KR890000538B1 - 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법

본 발명은 미생물 변이주를 이용하여 5'-이노신산을 제조하는 방법에 관한 것으로 가장 특징적인 점은 브레비 박테리움 암모니아 게네스 아데닌 구아닌 비오틴 동시 요구성이면서 크산틴에는 생육이 촉진되지 않고 세포막 투과성이 변한 세포막 투과성 변이주로 스트렙토 마이신 및 슬파구 아니딘 슬파치아졸에 강한 내성을 가지고 있는 특수한 변이주 MW-2369-3210(KCTC 8202P)를 사용하여 5'-이노신산을 고농도로 발효액에 축적시키는 것이다.

5'-이노신산은 5'-구아닐산과 더불어 글루타민산과 혼용할때 맛의 강한 상승 효과를 나타내는 핵산계조미료로 사용되는 것으로, 종래 미생물 변이주에 의한 5'-이노신산 제조방법은 아데닌요구성 균주를 이용하는 방법(일특공소 49-24474)망간 비감수성 균주를 이용하는 방법(U.S.P.-3745087)등이 있다. 그러나 이들 방법의 대부분은 5'-이노신산 축적량이 적거나 히포크산틴이 부생되거나, 발효배지에 망간 이온농도 혹은 아데닌 농도를 제한하여 주어야하는 어려움이 있었다.

특히 망간 비감수성변이주를 이용하는 경우 배지중의 망간 이온농도에는 영향을 받지 않으나 아데닌농도에 영향을 받고 발효액중의 생균수가 급격히 감소하여 5'-이노신산의 수율이 감소하는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결한 특수한 변이주 즉, 브레비박테리움 암모니아게네스 아데닌 요구성이며 구아닌 또는 크산틴에 생육이 촉진되고 세포막이 투과성이 변한 세포막 투과성 변이주 MW-2369(KAIST 850214-15612)를 발명한 바 있다. (한국 특허공고 85-1233)

본 연구자들은 변이주 MW-2369를 개량하여 생산성을 더욱 향상시키기 위해 미생물 균주개량에 흔히 사용되어 온 여러 약품에 대해서 각종 내감수성 균주를 분리하여 생산성을 조사한 결과 스트렙토 마이신 및 슬파구 아니딘 슬파치아졸에 강한 내성을 가지는 변이주가 친주에 비하여 생산성이 향상된 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 사용하는 특수한 변이주 MW-2369-3210을 분리한 방법은 다음과 같다.

브레비박테리움 암모니아 게네스 MW-2369(KAIST 850214-15612)를 주1의 배지에 식균하여 30℃에서 12시간 배양한 균체를 0.05M 인산완충액(pH 7.0) 2ml에 잘 현탁시킨 후 50㎍/ml 농도의 N-메칠-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘 용액(0.05 인산완충액에 용해)2ml를 첨가하여 상온에서 20분간 진탕시킨 후 원심분리 및 세척에 의해서 균체와 변이 유기체를 분리시킨 후 주2의 배지에 식균하여 일주일간 진탕 배양한 후 주3의 배지에 평판 배양한 후 (5일간)생성된 균집락을 취하여 다시 주4의 배지에서 일주일간 배양 후 주5의 배지에 평판배양(5일간)한 후 생육한 균주를 선별하였다. 선별된 균주중 스트렙토마이신 내성과 슬파구 아니딘 내성이 가장 강한 균주만을 취하여 생산성을 조사하여 생산성이 가장 우수한 본원 발명의 균주를 최종선별하였다.

주1) 포도당 1%, 비프엑기스 1%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 식염 0.3%, 아데닌 구아닌 각 50mg/l, 한천 2%, pH 7.2 120℃에서 15분 멸균.

주2) 주1의 배지에서 한천을 제외하고 스트렙토 마이신 20㎍/ml 농도로 첨가.

주3) 주1의 배지에 스트렙토 마이신 50㎍/ml 농도로 첨가.

주4) 주1의 배지에 한천을 제외하고 슬파구 아니딘 200㎍/ml 농도로 첨가.

주5) 주1의 배지에 슬파구 아니딘 300㎍/ml 농도로 첨가.

본 발명의 변이주 MW-2369-3210가 친주 MW-2369 및 MW-2367와의 유전적 및 생리학적 차이점은 다음과 같다.

[표 1] 영양 요구성 비교

주6) ++ : 생육양호 - : 생육않음

회소배지 : 포도당 2%, 제1인산카리 0.01%, 제2인산카리 0.03%, 황산마그네슘 0.01%, 염화칼슘 10mg/l, 황산철 10mg/l, 황산아연 1mg/l, 황산망간 1mg/l, 비오틴 50㎍/l, 치아민 염산염 1mg/l, 판토텐산칼슘 5mg/l, 황산암모늄 0.3%, 요소 0.2%, 한천 2%, pH 7.2

각 영양 요구물질은 50mg/l 농도로 첨가하였으며 30℃에서 72시간 배양생육도에 따라 조사하였다.

주7) MW-2367은 MW-2369의 친주임.

[표 2] 라이소자임 농도에 따른 생육비교

배지조성 : 주6의 최소 배지에 아데닌ㆍ구아닌 각 50mg/ℓ 라이소자임 각 농도로 첨가 5일간 30℃에서 배양 조사하였음.

[표 3] 페니실린-C 첨가농도에 의한 생육비교

주6의 조사방법과 동일하게 하였으며, 페니실린 각 농도로 첨가

[표 4] 스트렙토 마이신 첨가농도에 의한 생육비교

주1의 배지에 각 농도로 스트렙토 마이신을 첨가 30℃에서 5일간 배양 조사하였음

[표 5] 슬파구 아니딘 및 슬파치아졸 첨가농도에 의한 생육비교

주1의 배지에 각 약품을 첨가 30℃에서 5일간 배양 조사하였음.

그외 생리학적 특성으로 본원발명의 균주가 대부분의 항생관련 아나로그물질에 대한 강한 내성을 가지고 있었으며, 이러한 여러가지 생리적 성질은 친주와 비슷하였다.

위의 생리학적 및 유전적 변이확인 실험에서 볼 수 있는 바와같이 본원 발명의 특수한 변이주 MW-2369-3210은 영양요구성 확인에서 아데닌ㆍ구아닌 동시 요구성이며, 특징적인 점은 대부분의 5'-이노신산 생산균주가 크산틴 요구 혹은 생육 촉진을 하는데 비하여 본원 변이주는 크산틴을 요구하거나 생육이 촉진되진 않았다. 따라서 본원 발명의 균주는 핵산 생합성 대사에 명확한 변이가 확인되고, 단백질 합성등을 저해하는 항생물질에 대한 강한 내성을 나타내며, 세포막 투과성 변이를 확인하기 위한 페니실린 및 라이소자임 첨가 실험에서 친주에 비하여 감수성 농도가 다소 증가된 것을 확인할 수 있어 친주와 동일한 세포막 투과성 변이주임을 확인된다.

본원 발명의 균주의 5'-이노신산 생산 실험에 있어서도 친주에 비해서 생산성이 향상되었음을 확인할 수 있어 본원 발명의 균주가 5'-이노신산의 공업적인 제조 방법에 유용한 새로운 균주로 판단된다. 본원 발명의 균주가 종래의 균주에 비하여 더욱 특이한 점은 발효 과정에 있어서 스트렙토 마이신을 20㎍-40㎍/ml 농도로 첨가할때 대당 수율이 증가함을 발견하였다.

[표 6] 5'-아노신산 발효시 스트렙토 마이신 첨가비교

주) 스트렙토 마이신 첨가는 배양액의 10-20㎍/ml 농도로 발효개시 25-30시간 1회, 5-10시간 간격으로 1회 첨가 각 4회씩 실시한 평균 발효시간 및 생산량을 표시하였다. MW-2369는 3㎍/ml 2회 첨가하여 1회 실시하였으나 생산성이 좋지않고 발효시간이 지연되었다.

발효방법 : 실시예 1에 준하였음

본 발명의 균주를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 경우, 본 발명균주의 생육 및 5'-이노신산 생산에 적합한 탄소원, 질소원, 무기염류 및 영양원을 함유한 배지에서 pH 6.8-8.0, 온도 28-38℃ 호기적 조건으로 2-5일간 배양한다. 또한, 표6에서 상술한 바와같이 발효 과정에 있어서 스트렙토 마이신을 적절한 농도로 첨가하여 5'-이노신산의 생산을 촉진시킬 수도 있다. 5'-이노신산이 생산된 발효액을 통상의 방법에 따라 균체를 분리한 후 이온교환 수지에 흡착 용리시키고 탈색수지 혹은 활성탄을 사용하여 탈색한 후 농축하여 공지의 방법에 따라 5'-이노신을 회수한다. 본 발명의 상세한 방법은 실시예에서 기재하고 있으나 본원이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명의 균주 MW-2369-3210을 포도당 40g, 효모엑기스 10g, 육엑기스 5g, 폴리펩톤 5g, 제1 및 제2인산카리 각 1g, 황산망간 10mg, 황산아연 1mg, 황산철 10mg, 아데닌ㆍ구아닌 각 200mg, 증류수 1l, pH 7.2로 조성된 배지를 2l 진탕후라스크에 200ml 분주하여 120℃에서 20분 멸균한 종배지에 종균을 식균하여 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액을 제조하고 발효배지 조성으로는 포도당 100g, 과당 20g, 제1 및 제2인산카리 각 10g, 황산망간 10mg, 황산아연 1mg, 황산철 5mg, 글루타민소다 500mg, 비오틴 30㎍, CSL 20g, 치아민 염산염 1mg, 황산암모늄 2g, 아데닌ㆍ구아닌 각 120mg, 을 물 1l에 용해한 발효 배지를 2l 소형 발효조에 1l를 사입한 후 120℃에서 20분 멸균한 후 pH 7.0으로 조절하여 강기의 종배양액을 5%되게 식균하여 교반수 800rpM 통기량 1VVM, 33℃에서 배양하면서 배양중 암모니아수로 pH 7.2로 조절 유지하였다. 발효 완료액 중 5'-이노신산 축적량은 28.72mg/ml 였으며 5'-이노신산 이외의 핵산 관련물질은 검출되지 않았다. 반면에 이와 동일한 방법으로 MW-2369를 식균하였을때 19.43mg/ml 농도의 5'-이노신산을 생산하였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지 중 망간 이온 20mg/l, 아데닌ㆍ구아닌 각 150mg/l농도로 첨가하여 배양한 경우 5'-이노신산의 축적량은 24.87mg/ml였다.

[실시예 3]

실시예 1과 같은 방법으로 하였으며 배양 진행 25시간에 스트렙토 마이신 15㎍/ml 농도로 첨가한 후 10시간 후 다시 같은 농도로 첨가하였다. 배양 완료후 5'-이노신산 생산량은 35.46mg/ml였다.

[실시예 4]

50l 발효조에 실시예 1의 배지를 25l사입한 후 종배양액을 5%되게 식균하여 교반수 500rpM, 통기량 0.5VVM, 33℃암모니아로 pH 7.2 조절하였다. 배양중 잔당이 1-2%일때 70% 포도당액을 배양액의 5%되게 1회 첨가하였으며, 발효개시 25시간 부터 스트렙토 마이신 10㎍/ml 농도로 2회 추가하였다(8시간 간격) 발효 완료 후 5'-이노신산의 농도는 74.32mg/ml였다. 균체를 제거한 발효액 10l를 상법에 따라 이온교환 수지에 흡착용리하여 탈색한 후 농축하여 5'-이노신산 650g을 분리하였다.

Claims (2)

1. 아데닌ㆍ구아닌 동시 요구성이며, 스트렙토 마이신, 슬파구 아니딘, 슬파치아졸에 내성을 가지고 망간 이온에 영향을 받지 않는 세포막 투과성 브레비박테리움 암모니아 게네스 변이주 MW-2369-3210(KCTC 8202P)를 통상의 배지에서 배양함을 특징으로 하는 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 변이주 MW-2369-3210(KCTC 8202P)를 스트렙토 마이신을 첨가한 배지중에서 배양함을 특징으로하는 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법.