JP2695180B2 - アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 - Google Patents
アスコルビン酸−２−リン酸の製造法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアスコルビン酸−２−リン酸（以下AsA2Pと
略記する）の製造方法に関する。アスコルビン酸は医薬
品、食品、化粧品などの分野に広く用いられているが
熱、空気、光などにより分解されやすい。AsA2Pは、こ
のようなアスコルビン酸の欠点を取り除いた安定化誘導
体であり、生体中では容易に脱リン酸化されてアスコル
ビン酸となりビタミンＣ活性を示す。このような性質を
利用してAsA2Pは主として化粧品工業分野において用い
られる。
略記する）の製造方法に関する。アスコルビン酸は医薬
品、食品、化粧品などの分野に広く用いられているが
熱、空気、光などにより分解されやすい。AsA2Pは、こ
のようなアスコルビン酸の欠点を取り除いた安定化誘導
体であり、生体中では容易に脱リン酸化されてアスコル
ビン酸となりビタミンＣ活性を示す。このような性質を
利用してAsA2Pは主として化粧品工業分野において用い
られる。
従来の技術 これまでAsA2Pの製造法としては、化学的な合成法
（特公昭45-30328号公報、特公昭52-18191号公報、特公
昭48-15605号公報参照）および微生物由来の酵素を用い
た酵素法による製造法（日本農化学会昭和62年度大会講
演要旨集4L−1 P.696）などが知られている。
（特公昭45-30328号公報、特公昭52-18191号公報、特公
昭48-15605号公報参照）および微生物由来の酵素を用い
た酵素法による製造法（日本農化学会昭和62年度大会講
演要旨集4L−1 P.696）などが知られている。
発明が解決しようとする課題 これらのうちすでに工業的に実用化されているのは化
学的合成法であるが、この方法では、目的とするアスコ
ルビン酸の２位のリン酸化物の他に、６位のリン酸化物
などの異性体の副生が避けられない。このためAsA2Pを
高収率で得ることを目的として保護基の導入、選択的反
応条件の検討、リン酸基供与体の検討などがなされてい
る。しかし操作が煩雑となり、また高純度のAsA2Pを得
ることができない。また、シトロバクター・フロインデ
ィー（Citrobacter freudii）由来の酵素を用いる酵素
法による製造法（日本農芸化学会昭和62年度大会講演要
旨集4L−1 P.696）でも、主としてアスコルビン酸の６
位のリン酸化物が生成し、２位のリン酸化物であるAsA2
Pを得るためには、酵素反応に先立つ保護基の導入（イ
ソプロピリデン化など）と反応終了後に保護基を取り除
く各操作が必要である。
学的合成法であるが、この方法では、目的とするアスコ
ルビン酸の２位のリン酸化物の他に、６位のリン酸化物
などの異性体の副生が避けられない。このためAsA2Pを
高収率で得ることを目的として保護基の導入、選択的反
応条件の検討、リン酸基供与体の検討などがなされてい
る。しかし操作が煩雑となり、また高純度のAsA2Pを得
ることができない。また、シトロバクター・フロインデ
ィー（Citrobacter freudii）由来の酵素を用いる酵素
法による製造法（日本農芸化学会昭和62年度大会講演要
旨集4L−1 P.696）でも、主としてアスコルビン酸の６
位のリン酸化物が生成し、２位のリン酸化物であるAsA2
Pを得るためには、酵素反応に先立つ保護基の導入（イ
ソプロピリデン化など）と反応終了後に保護基を取り除
く各操作が必要である。
課題を解決するための手段 本発明者は、先にAsA2Pを工業的に安価に製造する方
法を開発するために、アスコルビン酸の２位を特異的に
リン酸化する活性を有する微生物を検索し、アスコルビ
ン酸とATPからAsA2Pを生成する活性を有する微生物を見
いだし、AsA2Pの効率的な生産方法を開発することに成
功した（特願昭61-302409）。
法を開発するために、アスコルビン酸の２位を特異的に
リン酸化する活性を有する微生物を検索し、アスコルビ
ン酸とATPからAsA2Pを生成する活性を有する微生物を見
いだし、AsA2Pの効率的な生産方法を開発することに成
功した（特願昭61-302409）。
しかしながらATPは高価な物質であることから、ATPに
代わるリン酸基供与体を用いる製造法を種々検討した。
その結果、種々の微生物がアスコルビン酸とピロリン酸
などのリン酸基供与体から目的とするアスコルビン酸の
２位のリン酸化物を特異的に生成する活性を有すること
を見いだし、本発明を完成するに至った。
代わるリン酸基供与体を用いる製造法を種々検討した。
その結果、種々の微生物がアスコルビン酸とピロリン酸
などのリン酸基供与体から目的とするアスコルビン酸の
２位のリン酸化物を特異的に生成する活性を有すること
を見いだし、本発明を完成するに至った。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アスコルビン酸またはアラボアスコルビン
酸とリン酸基供与体とからアスコルビン酸−２−リン酸
を生成する活性を有する微生物の菌体、培養液またはそ
れらの処理物の存在下、水性媒体中でアスコルビン酸ま
たはアラボアスコルビン酸とリン酸基供与体とを反応さ
せてアスコルビン酸−２−リン酸を生成させ、反応液か
ら生成したアスコルビン酸−２−リン酸を採取すること
を特徴とするアスコルビン酸−２−リン酸の製造法を提
供する。
酸とリン酸基供与体とからアスコルビン酸−２−リン酸
を生成する活性を有する微生物の菌体、培養液またはそ
れらの処理物の存在下、水性媒体中でアスコルビン酸ま
たはアラボアスコルビン酸とリン酸基供与体とを反応さ
せてアスコルビン酸−２−リン酸を生成させ、反応液か
ら生成したアスコルビン酸−２−リン酸を採取すること
を特徴とするアスコルビン酸−２−リン酸の製造法を提
供する。
リン酸基供与体としては、パラニトロフェニールフォ
スフェート、アセチルリン酸、ピロリン酸、トリポリリ
ン酸、テトラポリリン酸またはポリリン酸などがあげら
れる。
スフェート、アセチルリン酸、ピロリン酸、トリポリリ
ン酸、テトラポリリン酸またはポリリン酸などがあげら
れる。
本発明に用いる微生物としては、クレブシエラ属、セ
ルロモナス属、アルカリゲネス属、エアロモナス属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、フラボバクテ
リウム属、キサントモナス属、モルガネラ属、セラチア
属、エンテロバクター属、バチルス属またはコリネバク
テリウム属に属し、またはアラボアスコルビン酸とリン
酸基供与体からAsA2Pを生成する能力を有する微生物が
あげられる。具体的に好適な菌株は下記のとおりであ
る。
ルロモナス属、アルカリゲネス属、エアロモナス属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、フラボバクテ
リウム属、キサントモナス属、モルガネラ属、セラチア
属、エンテロバクター属、バチルス属またはコリネバク
テリウム属に属し、またはアラボアスコルビン酸とリン
酸基供与体からAsA2Pを生成する能力を有する微生物が
あげられる。具体的に好適な菌株は下記のとおりであ
る。
クレブシエラ・オキシトーカ（Klebsella oxytoca）ATC
C 8724 セルロモナス・フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）
SK−４（FERM BP-1575） セルロモナス・カルテ（Cellulomonas cartae）ATCC 21
681 アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrop
hus）ATCC 17697 未同定細菌（Unidentified bacterium）ATCC 15803 エアロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophil
a）ATCC 11163 クレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumonia
e）ATCC 21524 ブレビバクテリウム・リティカム（Brevibacterium lyt
icum）ATCC 15921 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacteri
um ammoniagenes）ATCC 6872 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ATCC 13826 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ATCC 13655 シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflav
ina）ATCC 9526 シュードモナス・ディミヌータ（Pseudomonas diminut
a）ATCC 11568 フラボバクテリウム・デボランス（Flavobacterium dev
orans）ATCC 10829 シュードモナス・アゾトリコリガンス（Pseudomonas az
otocolligans）ATCC 12417 シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomonas maltop
hilia）ATCC 17806 キサントモナス・オリゼー（Xanthomonas oryzae）IFO
3995 モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii）ATCC
25830 セラチア・ルビダエア（Serratia rubidaea）ATCC 1163
4 エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerog
enes）ATCC 13048 バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）ATCC 19221 コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC 13032 これらの微生物の培養には、通常の細菌の培養に用い
られる培地、例えばポリペプトン10g/l、肉エキス7g/
l、酵母エキス5g/lおよびNaCl3g/lを含みpH7.2に調整し
た培地（KM102培地）など、これらの微生物が生育でき
かつAsA2P生成活性を阻害しないものであれば、炭素
源、窒素源、その他の栄養素を含む天然培地、半合成培
地、合成培地などいかなる培地でも使用できる。
C 8724 セルロモナス・フラビゲナ（Cellulomonas flavigena）
SK−４（FERM BP-1575） セルロモナス・カルテ（Cellulomonas cartae）ATCC 21
681 アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrop
hus）ATCC 17697 未同定細菌（Unidentified bacterium）ATCC 15803 エアロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophil
a）ATCC 11163 クレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumonia
e）ATCC 21524 ブレビバクテリウム・リティカム（Brevibacterium lyt
icum）ATCC 15921 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacteri
um ammoniagenes）ATCC 6872 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ATCC 13826 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ATCC 13655 シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflav
ina）ATCC 9526 シュードモナス・ディミヌータ（Pseudomonas diminut
a）ATCC 11568 フラボバクテリウム・デボランス（Flavobacterium dev
orans）ATCC 10829 シュードモナス・アゾトリコリガンス（Pseudomonas az
otocolligans）ATCC 12417 シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomonas maltop
hilia）ATCC 17806 キサントモナス・オリゼー（Xanthomonas oryzae）IFO
3995 モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii）ATCC
25830 セラチア・ルビダエア（Serratia rubidaea）ATCC 1163
4 エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerog
enes）ATCC 13048 バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）ATCC 19221 コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC 13032 これらの微生物の培養には、通常の細菌の培養に用い
られる培地、例えばポリペプトン10g/l、肉エキス7g/
l、酵母エキス5g/lおよびNaCl3g/lを含みpH7.2に調整し
た培地（KM102培地）など、これらの微生物が生育でき
かつAsA2P生成活性を阻害しないものであれば、炭素
源、窒素源、その他の栄養素を含む天然培地、半合成培
地、合成培地などいかなる培地でも使用できる。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュクロ
ース、マルトースなどの各種の炭水化物、マンニトー
ル、ソルビトールなどの糖アルコールやグリセロールな
どのアルコール類、さらにピルビン酸、乳酸、クエン酸
などの各種の有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジ
ンなどの各種のアミノ酸、さらには澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜、白糠、キャッサバ、バガス、コーン・ステ
ィープ・リカーなどの天然有機栄養源などこれらの微生
物が資化できるものであればいずれでも使用できる。
ース、マルトースなどの各種の炭水化物、マンニトー
ル、ソルビトールなどの糖アルコールやグリセロールな
どのアルコール類、さらにピルビン酸、乳酸、クエン酸
などの各種の有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジ
ンなどの各種のアミノ酸、さらには澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜、白糠、キャッサバ、バガス、コーン・ステ
ィープ・リカーなどの天然有機栄養源などこれらの微生
物が資化できるものであればいずれでも使用できる。
窒素源としては、尿素、アンモニアあるいは塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩
類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミ
ノ酸類、あるいはペプトン、NZアミン、コーン・スティ
ープ・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、フィッシュミールあるいはその消化物、さなぎ加
水分解物などの含窒素有機物など種々の物質が使用可能
である。
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩
類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミ
ノ酸類、あるいはペプトン、NZアミン、コーン・スティ
ープ・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、フィッシュミールあるいはその消化物、さなぎ加
水分解物などの含窒素有機物など種々の物質が使用可能
である。
さらに、無機物としては、リン酸二水素カリウム、リ
ン酸一水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などが使用でき
る。また必要に応じて、微生物の生育に必要なビタミ
ン、アミノ酸、核酸その他のものを添加するが、前記し
たような他の培地成分に伴って培地に供給されれば特に
加えなくても良い。
ン酸一水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などが使用でき
る。また必要に応じて、微生物の生育に必要なビタミ
ン、アミノ酸、核酸その他のものを添加するが、前記し
たような他の培地成分に伴って培地に供給されれば特に
加えなくても良い。
培養は、振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条件下
で行うことが望ましい。温度は20〜40℃好ましくは25〜
35℃、pHは５〜10好ましくは6.5〜7.5で通常５〜100時
間培養を行う。
で行うことが望ましい。温度は20〜40℃好ましくは25〜
35℃、pHは５〜10好ましくは6.5〜7.5で通常５〜100時
間培養を行う。
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸とリン酸
基供与体とを反応させてAsA2Pを生成させる反応は、微
生物の培養中、培地にアスコルビン酸またはアラボアス
コルビン酸とリン酸基供与体とを存在させる方法（方法
１）、または微生物の培養液、菌体またはそれらの処理
物とアスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸および
リン酸基供与体を含有する液とを混合する方法（方法
２）により行われる。
基供与体とを反応させてAsA2Pを生成させる反応は、微
生物の培養中、培地にアスコルビン酸またはアラボアス
コルビン酸とリン酸基供与体とを存在させる方法（方法
１）、または微生物の培養液、菌体またはそれらの処理
物とアスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸および
リン酸基供与体を含有する液とを混合する方法（方法
２）により行われる。
反応液中には必要に応じて界面活性剤、有機溶剤など
を存在させることによりAsA2Pの生成率を向上させるこ
とができる。
を存在させることによりAsA2Pの生成率を向上させるこ
とができる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリ
ルアミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社
製）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドなど
のカチオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫
酸などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソ
ルビタン・モノステアレート（例えばノニオンST221、
日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤など、アス
コルビン酸またはアラボアスコルビン酸とリン酸基供与
体からAsA2Pを生成する反応を促進するものであればい
ずれでも使用でき、これらは通常１〜50mg/ml、好まし
くは１〜20mg/mlの濃度で用いられる。
ルアミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社
製）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドなど
のカチオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫
酸などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソ
ルビタン・モノステアレート（例えばノニオンST221、
日本油脂社製）などの非イオン性界面活性剤など、アス
コルビン酸またはアラボアスコルビン酸とリン酸基供与
体からAsA2Pを生成する反応を促進するものであればい
ずれでも使用でき、これらは通常１〜50mg/ml、好まし
くは１〜20mg/mlの濃度で用いられる。
有機溶剤としてはトルエン、キシレン、アセトン、脂
肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどを用いるこ
とができ、0.1〜50μl/ml、好ましくは１〜20μl/mlの
濃度で用いる。
肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどを用いるこ
とができ、0.1〜50μl/ml、好ましくは１〜20μl/mlの
濃度で用いる。
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸およびリ
ン酸基供与体としては、化学的な純品でも粗精製物でも
良く、またアスコルビン酸もしくはアラボアスコルビン
酸またはリン酸基供与体を含みAsA2Pの生成を妨げない
ものであればいかなるものでも使用できる。水性媒体中
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸は１〜500m
M、リン酸基供与体は１〜1,000mMの濃度範囲で用いる。
ン酸基供与体としては、化学的な純品でも粗精製物でも
良く、またアスコルビン酸もしくはアラボアスコルビン
酸またはリン酸基供与体を含みAsA2Pの生成を妨げない
ものであればいかなるものでも使用できる。水性媒体中
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸は１〜500m
M、リン酸基供与体は１〜1,000mMの濃度範囲で用いる。
方法２における反応は、温度20〜70℃で、アンモニ
ア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどによりpHを
３〜11に保ち、１〜48時間行う。
ア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどによりpHを
３〜11に保ち、１〜48時間行う。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、乾燥物、
界面活性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処
理物などがあげられる。また、菌体処理物としては、菌
体の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤処理
物、溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体からの抽
出酵素標品などがあげられる。
界面活性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処
理物などがあげられる。また、菌体処理物としては、菌
体の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤処理
物、溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体からの抽
出酵素標品などがあげられる。
分離菌体を用いる場合は、湿菌体重量にて１〜400mg/
mlの範囲が好ましい。
mlの範囲が好ましい。
AsA2Pは、ヌクレオシル10C18カラム〔マシュレー−ナ
ーゲル（Masherey-Nagel）社製〕を用いる高速液体クロ
マトグラフィーを用いて、254nmの吸収を測定すること
により、合成法により製造された純品を標準品として定
量することができる。
ーゲル（Masherey-Nagel）社製〕を用いる高速液体クロ
マトグラフィーを用いて、254nmの吸収を測定すること
により、合成法により製造された純品を標準品として定
量することができる。
培養液および水性媒体反応液からのAsA2Pの採取は、
菌体除去および除蛋白操作後、上清液を中和し、イオン
交換樹脂、セファデックスなどを用いるカラムクロマト
グラフィーや高速液体クロマトグラフィーにより行う。
菌体除去および除蛋白操作後、上清液を中和し、イオン
交換樹脂、セファデックスなどを用いるカラムクロマト
グラフィーや高速液体クロマトグラフィーにより行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1. シュードモナス・アゾトコリガンスATCC 12417を、KM
102培地30mlに植菌し、220rpmで30℃、20時間培養し
た。ついでKM102培地300mlに上記で得られた種培養液12
mlを植菌し、220rpmで30℃、20時間培養した。得られた
培養液を10,000×ｇにて10分間遠心分離し、湿菌体11.8
gを得て、−20℃にて凍結保存した。
102培地30mlに植菌し、220rpmで30℃、20時間培養し
た。ついでKM102培地300mlに上記で得られた種培養液12
mlを植菌し、220rpmで30℃、20時間培養した。得られた
培養液を10,000×ｇにて10分間遠心分離し、湿菌体11.8
gを得て、−20℃にて凍結保存した。
アスコルビン酸200mM、酢酸ナトリウム緩衝液100mM、
ナイミーンＳ−215（日本油脂社製）4g/l、キシレン10m
l/lの組成の液に、凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重量）
および第１表に示すリン酸基供与体のいずれか一つを40
mM含む反応液50mlを、マグネチック・スターラーにて10
0rpmで撹拌しつつ、温度を30℃に保って10時間反応させ
た。反応pHは、NaOHまたは塩酸を用いて調整した。生成
したAsA2Pを高速液体クロマトグラフィーにて定量し
た。ATPを用いた場合のAsA2Pの生成量を100としたとき
のそれぞれの相対活性と反応pHを第１表に示す。
ナイミーンＳ−215（日本油脂社製）4g/l、キシレン10m
l/lの組成の液に、凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重量）
および第１表に示すリン酸基供与体のいずれか一つを40
mM含む反応液50mlを、マグネチック・スターラーにて10
0rpmで撹拌しつつ、温度を30℃に保って10時間反応させ
た。反応pHは、NaOHまたは塩酸を用いて調整した。生成
したAsA2Pを高速液体クロマトグラフィーにて定量し
た。ATPを用いた場合のAsA2Pの生成量を100としたとき
のそれぞれの相対活性と反応pHを第１表に示す。
実施例2. シュードモナス・アゾトコリガンスATCC 12417を、KM
102培地30mlに植菌し、30℃で、20時間培養した。つい
でKM102培地300mlに上記で得られた種培養液12mlを植菌
し、30℃で、20時間培養した。得られた培養液を10,000
×ｇにて10分間遠心分離し、湿菌体11.8gを得て、−20
℃にて凍結保存した。凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重
量）を含む、アスコルビン酸200mM、ピロリン酸カリウ
ム200mM、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100mM、ナイ
ミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成の反応液
を50mlを、マグネチック・スターラーにて100rpmで撹拌
しつつ、温度を40℃に保って36時間反応させた。生成し
たAsA2Pを高速液体クロマトグラフィーにて定量したと
ころ、反応終了時に反応液上清中には32.0mg/mlのAsA2P
が生成蓄積していた。なお、アスコルビン酸−６−リン
酸、アスコルビン酸−３−リン酸、およびそれらのピロ
リン酸化物などの副生物はほとんど生成しなかった。
102培地30mlに植菌し、30℃で、20時間培養した。つい
でKM102培地300mlに上記で得られた種培養液12mlを植菌
し、30℃で、20時間培養した。得られた培養液を10,000
×ｇにて10分間遠心分離し、湿菌体11.8gを得て、−20
℃にて凍結保存した。凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重
量）を含む、アスコルビン酸200mM、ピロリン酸カリウ
ム200mM、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100mM、ナイ
ミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成の反応液
を50mlを、マグネチック・スターラーにて100rpmで撹拌
しつつ、温度を40℃に保って36時間反応させた。生成し
たAsA2Pを高速液体クロマトグラフィーにて定量したと
ころ、反応終了時に反応液上清中には32.0mg/mlのAsA2P
が生成蓄積していた。なお、アスコルビン酸−６−リン
酸、アスコルビン酸−３−リン酸、およびそれらのピロ
リン酸化物などの副生物はほとんど生成しなかった。
実施例3. 第２表に示す各菌株を、KM102培地30mlに植菌し、30
℃にて20時間種培養した。ついでKM102培地300mlに上記
で得られた種培養液12mlをそれぞれ植菌し、30℃にて20
時間培養した。得られた培養液をそれぞれ10,000×ｇに
え10分間遠心分離し、各菌株の湿菌体を得て、−20℃に
て凍結保存した。各凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重
量）を含む、アスコルビン酸200mM、ピロリン酸カリウ
ム200mM、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100mM、ナイ
ミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成の反応液5
0mlをそれぞれマグネチック・スターラーにて100rpmで
撹拌しつつ、NaOHでpHを4.0付近に、温度を30℃に保っ
て24時間反応させた。反応終了時に反応液上清中に生成
したAsA2Pを高速液体クロマトグラフィーにて定量し
た。結果を第２表に示す。
℃にて20時間種培養した。ついでKM102培地300mlに上記
で得られた種培養液12mlをそれぞれ植菌し、30℃にて20
時間培養した。得られた培養液をそれぞれ10,000×ｇに
え10分間遠心分離し、各菌株の湿菌体を得て、−20℃に
て凍結保存した。各凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重
量）を含む、アスコルビン酸200mM、ピロリン酸カリウ
ム200mM、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）100mM、ナイ
ミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成の反応液5
0mlをそれぞれマグネチック・スターラーにて100rpmで
撹拌しつつ、NaOHでpHを4.0付近に、温度を30℃に保っ
て24時間反応させた。反応終了時に反応液上清中に生成
したAsA2Pを高速液体クロマトグラフィーにて定量し
た。結果を第２表に示す。
実施例4. シュードモナス・アゾトコリガンスATCC 12417を、KM
102培地30mlに植菌し、220rpmで30℃、20時間種培養し
た。ついでKM102培地300mlに上記で得られた種培養液12
mlを植菌し、220rpmで30℃、20時間培養した。
102培地30mlに植菌し、220rpmで30℃、20時間種培養し
た。ついでKM102培地300mlに上記で得られた種培養液12
mlを植菌し、220rpmで30℃、20時間培養した。
得られた培養液を塩酸でpH4.0に調整した後、アスコ
ルビン酸200mM、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10
ml/lおよびピロリン酸40mMを添加し、100rpmで撹拌しつ
つ、温度を30℃に保って10時間反応させた。その結果As
A2Pが8.84g/l生成蓄積した。
ルビン酸200mM、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10
ml/lおよびピロリン酸40mMを添加し、100rpmで撹拌しつ
つ、温度を30℃に保って10時間反応させた。その結果As
A2Pが8.84g/l生成蓄積した。
実施例5. シュードモナス・アゾトコリガンスATCC 12417を、実
施例１と同様に培養し、得られた菌体を−20℃にて凍結
保存した。
施例１と同様に培養し、得られた菌体を−20℃にて凍結
保存した。
アラボアスコルビン酸200mM、第３表に示すリン酸基
供与体それぞれ150mM、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）
40mMの組成の反応液50mlに、ナイミーンＳ−215 4g/
l、キシレン10ml/lを加えて30℃で10分間処理した凍結
保存菌体50mg/ml（湿菌体重量）を加えて反応させた。
反応は、マグネチック・スターラーにて100rpmで攪拌し
つつ、NaOHでpHを4.0付近に、温度を30℃に保って60分
間行った。反応終了時に反応液上清中に生成したAsA2P
を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。結果を第
３表に示す。
供与体それぞれ150mM、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）
40mMの組成の反応液50mlに、ナイミーンＳ−215 4g/
l、キシレン10ml/lを加えて30℃で10分間処理した凍結
保存菌体50mg/ml（湿菌体重量）を加えて反応させた。
反応は、マグネチック・スターラーにて100rpmで攪拌し
つつ、NaOHでpHを4.0付近に、温度を30℃に保って60分
間行った。反応終了時に反応液上清中に生成したAsA2P
を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。結果を第
３表に示す。
発明の効果 本発明によれば、微生物の菌体、培養液またはそれら
の処理物を酵素源として用いて、アスコルビン酸または
アラボアスコルビン酸とピロリン酸などのリン酸基供与
体からAsA2Pを工業的に安価に製造することができる。
の処理物を酵素源として用いて、アスコルビン酸または
アラボアスコルビン酸とピロリン酸などのリン酸基供与
体からAsA2Pを工業的に安価に製造することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (1)
- 【請求項１】アスコルビン酸またはアラボアスコルビン
酸とリン酸基供与体とからアスコルビン酸−２−リン酸
を生成する活性を有するクレブシエラ属、セルロモナス
属、アルカリゲネス属、エアロモナス属、ブレビバクテ
リウム属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、
キサントモナス属、モルガネラ属、セラチア属、エンテ
ロバクター属、バチルス属およびコリネバクテリウム属
に属する微生物から選ばれる微生物の菌体、培養液また
はそれらの処理物の存在下、水性媒体中でアスコルビン
酸またはアラボアスコルビン酸と、パラニトロフェニー
ルフォスフェート、アセチルリン酸、ピロリン酸、トリ
ポリリン酸、テトラポリリン酸およびポリリン酸から選
ばれるリン酸基供与体とを反応させてアスコルビン酸−
２−リン酸を生成させ、反応液から生成したアスコルビ
ン酸−２−リン酸を採取することを特徴とするアスコル
ビン酸−２−リン酸の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63070218A JP2695180B2 (ja) | 1987-10-08 | 1988-03-24 | アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 |
| DE3888307T DE3888307T2 (de) | 1987-10-08 | 1988-10-05 | Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-2-phosphat. |
| EP88309279A EP0319130B1 (en) | 1987-10-08 | 1988-10-05 | Process for the preparation of ascorbic acid-2-phosphate |
| CA000579378A CA1335578C (en) | 1987-10-08 | 1988-10-05 | Process for the preparation of ascorbic acid-2-phosphate |
| KR1019880013190A KR920009525B1 (ko) | 1987-10-08 | 1988-10-08 | 아스코르빈산-2-포스페이트의 제조방법 |
| US07/758,528 US5212079A (en) | 1987-10-08 | 1991-09-06 | Process for the preparation of ascorbic acid-2-phosphate |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-254106 | 1987-10-08 | ||
| JP25410687 | 1987-10-08 | ||
| JP63070218A JP2695180B2 (ja) | 1987-10-08 | 1988-03-24 | アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01199590A JPH01199590A (ja) | 1989-08-10 |
| JP2695180B2 true JP2695180B2 (ja) | 1997-12-24 |
Family
ID=26411386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63070218A Expired - Lifetime JP2695180B2 (ja) | 1987-10-08 | 1988-03-24 | アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0319130B1 (ja) |
| JP (1) | JP2695180B2 (ja) |
| KR (1) | KR920009525B1 (ja) |
| CA (1) | CA1335578C (ja) |
| DE (1) | DE3888307T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101915847B1 (ko) * | 2016-09-21 | 2018-11-06 | 선문대학교 산학협력단 | 미생물을 이용한 생물전환 화합물의 생산 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3122663B2 (ja) * | 1990-06-21 | 2001-01-09 | 協和醗酵工業株式会社 | アスコルビン酸―２―リン酸の製造法 |
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| CN1760199B (zh) * | 2004-10-13 | 2010-05-05 | 华北制药集团有限责任公司 | 一种制备l-抗坏血酸-2-磷酸酯及其盐的方法 |
| CN101299932B (zh) * | 2005-09-02 | 2012-08-29 | 国立大学法人鹿儿岛大学 | 鱼酱油的生产方法 |
| WO2017214719A1 (en) * | 2016-06-13 | 2017-12-21 | 3R Valo, S.E.C. | Phosphorylated lignocellulosic fibers, uses and processes of preparation thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0740949A (ja) * | 1993-07-23 | 1995-02-10 | Koyo Autom Mach Co Ltd | ラべリングマシン |
-
1988
- 1988-03-24 JP JP63070218A patent/JP2695180B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-05 EP EP88309279A patent/EP0319130B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-05 CA CA000579378A patent/CA1335578C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-05 DE DE3888307T patent/DE3888307T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-08 KR KR1019880013190A patent/KR920009525B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
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| JPH0740949A (ja) * | 1993-07-23 | 1995-02-10 | Koyo Autom Mach Co Ltd | ラべリングマシン |
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|---|---|---|---|---|
| KR101915847B1 (ko) * | 2016-09-21 | 2018-11-06 | 선문대학교 산학협력단 | 미생물을 이용한 생물전환 화합물의 생산 방법 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0319130A2 (en) | 1989-06-07 |
| EP0319130A3 (en) | 1990-05-16 |
| KR920009525B1 (ko) | 1992-10-17 |
| KR890006823A (ko) | 1989-06-16 |
| JPH01199590A (ja) | 1989-08-10 |
| CA1335578C (en) | 1995-05-16 |
| EP0319130B1 (en) | 1994-03-09 |
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