KR850001233B1 - 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법

본 발명은 미생물의 변이주를 이용하여 5'-이노신산을 공업적으로 제조하는 방법에 관한 것으로 가장 특징적인 점은 브레비박테리움 암모니아 게네스 아데닌요구성이며 또는 크산틴에 생육이 촉진되고, 살베이지 합서능이 특히 강하며 세포막 투과성이 변한 특수한 변이주 MW-2369 (KAIST 850214-15612)를 사용하여 5'-이노신산을 고농도로 발효액중에 축적시키는 것이다.

5'-이노신산은 5'-구아닐산과 더불어 글루타민산과 혼용할 때 맛의 강한 상승효과를 나타내는 핵산계 조미료로서 잘 알려져 있는 물질이다. 종래 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법은 아데닌요구성 균주를 이들 방법(일특공소 43-24474) 망간비감수성 균주를 이용하는 방법(USP 3745687) 등이 있다. 그러나 이들 방법의 대부분이 5'-이노신산 축적량이 적거나, 히포크산틴 등이 부생되거나, 발효배지에 망간 이온농도 혹은 아데닌의 농도를 제한하여 주어야 하는 어려움이 있었다.

특히 망간비감수성 변이주를 이용하는 경우 배치중의 망간의 농도에는 영향을 받지 않으나 아데닌의 농도에 영향을 받고 배양후기 발효액중의 생균수가 급격히 감소하여 5'-이노신산의 수율이 감소하였다.

본 발명자들은 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구하여 오던 중 종래의 망간비감수성보다 생산성면이나 배양적 면에서 뛰어난 새로운 변이주를 발명하였다.

본 발명에서 사용하는 특이한 변이주 MW-2369의 분리방법은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872주를 모주로 하여 화학변이 유기체인 N-메칠-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘(NTG) 처리에 의하여 각종 퓨린계물질 요구성 변이주를 분리하여 이중 5'-이노신산 생산능이 가장 우수한 아데닌, 구아닌 동시 요구성 변이주를 선별하였다.

이 변이주를 재차 자외선처리하여 망간농도에 영향을 받지 않는 망간비감수성균주 MW-2367를 분리하였다. 그러나 동 변이주 역시 종래의 망간비감수성 변이주와 마찬가지로 배양중의 아데닌 농도에 대한 영향을 받으며 배양후기 발효액중의 생균수가 감소되어 당소비가 잘 되지 않고 5'-이노신산의 축적이 증가하지 않아 생산성이 좋지 않았다.

본 발명자들은 망간비감수성 균주 MW-2367주를 다시 디메칠설페이트로 처리한 후 변이를 유기시키고 세포막조성의 변화를 확인할 수 있는 약제를 사용하여 변이주를 분리하였다.

이중 라이소자임 50㎍/㎖농도에서 특히 감수성을 보이는 특이한 변이주 MW-2369가 친주보다 5'-이노신산생산능이 특별히 향상되었다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

라이소자임 감수성 균주의 분리바업은 변이처리한 균체를 코로니(colony)가 잘 분리되도록 희석한 후 완전배지(주 1)에 평판배양시킨 후 완전배지 및 완전배지에 라이소자임 50㎍/㎖농도로 첨가한 배지에 각각 레프리카법(replica)을 사용하여 이식한 후 라이소자임 무첨가 배지에서 잘 생육하고첨가배지에서는 생육하지 않거나 생육이 극히 미약한 코로니를 취하여 5'-이노신산 생산능이 우수한 변이주를 선별하였다.

주 1) 포도당 1%, 비프엑기스 1%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 식염 0.3%, 아데닌구아닌 각 50mg/ℓ, 한천 2%, pH 7.2 120℃ 15분 가압살균, 30℃에서 48시간 배양.

본 발명의 특이한 변이주 MW-2369와 친주인 망간비감수성 변이주 MW-2367과 생리적 특성을 비교한 결과를 다음과 같았다.

[표 1]

영양요구성 비교

주 1) ade : 아데닌, gua : 구아닌, xan : 크산틴, +~+++ : 생육정도, - : 생육 불

주 2) 최소배지(MM)

포도당 2.0%, 제1인산카리 0.01%, 제2인산카리 0.03%, 황산마그네슘 0.01%, 염화칼슘 10mg/ℓ, 황산철 10mg/ℓ, 황산아연 1mg/ℓ, 망간이온 1mg/ℓ, 시스테인 20mg/ℓ, 바이오친 60mg/ℓ, 치아민 염산염 5㎍/ℓ, 판토텐산칼슘 20㎍/ℓ, 황산암모늄 0.3%, 요소 0.2%, pH 7.2 영양요구 물질은 각 20mg/ℓ 농도로 첨가함.

[표 2]

라이소자임(Lysozyme)농도에 따른 생육도 비교

주 1) +~+++ : 생육 정도, ± : 생육 미약, - : 생육 불

주 2) 배지조성

포도당 1.0%, 제2인산카리 0.1%, 황산마그네슘 0.03%, 카사미노산 0.25%, 치아민염산염 5mg/ℓ, 판토텐산칼슘 10mg/ℓ, 요소 0.1%, 유안 0.4%, 시스테인 50mg/ℓ, 트립토판 50mg/ℓ, 바이오친 30㎍/ℓ, 아데닌, 구아닌 각 30mg/ℓ, 한천 2%, pH 7.3의 배지에 각 농도별 라이소자임을 첨가하여 30℃ 48시간 배양한 생육도의 차이임.

[표 3]

망간이온 농도에 의한 생육도 및 5'-이노신산 축적량 비교

주 1) DCW : 건조균체량

주 2) 발효배지 및 배양방법

포도당 10%, 제1인산카리 0.6%, 제2인산카리 0.6%, 황산마그네슘 0.6%, 황산아연 5mg/ℓ, 황산철 2mg/ℓ, 글루타민산소다 10mg/ℓ, 바이오친 50㎍/ℓ, 시스테인 10mg/ℓ , 베타알라닌 10mg/ℓ, 니코틴산 5mg/ℓ, 토텐산칼슘 5mg/ℓ, 아데닌 80mg/ℓ, 구아닌 80mg/ℓ, 황산암모늄 0.6%, 요소 0.2%, 육엑기스 0.3%, CSL 1.2, 멸균전 5N-NaOH로 pH 8.4 조절.

[표 4]

아데닌 농도에 의한 영향 비교

주) 발효배지 및 배양방법 : 표 3과 동일

단, 망간 10mg/㎖ 첨가, 아데닌제의 각 농도로 첨가.

[표 5]

5'-이노신산 생산 최적배지에서 발효액중 생균수 및 5'-이노신산 생산량 비교

주 1) 발효배지 및 배양방법

* : 망간이온 10mg/㎖ 사용, 기타 표 3과 동일

** : 망간이온 10mg/㎖ 아데닌, 구아닌 각 150mg/ℓ. 기타 표 3과 동일

주 2) 생균수 측정은 발효액 1㎖를 희석하여 평판배양 후 생육한 코로니수임

[표 6]

균주의 살베이지 합성능을 비교하기 위한 히포크산틴 첨가시 5'-이노신산 축적능 비교

주 1) 발효배지 및 배양방법 : 표 3에 준하여 실시하였으며 망간 10mg/㎖ 첨가배지 사용

상기 각 표에서 보는 바와 같이 본 발명의 특수한 변이주는 망간비감수성 변이주 MW-2367과는 생리학적 특성과 배양학적 특성에서 전혀 다른 성질을 나타내고 있다.

양 균주의 차이점을 요약해 보면 표 1에서 친주는 아데닌, 구아닌, 혹은 아데닌, 크산틴 동시요구성인데 MW-2369는 아데닌요구성에 구아닌 혹은 크산틴에 생육이 촉진되며, 표 2에서 양 균주 모두 상당한 농도의 망간이온 농도에도 불구하고 5'-이노신산 축적에 거의 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있으며 본 발명의 변이주가 친주보다 좋은 생육을 나타내어 5'-이노신산 생산능의 향상이 생육의 차이에서도 기인된다고 볼 수 있으며, 표 4와 표 5에서 보면 친주는 아데닌 농도에 따라 영향을 받으며 발효후기 생균수가 급격히 감소함을 알 수 있다.

그러나 본 발명의 변이주는 아데닌의 농도에 영향을 받지 않고, 발효후기 생균수의 감소도 나타내지 않아 종래의 망간 비감수성과는 전혀 상이한 생리적 성리적 성질을 가지고 있음을 알 수 있었다.

또한 배양액중 히포크산틴을 거의 축적하지 않아 5'-이노신산의 세포막 투과성이나 합성능이 크게 향상되었음을 나타내어 이를 확인한 표 6의 실험에서 본 변이주가 살베애지 합성능이 특히 간한 변이주라는 것을 증명하여 주었다.

따라서 본 발명의 변이주는 종래의 균주와는 다른 특이한 생리적 성질을 가지고 있는 5'-이노신산 생산면에서 극히 우수한 새로운 신규의 변이주인 것으로 판단된다.

본 발명의 균주를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 경우 본 발명 균주의 생육 및 5'-이노신산 생성에 적합한 조성의 탄소원, 질소원, 무기염류 및 영양원을 함유한 배지에서 pH 6.8-8.0, 온도 28-40℃ 호기적 조건으로 2-5일간 배양하여 5'-이노신산을 발효액에 축적시키고 통상의 방법에 따라 균체를 분리한 후 이온교환수지에 흡착용리하고 탈색수지 혹은 활성탄 등을 사용하여 탈색한 후 감압농축하여 공지의 방법에 따라 5'-이노신산을 결정상으로 회수할 수 있다.

이하 본 발명 균주를 사용한 실시예는 다음과 같다.

[실시예 1]

본 발명 균주 MW-2369를 포도당 4.0%, 효모엑기스 1.0%, 육엑기스 0.5%, 폴리펩톤 0.5%, 제1 및 2 인산카리 각 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 망간 10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 황산철 10mg/ℓ, 염화캄슘 0.1%, 아데닌, 구아닌 각 200mg/ℓ, pH는 5N-가성소다로 pH 7.2 조정하여 2ℓ 진탕 후라스크에 200㎖씩 분주하여 120℃에서 20분 멸균한 종배지에 종균 1백금이 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

이 종배지를 발효배지에 10% 비율로 접종하였다.

발효배지 조성으로는 포도당 15%, 과당 5%, 제 1 및 2인산카리 각 1.0%, 망간 10mg/ℓ, 황간아연 10mg/ℓ, 황산철 5mg/ℓ, 글루타민소다 0.1%, 바이오친 100㎍/ℓ, 시스테인 10mg/ℓ, 베타알라닌 10mg/ℓ, CSL 2.0%, 치아민염산염 5mg/ℓ, 황산암모늄 0.2%, 아데닌 150/ℓ, 구아닌 150mg/ℓ 되도록 탈이온수를 사용하여 조제하였으며 pH는 멸균 후 7.0이 되도록 조절하였다.

상기 발효배지 18ℓ를 28ℓ 소형발효조에 사입하여 120℃에서 30분 멸균 후 종균을 접종하고 32℃에서 400rpm, 1vvM의 조건으로 70시간 배양하였다. 배양중 pH는 암모니아수로 7.2 조절하였다. 발효완료액중 5'-이노신산 축적량은 63.4g/ℓ이었고 히포크산틴은 검출되지 않았다.

균체를 제거한 상등액 10ℓ를 상법에 따라 강산성 양이온 교환수지 및 강염기성 음이온 교환수지에 흡착용리하여 탈색수지로 탈색한 후 감압농축하여 5'-이노신산 결정 574g을 얻었다.

한편 MW-2367 균주를 동일한 방법으로 발효시켰을 때 5'-이노신산 축적량은 35.7/ℓ불과하였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지중 망간이온 20mg/ℓ, 아데닌, 구아닌 각각 200mg/ℓ를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 경우 본 발명 균주는 5'-이노신산 58.4g/ℓ이었으며 MW-2367주는 28.6/ℓ이었다.

[실시예 3]

실시예 1의 발효배지중 포도당, 과당 대신에 당밀가수분해액을 당으로 20% 첨가한 후 배양한 발효액중 5'-이노신산은 58.9g/ℓ이었다.

Claims (1)

1. 본문에서 상술한 바와 같이 브레비박테리움 암모니아게네스 아데닌 요구성 변이주로 구아닌 혹은 크산틴에 생육이 촉진되고 살베이지 합성능이 특히 강한 세포막 투과성 변이주 MW-2369 (KAIST 850214-15612)를 당질을 주원료로 한 영양배지에 호기적으로 배양하여 5'-이노신산을 축적시키는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법.