KR970002250B1

KR970002250B1 - 5-크산틸산(5'-Xanthyl산)을 생성하는 미생물

Info

Publication number: KR970002250B1
Application number: KR1019910018062A
Authority: KR
Inventors: 정성오; 심재익; 이현환; 한종권; 이강호; 오윤석
Original assignee: 제일제당 주식회사; 김정순
Priority date: 1991-10-14
Filing date: 1991-10-14
Publication date: 1997-02-26
Also published as: KR930008131A

Abstract

내용없음.

Description

5'-크산틸산(5'-Xanthyl산)을 생산하는 미생물

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)을 생산하는 미생물 자체에 관한 것으로 좀더 구체적으로 브레비박테리움 암모니아 게네스(ATCC 6872)의 변이주로 크산틸산 아미나제 불활성 균주이며 아데닌 구아닌 반영양요구성(leaky auxotoph)형 균주이며 구아노신유사체 내성을 가지고 있으며 삼투압에도 내성을 가지는 특수한 미생물로서, 값싼 당질 원료의 사용이 가능하며 질소원이 제한된 영양배지에서 호기적으로 배양하여 5'-크산틸산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물에 관한 것으로서 1991. 9. 17. 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 KFCC 10741).

5'-크산틸산은 핵산대사과정의 중간물질로 정미성을 갖고 있을뿐만 아니라 5'-이노신산(IMP)과 5'-구아닐산(GMP)의 제조원료로서도 중요한 물질이다. 특히 정미성이 강하고 상품적가치가 높은 5'-구아닐산의 제조방법으로서 현재 가장 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효에 의해 5'-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5'-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5'-크산틸산의 수요는 5'-구아닐산의 수요만큼 중요하다.

종래의 5'-크산틸산 제조방법에는, 1) 화학합성법, 2) 효모중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5'-구아닐산을 탈아미노화하는 제조법, 3) 발효배지내 전구물질로 크산틴(Xanthine)을 첨가하는 방법, 4) 미생물 변이주에 의한 발효법, 5) 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소 42-1477, 소 44-20390), 6) 계면 활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소 42-3835, 소 42-3838) 등이 알려져 있다. 이중에서도 미생물 변이주에 의한 5'-크산틸산의 제조방법이 공업적으로 유리하므로 본 발명자들은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872를 개량하여 5'-크산틸산이 최대로 생상될 수 있도록 여러가지 복합형질을 부여함으로써 종래의 균주가 소유하고 있는 단순형질에 의한 생산성을 월등히 능가하는 획기적인 변이주를 개발하였다.

본 발명의 신규한 변이주는 5'-이노신산으로부터 5'-아데닐산과 5'-구아닐산으로 가는 생합성 경로가 부분 차단된 아데닌, 구아닌 반영양요구성형 및 5'-크산틸산이 더이상의 대사과정으로 흐르는 것을 방지하기 위해 5'-크산틸산에서 5'-구아닐산으로 가는 효소인 이미나제 효소가 불활성화된 변이주로 개량한뒤 생합성 경로에 관여하는 5'-이노신산 이히드로게나제 효소의 역제어조절(feedback regulation)을 해제 하기 위해 구아닌퓨린계 유사체인 시오구아닌(Thioguanine)의 내성을 갖게 개량한 후 이를 다시 발효배지내 고농도당과 고농도 생성물에 의한 미생물 생리작용 저해를 방지키위해 삼투압 내성 형질을 가게끔 개량하여 본 발명을 완성하게 되었다.

다음에서 본 발명 변이주의 분리방법을 좀더 상세히 설명하며 브레비 박테리움 암모니아게네스(ATCC 6872)를 친주로서 자외선 조사 또는 N-메틸-N'니트로소구아니딘(NTG), 디에틸설페이트, 에틸설페이트 등으로 처리하고 포도당 2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네숨 0.1%, 염화칼슘 100mg/1, 황산철 20mg/1, 황산망간 10mg/1, 황산아연 10mg/1, 비오틴 100㎍/1, 황산구리 0.8mg/1, 티아민염산염 5mg/1, 우레아 0.2%로 구성되고 PH 7.3으로 조정된 최소배지(배지1)에서는 매우느리게 생육되나 상기 최소배지(배지1)에 아데닌, 구아닌 각 50-200mg/1까지 농도별로 첨가한 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지(배지2)에서는 생육이 촉진되는 아데닌, 구아닌 반영양요구성형 변이주를 선별하여 선별된 변이주들 중에서 크산틸산 이미나제가 불활성화된 변이주를 선별하고 상기 방법에 의해 변이시킨후 펩톤 1%, 효모엑시스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 150mg/1, 구아닌 150mg/1로 구성되고 PH 7.3으로 조성된 배지에 thio guanine 10-1000㎍/ml까지 노도별로 첨가한 시오구아닌 첨가 배지(배지3)의 thioguanine 농도에 의해 thioguanine에 내성이 있으며 상기 형질을 계속 유지한 균주를 선별하고 다시 상기 방법에 의해 변이시켜 팹톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 150mg/1로 구성되고 PH 7.3으로 조정된 배지에 염화나트륨 1.0-2.2몰까지 농도별로 첨가한 염화나트륨첨가배지(배지4)에 도말하여 발생한 콜로니를 순수분리한 후 이를 다시 염화나트륨첨가배지(배지4)에서 확인하여 염화나트륨이 2.1몰 포함된 배지에서도 생육이 가능한 변이주를 선별하여 KFCC 10741이라 명명하였다.

위에 상술한 방법에 따라 획득분리한 본 발명의 변이주의 생화학적 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

* +; 성장-; 성장치 못함

* + : 성장- : 성장치 못함

본 발명에 사용할 수 있는 발효배지는 공업적으로 값싼 당질원료(포도당, 과당 및 이를 구성성분으로 하는 다당류의 가수분해물)와 질소원(유기 및 무기질소원) 및 미생물의 생육에 필요한 무기염, 미량 원소, 비타민등을 적당히 첨가한 배지라면 모두 사용이 가능하다.

배양방법은 실시예의 기재와 같이 28℃-35℃, PH 6-8로 유지하면서 호기적으로 3-4일간 배양하였다.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

삼각 플라스크에의 한 친주, 종래균주 및 본 발명 변이주의 XMP 생산력 비교

포도당 3%, 펩톤 1.5%, 효모엑기스 1.5%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 150mg/1, 구아닌 150mg/1, 우레아 0.2%로 구성되고 PH 7.2로 조정된 종배지를 5ml씩 지름 18mm 시험관 넣고 살균후 친주 ATCC 6872, 종래균주 KFCC 10004, 본 발명의 미생물 KFCC 10741으로 된 사용균주를 각각 식균하여 150rpm으로 30℃에서 12-14시간 진탕 배양하였다. (종배양)

포도당 6%, 인산제 1, 2칼륨 각 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 100mg/1, 황산철 20mg/1, 황산망간 10mg/1, 황산아연 10mg/1, 비오틴 100㎍/1, 아데닌 30mg/1, 구아닌 30mg/1, 황산구리 1mg/1, 티아민염산염 5mg/1, 우레아 0.7%로 구성되고 PH 7.2로 조정된 발효배지를 30ml 씩 500ml 용량의 진탕용 삼각플라스크 넣고 121℃에서 20분간 살균냉각후 종배양에서 얻은 배양완료액을 5ml씩 접종하고 180rpm으로 30℃에서 60-70시간 진탕 배양하였다.

배양 완료후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 친주 ATCC 6872 균주가 3.3g/1이고 종래균주 KFCC 10004 균주는 13.1g/1이며, 본 발명의 미생물 KFCC 10741 균주는 18.6g/1이었다.(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨 7H₂O로 표시하였다).

[실시예 2]

발효조에서의 종래균주와 본 발명 변이주의 XMP 생산력 비교

실시예 1의 종배지를 40ml씩 500ml 용량의 진탄용 삼각플라스크에 넣고 살균후 포도당 18%, 인산제 1, 2 칼륨 각 2%, 아데닌 150mg/1, 구아닌 150mg/1, 황산철 20mg/1, 황산아연 15mg/1, 황산망간 10mg/1, 황산구리 1mg/1, 비오틴 150㎍/1, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 100mg/1, 티아민염산염 5mg/1, 황산아염 15mg/1으로 구성되고 PH 7.3으로 조정된 발효배지를 5리터 용량의 시험발효조에 1.8리터씩 분주하고 121℃에서 20분간 살균냉각하여 종배양액 180ml을 접종한 후 공기를 매분당 1-2.5 리터 정도 공급하면서 회전수 분당 900회, 온도 30℃-35℃에서 배양하되 배양중 잔존 당농도가 1-2%가 되면, 살균된 포도당을 공급하여 발효배지에 첨가된 당의 합계를 24%로 조절하여 60-70시간 배양하였다.

배양완료후 5'-크산틸산의 배지내의 축적량은 종래균주 KFCC 10004 균주는 71.5g/1이고 본 발명의 변이주 KFCC 10741 균주는 94.9g/1이었다(5'-크산틸산 축적농도는 5'-크산틸산나트륨 7H₂O로 표시하였다.)

Claims

브레비박테리움 암모니아게네스 변이주에 속하고 생육적으로 아데닌, 구아닌 반요구성이며, 5'-크산틸산 아미나제 불활성형 균주이며 구아노신유사체 내성을 가지고 있고, 삼투압에도 내성을 가지는 5'-크산틸산을 생산하는 미생물인 KFCC 10741.