KR910007822B1 - 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법
본 발명은 L-로이신 요구성을 갖고 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 L-글루타민 생성균주를 변이 처리한후 L-글루라이신 요구성을 부가시킨 뉴주를 분리 배양하여 다량의 L-글루타민을 배양액에 축적하는 것을 특징으로하는 미생물에 의해 L-글루타민을 제조하는 방법에 관한것이다.
L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기 궤양치료제, 알콜중독치료제, 뇌기능개선제등 의약용으로 잘 알려져 있는 물질이다.
종래 미생물에 의한 L-글루타민 제조방법으로서는 일본특허공보 소 39-7391호에 L-글루타민산 생산균주를 과잉의 질소원이 함유되어있는 배지에 배양하는 방법이, 일본특허 공보 소 49-31547호에 설파제 내성균주를 분리 배양하는 방법이, 일본특허 공보 소 53-12490호에 항생물질을 배양액내에 첨가하는 방법이, 일본특허공보 소 51-15688호에 항생물질과 계면활성제를 첨가시켜서 L-글루타민을 생성 축적시키는 방법, 대한민국 특허 제15042에 L-로이신, L-알라닌 요구성균주를 이용 L-글루타민을 축적시키는 방법등이 알려져있다.
그러나 공지의 방법을 이용 L-글루타민 생성시 타아미노산인 L-글라이신이 배양액내 축적되고 축적된 L-글라이신은 L-글루타민의 생합성을 저해시키므로서 다량의 목적 생산물 축적에 어려움이 있었다.
본 발명자들은 L-글루타민의 미생물에 의한 생산을 연구해오던중 생육에 로이신을 요구하고 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되는 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)를 변이처리하여 L-글루타민 생합성에 저해작용을 하는 L-글라이신 요구성을 첨가한 코리네박테리움 KCTC-8467P)(MWM860619)가 L-글라이신 요구성을 갖지 않는 친주에 비해 배양액내에 L-글루타민 생성능력이 우수한 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 된것이다.
본 발명의 새로운 균주의 분리방법은 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)를 통상의 변이처리 즉 자외선 조사나 화학변이 유기제인 NTG(N-메틸-N'-메틸-N-니트로소구아니딘), DES(디에틸설페이트)를 처리하여 일정 농도이상의 L-글라이신을 첨가한 배지에 배양한후 이를 분석 L-글라이신에 요구성을 갖는 균주가 친주균인 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)보다 다량의 L-글루타민을 배양액내에 축적시키는 것으로 나타나 본 균주를 분리 이용했다.
신균주의 분리용 배지의 조성은, 포도당 10%, 염화암모늄 3%, 제1인산칼륨 1%, 제2인산칼륨 1%, 황산마그네슘 500mg/L, 황산망간 10mg/ℓ, 티아민 염산염 1mg/ℓ, 육즙 0.5%, L-로이신 50mg/ℓ, L-알기닌 50mg/ℓ, L-글라이신 30mg/ℓ, pH 7.2, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가)이다.
분리배지에서의 배양 방법은 분리배지 5ml을 50ml 삼각플라스크에 분주하여 멸균한 후 변이 처리한 균주를 접종하여 30℃에서 72시간 진탕 배양하였으며, L-글루타민의 생성량을 페이퍼크로마토그라피, 및 아미노산 자동분석기를 이용분석하였다.
이와 같은 방법으로 선별 분리한 본 발명의 신균주의 균학적 성질을 친주인 코리네박테리움 MWM-791012와 L글라이신 첨가 농도별 생육 및 L-글루타민 생성량을 비교 분석 해본 결과는 다음표 1에 기재된 것과 같이 L-글라이신이 첨가된 경우 생육은 약간 저해 되었으나 L-글루타민 축적량이 향상되는 것으로 나타났다.
[표 1]
Figure kpo00001
주(1)생육도: 배지 (분리배지 이용)에서 72시간 진탕배양한 배양액을 희석 610nm에서 흡광도 측정.
주(2) Gln 축적량 : L-글루타민 축적량(mg/ml)
배지조성 : 후기실시예 1의 발효배지조성과 동일함.
이와같은 성질을 갖는 본 발명의 새로운 균주 KCTC. 8467P(MWM 860619)를 이용하여 L-글루타민을 발효할때 L-글루타민 축적량이 증가하는 것은 다가 다른자리입체성(Multivalent allosteric) 저해를 받는 L-글루타민 합성효소가 L-글라이신에 의해서 저해 받는 작용이 해제되므로해서 합성 대사작용이 L-글루타민쪽으로 집중되기 때문인것으로 판단된다.
L-글루타민 발효의 배양조건은 탄소원으로써 포도당, 원당, 전분가수분해물등이 사용 가능하며, 질소원으로서는 암모니아 가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄등을 이용할수 있으며, 그외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지면 이용가능하다.
배양방법은 온도 30℃내외에서 pH를 5.5-7.5로 유지시키면서 호기적으로 2-3일간 배양한다.
배양 완료액내에서 축적된 L-글루타민은 통상의 방법에 따라 이온 교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 정제하여 L - 글루타민 조결정을 얻는다.
이하 실시예에서 상세히 설명한다.
[실시예 1]
사용균주 : 코리네박테리움 MWM 860619(kctc-8467p)
종배지조성 : 포도당 5%, 펩톤1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.025%, 요소 0.3%, 비오틴 30γ/ℓ, pH 7.0
발효배지조성 : 포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(C.S.L) 0.5%, 육즙 0.7%, 제1인산칼리 0.2%, 황산마그네슘 300mg/ℓ, 황산철 200mg/ℓ, 황산망간 200mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 티아민염산염 1mg/ℓ, 요소 0.5%, 로이신 50mg/ℓ, 알라닌 50mg/ℓ,글라이신 30mg/ℓ, 탄산칼슘 5%(별도멸균첨가) pH 7.2
배양방법 : 상기 종배지 50ml을 500ml진탕 플라스크에 분주하여 통상의 방법에 따라 가압 멸균한후 본 발명의 신균주 코리네박테리움 KCTC. 8467P(MWM-860619)를 접종하여 30℃에서 24시간동안 진탕 배양한 것을 종균 배양액으로 한다.
상기 발효 배지 20ml를 500ml 진탕 플라스크에 분주하여 120℃에서 15분간 가압 멸균하여, 준비한 종균 배양액 2ml를 접종한 후 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양한다.
발효 종료후 배양액내의 L-글루타민 축적량은 62.5mg/ml였다.
[실시예 2]
실시예 1의 발효배지에서 탄산칼슘을 제외한 배지 16ℓ을 사입하여 멸균한 30ℓ소형 발효조에 미리 준비한 종균 배양액 1ℓ을 접종하고 400rpm, 1vvm의 조건으로 30℃에서 74시간 배양한다.
pH조절은 액체암모니아로 5.5-7.5사이로 조절한다.
발효 완료후 배양액내 L-글루타민 축적량은 69.2mg/ml발효 완료액 1ℓ을 여과하여 균체를 제거한후 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착, 분리정제하여 L-글루타민 조결정 58.8g을 얻었다.
[실시예 3]
실시예 2의 발효배지중 포도당 대신 원당을 포도당으로 환산 10%되게 첨가한 발효배지 16L을 30ℓ소형 발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한후 냉각하여 미리 준비한 종균 배양액 1ℓ를 접종한 후 400rpm,1vvm의 호기적인 조건으로 30℃에서 70시간 배양한다.
그외는 실시예 2와 동일하게 행한다.
발효 종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 62.1mg/ml였다.
[실시예 4]
실시예 2와 동일한 배지중 포도당 대신 전분가수 분해물을 포도당으로 10%되게 첨가한 발효배지를 이용하여 실시예2와 동일한 방법으로 행하였다.
발효종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량을 64.7mg/ml였다.

Claims (1)

  1. 미생물에 의한 L-글루타민을 제조함에 있어서 글라이신 및 로이신 요구를 갖고 알라닌에 의해 생육이 촉진되는 균주인 코리네박테리움 KCTC 8467P (MWM-860619)를, 당질을 주원료로 하는 영양 배지에 호기적으로 배양하는 것을 특짖으로 하는 미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법.
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