KR970002253B1 - 5'-구아닐산을 생산하는 미생물 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

5'-구아닐산을 생산하는 미생물

본 발명은 5'-구아닐산(이하에서는 GMP로 약칭한다)을 생산하는 미생물에 관한 것이다.

GMP는 글루탐산(MSG) 및 5'-이노신산(IMP)과 더불어 조미료로서 직접 이용되고 있고 조미식품의 식품 첨가제로서 많은 양이 요구되고 있어 식품공업분야에서는 중요한 품목중의 하나이다.

지금까지 알려진 GMP의 제조 방법으로서는 (1) 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소학적으로 분해하는 방법 (2) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화시키는 방법 및 (3) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산(이하에서는 XMP로 약칭한다)을 미생물을 이용하여 GMP로 전환시키는 방법(J. Ferment, Technol, Vol. 62, No. 2, p. 131-137, 1984) (4) 미생물 발효법에 의한 GMP의 직접 생산법 등이 있는데 (4)의 방법은 GMP의 세포막 투과성이 매우 낮아 공업적 이용이 불가능하며, 현재 경제적으로 생산 비용이 저렴하여 공업적으로 가장 널리 이용되고 있는 제조방법은 (3)의 방법이다.

(3)의 방법을 좀 더 구체적으로 서술하면, 우선 고농도 XMP를 생산할 수 있는 XMP 생산균주가 개발되어야 하며 또한 XMP 발효 공정이 공업화 되어야 한다. 그 다음 단계로 XMP에서 GMP로 전환되는 강력한 효소를 소유하는 미생물의 개발과 그 전환공정의 공업화 과정이 GMP 제조에 있어서 핵심적인 기술로 통념되어 있다. 특히 후자의 단계에서 XMP에서 GMP로의 전환 효소 균주는 (3) 방법에 의한 GMP 생산에 있어서 절대적인 역할을 하는데 지금까지의 모든 연구와 발명이 이 효소 균주에 집중되어 있음은 이를 증명한다. (바이오테크놀로지 앤드 바이오 엔지니어링 Vol. 13, 229-240, 1971, Vol. 16. 795-803, 1973, 일본국 공고 특허출원 제71-39069호, 일본국 공개 특허출원 제84-78697호, 대한민국 특허 출원 제77-2519, 84-248, 86-5305, 86-5302, 86-5303, 87-6194, 87-5453호)효소 균체를 이용하여 XMP로부터 GMP를 제조하는 방법에는 XMP 아미나제(또는 GMP 합성효소)라는 효소가 관여하며 이의 효소학적 반응 메카니즘은 다음과 같다.

지금까지의 XMP 아미나제 효소 활성을 강화시키기 위한 방법으로는 이 효소의 특이적 방해물질인 데코이닌에 대한 내성을 미생물에 부여함으로써 그 목적을 달성하였으나(바이오테크놀로지 앤드 바이오엔지니어링 Vol. 13, 229-240, 1971, Vol. 16, 795-803, 1973, 대한민국 특허 출원 87-5453), 본 발명자들은 XMP에서 GMP로의 전환 미생물에 데코이닌 내성을 부여하였을 뿐 아니라 효소 반응시 첨가되는 계면활성제에 의한 효소반응 저해 작용(원래 생물학적 모든 효소는 수용액 속에서 최적 반응을 일으키며 계면활성제와 같은 소수성(hydrophobic) 물질이 존재할 때 반응은 저해된다. 따라서 가능한 계면활성제 따위를 적게 첨가한 수족 반응효과는 증대된다.)을 감소시키기 위해 현재 첨가되는 계면활성제 양보다 더 적은 양을 첨가하여도 종래의 효과와 같은 효과를 나타낼 수 있도록 계면활성제에 대한 종전 균주보다 감수성이 큰 형질을 부여함으로써, 기존의 데코이닌 단순 내성균주보다 과학적이고 복합적인 형질이 부과됨으로써 데코이닌 내성으로 강력한 XMP 아미나제 역가와 함께 적은 양의 계면활성제 조건하에서 XMP로부터 GMP로의 높은 반응전환환율을 일으킬 수 있는 신규의 변이주를 개발하여 본 발명은 완성하게 되었다.

다음에서 본 발명 미생물의 분리 획득 방법을 좀더 구체적으로 설명한다.

본 발명의 변이주는 브레비박테리움 암모니아게네스(ATCC 6872)를 친주로 하여 X-선, 자외선 또는 니트로소구아니딘, 디에틸 설페이드, 에틸아민 등 화학변이 유기제로 처리한 후 친주보다 더 높은 데코이니 내성을 나타내는 변이주들로부터 선택된 높은 XMP 아미나제 활성을 갖는 XMP 아미나제 강화 균주를 선별하고, 이를 다시 상기의 방법으로 변이시킨 후 데코이닌에 지속적으로 내성을 가지면서 높은 XMP 아미나제 활성을 갖는 균주중 친주보다 계면활성제에 감수성이 보다 높은 변이주를 선별하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 특이한 변이주 KCCM 10011과 친주 및 종전균주와의 형질을 비교하여 종합하면 표 1과 같다.

본 발명의 특수한 변이주 KCCM 10011와 친주 및 종전 균주와의 계면활성제에 대한 감수성 비교는 표 2와 같다.

(주) 생육도 : +; 생육가능, -; 생육불능

XMP 아미나제(GMP 합성효소) 생산 배지는 탄소원으로 포도당, 과당 및 이들을 구성하고 있는 다당류의 가수분해물을 사용할 수 있고, 질소원으로 황산암모니움, 염화암모니움, 인산암모니움, 요소, 암모니아수, 암모니아 기체 등을 사용할 수 있으며, 그 외에 미생물의 생육에 필요한 각종 무기염과 비오틴을 적당량 첨가하면 된다.

또한, 천연 영양원으로 효모멕기스, 펩톤, 카제인가수분해물, 옥수수침지액 등도 효소생산에 효과가 좋다. 배양은 호기적 조건하에 진탕배양 또는 통기교반 배양하고 생육온도는 20~40℃의 온도에서 수행하며, 배양중 pH는 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며 10~50시간 배양시킨 배양액 또는 원심분리하여 얻어진 균체를 XMP 아미나제 효소원으로 사용한다. 본 발명주는 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 특수한 변이주 KCCM 10011로서 1991년 10월 23일자로 기탁하였다.

[실시예 1]

친주, 종전 균주 및 KCCM 10011와의 XMP 아미나제 활성도 측정

KCCM 10011의 XMP 아미나제 활성도의 우수성을 입증하기 위하여 공지의 XMP 아미나제 활성도 측정법을 이용하였다. 효소액을 얻기 위하여 포도당 5g, 펩톤 10g, 효모 추출물 10g, 염화나트륨 2.5g, 증류수 1L, pH 7.3 이하(C배지)의 배양 배지에서 대수증식기까지 각 실험균주를 키운 후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 0.1M 트리스 완충액(pH 7.3)에 현탁하여 초음파 균체 분쇄기(ultasonicator)로 균체를 분쇄한 뒤 원심분리하여 얻어진 상등액을 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액의 적당량을 2.4mL의 XMP 아미나제 반응액(0.16M 트리스(pH 7.6), 4mM ATP, 16mM 염화마그네슘, 25mM XMP, 0.33M 황산암모늄)에 첨가하여 35-50℃에서 30분-1시간 반응시킨 뒤, 30mL의 3.5% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 상등액의 흡광도를 290nm에서 측정하였다. 그 결과 KCCM 10011 균주는 친주인 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 보다 80배, 종전균주인 KFCC 10006 보다 5배 정도의 활성도 증가를 보여 종전보다 월등히 우수한 XMP 아미나제 생산균주임이 증명되었다. 자세한 결과는 표 3에 기재하였다.

* 효소활성의 단위(U,unit)는 반응 후 시간당 290nm에서의 흡광도의 증가로써 표시한다.

[실시예 2]

계면활성제 첨가 감량에 따른 KCCM 10011에 의한 XMP의 GMP로의 전환 반응.

XMP 아미나제에 의한 XMP로부터 GMP로의 전환과정중 보다 적은 양의 계면활성제 첨가에 의한 계면활성제 감수성 균주와 비감수성 균주와의 GMP 반응 실험을 실시하였다. 실시예 1의 C 배지를 종 배양배지로 하여 500mL의 진탕용 삼각플라스크에 30mL씩 분주하고 120℃에서 15분간 가압살균하여 종전균주 KFCC 10006 및 신개발 균주 KCCM 10011균을 각각 백금이 식균한 후 30℃에서 24시간 배양하여 종균액으로 사용하였다. 또한 글루코오즈 100g/L, 인산제 1, 2 수소칼륨 각 10g/L, 황산마그네슘 10g/L, 염화칼슘 0.1g/L, 황산철 10mg/L, 황산망간 2mg/L, 효소추출물 10g/L, 카제인 가수분해물 10g/L, d-비오틴 30㎍/L, 아데닌 10mg/L으로 구성되고 pH 8.5로 조정된 발효배지 1.5L를 5L 발효조에 넣고 120℃에서 30분간 가압 살균후 종배양액을 2% 용량으로 식균하여 30℃, pH 7.0으로 3일간 배양하였다. 이때 비교하는 균주의 균체수를 동일하게 하기 위해 최종 균체 희석액의 흡광도가 같도록 하였다. 회전속도는 750rpm, 공기첨가속도는 1vvm이었다.

배양이 완료된 효소균체 함유액에 XMP를 최종농도 20mg/㎖되게 첨가하고 30-50℃에서 pH를 7.0-8.0으로 유지시키면서 24시간 반응시켰으며, 전환반응의 시작은 계면활성제인 폴리옥시에틸렌 스테아릴아민을 적당량 첨가함으로써 시작하였다. 각 균주에 대한 시간에 따른 GMP 생산량은 다음과 같다.

표 4에서 보는 바와 같이 신개발 균주 KCCM 10011의 반응조건은 계면활성제 비감수균주인 종전균주보다 월등히 적은 계면활성제 농도 조건이 최적임을 알 수 있다. 또한 종전 균주보다 GMP 생산량도 월등히 증가되었음을 알 수 있다.

a. POESA : Polyoxyethylestearylamine.

b. 종전균주 : 계면활성제 비감수성, XMP 아미나제 종전역가.

c. KCCM 10011 : 계면활성제 고감수성, XMP 아미나제 강화균주.

Claims (2)

1. 브레비박테리움 암모니아게네스 변이주에 속하고 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 제조하기 위한 XMP 아미나제 효소가 강화됨과 동시에 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산의 제조시 첨가되는 계면활성제에 대한 감수성을 형질로 가짐을 특징으로 하는 미생물인 KCCM 10011.
2. 브레비박테리움 암모니아게네스 변이주에 속하고 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 제조하기 위한 XMP 아미나제 효소가 강화됨과 동시에 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산의 제조시 첨가되는 계면활성제에 대한 감수성을 형질로 가짐을 특징으로 하는 미생물인 KCCM 10011을 배양하여 5'-구아닐산을 제조하는 방법.