KR950005923B1

KR950005923B1 - 발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법

Info

Publication number: KR950005923B1
Application number: KR1019910022003A
Authority: KR
Inventors: 최덕호; 경기천; 홍석철; 전병윤; 황이남
Original assignee: 주식회사미원; 유영학
Priority date: 1991-12-03
Filing date: 1991-12-03
Publication date: 1995-06-07
Also published as: KR930013135A

Abstract

내용 없음.

Description

발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법

본 발명은 미생물 변이주를 이용한 발효법에 의해 5'-이노신산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

5'-이노신산은 5'-구아닐산과 더불어 글루타민산과 혼용시 맛의 강한 상승효과를 나타내기 때문에 핵산계 조미료로 사용되고 있다.

종래 미생물 변이주를 이용한 발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법으로는 아데닌 요구성 균주를 이용하는 방법(일본특허공고소 49-24474), 망간 비감수성 균주를 이용하는 방법(U.S.P 3745087)등이 있다. 그러나 이들 방법 대부분은 5'-이노신산의 축적량이 적거나 하이포크산틴이 부생되거나, 발효배지에 망간이온 농도 혹은 아데닌 농도를 제한하여 주어야 하는 어려움이 있다.

본 발명자들은 아데닌 요구성이며서 구아닌 또는 크산틴에 의한 막 투과성 증대를 이용하는 방법(한국특허공고 85-1223) 및 스트렙토마이신 및 슬파구아닌딘 슬파치아졸의 대성주연 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) MW-2369-3210(KCTC 8202P)를 발명 및 출원한 바 있다(한국특허공고 86-5304).

그러나 이들 변이주에 의해 생산성의 증가에도 불구하고 아직도 5'-이노신산의 공업적 생산에 있어서 생산성의 증가가 요구되어 왔다.

이러한 상황하에서, 본 발명자들은 본 발명자들이 이미 발명한 바 있는 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-2369-3210을 개량하여 5'-이노신산의 생산성을 더욱 향상시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따르는 최소배지에 각종 아미노산을 첨가하여 변이주 MW-2369-3210을 배양한 후, 이노신산의 축적을 증진시키고, 변이주의 생육을 증진시키며, 하이포크산틴을 감소시키는 작용을 갖는 아미노산을 선별하고, 그 아미노산의 각종 아나로그 실험을 통하여 아미노산 축적을 저해하는 아나로그를 선별한 후, 그에 대해 강한 내성을 갖는 균주를 분리하여 얻는 변이주를 배양하여 5'-이노신산을 제조하는, 발효법에 의해 5'-이노신산의 제조방법이 제공된다.

본 발명에 아미노산의 축적을 저해하는 것으로 밝혀진 아미노산 아나로그는 트립토판의 아나로그인 5-플루오로트립토판 및 시스테인의 아노로그인 부틸머캡토시스테인이다. 즉, 본 발명의 변이주는 5-플루오로트립토판 및 부틸머캡토시스테인에 대해 동시에 내성을 나타낸다.

본 발명에서 5'-아노신산의 발효법에 사용되는 변이주를 분리하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 아미노산의 첨가가 MW-2369-3210(KCTC 8202P)의 이노신산축적율 및 하이포크산틴의 감소에 미치는 영향을 조사하기 위하여 포도당 9%, 제1인산칼륨 0.01%, 제2인산칼륨 0.03%, 황산마그네슘 0.01%, 염화칼슘 10㎎/ℓ, 황산철 10㎎/ℓ, 황산아연 1㎎/ℓ, 황산망간 1㎎/ℓ, 비오틴 50㎍/ℓ, 티아면염산염 1㎎/ℓ, 판토텐산 칼슘 5㎎/ℓ, 황산암모늄 0.3% 및 요소 0.2%로 이루어진 희소배지에 트립토판, 글루타민, 발린, 알라닌, 글리신, 시스테인, 페닐알라닌 및 타이로신을 각 5㎎/ℓ씩 첨가하고, 이들 아미노산-첨가 배지를 500㎖ 사까구찌 플라스크에 50㎖씩 넣고 30℃에서 72시간동안 배양한 후 이노신산의 축적율 및 하이포크산틴의 농도를 검사하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

아미노산이 5'-이노신산의 축적율 및 하이프그산단의 농도에 미치는 영향

*주) O.D.는 610㎚에서 측정

상기 표 1의 결과로부터, 트립토판 및 시스테인이 5'-이노신산의 축적 및 하이포크산틴의 농도에 가장 큰 영향을 주는 아미노산임을 알 수 있다.

각종 트립토판 아나로그 및 시스테인 아나로그가 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-2369-3210(KCTC 82020P)의 이노신산 축적 및 생육에 미치는 영향을 다음과 같이 실험하였다. 즉, 트립토판 아나로그로서 5-메틸트립토판, 6-메틸트립토판, 5-플루오로트립토판 및 시스테인 아나로그로서 부틸시스테인, 부틸머캡토시스테인 및 펜타플루오로페닐을 상술한 희소배지에 각각 50㎎/ℓ첨가하여 제조한 배지에 MW-2369-3210주(KCTC 8202P)를 식균하고 30℃에서 일주일간 배양한 후 배양액에 축적된 이노신산의 농도 및 균생육도(610㎚에서의 O.D.)를 조사하고 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

아미노산 아나로그가 이노신산 및 균 생육에 미치는 영향

상기 표 2의 결과로부터 트립토판의 아나로그중 5-플루오로트립토판 및 시스테인의 아나로그중 부틸머캡토시스테인이 이노신산 축적과 균 생육을 가장 저해함을 알 수 있다.

5'-플루오로트립토판 및 부틸머캡시스테인에 대해 동시에 내성을 나타내는 균주인 본 발명의 변이주를 얻는 방법은 다음과 같다.

브레비박테리움 암모니아게네스 MW-2369-3210(KCTC 8202P)를 포도당 1%, 비프 엑기스 1%, 펩톤 1%, 효모 엑기스 1%, 식염 0.3%, 아데닌 50㎎/ℓ, 구아닌 50㎎/ℓ 및 한천 2%로 이루어진 종배지(pH7.2, 120℃에서 15분간 멸균)에 식균하고 30℃에서 2시간동안 배양한 후, 배양된 균체를 0.05M 인산완충액(pH 7.0) 3㎖에 잘 현탁시킨다. 여기에 100㎍/㎖농도의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘용액(0.05M인산 완충액에 용해) 3㎖를 첨가하여 상온에서 20분간 진탕시킨 후, 원심분리 및 세척에 의해서 균체와 변이유발물질을 분리시킨다. 이어서, 포도당 1%, 비프 엑기스 1%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 식염 0.3%, 아데닌 50㎎/ℓ 및 구아닌 50㎎/ℓ(pH 7.2)로 이루어진 배지(배지 A)에 균체를 식균하여 일주일간 배양하고, 다시 상기 종배지에 5-플루오로트립토판 1g/ℓ를 첨가하여 제조한 배지에서 7일간 평단 배양한 후 균 집락을 위하여 다시 배지 A에서 일주일간 진탕배양하고 다시금 상기 종배지에 부틸머캡토시스테인을 1g/ℓ를 첨가하여 제조한 배지에서 7일간 평판배양한 후 생육한 균주를 선별하였다. 선별된 균주중 내성이 강한 균주를 위하여 5'-이노신산의 생산성을 조사하고, 생산성이 가장 우수한 균주를 최종 선별하고 MW-5958-5419로 명명 하였다.

본 발명의 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5958-5419는 1991년 11월 26일자로 한국종균협회(KFCC)에 수탁변호 KFCC-10748호로 기탁되어 있다.

본원 발명의 변이주인 MW-5958-5419주(KFCC-10748)와 그의 친주인 MW-2369-3210(KCTC 8210 KCTC 8202P)에 대하여 5'-플루오로트립토판 및 부틸머캡토시스테인이 생육에 미치는 영향을 상술한 바 있는 방법대로 조사, 비교하고 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.

[표 3]

5-플루오로트립토판 농도에 따른 생육비교

[표 4]

부틸머캡토시스테인 농도에 따른 생육비교

주) 생육 양호 정도 : +++＞++＞+＞±＞-

상기 표 3 및 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 변이주 MW-5958-5419주는 그의 친주인 MW-2369-3210주에 비하여 5-플루오로트립토판 및 부틸머캡토시스테인에 대해 개선된 내성을 나타낸다. 그러나, 그외의 생리학적 및 균학적 성질은 양균주가 유사성을 나타낸다.

나아가, 본원 발명의 MW-5958-5419주는 후술하는 실시예에서 확인되는 바와 같이, 친주인 MW-2369-3210주에 비해 훨씬 향상된 5'-이노신산 생성능을 갖기 때문에, 5'-이노신산의 공업적인 제조방법에 유용한 새로운 균주임을 알 수 있다.

더우기, 본원 발생의 MW-5958-5419주를 이용하는 발효법에 따르면, 공지의 균주를 이용하는 발효법에 의해 5'-이노신산의 제조시 부산물로 생성되는 발린의 생성이 휠씬 감소된다(표 5 참조).

[표 5]

밀린의 생성량 비교*

주) 배양방법은 실시예 1과 동일

본 발명의 변이주를 이용하여 5'-이노신산을 생산하는 경우 본 발명 균주의 생육 및 5'-이노신산 생산에 적합한 탄소원, 질소원, 무기염류 및 영양원을 함유한 배지에서 pH 6.8-8.0, 온도 28℃∼30℃ 및 호기적 조건으로 2-5일간 배양한다. 5'-이노신산의 생산된 발효액으로부터 통상의 방법에 따라 균체를 분리한후, 이온 교환 수지에 흡착, 분리시키고 탈색수지 혹은 활성탄을 사용하여 탈색한 후 농축하여 공지의 방법에 따라 5'-이노신산을 회수한다.

본 발명의 상세한 설명은 실시예에서 기재하고 있으나 본원이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명의 균주 MW-5958-5419(KFCC-10748)을 포도당 40g, 효모 엑기스 10g, 비프엑기스 5g, 폴리펩톤 5g, 제1 및 제2인산 캄륨 각 1g, 황산망간 10㎎, 황산아연 1㎎, 황산철 10㎎, 아데닌, 구아닌 각 200㎎, 증류수 1ℓ, pH 7.2로 조성된 종배지를 2ℓ 진탕 플라스크에 200㎖ 분주하여 120℃에서 20분 멸균한 후 종균을 식균하여 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액을 제조한다.

발효배지 조성으로는 포도당 100g, 과당 20g, 제1 및 제2인산 칼륨 각 10g, 황산망간 10㎎, 황산아연 1㎎, 황산철 5㎎, 글루타민산 소다 500㎎, 비오틴 30㎍, CSL 20g, 티아민 염산염 1㎎, 황산암모눔 2g, 아데닌, 구아닌 각 120㎎을 물 1ℓ에 용해한 발효배지를 2ℓ 소형발효조에 1ℓ를 사입한 후, 120℃에서 20분 멸균한 후, pH 7.0으로 조절하여 상기의 총 배양액을 5%의 최종농도로 식균하여 교반수 800rpm, 통기량 1VVM, 33℃에서 배양하면서 배양중 암모니아수로 pH 7.2로 조절 유지하였다.

발효 완료액중 5'-이노신산 축적량은 30.14㎎/㎖였으며, 헥산 관련물질로는 하이포크산틴이 0.2㎎/㎖가 검출되었다. 반면에 이와 동일한 방법으로 MW-2369-3120(KCTC 8202P)을 식균하였을때 38.72㎎/㎖ 농도의 5'-이노신산을 생산하였다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일하게 실시하되, 발효 배지중 5-플루오로트립토판 및 부틸머캡토시스테인 각각을 50㎎/ℓ농도를 첨가하여 배양한 경우 5'-이노신산 측정량은 29.57㎎/ℓ이었다.

[실시예 3]

50ℓ 발효조에 실시예 1의 발효배지에 트립토판 및 시스테인을 각기 50㎎/ℓ의 농도로 첨가하여 25ℓ 사입한 후, 총배양액을 5%의 농도로 식균하여 교반수 500rpm, 통기량 0.5VVM, 33℃에서 암모니아 가스로 pH 7.2로 조절하였다. 배양중 진당이 1-2%일때 70% 포도당액을 배양액의 5% 농도로 1회 첨가하여 발효시켰다. 발효완료후 5'-이노신산 농도는 81.43㎎/㎖이었다. 균체를 제거한 발효액 10ℓ를 상법에 따라 이온 교환 수지에 흡착 용리하여 탈색한 후 농축하여 5'-이노신산 712g을 분리하였다.

Claims

5-플루오로트립토판 및 부틸머캡토시스테인에 대해 동시에 내성을 갖는 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)MW-5958-5419(KFCC 10748)를 배지에서 배양하여 5'-이노신산을 축적시키고, 배양액으로부터 5'-이노신산을 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법.
제1항에 있어서, 변이수 MW-5958-5419(KFCC 10748)를 트립토판 및 시스테인을 첨가한 배지중에서 배양함을 특징으로 하는 발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법.