KR920009513B1

KR920009513B1 - 5'-이노신산의 제조방법

Info

Publication number: KR920009513B1
Application number: KR1019880002835A
Authority: KR
Inventors: 다쓰로 후지오; 야스또시 다께이찌; 가쓰라 기따쓰지; 아끼히로 이이다
Original assignee: 교오와학꼬고오교 가부시끼가이샤; 가또 마끼오
Priority date: 1987-03-18
Filing date: 1988-03-17
Publication date: 1992-10-17
Also published as: JPS63230094A; EP0282989B1; DE3884644T2; HK49895A; KR880011346A; EP0282989A3; DE3884644D1; JPH0669386B2; EP0282989A2

Abstract

내용 없음.

Description

5'-이노신산의 제조방법

본 발명은 효소 반응에 의해 이노신을 인산화 함으로써 5'-이노신산 (이후에는 ＂IMP＂로 표시한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다. IMP는 조미료로 이용되며 따라서 본 발명은 식품공업의 분야에 관한 것이다.

지금까지 공지된 IMP제조방법으로는, (1) 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소적으로 분해하는 방법[일본국 특허 공고 제16141/1957호, 23698/1957호, 7532/1958호 및 35914/1958호 및 Food Technology 29,287(1964)], (2) 발효에 의해 생산된 이노신을 화학적으로 인산화 하는 방법[Agric. Biol. Chem., 36, 1511(1972) 및 Tetrahedron Letters, 50, 5065∼5068(1967)] 및 (3) IMP를 생산할 수 있는 미생물을 배양하고 배지에 축적된 IMP를 회수하는 방법[Agric. Biol. Chem., 46, 2257(1982)]등이 포함된다. 이들 공정 모두가 실용화되고 있다.

IMP는 일반 가정에서 조미료로 사용될 뿐만 아니라 어묵(boiled fish paste), 관모양의 어묵(tubularrolls of boiled fish paste), 인스턴트국수, 각종 수프 등의 가공식품에 널리 사용되며, 따라서 IMP를 경제적으로 제조하는 방법의 개발이 요구되어 왔다.

이오신 및 아데노신 -5'- 트리포스페이트(이후에는 ＂ATP＂로 표기한다)를 기질로 이용하여 이노신을 IMP로 효소적으로 인산화하는 반응은 이노신 키나제(EC 2. 7. 1. 73)에 대응하는 활성에 의해 촉매되어 다음식에서 나타낸 바와같이 IMP와 ATP전구체를 동시에 생성시킨다.

이노신 + ATP → IMP + ATP 전구체

IMP를 제조하는 경제적으로 실용적인 방법에서는 ATP를 저렴한 가격으로 공급하는 것이 필요하다. 이노신의 인산화 반응에서, ATP전구체 부분은 그대로 남아있는 반면에 ATP의 말단 인산기는 이노신에 취입되어 IMP를 형성한다. ATP의 합성에 필요한 에너지가 적절한 기질에 의해 공급되고 이 에너지를 이용하여 ATP전구체로 부터 ATP가 생하성되는 반응계(이후에는 이 반응계를 ＂ATP 재생계＂로 표기한다)가 있다면, ATP재생계를 이오신의 인산화반응과 결합 시킴으로써, ATP전구체에 대응하는 부분을 반복적으로 사용할 수 있는 IMP생성계, 즉 ATP이 공급이 없는 IMP생산계를 다음식과 같이 확립할 수 있다. 이경우에 있어서, 인산기 공여체 및 에너지 공여체의 가격이 저렴하다면, IMP를 경제적으로 이롭게 생산할수 있는 방법을 확립할 수 있다.

이노신 + ATP → IMP + ATP 전구체

ATP전구체 + 인산기 공여체 + 에너지 공여체 → ATP

본 발명자들은 탄화수소물 같은 탄소원으로 부터 이노신을 직접 발효 생산 시킬 수 있는 이노신 ―생산 미생물(이후에는 ＂이노신 미생물＂로 표기한다)의 작용, ATP전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로 부터 ATP를 생합성할 수 있는 활성을 갖는 미생물(이후에는 미생물은 ＂ATP―재생 미생물＂로 표기되고, 그 활성은 ＂ATP―재생활성＂으로 표기된다)의 작용 및 이노신 및 ATP로부터 IMP와 ATP전구체를 합성할 수 있는 미생물 (이후에는 ＂인산화 미생물＂로 표기한다)의 작용을 결합시키면, 글루코스 같은 탄수화물을 이노신 생산의 주원료로 사용하고 ATP를 재생하기 위한 값싼 에너지 공여체 및 값싼 인산기 공여체를 ATP대신에 이용함으로써 IMP를 실용적으로 생산할 수 있다는 것과 이노신 미생물이 동시에 갖고 있는 ATP재생 활성을 ATP재생계에 이용할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성 하였다.

본 발명을 이노신 또는 이노신을 생산할 수 있는 미생물을 배지에 배양하여 얻은 이노신―함유배양 브로쓰를 ATP전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로 부터 ATP를 생합성할 수 있는 미생물 세포의 처리생성물 및 이노신 및 ATP로부터 IMP 및 ATP전구체를 형성할 수 있는 미생물 세포의 처리 생성물과, 에너지 공여체 및 인산기 공여체의 존재하에 반응 혼합물내에 IMP가 축적될때까지 접촉시키고 그로부터 IMP를 회수함을 특징으로 하는 IMP의 제조방법에 관한 것이다.

이노신 또는 이노신―함유배양 브로쓰로는 이노신의 정제제품 또는 조정제품, 이노신 발효의 배양 브로쓰 및 그의 농축액, 세포가 없는 상층액 또는 상층액의 농축액을, 이들이 이노신→IMP에로의 인산화 반을을 방해하지 않는한 사용할 수 있다. 이노신 미생물을 배양하여 얻은 배양 브로쓰가 바람직하게 이용된다.

배지내에 이노신을 생산할 수 있는 한 어느 미생물이든 이노신 미생물로 사용할 수 있다. 특히, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) ATCC21295, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATTCC 19185, 바실루스 서브틸리스(Bacillus Subtilis) ATCC 14618등이 적절하다.

통상의 배양법에 따라 이들 미생물을 배양함으로서 상당량의 이노신을 배지에 축적할 수 있다. 즉, 이들 미생물을 적절한 탄소원, 적절한 질소원, 적절한 무기물, 아미노산, 비타민 등을 함유하는 통상의 배지 내에서, 온도, pH등을 조정하면서 호기성 조건하에 배양한다.

배양은 예를들면 진탕 및 통기 교반에 의한 호기성 조건하에서 20∼40℃, 바람직하게는 25∼35℃의 온도에서 통상적으로 10∼120시간 동안 배지의 pH를 중성 근처로 유지하면서 실시한다.

ATP전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로 부터 ATP를 생합성할 수 있는 미생물로는, ATP전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로 부터 ATP를 재생하는 활성을 갖는 것인한 어느 균주든 사용할 수 있다. 특히, 상술한 이노신 미생물 이외에, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 33525, 에스케리키아 콜리 ATCC 11303, 스타필로코커스 아우레우스(Staphy lococus aureus)ATCC 4012, 사이로미세스사케(Saccharomyces sake) ATCC20018, 칸디다 제일라노이데스(Candida zeylanoides) ATCC 203456, 토룰롭시스 시클로필라(Torulopsis paychrophila) ATCC 22163 등을 사용할 수 있다.

ATP―재생 활성을 갖는 세포로는 통상의 배양법에 따라 이들 미생물을 배양하여 얻은 배양액을 있는 그대로 사용할 수 있다. 덧붙여, 필요하다면, 배양액을 원심분리하여 얻은 세포를 이용할 수 있다. 즉, 이들 미생물을 적절한 턴소원, 적절한 질소원, 적절한 무기물, 아미노산, 비타민 등을 함유하는 통상의 배지내에서 온도, pH등을 조정하면서 호기성 조건하에서 배양한다.

배양은 예를들면 진탕 및 통기 교반에 의한 호기성 조건하에서 20∼50℃, 바람직하게는 25∼43℃의 온도에서 통상적으로 10∼120시간 동안 배지의 pH를 중성 근처로 유지하면서 실시한다. 원심분리는 5,000∼10,000rpm에서 10∼20분간 실시한다.

에너지 공여체로는, 사용되는 ATP―재생 미생물에 의해 이용될 수 있기만 하면, 클루코스, 아라비노스, 락토스, 말토스, 수크로스, 만니톨, 소리비톨, 트레할로스, 당밀, 블랙스트랩(blackstrap) 당밀. 전분 가수분해물 같은 탄수화물; 피루브산, 락트산, 아세트산, α―케토글루타르산 같은 유기산; 및 글리신, 아스파프트산, 글루탐산, 글루타민 같은 아미노산을 어느 것이든 사용할 수 있다. 나아가, 아세틸인산, 카르바밀인산, 크레아틴 인산 같은 인산화 화합물을 사용할 수 있다. 그 농도를 10g/ℓ∼ 500g/ℓ로 유지하는 것이 바람직하다.

인산기 공여체로는, 오르토인산, 피로인산, 폴리인산, 폴리메타인산 같은 무기 인산의 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염 등을 사용할 수 있다. 덧붙여, 아세틸인산, 카르바밀인산, 크레아틴딘산, 프룩토스―1,6―비스인산 같은 유기 인산화 화합물도 사용할 수 있다. 그 농도를 10∼400mM로 유지하는 것이 바람직하다.

이노신 및 ATP로부터 IMP 및 ATP 전구체를 형성할 수 있는 미생물로는, 이노신 및 ATP로부터 IMP를 형성하는 이노신―인산화 활성을 갖는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 특히, 에스케리키아 콜리 ATCC 14948, 에스케리아 콜리 ATCC 11303, 바실루스 서브틸리스 ATCC 14617, 플라보박테늄 데보란스(Flavobacterium devorans) ATCC 10829, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) YT 101, FERM BP―1291등을 예시할 수 있다. 나아가, 이들 미생물에서 유래된, 유전자 재조합, 세포 융합 같은 분자 육종법(molecular breeding procedure)에 의해 그 이노신―인산화 활성을 증가시킨 균주가 적절하다.

이노신 및 ATP로 부터 IMP를 형성하는 활성을 갖는 세포로는, 통상의 배양법에 따라 이들 미생물을 배양하여 얻은 배양액을 있는 그대로 사용할 수 있다. 덧붙여, 필요하다면, 배양액을 원심분리하여 얻은 세포를 이용할 수 있다. 즉, 이들 미생물을 적절한 탄소원, 적절한 질소원, 적절한 무기물, 아미노산, 비타민등을 함유하는 통상의 배지내에서, 온도, pH등을 조정하면서 호기성 조건하에서 배양한다.

배양은, 예를들면 짙아 및 통기 교반에 의한 호기성 조건하에서, 20∼50℃, 바람직하게는 28∼43℃의 온도에서 통상적으로 1∼48시간 동안 실시한다. 배양도중에는 배지의 pH를 중심 근처로 유지하는 것이 바람직하다. 원심 분리는 5,000∼10,000rpm에서 10∼20분간 실시한다.

이노신 미생물, ATP―재생 미생물 및 인산화 미생물의 배양에 이용되는 탄소원에는 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 만니톨, 소르비를 같은 탄수화물; 당 알콜, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 같은 각종 알콜 및 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 같은 각종 아미노산이 포함된다. 미생물에 의해 동화될 수 만 있다면, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수찌기, 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있다.

질소원은 암모니아; 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 초산암모늄 같은 무기 및 유기 암모늄염; 글루탐산, 글루타민, 메티오닌 같은 각종 아미노산; 및 펩톤, NZ아민, 옥수수 침지액, 육즙, 효모 엑기스, 카제인 가수분해물, 어육 또는 그의 소화물, 번데기 가수분해물 등의 질소―함유 유기물질을 포함한다.

무기물로는, 인산이수소칼륨, 인산일수소나트륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산구리, 염화망간, 암모늄 몰리브데이타. 황산아연 등을 필요에 따라 배지에 가할 수 있다. 비타민, 아미노산, 미네랄, 핵산 및 미생물의 성장에 필요한 다른 물질을 배지에 가하는데, 만일 이것들이 상술한 다른 배지 성분에 의해 자연적으로 공급된다면 이들 특정 영양소를 배지에 따라 첨가할 필요는 없다.

ATP―재생 미생물 및 인산화 미생물 세포의 처리 생성물에는 배양물의 건조 잔류물, 동결―해동 생성물 및 동결 건조 생성물; 계면 활성제―및/또는 유기용매―처리 배양액, 아세톤―처리 배양액 및 세균 분해효소―처리 배양액; 동결 세포, 건조세포, 동결건조세포, 동결―해동세포 아세톤 처리 세포, 계면 활성제―및/또는 유기용매―처리 세포 및 세균분해 효소―처리 세포 및 그의 고정화 세포가 포함된다. 덧붙여, 세포로부터 추출한 ATP―재생 효소 또는 이노신―인산화 효소를 함유하는 액체, 이들 효소의 정제품 및 고정화 생성물 등을 이 목적을 위해 사용할 수 있다.

이노신 또는 이노신―함유 배양 브로쓰, ATP―재생 미생물의 처리 세포 및 인산화 미생물의 처리세포를 인산기 공여체 및 에너지 공여체와 접촉시킴으로써 IMP가 반응 혼합물 내에 축적된다. 필요하다면 ATP전구체를 반응 혼합물에 가할 수도 있다.

이노신의 IMP에로의 인산화 반응은 필요에 따라 pH를 6―10, 바람직하게는 7∼8로 조정하고, 반응 혼합물을 20∼50℃로 1∼48시간 동안 유지하면서 마그네슘 이온, 계면활성제 및/또는 유기용매를 반응혼합물에 가함으로써 실시한다. 이노신→IMP에로의 인산화 반응에서 이노신의 농도는 1∼100mg/ml의 범위인 것이 바람직하다.

ATP전구체로는 이노신→IMP에로의 인산화반응을 방해하지 않는한, 아데노신 5'―디포스페이트, 아데노신 5'―모노포스페이트, 아데노신, 아데닌의 정제제품 또는 조정제품 및 이들 화합물을 함유하는 물질을 사용할 수 있다. 세포 또는 배양액으로 부터 반응계내에로 생기는 ATP전구체의 양이 충분한 경우에는 그것을 첨가할 필요는 없다.

계면 활성제로는, 폴리옥시에틸렌 스테아릴아민(예, 니민 S-215(Nymin S-215), Nihon Oil and Fats Co., Ltd.의 제품, 일본국); 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 카치온(Kachion) FB, 카치온 F2-40E(Nihon Oil and Fats Co., Ltd.,의 제품)같은 양이온성 계면 활성제; 소듐 올레일아미드 설페이트, 니우레꾸스(Nyurekkus) TAB, 라피조루(Rapizoru) 80 (Nihon Oil and Fats Co., Ltd.,의 제품)같은 음이온성 계면 활성제; 폴리옥시에틸렌소프비탄 모노스테아레이트(예, Nonion ST 221, Nihon Oil and Fats Co., Ltd.,의 제품)같은 양성 계면 활성제; 및 산뀨(Sankyu) 아민 PB(Nihon Oil and Fats Co., Ltd.,의 제품), 헥사데실 디메틸아민등을, 이들이 이노신→IMP에로의 인산화를 촉진시킬 수 있기만 하면, 사용할 수 있다. 계면활성제는 통상적으로 0.1∼50mg/ml, 바람직하게는 1∼20mg/ml의 농도로 사용한다. 덧붙여, 유기 용매로는 톨루엔, 크실렌, 지방족 알콜, 벤젠, 에틸 아세테이트 등을 0.1∼50μg/ml, 바람직하게는 1∼20μg/ml의 농도로 사용할 수 있다.

이노신의 IMP에로의 인산화 반응에서 마그네슘 이온의 농도는 4∼400mM로 유지하는 것이 바람직하다. 배양물 또는 세포로부터 인산화 반응계 내로 생성되는 마그네슘 이온의 양이 이 농도범위에 속하면 이들 이온을 첨가 할 필요는 없지만, 한편으로 이 이온의 양이 적으면 그양이 상기 농도 범위에 속하도록 첨가한다. 마그네슘 이온으로는 무기 및 유기 마그네슘 염을 어느것이든 사용할 수 있다.

반응 혼합물로 부터 IMP를 회수하는 것은 활성탄, 이온교환수지 등을 이용하는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.

하기에 본 발명의 실시예를 나타내었다.

[실시예 1]

1%폴리펩톤, 0.5%욱즙, 0.5%효모 엑기스 및 0.25%염화나트륨을 함유하는 종 배지(pH 7.2)10ml를 포함하는 50ml들이 대형 시험관에 1루프(one loopful)의 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295를 접종시키고, 30℃에서 24시간 동안 왕복 진 배양한다. 15%글루코스, 0.01%카제인 가수분해물, 0.7%효모엑기스, 1.0%황산암모늄, 0.3%KH₂PO₄, 0.3% K₂HPO₄, 0.5% MgSO₄·7H₂O, 10μg/ml 아데닌, 10μg/ml구아닌 및 10μg/ℓ의 비오틴을 함유하는 배지(pH 7.2로 조정한 후에 120℃에서 20분간 오토클레이브한다) 30ml을 함유하는 배풀이 장치된 300ml들이 에를렌마이어 플라스크에 2ml씩의 종배양액을 접종시킨다. 30℃에서 회전진탕에 의해 배양하는 중에, 필요에 따라 배지에 우레아를 가하여 pH를 중성 근처로 유지한다. 72시간 동안의 배양에 의해 21.1mg/ml 이노신이 배지에 형성된다. 원심분리에 의해, 이노신 미생물의 세포를 제거한 상층액을 얻는다.

세균주, 즉 사카로미세스 사케 20018, 토룰롭시스 시크로필라 ATCC 22163 및 칸디다 제일라노이데스 ATCC 20356을, 30g/ℓ글루코스, 5g/ℓ황산암모늄, 1g/ℓKH₂PO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄·7H₂O, 3g/ℓ 효모엑기스 및 10g/ℓCaCO₃(멸균전 pH 6.5)를 함유하는 종배양 배지 300ml를 포함하는 2ℓ―에를렌마이어플라스크에 접종하고 30℃에서 24시간동안 배양한다. 30ml의 종배양액을, 150g/ℓ글루코스, 10g/ℓ황산암모늄, 1g/ℓKH₂PO₄, 0.5g/ℓMgSO₄·7H₂O 및 5g/ℓ옥수수 침지액(멸균전 pH 6.5)을 함유하는 생산 배지 300ml를 함유하는 2ℓ―에를렌마이어 플라스크에 접종하고, 배양도중에 암모니아를 이용하여 pH를 약 6.5로 조정하면서 30℃에서 48시간 동안 회전진탕 배양한다. 원심분리에 의해 배양액으로부터 세포를 회수한다.

1루프의 각각의 에스케리키아 콜리 ATCC 33525, 에스케리키아 콜리 ATCC 11303, 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 4012 및 세라티아 마르세센스 YT101, FERM BP―1291을, 상기와 동일한 조성을 갖는 종배지(pH 7.2) 10ml를 함유하는 대형 시험관에 멸균후에 접종시키고 30℃에서 20시간 동안 왕복 진탕 배양한다. 2ml의 종배양액을, M9 배지(6mg/ml Na₂HPO₄, 3mg/ml KH₂PO₄, 5mg/ml NaCl, 1mg/ml NH4, Cl, 4μg/ml 티아민·HCl, 3mg/ml 글루코스 및 0.25mg/ml MgSO₄·7H₂O, pH 7.2)300ml를 함유하는 2ℓ―에를렌마이어 플라스크에 접종시키고, 30℃에서 17시간 동안 회전진탕 배양한다. 원심 분리하여, 배양액으로부터 세포를 회수한다.

각각 ATP―재생 활성을 갖는 사카로미세스 사케 ATCC 20018, 토롤롭시스 시크로필리아 ATCC 22163, 칸디다 제일라노이데스 ATCC 29356, 에스케리키아 콜리 ATCC 33525, 에스케리키아 콜리 ATCC 11303 또는 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 4012를, 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295의 이노신 발효 배양액의 상측액에 100mg/ml(젖은 세포 중량)의 균주 농도가 되도록 가하고, 이노신을 인산화하여 IMP를 형성하는 활성을 갖는 세라티아 마르세센스 YT101, FERM BP―1291을 100mg/ml(젖은 세포 중량)의 농도로 가한다. 이렇게 얻은 각각의 세포 현탄액에 50mg/ml 글루코스, 8mg/ml의 25%의 소듐 피테이트(pH 7.0), 5mg/ml Na₂HPO₄및 5mg/ml MgSO₄·7H₂O를 가하고, 4mg/ml 니민 S-215 및 10μg/ml크실렌(에스케리키아 및 스타필로코커스 속의 경우에)을, 그리고 1g/l 산꾸아민 PB(사카로미세스, 토룰롭시스 및 칸디다 속의 경우에)를 더 가하고, 이렇게 얻은 현탁액 200ml 비이커에 따로따로 넣고, 암모니아를 이용하여 현탁액의 pH를 약 7.4로 유지하면서 자기 교반기를 이용하여 900rpm으로 교반하며 30℃에서 24시간 동안 반응을 실시하여 이노신의 IMP에로의 인산화 반응을 수행한다. 결과를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

[실시예 2]

1% 폴리펩톤, 0.5% 육즙, 0.5% 효모엑기스 및 0.25% 염화나트륨을 함유하는 종배지(pH 7.2) 10ml를 포함하는 70ml- 대형 시험관에 1루프의 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295를 접종시키고, 30에서 24시간 동안 왕복 진탕 배양한다.

한편, 15% 글루코스, 0.01% 카제인 가수분해율, 0.7％ 효모엑기스, 1.0% 황산 암모늄, 0.3% KH₂PO₄, 0.3% K₂HPO₄, 0.5% MgSO₄·7H₂O, 10μg/ml 아데닌, 10μg/ml 구아닌 및 10μg/l 비오틴을 함유하는 배지를 pH 7.2로 조정하고, 20ml의 배지를 배플이 장치된 300ml- 에를렌마이어 플라스크에 넣는다. 배지를 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 2ml의 종배양액을 거기에 접종시킨 후에, 필요에 따라 우레아를 가하여 pH를 중선 근처로 유지하면서 30℃에서 회전 진탕 배양한다. 76시간의 배양에 의해 20.0mg/ml 이노신이 배지에 형성된다.

1루우프의 세라티아 마르세센스 YT 101, FERM BP-1291을 상기와 동일한 조성을 갖는 멸균 종배지(pH 7.2) 10ml를 포함하는 대형 시험관에 접종 시키고, 30℃에서 20시간 동안 왕복 진탕하여 배양하고, 이렇게 얻은 종배지 2ml를 30ml의 M9 배지를 함유하는 2ℓ- 에를렌마이어 플라스크에 접종시키고 30℃에서 17시간 동안 회전 진탕 배양한다. 원심 분리하여 배양액으로부터 세포를 회수하고 -20℃에서 동결하여 보존한다.

세라티아 마르세센스 YT 101, FERM BP-1291의 동결 균주를 물에 현탁시키고, 이노신 발효액을 가하여 젖은 세포 중량으로서 농도 50mg/ml로 만들고, 50mg/ml 글루코스, 8mg/ml의 25% 소듐 피테이트(pH 7.0), 5mg/ml Na₂HPO₄및 5mg/ml MgSO₄·7H₂O를 가하고, 4mg/ml 니민 S-215 및 10μg/ml 크실렌을 더 가한다. 20ml의 현탁액을 200ml- 비이커에 넣고, 암모니아를 이용하여 pH를 약 7.4로 유지하면서 자기 교반기를 이용하여 900rpm으로 교반하여 30℃에서 24시간 동안 이노신→IMP의 인산화 반응을 실시한다. 8.80mg/ml IMP가 반응 혼합물내에 형성 축적되고, 니민 S-215 또는 크실렌을 첨가하지 않았을 때에는 0.6mg/ml IMP가 축적되는 것이 발견된다. 세라티아 마르세센스의 세포를 가하지 않았을 때에는, 축적된 IMP의 양은 0.3mg/ml 미만이다.

[실시예 3]

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 19185를 이노신 미생물로 사용하는 것을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 배양 및 반응을 행한다. 형성된 이노신의 양은 7.35mg/ml이고, 형성된 IMP의 양은 3.44mg/ml이다

[실시예 4]

실시예 2와 동일한 방법으로 배양을 실시한다. 형성된 이노신의 양은 18.9mg/ml이다. 세라티아 마르세센스 YT 101, FERM BP-1291 대신에 표 2에 나타낸 균주를 사용하는 것을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로, (A) 상기에서 얻은 배양액 및 (B)원심분리하여 이노신 발효 배양액으로부터 얻은 상층액을 이용하여 반응을 실시한다. 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

[실시예 5]

브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295를 실시예 2와 동일한 방법으로 74시간 동안 배양하여 18.3mg/ml 이노신을 함유하는 발효 배양액을 얻는다.

한편, 세라티아 마르세센스 YT 101, FERM BP-1291을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 이렇게 얻은 배양액으로부터 원심분리에 의해 세포를 회수한다. 세포를 인산염 완충액(pH 7.0)에 현탁시켜 200mg/ml(젖은 세포 중량) 농도로 만들고, 총 10분간 가끔 빙냉조건하에 초음파 파쇄기(UR-200P형, Tomy Seiko K.K. 제품, 일본국)내에서 파쇄한다. 세포-파쇄된 현탁액 100ml를 10,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 분자 시이브막(Amicon사제의 스탠다드 셀 모델 52(standard cell model 52), 동일회사 제품의 디아플로우막(Diaflow membrane) YM10이 장치되어 있음을 이용하여 상층액을 10ml로 농축한다. 농축생성물을 반응액에 이용한다.

2ml의 세라티아 마르세센스의 세포 추출 농축액을 18ml의 이노신 발효 배양액에 가하고 50mg/ml 글루코스, 8mg/ml의 25% 소듐 피테이트(pH 7.0), 5mg/ml Na₂HPO₄및 5mg/ml MgSO₄·7H₂O를 가하고, 4mg/ml 니민 S-215 및 10μg/ml 크실렌을 더 가한다. 20ml의 생성된 혼합물을 200ml - 비이터에 넣고 실시예 2와 동일한 방법으로 반응시킨다. 반응 혼합물내에 6.44mg/ml IMP가 발견된다.

[실시예 6]

브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양함으로써 19.3mg/ml 이노신과 세포를 함유하는 발효 배양액을 얻는다.

한편, 세라티아 마르세센스 YT 101, FERM BP-1291을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 회수한다.

세라티아 마르세센스의 세포를 (1)증류수, (2) 0.4% 니민용액, (3) 1% 크실렌 용액 또는 (4) 0.4% 니민 -1% 크실렌용액에 현탁시키고, 각각의 현탁액을 이노신 발효 배양액에 가하여 50mg/ml(젖은 세포 중량)로 만든다. 50mg/ml 글루코스, 8mg/ml의 25% 소듐 피테이트(pH 7.0) 5mg/ml Na₂HPO₄, 및 5mg/ml MgSO₄·7H₂O를 가하고, 각 혼합물 20ml씩을 200ml - 비이커에 넣고 실시예 2와 동일한 방법으로 IMP형성 반응을 실시한다. 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

Claims

이노신 또는 이노신을 생산할 수 있는 미생물을 배지에서 배양하여 얻은 배양 브로쓰를, 아데노신- 5'- 트리포스페이트의 전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로부터 아데노신 -5'- 트리포스페이트를 생합성 할 수 있는 미생물 세포의 처리 생성물 및 이노신 및 아데노신 -5'- 트리포스페이트로부터 5'- 이노신산 및 아데노신 -5'- 트리포스페이트의 전구체를 형성할 수 있는 미생물 세포의 처리 생성물과, 에너지 공여체 및 인산기 공여체의 존재하에 5'- 이노신산이 반응 혼합물내에 축적될 때까지 접촉시키고 그로부터 5'- 이노신산을 회수함을 특징으로 하며; 상기 아데노신 -5'- 트리포스페이트를 생합성 할 수 있는 미생물 세포의 처리 생성물은 배양액의 건조잔류물, 동결- 해동 생성물 및 동결- 건조 생성물; 계면활성제- 및/ 또는 유기용매- 처리 배양액, 아세톤- 처리 배양액 및 세균 분해 효소- 처리 배양액; 동결 세포, 건조 세포, 동결- 건조 세포, 동결 - 해동 세포, 아세톤- 처리 세포, 계면 활성제- 및/또는 유기용매- 처리 세포 및 세균 분해 효소-처리 세포로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 5'- 이노신산 및 아데노신 -5'-트리포스페이트의 전구체를 형성할 수 있는 미생물 세포의 처리 생성물은 배양액의 건조 잔류물, 동결-해동 생성물 및 동결- 건조 생성물; 계면 활성제- 및/또는 유기용매- 처리 배양액, 아세톤- 처리 배양액 및 세균 분해 효소- 처리배양액; 동결 세포, 건조 세포 동결- 건조 세포, 동결- 해동 세포, 아세톤- 처리 세포, 계면 활성제- 및/또는 유기용매- 처리 세포 및 세균분해 효소- 처리 세포로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 이노신을 생산할 수 있는 미생물은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 19185, 바실루스 서브틸리스 ATCC 14618로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 아데노신 -5'- 트리포스페이트의 전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로부터 아데노신 -5'-트리포스페이트를 생합성할 수 있는 미생물은 에스케리키아 콜리 ATCC 33525, 에스케리키아 콜리 ATCC 11303, 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 4012, 사카로미세스 사케 ATCC 20018, 칸디다 제일라노이데스 ATCC 20356, 토룰롭시스 시크로필라 ATCC 22163으로 구성된 군으로부터 선택되며; 상기 이노신 및 아데노신-5'- 트리포스페이트로부터 5'- 이노신산 및 아데노신 -5'- 트리포스페이트의 전구체를 형성할 수 있는 미생물은 에스테리키아 콜리 ATCC 14948, 에스케리키아 콜리 ATCC 11303, 바실루스 서브틸리스 ATCC 14617, 플라보박테리움 데보란스 ATCC 10829, 세라티아 마르세센스 YT 101, FERM BP-1291로 구성된 군으로부터 선택된 5'-이노신산의 제조방법.
제1항에 있어서, 이노신을 생산할 수 있는 미생물이 아데노신 -5'-트리포스페이트의 전구체, 에너지 공여체 및 인산기 공여체로부터 아데노신 -5'-트리포스페이트를 생합성할 수 있는 미생물임을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 에너지 공여체를 탄수화물, 유기산 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택함을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 인산기 공여체를 무기인산 및 그의 염, 유기 인산화 화합물로 구성된 군으로부터 선택함을 특징으로 하는 제조방법.