JP4504739B2 - ホスホリラーゼの製造法 - Google Patents

Description

ホスホリラーゼ生産菌からホスホリラーゼを製造する方法に関する。

ホスホリラーゼは、無機リン酸の存在下で基質糖類の加リン酸分解を触媒する酵素である。基質の糖の種類によってマルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、マルトースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼなどが知られている。各種ホスホリラーゼ類は、反応基質である無機リン酸や糖類の定量用酵素試薬として、または反応の可逆性を利用してリン酸化糖を基質に各種配糖体の合成などに使用できる酵素として有用である。

ホスホリラーゼは、Leuconostoc属等の多くの微生物が菌体内あるいは細胞内酵素として保有していることが知られている。
ホスホリラーゼを上記の目的に使用するためには酵素調製物の純度をある程度高めることが望ましく、このような酵素調製物を得るためにはホスホリラーゼ生産菌を培養した後、菌体（細胞）回収、菌体洗浄、菌体破砕、酵素画分回収、精製等の複雑な工程が必要となる（例えば、特許文献１〜５参照）。またこの際、菌体破砕のために溶菌酵素やキレート剤などを添加する必要があるのに加えて菌体成分のほとんどが溶出するため、ホスホリラーゼ純度を上げるための精製工程の負荷が大きくなるのを避けることができない。

このような負荷を低減する方法としては、培地組成の最適化などにより菌体内のホスホリラーゼレベルを上げる方法（例えば、特許文献６〜７参照）、遺伝子組換え体を使用することによって目的ホスホリラーゼを高純度に生成させる方法（例えば、非特許文献１、特許文献３〜５参照）及び簡単な精製方法（例えば、特許文献８参照）などが知られているが、工程そのものを変更することはできず必ずしも満足できるものではない。
特開平１−９１７７８号公報 特開平８−２８０３８２号公報 特開平１０−１４５８０号公報 特開平１０−２７６７８５号公報 特開平１０−３２７８８７号公報 特開平２−１５４６８６号公報 特開平３−４７８５号公報 特開２００２−３４５４５８号公報 Kitaoら、J.Ferment.Bioeng.,73,179-184 (1992)

本発明は、ホスホリラーゼ生産菌から効率よく簡便にホスホリラーゼを製造する方法を提供することに関する。

本発明者らは、ホスホリラーゼ生産菌からホスホリラーゼ画分を効率よく調製する方法について検討したところ、リン酸高濃度培地上でホスホリラーゼ生産菌を培養すると、培養上清中にホスホリラーゼが高収率で生産され、菌体内から酵素を回収する等の操作をすることなく、効率よくホスホリラーゼを製造できることを見出した。

すなわち本発明は、リン酸類又はその塩の濃度が５０ｍＭ以上である培地中でホスホリラーゼ生産菌を培養し、培地中に生成されたホスホリラーゼを採取することを特徴とするホスホリラーゼの製造法を提供するものである。

また本発明は、リン酸類又はその塩の濃度が５０ｍＭ以上であるホスホリラーゼ生産用培地を提供するものである。

本発明によればホスホリラーゼ生産菌を培養した後、培養上清の回収（細胞除去）、精製といった極めてシンプルな工程で効率よく簡便にホスホリラーゼを製造することができる。

本発明において用いられるホスホリラーゼ生産菌としては、菌体内あるいは細胞内にホスホリラーゼを有する菌であり、一定濃度のリン酸類またはその塩の存在下、培養上清中にホスホリラーゼを産生するものであればよいが、例えばEscherichia属、Bacillus属、Klebsiella属、Streptococcus属、Corynebacterium属、Thermus属、Thermococcus属、Thermotoga属、Leuconostoc属、Pseudomonas属、Clostridium属、Acetobacter属、Pullularia属、Agrobacterium属、Synecoccus属、Aspergillus属、Monilia属、Sclerotinea属、Chlamydomonas属、Lactobacillus属、Neiserria属、Enterococcus属、Lactococcus属、Plesiomonas属、Catellatospora属、Kineosporia属、Micrococcus属、Arthrobacter属、Brevibacterium属、Flavobacterium属、Seratia属、Streptomyces属、Xanthomonas属、Thermoanaerobium属、Rhizopus属、Chaetomium属、Acreomonium属、Byssochilamys属、Cercospora属、Glomerella属、Humicola属、Myceliophthora属、Rhizomucor属、Rosellinia属、Sclerotinia属、Sporidiobolus属、Sterigmatomyces属、Thermoascus属、Thielavia属、Tyromyces属、Erwinia属、Ruminococcus属、Cellvibrio属に属する細菌が挙げられる。
尚、斯かるホスホリラーゼ生産菌は、天然又はＵＶ照射や化学変異剤例えばN-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine（MNNG）やethylmethane sulfonate(EMS)（C. Guhrie & G. R. Fink, Methods in Enzymology vol. 194, pp273-281 Academic Press Inc.)等の処理を施すことによって、ホスホリラーゼ産生能が向上した変異株であってもよい。

このうち、Leuconostoc属、Corynebacterium属の細菌が好ましく、Leuconostoc属ではLeuconostoc mesenteroides、Leuconostoc lactis、Leuconostoc fallax、Leuconostoc citreum、Leuconostoc carnosum、Leuconostoc argetinum、Leuconostoc pseudomesenteroides、Corynebacterium属ではCorynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium hoagii、Corynebacterium vitaeruminis、Corynebacterium pilosumがより好ましく、中でもLeuconostoc mesenteroides、Leuconostoc mesenteroides KSM-SP1(FERM P-19737)及びLeuconostoc mesenteroides KSM-SP78(FERM AP-20037（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、平成１６年４月２８日受領）)、Corynebacterium vitaeruminis、Corynebacterium glutamicum KSM-MP669(FERM AP-20036（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、平成１６年４月２８日受領）)が特に好ましい。

ホスホリラーゼの製造は、上記ホスホリラーゼ生産菌を、リン酸類又はその塩の濃度が５０ｍＭ以上である培地（ホスホリラーゼ生産用培地）中で培養することにより行われる。

培地に添加されるリン酸類又はその塩としては、例えばリン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、二リン酸、ポリメタリン酸及びこれらの塩が挙げられ、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。特に好ましいリン酸類の塩としては、例えばリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等が挙げられ、リン酸類とその塩又は数種のリン酸類の塩を混合して用いることが更に好ましい。

培地中のリン酸類又はその塩の濃度は、一般的には効果の点から５０ｍＭ以上であることが必要であるが、好ましくは５０ｍＭ〜１．５Ｍ、より好ましくは５０ｍＭ〜１Ｍ、特に１００ｍＭ〜１Ｍの範囲が好ましい。また、Leuconostoc属の細菌においては、４００ｍＭ〜１．２Ｍが好ましく、Corynebacterium属では１００ｍＭ〜６００ｍＭが好ましい。

本発明において用いられる培地は、ホスホリラーゼ生産菌が生育できるものであればよく、上記のリン酸及びその塩の他に、炭素源、窒素源、金属ミネラル類、ビタミン類等を含有する液体培地等が使用できる。

培地に添加される糖としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖が挙げられ、これら2種以上を混合して用いても良い。

糖質以外の炭素源としては、例えば酢酸塩等の有機酸塩が挙げられ、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機及び有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、アラニン、メチオニン等のアミノ酸等が挙げられ、金属ミネラル類としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が挙げられ、これらを単独で又は必要に応じ混合して用いればよい。

培養方法は、微生物が十分に生育できる条件となるようｐＨ及び温度を適宜調整して行われる。また、培養手段は、振とう培養、嫌気培養、静置培養、醗酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。

斯くして、リン酸高濃度培地中でホスホリラーゼ生産菌を培養すると、培養上清中にホスホリラーゼが高収率で生産蓄積され、これを採取すれば目的のホスホリラーゼを容易に得ることができる。

培地中からホスホリラーゼを採取する方法は、公知の方法に従って行えば良く、例えば、菌体を分離除去し、限外ろ過、塩析、イオン交換、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過、乾燥などを組合わせることによって行うことができる。固定化酵素を作製する際にも菌体外へ産生させることにより煩雑な操作をすることなく可能である。

尚、得られたホスホリラーゼの活性測定は、一般的なホスホリラーゼ活性測定法を使用できる。例えば、Weinhausel（Enzyme Microb. Technol., 17, 140-146(1995)）の方法が挙げられる。

本発明によれば、直接菌体外にホスホリラーゼを生産させることが可能であり、菌体破砕など煩雑な操作がなく酵素を得ることが可能である。さらに、低分子化合物であるリン酸類を培地に添加するだけなので、精製工程への負荷も大きく低減され、ホスホリラーゼ高純度品の調製も容易である。

また、培養液に直接二糖、オリゴ糖、多糖及びリン酸類又はその塩などの基質を加えることによって、特別な操作なく糖リン酸を生産させることが可能である。さらに、アグリコンとなる化合物及び糖リン酸を培養液と直接作用させることによって、特別な操作なく配糖体を得ることも可能である。

実施例１ ロイコノストック属細菌によるホスホリラーゼの生産

Leuconostoc mesenteroides JCM9693、Leuconostoc carnosum JCM9695、Leuconostoc argentinum JCM11052、Leuconostoc pseudomesenteroides JCM11045、及びLeuconostoc mesenteroides JCM9693株をMNNG処理（C. Guhrie & G. R. Fink, Methods in Enzymology vol. 194, pp273-281 Academic Press Inc.）することにより得られたホスホリラーゼ高生産変異株Leuconostoc mesenteroides KSM-SP1(FERM P-19737)及びLeuconostoc mesenteroides KSM-SP78(FERM AP-20037)を、MR寒天培地（Oxoid社製）に塗末し、嫌気条件で30℃にて培養した。本菌の一白金耳を液体培地（1% 酵母エキス（Difco社製）、1% ポリペプトン（日本製薬製）、0.04% 硫酸マグネシウム七水和物、0.02% 塩化マンガン四水和物、0.0002% 硫酸第二鉄四水和物、400、800,1000 mMのリン酸緩衝液、5%、10%、１5%のシュークロース）に接種し、30℃で2日間静置培養を行った。遠心分離により菌体を除去した培養液上清のシュークロースホスホリラーゼ活性を測定した。

上清のシュークロースホスホリラーゼ活性は、Weinhausel（Enzyme Microb. Technol., 17, 140-146(1995)）の方法を一部改変し行った。９６穴マイクロプレート上で適宜希釈した培養上清サンプル20μLに酵素反応液（200 mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、90 mM シュークロース、100 mM Tris-酢酸緩衝液（pH6.8）、2 mM EDTA、10 mM 硫酸マグネシウム、2 mM NAD、10μＭグルコース−1,6−二リン酸、1.2unit/mlホスホグルコムターゼ（ウサギ筋肉由来、ロシュダイアグノスティック社製）、1.2 unit/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Leuconostoc mesenteroides由来、ロシュダイアグノスティック社製））を180μL加え、37℃で340 nmのG1P生成に起因する吸光度上昇を測定した。酵素単位１ユニット（U）は、1分間に１μmolのグルコース−１−リン酸（G1P）を生成する量とした。結果を表１に示す。

表１より、培地中のリン酸濃度を高くすることにより、菌体外に生産されるホスホリラーゼの量が上昇することが確認された。

実施例２ コリネバクテリウム属細菌によるホスホリラーゼの生産
Corynebacterium vitaeruminis JCM1323、Corynebacterium callunae IFO15359、Corynebacterium glutamicum JCM1321及びCorynebacterium glutamicum JCM1321をMNNG処理することにより得られたホスホリラーゼ高生産変異株Corynebacterium glutamicum KSM-MP669(FERM AP-20036)を、SCD寒天培地（日本製薬株式会社）に塗末し30℃にて培養した。本菌の一白金耳を液体培地（0.67％のYeast Nitrogen Base(Difco社)、50, 100,200 mMのリン酸緩衝液（pH７）、15%のデキストリン(sigma社 potato由来)）に接種し、30℃で６日間振とう培養を行った。遠心分離により菌体を除去した培養液上清のマルトデキストリンホスホリラーゼ活性を測定した。

上清のマルトデキストリンホスホリラーゼ活性は、Weinhausel（Enzyme Microb. Technol., 17, 140-146(1995)）の方法を一部改変し行った。９６穴マイクロプレート上で適宜希釈した培養上清サンプル20μLに酵素反応液（200 mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、２％ デキストリン、100 mM Tris-酢酸緩衝液（pH6.8）、2 mM EDTA、10 mM 硫酸マグネシウム、2 mM NAD、10μＭグルコース−1,6−二リン酸、1.2unit/mlホスホグルコムターゼ（ウサギ筋肉由来、ロシュダイアグノスティック社製）、1.2 unit/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Leuconostoc mesenteroides由来、ロシュダイアグノスティック社製））を180μL加え、37℃で340 nmのG1P生成に起因する吸光度上昇を測定した。酵素単位１ユニット（U）は、1分間に１μmolのグルコース−１−リン酸（G1P）を生成する量とした。結果を表２に示す。

表２より、培地中のリン酸濃度を高くすることにより、菌体外に生産されるホスホリラーゼの量が上昇することが確認された。

Claims (1)

1. リン酸類又はその塩の濃度が４００ｍＭ〜１．２Ｍである培地中でロイコノストック属細菌を培養し、培地中に生成されたホスホリラーゼを採取することを特徴とするホスホリラーゼの製造法。