用いて確認できるものである。

【００７４】ミオイノシトールからミオイノソース２を
生成する反応の液組成については、使用するカイロイノ
シトールよりもミオイノシトールに特異性の高いデヒド
ロゲナーゼの各種補酵素間のＫｍ値等を考慮して補酵素
を１種類またはそれ以上適宜選択し、その後、至適ｐＨ
の曲線から反応が効率よく進行するよう反応液ｐＨを適
宜設定すればよい。

【００７５】例えば前記したクレブシーラ属由来のカイ
ロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性の高い
デヒドロゲナーゼについてみれば、前記した補酵素を含
め、反応しうる補酵素で有れば何れの補酵素を用いても
良く、例えば前記補酵素の使用濃度としては０．０２ｍ
Ｍ〜１Ｍ程度で良いが、好適にはＮＡＤであり、例えば
ＮＡＤに対するＫｍ値は１．５ｍＭであるからＮＡＤの
濃度は０．０２Ｍ〜５００ｍＭ、好ましくは０．１〜１
００ｍＭであり、また酵素の量は０．０１〜１０００Ｕ
／ｍｌ、特に０．０５〜５００Ｕ／ｍｌが好ましく、ま
た至適ｐＨは１０付近であるから、反応のｐＨは８〜１
２、特に９〜１１が好ましいが、補酵素の量、酵素量、
反応のｐＨはカイロイノシトールを定量する被検液や、
カイロイノシトール純化時に用いる液体の種類や量等に
より適宜決定することができ、これ以外の量を用いるこ
ともできる。

【００７６】同様にカイロイノシトールを定量する酵素
反応液については、使用する少なくともカイロイノシト
ールに作用するデヒドロゲナーゼの各種補酵素間のＫｍ
値等を考慮して補酵素を１種類またはそれ以上適宜選択
し、その後、至適ｐＨの曲線から反応が効率よく進行す
るよう反応液ｐＨを適宜設定すればよい。例えば少なく
ともカイロイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼに
ついてみれば、前記した補酵素を含め、反応しうる補酵
素で有れば何れの補酵素を用いても良く、前記補酵素の
使用濃度としては０．０１〜１Ｍ程度でよく、また酵素
の量は０．０１〜１０００Ｕ／ｍｌ程度でよく、反応の
ｐＨは６〜１３付近でよいが、その補酵素量、酵素量、
ｐＨはカイロイノシトールを定量する被検液の種類や
量、さらに使用する酵素の性質等により適宜決定しても
良くこれ以外の量を用いることもできる。

【００７７】例えばバチルス属由来の酵素について見れ
ば、前記補酵素の使用濃度としては０．０１ｍＭ〜１Ｍ
程度で良いが、好適にはＮＡＤ、チオＮＡＤであり、例
えばＮＡＤに対するＫｍ値は０．５ｍＭであるからＮＡ
Ｄの濃度は０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０５
〜５０ｍＭであり、チオＮＡＤに対するＫｍ値は０．９
ｍＭであるからチオＮＡＤの濃度は０．０２〜１００ｍ
Ｍ、好ましくは０．１〜５０ｍＭであり、酵素の量は
０．０１〜１０００Ｕ／ｍｌ、特に０．０５〜５００Ｕ
／ｍｌが好ましく、また至適ｐＨは１１付近であるか
ら、反応のｐＨは６〜１３、特に８〜１２が好ましい。

【００７８】さらに例えばアグロバクテリウム属由来の
酵素について見れば、前記補酵素の使用濃度としては
０．０１ｍＭ〜１Ｍ程度で良いが、好適にはＮＡＤＰで
あり、同様にＮＡＤＰの濃度は０．０１〜１００ｍＭ、
好ましくは０．０５〜５０ｍＭであり、酵素の量は０．
０１〜１０００Ｕ／ｍｌ、特に０．０５〜５００Ｕ／ｍ
ｌが好ましく、また至適ｐＨは１０付近であるから、反
応のｐＨは６〜１２、特に８〜１１付近が好ましいが、
その量は、カイロイノシトールを定量する被検体の種類
や量等により適宜決定することができ、これ以外の量を
用いることもできる。

【００７９】以上のことから、カイロイノシトール定量
用組成物としては、カイロイノシトールよりもミオイノ
シトールに特異性が高いデヒドロゲナーゼ、及び、少な
くともカイロイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼ
を含有するものとして調整すれば良く、好ましくはこれ
に補酵素、好適にはＮＡＤを添加せしめて液状、液状の
凍結物、凍結乾燥品として提供できる。

【００８０】さらに本発明に基づくミオイノシトールか
らミオイノソース２を生成する反応、及びカイロイノシ
トールを定量する酵素反応組成には、例えば界面活性
剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択
して添加しても良い。

【００８１】適宜な添加物において、界面活性剤として
はポリオキシエチレンアルキルエーテル類〔例えばポリ
オキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ト
リトンＸ−１００）、ポリオキシエチレン（２３）ラウ
リルエーテル（以上、ナカライテスク社製、日本
国）〕、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
類〔；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
（ツイーン２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
パルミテート（ツイーン４０）、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノステアレート（ツイーン６０）、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン８
０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート
（ツイーン８５）（以上、関東化学社製、日本国）〕、
ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリ
グリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソル
ビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンポリオキ
シプロピレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル類、ポ
リオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド類、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテルリン酸・リン酸塩
類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類（以
上、ＮＩＫＫＯ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社製、日本国）、
ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステルコール酸
（和光純薬社製、日本国）、アデカトール７２０Ｎ、ア
デカトールＢ−７９５、アデカトールＳＯ−１２０、ア
デカノールＢ−７９５（以上、旭電化工業社製、日本
国）、、トリトンＸ−３０５、トリトンＸ−１１４、ト
リトンＸ−４０５、トリトンＷＲ−１３３９、（以上、
ナカライテスク社製、日本国）等の０．０１〜１０％、
好適には０．０５〜５％、各種金属塩類、例えば塩化リ
チウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガ
ン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウムの１ｍＭ
〜５Ｍ、好適には１０ｍＭ〜１Ｍ、各種緩衝液、例えば
トリス−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、燐酸
緩衝液、グッドの緩衝液等の１０ｍＭ〜２Ｍ、好適には
２０ｍＭ〜１Ｍ、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウム
の０．０１〜１０％、好適には０．０５〜１％を適宜添
加すればよい。

【００８２】またミオイノシトールをミオイノソース２
となした後のカイロイノシトールの検出は、補酵素の変
化量を、例えば補酵素としてＮＡＤを用いて生成される
変化の量として還元型補酵素である還元型ＮＡＤをその
極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて比色計
で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、もしく
は、たとえば生じた還元型補酵素を各種ジアフォラー
ゼ、またはフェナジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと
略す）、メトキシＰＭＳ、ジメチルアミノベンゾフェノ
キサジニウムクロライド（メルドラブルー）等の電子キ
ャリアー及びニトロテトラゾリウムに代表される各種テ
トラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に定量
するか、たとえば下記式に示すようなデヒドロゲナー
ゼ、オキシダーゼの組み合わせを適宜用い還元型補酵素
から過酸化水素を発生させ、生じる過酸化水素を公知の
方法を用い直接、間接的に測定してもよく、またこれ以
外の公知の方法により直接、間接的に測定してもよい。

【００８３】

【化２】

【００８４】式中デヒドロゲナーゼＡはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
類の存在下、基質Ａを基質Ｂに変換するデヒドロゲナー
ゼで有れば何れのデヒドロゲナーゼを使用しても良く、
またオキシダーゼＢは基質Ｂに作用し過酸化水素を生じ
るオキシダーゼで有れば何れのオキシダーゼを用いても
良いが、例えばｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９に
おいて、基質Ａにピルビン酸０．０１ｍＭ〜１Ｍ、好ま
しくは０．０５ｍＭ〜５００ｍＭを用いた場合には、ラ
クテートデヒドロゲナーゼ（旭化成工業社製、日本国）
０．００１〜５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１
００Ｕ／ｍｌが選択でき、生じた乳酸はラクテートオキ
シダーゼ（旭化成工業社製、日本国）０．００１〜５０
０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１００Ｕ／ｍｌを用
いることにより、Ｄ−カイロイノシトール量に比例した
過酸化水素を得ることができる。

【００８５】カイロイノシトールを純化する方法に於け
る、ミオイノシトールをミオイノソース２となした後の
カイロイノシトールの純化は、公知のカラムクロマトグ
ラフィー、例えば陽イオン交換クロマトグラフィー、陰
イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラ
フィー、電気泳動、再結晶、蒸発乾固等の公知の技術を
用いて行うことができる。

【００８６】またカイロイノシトールを定量するに当た
って、さらに高感度に定量する場合には、下記式で示さ
れる酵素サイクリング法を用いることができる。

【００８７】

【化３】 式中、生成物とはカイロイノシトールから２原子または
４原子の水素原子が引き抜かれた化合物を示し、Ａ１は
ＮＡＤ（Ｐ）類、またはチオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ａ
２はＡ１の還元型を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤ
（Ｐ）類の場合には還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を、Ａ１がＮ
ＡＤ（Ｐ）類の場合には還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す。

【００８８】酵素サイクリングを用いたカイロイノシト
ール定量反応の液組成については、使用するカイロイノ
シトールに作用するデヒドロゲナーゼの各種補酵素間の
Ｋｍ値等を考慮して補酵素を２種類またはそれ以上適宜
選択し、その後正反応／逆反応の至適ｐＨの間でｐＨ条
件を酵素的サイクリングが効率よく進行するように設定
すればよい。Ａ１、Ｂ１の量は被検体中のカイロイノシ
トールの量に比較して過剰量であり、またカイロイノシ
トールに作用するデヒドロゲナーゼのＡ１、Ｂ１に対す
るＫｍ値に比較しても過剰量であることが必要である。

【００８９】例えばバチルス属由来の少なくともカイロ
イノシトールに作用するデヒドロゲナーゼについてみれ
ば、Ｋｍ値はＮＡＤ、チオＮＡＤについてそれぞれ０．
５０、０．８７ｍＭと小さくチオＮＡＤ、ＮＡＤを補酵
素とし選択することができる。またサイクリング反応を
行う場合に、チオＮＡＤを用いた場合の正反応の至適ｐ
Ｈは１０．５付近であり、ＮＡＤＨを用いた逆反応の至
適ｐＨが１０付近であることからチオＮＡＤ、ＮＡＤＨ
を補酵素として選択しｐＨ１０付近でサイクリングを行
うと良い。

【００９０】Ａ１及びＢ１の濃度は０．０２ｍＭ〜２
Ｍ、特に０．０５〜１００ｍＭが好ましく、カイロイノ
シトールに作用する酵素の量は１〜１０００Ｕ／ｍｌ、
特に５〜５００Ｕ／ｍｌが好ましいが、その量は被検体
の種類や量等により適宜決定することができ、これ以外
の量用いることもできる。

【００９１】同様に例えばアグロバクテリウム属由来の
酵素については、チオＮＡＤＰ、ＮＡＤＰを補酵素とし
選択することができ、サイクリング反応はチオＮＡＤ
Ｐ、ＮＡＤＰＨを補酵素として選択しｐＨ１０付近でサ
イクリングを行うと良い。Ａ１及びＢ１の濃度は０．０
２ｍＭ〜２Ｍ、特に０．０５〜１００ｍＭが好ましく、
カイロイノシトールに作用する酵素の量は１〜１０００
Ｕ／ｍｌ、特に５〜５００Ｕ／ｍｌが好ましいが、その
量は被検体の種類や量等により適宜決定することがで
き、これ以外の量用いることもできる。

【００９２】このサイクリング反応においては、ミオイ
ノソース２が残存すれば、ミオイノシトールへの可逆反
応が生じ、その結果カイロイノシトールの定量に悪影響
を及ぼす場合があることから、ミオイノソース２を分
解、除去する事が望ましい。一方ミオイノソース２はア
ルカリ性で還元性を示し、室温に於いて徐々に分解する
こと、およびカイロイノシトールはアルカリ性にて安定
であることから、例えばｐＨ８〜１４、好ましくは９〜
１４において、室温にて一定時間放置すれば、ミオイノ
ソース２を分解することができ、ミオイノソース２の影
響を受けないカイロイノシトールの定量、特にミオイノ
ソース２の影響を受けない酵素サイクリングを用いた高
感度定量が可能になり、さらにカイロイノシトールの純
化においては、さらに簡便なカイロイノシトールの純化
が可能になる。

【００９３】さらに、ミオイノソース２を分解する反応
は加熱、例えば３７〜１００℃、好ましくは５０〜１０
０℃、及び酸化剤の添加、例えば酸化型補酵素、ＮＡ
Ｄ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ、アルデヒド
ＮＡＤ、デアミノＮＡＤ、アセチルＮＡＤ等を０．０１
ｍＭ〜１Ｍ好ましくは０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、その他
各種酸化剤、各種酸化力のある金属等により加速する事
ができるが、その量は、カイロイノシトール純化時に用
いる液体や、カイロイノシトールを定量する被検体の種
類や量等により適宜決定することができ、これ以外の量
用いることもでき、さらに適宜組み合わせても良い。

【００９４】また、カイロイノシトールの定量法、定量
用組成物に於いて、少なくともカイロイノシトールに作
用するデヒドロゲナーゼの性状により、カイロイノシト
ールの定量が、他の糖、例えばグルコース、ガラクトー
ス、フルクトース、マンノース、グルコサミン、リブロ
ース、キシルロース、アラビノース、フコース、アロー
ス等、またはポリオール、例えばグリセロール、ソルビ
トール、マンニトール等、または酸、例えばグルクロン
酸等によって影響を受ける場合には、あらかじめ、それ
ぞれの糖、ポリオール、酸等に作用し、かつカイロイノ
シトールには作用しない、デヒドロゲナーゼ、キナーゼ
若しくはオキシダーゼ等にて処理を行い、影響を回避す
ることができる。

【００９５】例えばグルコースの影響を受ける場合は、
カイロイノシトールを測定する前にヘキソキナーゼＩＩ
（旭化成工業社製、日本国）０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、
好ましくは０．５〜５０Ｕ／ｍｌ、及びＡＴＰ（オリエ
ンタル酵母社製、日本国）０．１〜１００ｍＭ、好まし
くは０．５〜５０ｍＭ、マグネシウム０．１〜１００ｍ
Ｍ、好ましくは０．５〜５０ｍＭを含む溶液で処理し、
グルコースをリン酸化し、処理すればよい。また例えば
ガラクトースの影響を受ける場合には、カイロイノシト
ールを測定する前にガラクトキナーゼ（シグマ社製、米
国）０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０
Ｕ／ｍｌ、及びＡＴＰ（オリエンタル酵母社製、日本
国）０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．５〜５０ｍ
Ｍ、マグネシウム０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．
５〜５０ｍＭを含む溶液で処理し、ガラクトースをリン
酸化し、処理すればよい。他糖、ポリオール、酸に対し
ても同様である。

【００９６】またカイロイノシトール定量の対象となる
被検液としては、例えば血液、尿、随液、血球、リンパ
液、組織抽出液などの生体液や食品抽出液等が挙げられ
るが、これ以外の被検液でもカイロイノシトールを含む
ものであれば何ら限定されるものはない。またカイロイ
ノシトールとしてはＤ体が好ましい測定対象物として挙
げられる。

【００９７】かくして、調製された本発明のカイロイノ
シトール定量用組成物によって、被検体中のカイロイノ
シトールを定量するには、カイロイノシトール定量用組
成物に被検体０．００１〜０．５ｍｌを加え、３７℃の
温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反
応開始後の一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、
例えば３分後と４分後の１分間、または３分ごと８分後
の５分間における変化した補酵素の量を直接または間接
的に測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合に
は反応開始後一定時間後の変化した補酵素の量を直接ま
たは間接的に測定すれば良い。この場合既知濃度のカイ
ロイノシトールを用いて測定した場合の吸光度等の変化
と比較すれば被検液中のカイロイノシトールの量を求め
ることができる。尚、本発明において変化した補酵素量
の測定にあたり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定
法を使用して定量を行うこともできる。

【００９８】また、本発明のカイロイノシトール純化方
法に使用しうるカイロイノシトールを含む液体として
は、少なくともミオイノシトールとカイロイノシトール
を含む液体であれば何れの液体でもかまわないが、例え
ばミオイノシトールをカイロイノシトールに変換する各
種の方法に於いて生じた、少なくともミオイノシトール
とカイロイノシトールを含む反応液、化学的に合成され
た少なくともミオイノシトールとカイロイノシトールを
含む反応液、植物や微生物から抽出した少なくともミオ
イノシトールとカイロイノシトールを含む反応液、等が
挙げられる。

【００９９】

【発明の実施の形態】ついで、本発明の実施例及び参考
例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定され
るものではない。

【０１００】

【参考例１】クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） ＴＫ２４；通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所； （受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０６）の培養、精製 酵母エキス（極東製薬社製、日本国）２％、ペプトン
（極東製薬社製、日本国）２％、グリセロール（和光純
薬社製、日本国）２％、リン酸２カリウム（和光純薬社
製、日本国）０．１％、グルコース（国産化学社製、日
本国）０．１％、ｐＨ７．０を含む液体培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分
加熱滅菌した後これにクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０６）株の１白金耳を接種し、
２８℃で１２０ｒｐｍの振とう培養器で２０時間培養し
て種母８５ｍｌ（酵素活性０．０４Ｕ／ｍｌ）を得た。

【０１０１】一方、上記と同様の培地組成にて消泡剤と
してディスフォームＢＣ５１Ｙ（日本油脂社製、日本
国）を０．１％添加した液体培地２０Ｌを３０Ｌ用ジャ
ーファメンターに仕込み加熱後滅菌した後に上記の種母
８５ｍｌを移植し、培養温度３０℃、通気量２０Ｌ／
分、内圧０．４ｋｇ／ｃｍ² 、攪拌速度２００ｒｐｍで
１６時間通気培養し、培養物２０Ｌ（酵素活性０．１２
Ｕ／ｍｌ）を得た。

【０１０２】得られ培養物を遠心分離で集菌し、これを
１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．０に分散させ、氷浴で冷
却しながら超音波処理を行い、菌体を可溶化した。可溶
化液は３０００ｒ．ｐ．ｍ．１５分の遠心分離を行い、
可溶化上清２．５Ｌ（２Ｕ／ｍｌ）を得た。

【０１０３】この酵素液を１０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．
５にて平衡化されたＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）Ｂ．Ｂ．（ファルマシアバイオテック；Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、スウェーデン国）
１．２５Ｌにかけ、０、０．１、０．２、０．３ＭのＫ
Ｃｌ（ナカライテスク；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ
社製、日本国）を含む同一の緩衝液にてステップワイズ
に溶出、活性のあるフラクション２．２Ｌ（１．５Ｕ／
ｍｌ）を得た。

【０１０４】得られた酵素液は４ＭになるようにＮａＣ
ｌ（ナカライテスク社製、日本国）を加え、４Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平
衡化されたフェニルセファロースＦＦ（ファルマシア社
製、スウェーデン国）２００ｍｌにかけ４→０ＭのＮａ
Ｃｌグラジエントにて展開、活性ピークをプールし酵素
溶液６００ｍｌを得た。得られた酵素溶液は１０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．５に対し透析し、分子量５万カット
の膜で濃縮し１００ｍｌ（２７Ｕ／ｍｌ）の酵素溶液を
得た。得られた酵素液は凍結して−２０℃にて保存し
た。

【０１０５】

【参考例２】バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）Ｎｏ．３ ；通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所； （受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８１）の培養、精製 酵母エキス（極東製薬社製、日本国）２％、ペプトン
（極東製薬社製、日本国）２％、リン酸２カリウム（和
光純薬社製、日本国）０．２％、塩化カルシウム（和光
純薬社製、日本国）０．０２％、硫酸マグネシウム（和
光純薬社製、日本国）０．０５％、ミオイノシトール
（和光純薬社製、日本国）２％、ｐＨ７．３を含む液体
培地１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１
２０℃で２０分加熱滅菌した後これにバチルス・エスピ
ーＮｏ．３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８１）の１白金耳を
接種し、５０℃で１２０ｒ．ｐ．ｍ．の振とう培養器で
３０時間培養して種母８５ｍｌ（酵素活性１．９Ｕ／ｍ
ｌ）を得た。

【０１０６】一方、上記と同様の培地組成にて消泡剤と
してデイスフォーム４４２（日本油脂社製、日本国）を
０．１％添加した液体培地２０Ｌを３０Ｌ用ジャーファ
メンターに仕込み加熱後滅菌した後に上記の種母８５ｍ
ｌを移植し、培養温度５０℃、通気量２０Ｌ／分、内圧
０．４ｋｇ／ｃｍ² 、攪拌速度１５０ｒ．ｐ．ｍ．で２
４時間通気培養し、培養物１８．０Ｌ（酵素活性２．９
Ｕ／ｍｌ）を得た。

【０１０７】培養物を遠心分離で集菌し、これに０．１
％のリゾチーム（エーザイ社製、日本国）を含む２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を５Ｌ加え、３７℃で１
時間インキュベートした後、遠心分離して沈殿物を除去
し、上清４．５Ｌ（１０Ｕ／ｍｌ）を得た。この上清に
アセトン１．８Ｌを添加攪拌し、生じた沈殿物を遠心分
離して集め、これを２０ｍＭリン酸緩衝液で溶解し１Ｌ
の粗酵素液（３９Ｕ／ｍｌ）を得た。この溶液に固形硫
安２００ｇを溶解し、生じた沈殿物を遠心分離で除去
し、得られた上清に再び固形硫安５０ｇを溶解した。こ
の処理液を遠心分離して得られた沈殿物を２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解し、５００ｍｌの酵素液
（５８．１Ｕ／ｍｌ）を得た。

【０１０８】この酵素液をＵＦモジュール（日本国、旭
化成工業社製；ＡＣＰ−１０１０）にて濃縮し、２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデッ
クスＧー２５（ファルマシア社製）にて脱塩し、同一の
緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）２５０ｍｌにかけ０→０．３Ｍの
ＫＣｌグラジエントにて展開、活性ピークをプールし酵
素溶液４００ｍｌ（４９．３Ｕ／ｍｌ）を得た。得られ
た酵素液を１０ｍＭリン酸緩衝液（７．０）２０Ｌに対
して一晩透析した。こうして得られた酵素液は牛血清ア
ルブミン（シグマ社製）を０．２ｇ溶解した後に凍結乾
燥して凍結乾燥品１．２ｇ（１７．０Ｕ／ｍｇ）を得
た。

【０１０９】

【参考例３】アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）１２１
５ 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所； （受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７０）の培養、精製 酵母エキス（極東製薬社製、日本国）２％、ペプトン
（極東製薬社製、日本国）２％、リン酸２カリウム（和
光純薬社製、日本国）０．１％、グルコース（国産化学
社製、日本国）０．１％、グリセリン（和光純薬社製、
日本国）２％、ｐＨ７．０を含む液体培地１００ｍｌを
５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分加
熱滅菌した後、これにアグロバクテリウム・リゾゲネス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ
ｓ）１２１５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２７０）の１白金耳
を接種し、２８℃で１２０ｒｐｍの振とう培養器で３０
時間培養して種母とした。

【０１１０】一方、上記からグルコースとグリセリンを
抜いた培地組成にて消泡剤としてデイスフォームＢＣ−
５１Ｙ（日本油脂社製、日本国）を０．１％添加した液
体培地２０Ｌを３０Ｌ用ジャーファメンターに仕込み加
熱後、滅菌した後に上記の種母１００ｍｌを移植し、培
養温度３０℃、通気量２０Ｌ／分、内圧０．４ｋｇ／ｃ
ｍ² 、攪拌速度１５０ｒｐｍで２４時間通気培養し、培
養物２０Ｌ（酵素活性６０ｍＵ／ｍｌ）を得た。得られ
た培養物を遠心分離で集菌し、これに１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を２Ｌ加え、氷浴中にて３０分ソニ
ケーション処理を行った。ついで遠心分離（８０００ｒ
ｐｍ、２０分）して沈殿物を除去し、上清１．５Ｌ（６
９０ｍＵ／ｍｌ）を得た。

【０１１１】この酵素液を同一の緩衝液で平衡化された
Ｑセファロース ビックビーズ（ファルマシア社製、ス
ウェーデン国）にかけ０、０．１、０．２、０．３、
０．４ＭのＫＣｌを含む同一緩衝液にてステップワイズ
に展開、０．１Ｍ画分をプールし酵素溶液１０Ｌ（４ｍ
Ｕ／ｍｌ）を得た。得られた酵素液はＵＦモジュール
（日本国、旭化成工業社製；ＡＣＰ−１０１０）にて濃
縮し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０Ｌに対
して一晩透析し酵素粗精製液２００ｍｌ（２７０ｍＵ／
ｍｌ）を得た。

【０１１２】

【実施例１】 ＜ミオイノシトール消去試薬＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．１） ２ｍＭ 酸化型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） ５Ｕ／ｍｌ クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のカイロイノシトールよ りもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ ジアフォラーゼ（旭化成工業社製、日本国） ０．０２５％ ＮＴＢ（和光純薬社製、日本国）

【０１１３】 ＜カイロイノシトール検出試薬＞ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．５） ２ｍＭ 酸化型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） ５Ｕ／ｍｌ バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｎｏ．３ 株由来の少なくともカイロイノシトールに作用するデヒドロ ゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ ジアフォラーゼ（旭化成工業社製、日本国） ０．０２５％ ＮＴＢ（和光純薬社製、日本国） １．５％ トリトン−Ｘ１００（和光純薬社製、日本国）

【０１１４】＜操作＞カイロイノシトール６００μＭ、
かつミオイノシトール０、１００、２００、３００、４
００、５００μＭを含む、ミオイノシトール及びカイロ
イノシトール混合被検液０．１ｍｌを、上記のミオイノ
シトール消去試薬０．４ｍｌに加えて、３７℃、１時間
のミオイノシトールをミオイノソース２となす反応を行
った。また対照としてクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４
株由来の酵素無添加の反応を行った。反応終了後、反応
液は分子量３万カットの膜（ウルトラフリーＭＣ ミリ
ポア社製）にて遠心、除蛋白を行い、カイロイノシトー
ル定量用サンプルとした。

【０１１５】次いで上記のカイロイノシトール検出試薬
１ｍｌを試験管にとり、３７℃にインキュべートのの
ち、上記のカイロイノシトール定量用サンプル０．０５
ｍｌを添加し、反応を開始させた。正確に１０分後、
０．１ＮのＨＣｌ ２ｍｌを加え反応を停止し、５５０
ｎｍにおける吸光度を測定した。測定結果は図３に示
し、その吸光度変化値を下記表４に示した。（ミオイノ
シトール０μＭでカイロイノシトール６００μＭの被検
液の推定吸光度は８３ΔｍＡｂｓである）。

【０１１６】

【表４】

【０１１７】図３及び表４から明らかなように、ミオイ
ノシトールをミオイノソース２となさない場合には（消
去なし；−○−）、ミオイノシトールの添加量に伴って
カイロイノシトール定量への影響が増加し、正確にカイ
ロイノシトールが定量できてないことが明らかであり、
これに対し、ミオイノシトールをミオイノソース２とな
す反応を行った場合には（消去有り；−□−）、ミオイ
ノシトールを添加してもカイロイノシトールの定量値は
一定であり、ミオイノシトールの影響を受けないカイロ
イノシトールの正確な測定ができることが明らかであっ
た。

【０１１８】

【実施例２】 ＜ミオイノシトール消去試薬＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．１） ２ｍＭ 酸化型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） ５Ｕ／ｍｌ クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のカイロイノシトールよ りもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ ジアフォラーゼ（旭化成工業社製、日本国） ０．０２５％ ＮＴＢ（和光純薬社製、日本国）

【０１１９】 ＜カイロイノシトール高感度検出試薬＞ １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ ９．８） ２ｍＭ 酸化型チオＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） １００Ｕ／ｍｌ バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ｎｏ．３ 株由来の少なくともカイロイノシトールに作用するデヒドロ ゲナーゼ ０．０３ｍＭ ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母社製、日本国）

【０１２０】＜操作＞カイロイノシトール１００μＭ、
かつミオイノシトール０、１００、２００、３００、４
００、５００μＭを含有するミオイノシトール及びカイ
ロイノシトール混合被検液０．１ｍｌを、上記のミオイ
ノシトール消去試薬０．４ｍｌに加えて、３７℃、１時
間のミオイノシトールをミオイノソース２となす反応を
行った。また、対照としてクレブシーラ・ニューモニエ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ
２４株由来の酵素無添加の反応を行った。反応終了後、
反応液は分子量３万カットの膜（ウルトラフリー−ＭＣ
ミリポア社製）にて除蛋白を行った。除蛋白を行った
サンプルは、７０℃、３０分熱処理を行い、カイロイノ
シトール定量用サンプルとした。

【０１２１】次いで上記のカイロイノシトール高感度検
出試薬１ｍｌをキュベットにとり、３７℃にインキュべ
ートののち、カイロイノシトール定量用サンプル０．０
３３ｍｌを添加し、反応を開始させた。反応開始後の１
分目と３分目の４０５ｎｍにおける吸光度を読みとりそ
の差をとり、１分間あたりの吸光度変化を求め、ミオイ
ノシトール無添加の時の吸光度を１００％とした場合の
各ミオイノシトール添加時の吸光度の割合を算出した。
その結果は図３に示し、その吸光度変化値を下記表５に
示した。

【０１２２】

【表５】

【０１２３】図４及び表５から明らかなように、高感度
な酵素サイクリングを用いた検出系を使用した場合に
も、ミオイノシトールをミオイノソース２となさない場
合には、ミオイノシトールの添加量に伴ってカイロイノ
シトール定量への影響が増加し、正確にカイロイノシト
ールが定量できてないことが明らかであり（消去なし；
−○−）、これに対し、ミオイノシトールをミオイノソ
ース２となす反応を行った場合には、ミオイノシトール
を添加してもカイロイノシトールの定量値は一定であ
り、ミオイノシトールの影響を受けないカイロイノシト
ールの正確かつ高感度な定量が可能であることが明らか
であった（消去有り；−□−）。

【０１２４】

【実施例３】 ＜ミオイノシトール消去反応溶液＞ ２ｍＭ ミオイノシトール（シグマ社製 米国） ２ｍＭ カイロイノシトール（和光純薬社製 日本国） １００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．１） ５０ｍＭ 酸化型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製、日本国） １５Ｕ／ｍｌ クレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株由来のカイロイノシトールよ りもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ ジアフォラーゼ（旭化成工業社製、日本国） ０．０２５％ ＮＴＢ（和光純薬社製、日本国）

【０１２５】 ＜ＨＰＬＣ条件＞ 装置 ＨＰＬＣシステム（島津社製 日本国） カラム Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＮＨ２Ｐ−５０ （昭和電工社製 日本国） 流速 ０．６ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ３０℃ 溶離液 １０ｍＭ グリシン緩衝液 ｐＨ１０．０：アセトニトリ ル＝１：３ 検出 ＲＩ サンプル 標準品；ミオイノシトール及びカイロイノシトールを１ｍ Ｍになるように溶離液に溶解 反応液；酵素反応溶液を溶離液にて２倍希釈

【０１２６】＜操作＞上記のミオイノシトール消去反応
溶液を作成し、３７℃、１時間のミオイノシトールをミ
オイノソース２となす反応を行った。反応終了後、反応
液は分子量３万カットの膜（ウルトラフリー−ＭＣ ミ
リポア社製）にて除蛋白を行い、ＨＰＬＣ用溶離液にて
２倍希釈し、酵素反応溶液とし、上記の条件でＨＰＬＣ
分析を行った。またミオイノシトール及びカイロイノシ
トールをそれぞれ１ｍＭになるように溶離液に溶解した
溶液を作成し、標準品とした。ＨＰＬＣのクロマトグラ
ムを図５及び図６に示した。標準品では、カイロイノシ
トールは１９．２８分、ミオイノシトールは１９．８７
分に溶出し（標準品クロマトグラム；図５）、反応溶液
はカイロイノシトールのピークのみが検出されミオイノ
シトールのピークは検出されなかった（反応液クロマト
グラム；図６）。それ故、このカイロイノシトールのピ
ークのものを回収することによりカイロイノシトールの
純化用定量組成物がえられる。このことから、カイロイ
ノシトールの純化においても、本発明が有用であること
は明らかである。

【０１２７】

【発明の効果】本発明により、実質的にミオイノシトー
ルの影響をなくし被検液中のカイロイノシトールを、正
確、簡便、安価に測定することが可能となり、かつ少な
くともミオイノシトールとカイロイノシトールを含む水
溶液中から簡便、安価にカイロイノシトールを純化する
ことが可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株の
生産するカイロイノシトールよりもミオイノシトールに
特異性の高いデヒドロゲナーゼに作用する酵素の至適ｐ
Ｈを示す曲線である。

【図２】本発明のクレブシーラ・ニューモニエ（Ｋｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＴＫ２４株、
及び市販のエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）株の生産する
カイロイノシトールよりもミオイノシトールに特異性の
高いデヒドロゲナーゼの熱安定性を示す曲線である。

【図３】本発明の実施例１に基づくカイロイノシトー
ル、ミオイノシトール混合被検液の定量曲線である。

【図４】本発明の実施例２に基づくカイロイノシトー
ル、ミオイノシトール混合被検液の定量曲線である。

【図５】本発明の実施例３に基づくカイロイノシトー
ル、ミオイノシトール混合被検液のＨＰＬＣによる定量
分析結果である。

【図６】本発明の実施例３に基づくカイロイノシトール
のＨＰＬＣによる定量分析結果である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくともミオイノシトール及びカイロ
   イノシトールを含有する被検液に、カイロイノシトール
   よりもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲナー
   ゼを作用せしめて、ミオイノシトールをミオイノソース
   ２となし、次いで少なくともカイロイノシトールに作用
   するデヒドロゲナーゼを用いてカイロイノシトールを定
   量することを特徴とするカイロイノシトールの定量方
   法。
2. 【請求項２】 カイロイノシトールよりもミオイノシト
   ールに特異性の高いデヒドロゲナーゼが、クレブシーラ
   ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏ
   ｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０６）由来
   のデヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 カイロイノシトールよりもミオイノシト
   ールに特異性の高いデヒドロゲナーゼ及び少なくともカ
   イロイノシトールに作用するデヒドロゲナーゼを含有し
   てなるカイロイノシトールの定量用組成物。
4. 【請求項４】 カイロイノシトールよりもミオイノシト
   ールに特異性の高いデヒドロゲナーゼが、クレブシーラ
   ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏ
   ｎｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０６）由来
   のデヒドロゲナーゼである請求項３に記載の定量用組成
   物。
5. 【請求項５】 少なくともミオイノシトール及びカイロ
   イノシトールを含有する液体に、カイロイノシトールよ
   りもミオイノシトールに特異性の高いデヒドロゲナーゼ
   を作用せしめて、ミオイノシトールをミオイノソース２
   となすことを特徴とするカイロイノシトールの純化方
   法。
6. 【請求項６】 カイロイノシトールよりもミオイノシト
   ールに特異性の高いデヒドロゲナーゼがクレブシーラ・
   ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎ
   ｉａｅ）ＴＫ２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５０６）由来の
   デヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項５に記
   載のカイロイノシトールの純化方法。