KR910007818B1 - 글루타민(Glutamine)을 생산하는 미생물 - Google Patents

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Abstract

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Description

글루타민(Glutamine)을 생산하는 미생물
본 발명은 글루타민을 생산하는 미생물에 관한 것으로 브레비 박테리움속(Brevibacterium속) 균주의 변이주로서 설파구아니딘(Sulfaguanidine)과 글루타민 아날로그(Glutamine analogue)에 내성을 가지고 글루타민을 탄소원 및 질소원으로 자화하지 않으면서 글루타민을 고농도로 생산하는 미생물에 관한 것이다.
종래 미생물에 의한 글루타민의 생산은 일본특허공보 소 53-17675호에 설파구아니딘(Sulfaguanidine)내성 균주로부터 얻는 방법과 일본 특허공보 소46-42195호에 글루타민산을 생산할 수 있는 균주를 사용하여 생육배지에 탄소원 100에 대해서 질소원 10이상 첨가된 배지에 염소이온을 0.2MO1 이상을 첨가하여 글루타민을 생산하는 방법등이 있다.
본 발명자들은 글루타민을 생성할 수 있는 공지의 균주, 예를들면 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13032), 브레비박테리움 프라법(ATCC 14067), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(ATCC 13869), 당사에서 글루타민산을 생산하기 위해서 개량된 브레비박테리움 락토퍼멤텀의 삼투압 내성균주 (KFCC 10659, 출원번호 88-16541) 등의 균주들을 주 3의 배지에 접종하여 글루타민 생산을 시도해 본 결과 글루타민 이외의 부산물이 많이 생산되어 생산효율이 극히 낮았다. 시험결과는 표 1과 같다.
따라서 본 발명자들은 글루타민 생산효율을 높이기 위해서 당사에서 글루타민산 생산균으로 개발된 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 삼투압내성 균주 KFCC 10659를 모주로 하여 설파구아니딘 및 O-Diazoacetyl-L-Serine에 내성을 갖는 변이주를 유도하였다. 모주로 KFCC 10659를 사용한 이유는 표 1에서 보는 바와 같이 글루타민 생산량은 1.8g/ℓ로 작은량을 생산하지만 글루타민과 글루타민산 이외의 아미노산 생산이 타 균주보다 다소 적으며 글루타민산은 타균주들 보다 다소 높은 편이다. 따라서 부산물이 적고 글루타민 합성효소의 활성을 높여주면 글루타민산에서 글루타민으로의 전환이 용이할 것으로 사료되어 KFCC 10659를 선택하게 되었다.
본 발명자들은 현재 산업에 이용되고 있는 글루타민산 생산균주, 예를들면 ATCC 13869, ATCC 13032, ATCC 14067등의 균주를 이용해서 설파구아니딘 및 O-diazoacetyl-L-Serine에 내성을 갖는 변이주들로 배지내에 글루타민이 고농도로 축적됨을 확인하였다. (표4)
변이주를 유도한 방법을 설명하면 다음과 같다.
브레비박테리움 락토퍼멘텀 삼투압 내성균주 KFCC 10659에 변이 유기제인 엔티지(N.T.G, N-methyl -N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 설파구아니딘 내성주들을 얻어서 일정량의 글루타민을 생산하는 균주를 선별하였다.
또한 일정량의 글루타민이 배양배지내에 축적되면 글루타민에 의해 글루타민합성효소(Gultamine Synthetase)의 활성이 저해되는 현산(feed-back inhibition)이나 글루타민 합성효소의 합성이억제되는 현상)feed-back repression)이 나타나게 되어 글루타민의 과잉생산이 어렵게되는데, 이러한 현상들을 제거하기 위하여 글루타민을 생산하는 설파구아니딘 내성 균주에 엔티지를 처리하여 글루타민 아날로그 내성주들을 얻었고 이들 중에서 글루타민을 고농도로 생산하는 균주를 선별하였다.
변이주를 유도한 방법을 설명하면 다음과 같다.
브레비박테리움 락토퍼멘텀 삼투압 내성균주 KFCC 10659 에 변이 유기제인 엔티지를 처리하고 설파구아니딘 최종농도 400ug/ml 되게 첨가된 최소배지 (주1)에 도말하고 30℃에서 5-6일간 배양하여 설파구아니딘 내성주를 구하였다.
설파구아니딘 내성주들을 글루타민 생산배지(주2)에서 48시간 삼각 플라스크에서 배양하여 3-4g/ℓ의 글루타민을 생산하는 균주를 선별하였고 이를 브레비박테리움 락토퍼멘텀 CS 311로 명명하였다.
위에서 얻은 변이주에 또다시 변이 유기제인 엔티지를 처리하여 글루타민 아날로그인 O-Diazoacetyl-L-Serine가 최종농도 80ug/ml되게 첨가된 최소배지(주1)에 도말하고 30℃에서 5-6일간 배양하여 글루타민 아날로그 내성주들을 얻었다. 글루타민 아날로그 내성주들을 글루타민 생산배지(주2)에서 48시간 삼각플라스크에서 배양하여10-11g/ℓ의 글루타민을 생산하는 균주를 선별하였고 이를 브레비박테리움 락토퍼멘텀 CS 31102로 하였으며,변이주의 생리적인 특성은 표2, 표3과 같다. 이균주는 한국종균협회에 기탁하여 KFCC 10680의 기탁번호를 부여받았다. 또한 KFCC 10659와 CS-31102(KFCC 10680)를 글루타민, 생산배지(주2)에서 48시간 삼각플라스크에서 배양하여 그 아미노산의 함량을 비교한 결과, KFCC10659의 경우 글루타민산이 10.2g/ℓ, 글루타민이 1.8g/ℓ, 푸롤린이 0.8g/ℓ 생산된 반면, 본 발명의 변이주 CS31102(KFCC 10680)의 경우 글루타민이 9.8g/ℓ, 글루타민산이 1.34/ℓ생산되었고, 푸롤린의 함량은 훨씬 낮았다.(표4)
따라서 본 발명은 글루타민산(Glutamate)을 고농도를 생산하는 균주로부터 글루타민의 생산성이 높은 변이주를 얻음으로서 글루타민의 공업적인 생산을 가능하게 하는 미생물 발효에 관한 것이다.
본 발명에서 획득한 변이주의 특성은 표 2,3,4와 같다.
(주1) 최소배지 : 포도당 2%, 우레아 0.1%, 염화암모니움 1%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.1%, 황산철 0.001%, 티아민 연산염 350ug/ℓ, 비오틴 5㎍/ℓ, pH7.0
(주2) 발효배지: 포도당 5%, 염화암모니움 4%, 육즙 0.5%, 인산제 1칼륨 0.05%, 인산제 2칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.05%, 황산철 0.001%, 비오틴 10㎍/ℓ, 타아민 염산염 350㎍/ℓ, 칼슘 카보네이트 1.5%, pH 7.4
[표 1]
Figure kpo00001
[표 2]
Figure kpo00002
[표 3]
Figure kpo00003
[표 4]
Figure kpo00004
이상에서 발명한 변이주를 실시예에 따라 설명하면 다음과 같다.
[실시예1]
본 발명의 변이주 CS 31102 (KFCC 10680)
종배지 :
포도당 1%, 펩톱 1%, 효모엑기스 0.5%, 육즙 0.5%, 염화나트리움 0.25%, 우레아 0.1%, pH 7.2
발효배지 :
포도당 5%, 염화암모니움 4%, 육즙 0.5% 인산제1칼륨 0.05%, 인산제2칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.05%, 황산철 0.001%, 비오틴 10㎍/ℓ, 티아민 염산염 350㎍/ℓ, 칼슘 카보네이트 1.5%, pH7.4
발효방법
상기 종배지 20ml 을 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 사용균주를 접종하고 30℃에서 22시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 50ml을 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균하여 종배양액 3ml을 식균한 다음 72시간 배양하였다. 진탕기의 회전수 매분당 220, 온도 30℃에서 배양하였으며, 48시간 이후부터 5N-KOH를 수시로 첨가하여 pH가 7/4가 되게 하였다. 그 결과 배지내에 15.6g/ℓ의 글루타민이 축적되었다.
[실시예 2]
사용균주
본 발명의 변이주 CS 31102(KFCC 10680)
종배지 :
실시예 1과 동일
발효배지:
실시예 1과 동일
발효방법 :
실시예1과 동일하나 48시간 후 20% 염화암모니움 5ml을 첨가하였다. 그 결과 글루타민의 배지내 축적량은 15.2g/ℓ였다.
[실시예 3]
사용균주 본 발명의 변이주 CS 31102(KFCC 10680)
종배지 :
실시예 1과 동일
발효배지:
실시예 1과 동일하나 Mn++의 최종농도가 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M되게 첨가하였다.
발효방법:
실시예 1과 동일
그결과 10-6M의 Mn++에서 글루타민이 19.4g/ℓ가 배지내에 축적되었다.
[실시예 4 ]
사용균주 :
본 발명의 변이주 CS 31102(KFCC 10680)
종배지 :
실시예1과 동일
발효배지 : 실시예1과 동일하게 하고 Mn++의 최종농도 10-6M 되도록 MnCl2를 첨가하였다.
1차 종배양 :
종배지를 40ml씩 진탕용 삼각프라스크에 넣고 살균후 상기 균주를 식균하여 진탕기에서 180rpm, 30℃, 20-24시간 배양하였다.
2차 종배양 :
종배지를 2.6L 시험용 발효조에 1.2L량 분주하고 121℃에서 15분간 살균, 냉각후 1차 종배양의 배양액 10ml량 식균한 후 900rpm, 30℃, 산소유통량 1vvm에서 10-15시간 배양하였다.
발효방법 :
상기 발효배지를 5L 용량 시험 발효조에 1.8L량 분주하고 121℃에서 15분간 살균, 냉각후 2차 종배양액을 약 150ml 접종하여 회전수 매 분당 900, 1-1.5vvm, 30℃에서 배양하였다. 배양중 잔당 농도가 0.5-1.5%가 될때 마다 살균된 당을 피딩하여 96시간까지 배양하였고, 배양도중 20% KOH를 이용하여 pH를 6.8로 유지시켰다. 배양완료 후 배지내에 축적된 글루타민은 42.5g/ℓ였다.

Claims (4)

  1. 글루타민산을 생산하고, 설파구아니딘 및 O-Diazoacetyl-L-Serine에 내성을 갖는 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)변이주 KFCC 10680.
  2. 제1항의 변이주 KFCC 10680을 배양배지에서 발효하여 글루타민을 생산하는 제조방법.
  3. 제2항에서 질소원으로 염화암모니움을 사용하는 제조방법.
  4. 제2항에서 배양배지내 Mn++의 농도를 10M-5M과 10-7M사이에서 사용하는 제조방법.
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