KR830001259B1

KR830001259B1 - 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법

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Publication number: KR830001259B1
Application number: KR1019810002929A
Authority: KR
Inventors: 한상열; 이새배; 옥치영; 최종수
Original assignee: 서울미원 주식회사; 임철수
Priority date: 1981-08-12
Filing date: 1981-08-12
Publication date: 1983-06-30

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법

본 발명은 발효법에 의한 L-글루타민을 제조할때 토양에서 분리한 코리네박테리움속의 글루타민산 생산능력을 가진 균주를 변이처리하여 얻은 푸로린(proline)과 알지닌(Arginine) 동시요구성을 갖는 코리네박테리움속의 변이주 MWM-800208(KFCC-10033)를 분리, 배양하여 다량의 L-글루타민을 배지내에 생성시켜 이를 분리, 회수하는 방법에 관한 것이다. L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기궤양치료제, 알콕중독치료제, 뇌기능개선약제등 의약용으로 다양하게 이용되고 있는 물질이다.

종래의 발효에 의한 L-글루타민의 제조방법은 일본특허공보 소39-7391호에 글루타민산 생산균주를 과량의 질소원이 함유되어 있는 배지에 배양하는 방법이, 일본특허공보 소49-81587호에 설파제 내성균주를 분리 배양하는 방법이, 또는 일본특허공보 소51-15688호에 항생물질을 배양액에 첨가하거나 항생물질과 계면활성제를 첨가시켜서 L-글루타민을 생산 축적시키는 방법등이 알려져 있다.

그러나 질소과잉의 배지에서는 균주의 정상적인 생육이 불량하므로 다량의 무기염을 첨가시켜 과잉의 질소에 의한 균의 생육저해작용을 해제시켜야 했으며, 또한 축적된 L-글루타민이 부산물인 푸로린이나 알지닌 합성계로 전환되어 다량의 L-글루타민 생산이 어려웠다.

또 설파제 내성균주를 분리하여 배양할 경우에는 내성균주의 분리가 용이하지 않을뿐만 아니라 내성균주를 분리하여 이용할 경우에도 배양액에 설파제의 첨가농도시간등이 균주나 균주의 생육상태에 따라 달라짐으로 해서 공업적으로 매우 복잡한 방법이었다. 마찬가지로 항생물질이나 계면활성제등의 첨가시에도 사용균주나 균주의 생육조건등에 따라서 약제의 처리시간, 처리농도등 그 방법이 상이해서 공업적으로 불리한 L-글루타민 생산방법이었다.

본 발명자들은 토양에서 분리한 글루타민산을 생산하는 코리네박테리움 NO462를 친주로 변이처리하여 각종 영양요구주, 항생물질 내성균주, L-글루타민아날로그내성균주를 분리, 이들 변이주에 의한 L-글루타민의 발효적인 제조방법을 연구해오던중 푸로린과 알지닌 동시요구성 균주 MWM-800208(KFCC-10033)가 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 알아내고 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명을 구체적으로 설명하면, 미생물에 의하여 L-글루타민을 제조함에 있어서 푸로린과 알지닌 동시요구성을 갖는 코리네박테리움속의 변이주 MWM-800208(KFCC-10033)을 당질을 주원료로 하는 영양배지에 호기적으로 배양하여 배양액내에 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 새로운 균주의 분리방법은 토양에서 분리한 글루타민산을 생산하는 코리네박테리움속의 균주를 친주로 통상의 변이처리 즉, 자외선조사나 화학변이유기제를 처리하여 푸로린요구성 균주를 얻고 이 균주를 모균주로 해서 다시 자외선조사나 NTG(N-메칠-N'-메칠-N-니트로소구아니딘), DES(디에칠설페이트)등의 화학변이유기제를 처리하여 얻어진 균주중에 푸로린과 알지닌 동시요구성 균주가 높은 L-글루타민을 축적하여 이 균주를 분리하게 된 것이다.

신균주의 분리용 액체배지조성은 포도당 10%, 염화암모늄 3%, 제1인산카리 1%, 제2인산카리 1%, 황산마그네슘 500mg/

, 황산망간 10mg/

, 치아민염산염 1mg/

, 육즙 0.5%, 푸로린 50mg/

, 알지닌 50mg/

, pH7.2, 탄산칼슘 5%(별도멸균첨가)이다.

분리배지에서의 배양방법은 분리배지 10ml를 50ml 삼각후라스크에 분주하여 멸균한 후 변이주를 접종하여 온도 30℃에서 72시간 진탕배양한 후 L-글루타민의 생성량을 상법에 따라 분석하여 축적량이 높은 균주를 분리하였다.

이와 같은 방법으로 선별분리한 본 발명 신균주의 균학적성질을 조사해본 결과 다음에 상세히 기재하는 바와 같다. 실험방법은 매뉴얼 오프 마이크로바이올로지칼메소드(Manual of Microbiolocal method : H.J.Conn and M.W. Jennison, Society of American bacteriologist 1957)에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

현미경적 성상

18) 글루타민 합성계효소(Glutamine synthetase)의 활성이 극히 강함.

19) 본 발명의 신균주를 그래이와 타텀(Gray and Tatum)배지를 변형한 최소배지에 접종 배양할 경우 생육을 하지않고 푸토린과 알지닌을 단독으로 첨가했을 경우에도 생육을 하지않았으나 푸로린과 알지닌을 동시에 최소배지에 첨가했을때 생육을 나타냈다. 그러므로 본 발명의 신균주는 푸로린과 알지닌 동시요구성 균주임이 확실하다. 또한 본 발명의 신균주의 친주를 당질을 함유하는 영양배지에 호기적인 방법으로 동일하게 배양, 비교했을때 본 발명 신균주의 친주는 글루타민산의 축적이 현저한 반면, 본 발명의 신균주는 글루타민산의 축적이 거의 나타나지 않고 글루타민의 생성이 크게 증가했다.

20) 유기산의 생성 : 포도당배지에서 α-케토글루탈산과 젖산이 미량 생성됨.

21) 당자화성

상기와 같은 균학적 성질을 갖는 본 발명의 신균주를 버지스 메뉴얼(Bergy′s Manual of Determinative Bacteriology) 7,8판을 이용하여 분류 동정해본 결과 코리네박테리움속의 영양요구주임을 알게되어 코리네박테리움 MWM-800208(KFCC-10033)이라 명명하고 이를 변이처리전 친주의 균학적성질과 비교해본 결과는 다음표 1에 기재된 바와 같이 균주의 생리학적 성질이 상이하게 나타났다.

[표 1]

[친주(코리네박테리움 NO 462)와 본 발명 사용변이주(MWM-800208)의 균학적 성질 비교]

주 1) 최소배지 : 그래이와 타텀(Gray and Tatum)배지의 변형포도당 5%, 염화암모늄 0.5%, 질산암모늄 0.1%, 황산나트륨 0.2%, 황산마그네슘 0.01%, 제1인산카리 0.1%, 제2인산카리 0.3%, 비오틴 10r/

, 치아민 1mg/

, 미량원소혼합액 1ml(미량원소혼합액조성 : 소디움테트라보레이트 90mg, 암모니움멜리보데이트 40mg, 염화철 1g, 황산아연 800mg 등을 혼합하여 증류수 1

에 용해한 것)

주 2) +++: 생육양호, +: 생육보통, ± : 생육불량, - : 생육불능

주 3) *발효조건 : 후기 실시예 2와 동일함.

이상과 같은 성질을 갖는 본 발명의 새로운 균주 MWM-800208을 이용하여 L-글루타민을 발효할때 L-글루타민의 축적이 현저하게 증가하는 원인은 다음에 표시한 대사경로에서 알 수 있듯이 푸로린과 알지닌을 생육에 요구하기 때문에 글루타민산이 푸로린이나 알지닌으로 전환되어지는 효소계의 첫번째 효소인 글루타메이트 키나제와 글루타메이트 아세틸트란스퍼라제의 결손으로 생성되는 대부분의 글루타민산이 글루타민 합성효소(Glutamine Synthetase)의 작용을 받아 모두 글루타민으로 전환되어지기 때문인 것으로 나타났다.

다음은 본 발명에 사용한 변이주 MWM-800208(KFCC-10033)의 L-글루타민 생산대사의 추정경로이다.

본 발명자들의 실험결과에 의하면 발효배지중 푸로린과 알지닌을 각각 30-100mg/

첨가하는 것이 L-글루타민 축적에 가장 적당한 것으로 나타났다. 글루타민 발효의 배양조건은 탄소원으로써 포도당, 전분 가수분해물, 폐당밀등을 사용할 수 있으며, 질소원으로써는 암모니아가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄, 초산암모늄등을 이용할 수 있으며, 천연의 영양원으로써 육즙, 효모엑기스, 펩톤, 콘스팁리커(C.S.L), 대두박 가수분해물이 사용가능하고, 무기금속염으로서는 황산마그네슘, 염화아연, 제1인산카리, 제2인산카리, 황산망간 등이 혼합첨가된 배지면 이용가능하다.

배양방법은 온도 30℃내외에서 pH 5.5-7.5로 유지하면서 호기적으로 2-3일간 배양한다. 배양완료액내에 축적된 L-글루타민은 상법에 따라 이온교환수지에 흡착시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 정제하여 L-글루타민 조결정을 얻는다. 이하 실시예에서 상세히 기술한다.

[실시예 1]

사용균주 : 코리네박테리움 MWM-800208(KFCC-10033)

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30r/

, pH7.0

발효배지 : 포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(C.S.L) 0.5%, 육즙 0.7%, 제1인산카리 0.2%, 제2인산카리 0.2%, 황산마그네슘 300mg/

, 황산철 20mg/

, 황산망간 20mg/

, 황산아연 10mg/

, 치아민염산염 1mg/

, 요소 0.5%, 푸로린 50mg/

, 알지닌 50mg/

, pH7.2, 탄산칼륨 5%(별도 멸균첨가)

배양방법 : 상기 종배지 50ml를 500ml 진탕후라스크에 분주하여 상법에 따라 가충 멸균한 후 본 발명의 신균주 코리네박테리움 MWM-800208 균주를 접종하고 30℃에서 24시간동안 진탕 배양하여 종균배양액으로 한다.

발효배지 20ml를 500ml 진탕후라스크에 분주하고 120℃에서 10분간 가압멸균하여 준비한 본 배지에 종균배양액 2ml에 접종하여 30℃에서 72시간동안 진탕배양한다. 발효종료 후 배양액내의 L-글루타민 축적량은 50.1mg/ml였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지에서 탄산칼륨을 제외한 배지 2

를 사입하여 멸균한 5

소형 발효조에 종균배양액 200ml를 접종하고 600rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. pH조절은 암모니아수로써 6.0-7.0으로 조절한다. 발효완료 후 배양액내 L-글루타민의 축적량은 56.8mg/ml였다. 발효완료액 1

를 균체를 제거한 후 상법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리, 정제하여 L-글루타민 조결정 49.8g을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 2의 발효배지중 포도당대신 폐당밀을 포도당으로 환산 10%되게 첨가한 발효배지 2

를 5

소형 발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한 후 냉각한다. 여기에 종균배양액 200ml를 접종하여 600rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. 그외는 실시예 2와 동일하게 행한다. 발효종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 50.4mg/ml였다.

[실시예 4]

실시예 2의 발효배지중 포도당 대신 전분가수분해물을 포도당으로 10%되게 환산하여 첨가한 발효배지 2

를 5

소형발효조에 사입하여 실시예 2와 동일한 배양방법으로 배양한다. 발효종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 52.6mg/ml였다.

[실시예 5]

실시예 2와 동일한 발효배지 15

를 30

소형발효조에 사입하여 멸균, 냉각한 다음 종균배양액 1.5

의 종배양액을 접종하여 온도 30℃, 400rpm, 1.5vvm으로 48시간 배양한다. pH는 암모니아가스로 6.0-7.0사이로 조절한다. 그외는 실시예 2와 동일하게 행한다. 발효종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 57.4mg/ml였다.

Claims

미생물에 의해 L-글루타민을 제조함에 있어서, 푸로린과 알지닌 동시요구성을 갖는 코리네박테리움속의 변이주 MWM-800208(KFCC-10033)을 당질을 주원료로 하는 영양배지에 호기적으로 배양하여 배양액내에 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법.