KR970002252B1

KR970002252B1 - 5'-크산틸산(5'-Xanthyl산)을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR970002252B1
Application number: KR1019910018064A
Authority: KR
Inventors: 정성오; 심재익; 이현환; 한종권; 이강호; 오윤석
Original assignee: 제일제당 주식회사; 김정순
Priority date: 1991-10-14
Filing date: 1991-10-14
Publication date: 1997-02-26

Abstract

내용없음.

Description

5'-크산틸산(5'-Xanthyl산)을 생산하는 미생물

본 발명은 5'-크산틸산(XMP)을 생산하는 미생물 자체에 관한 것으로 좀더 구체적으로 브레비박테리움 암모니아게네스(ATCC 6872)의 변이주로서 아데닌 구아닌 반영양 구성(leaky auxotoph)형의 크산틸산 아미나제 불활성 균주이며 구아노신 유사체 내성을 가지고 있으며 세포벽 분해효소인 라이소자임(Lysozyme)에 감수성이 매우 높은 삼투압에도 내성을 가지는 특수한 미생물로서 값싼 당질원료의 사용이 가능하며 질소원제한 영양배지에서 호기적으로 배양하여 5'-크산틸산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물에 관한 것으로서 1991년 9월 17일 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 KFCC 10743).

5'-크산틸산의 퓨린뉴클레오타이드(Purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 정미성을 갖고 있을뿐만 아니라 5'-이노신산(IMP)과 5'-구아닐산(GMP)의 제조원료로서도 중요한 물질이다. 특히 정미성이 강하고 상품적 가치가 높은 5'-구아닐산의 제저방법으로 현재 가장 널리 이용되고 있는 방법은 미생물 발효법에 의해 5'-크산틸산을 생산하고 이를 효소학적으로 5'-구아닐산으로 전환시키는 과정이 가장 경제적이어서 5'-크산틸산의 수요는 5'-구아닐산의 수요만큼 중요하다.

종래 5'-크산틸산의 제조방법에는 화학합성법, 또는 효모중의 리보핵산을 분해하여 제조된 5'-구아닐산을 탈 아미노화하는 제조법, 그리고 발효법으로는 발효배지내 전구물질로 크산틴(Xanthine)을 첨가하는 방법과 미생물 변이주에 의한 제조법, 항생물질 첨가에 의한 제조법(일본특허 소 42-1477, 소 44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조법(일본특허 소 42-3835, 소 42-3838) 등이 알려져 있다. 이중에서도 미생물 변이주에 의한 5'-크산틸산의 직접적인 발효제조방법이 공업적으로 유리하므로 본 발명자들은 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872를 개량하여 XMP가 최대 생산될 수 있는 여러가지 복합형질을 부여함으로써 종래의 균주가 소유하고 있는 단순형질에 의한 XMP 생산성을 월등히 능가하는 획기적인 변이주를 개발하였다.

따라서 본 발명자들은 미생물로 하여금 직접적으로 5'-크산틸산을 다량 생산케하기 위해서 5'-이노신산으로부터 5'-아데닐산과 5'-구아닐산으로 가는 생합성 경로가 부분 차단된 아데닌, 구아닌 반영양요구성형 및 5'-구아닐산이 더 이상의 대사과정으로 흐르는 것을 방지하기 위해 5'-크산틸산에서 5'-구아닐산으로 가는 효소인 5'-크산틸산 아미나제 효소가 불활성화된 변이주로 개량한뒤 세포내 5'-이노신산에서 5'-크산틸산으로 가는 생합성 경로에 관여하는 5'-이노신산 디히드로게나제 효소의 5'-구아닐산에 의한 역제어 조절(feedback regulation)을 해제하기 위해 구아닌 퓨린계유사체인 시오구아닌(thioguanine)의 내성을 갖게끔 개량하였다. 더 나아가 세포내 5'-크산틸산이 축적될 경우 이의 세포 외로의 분비가 원활하도록 세포벽 합성이 부분 결여된 것으로 예상되는 세포벽 분해 효소인 라이소자임(Lysozyme)에 감수성이 큰 변이주로 개량하였으며 이를 다시 발효배지내 고농 당과 고농도 생성물에 의한 미생물 생리작용 저해를 방지키위해 삼투압 내성 형질을 갖게끔 개량하여 본 발명을 완성하게 되었다.

다음에서 본 발명 변이주의 분리방법을 좀더 상세히 설명하면, 브레비박테리움 암모니아게네스(ATCC 6872)를 친주로서 자외선 조사 또는 화학변이 유기제인 N-니트로-N'-니트로소구아니딘(NTG), 디에틸설페이트, 에틸설페이트 등으로 처리하고 포도당2%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네숨 0.1%, 염화칼슘 100mg/1, 황산철 20mg/1, 황산망간 10mg/1, 황산아연 10mg/1, 비오틴 100㎍/1, 황산구리 0.8mg/1, 티아민염산염 5mg/1, 우레아 0.2%로 구성되고 PH가 7.3으로 조정된 최소배지(배지1)에서는 매우 느리게 생육되나, 상기 최소배지(배지1)에 아데닌, 구아닌 10-200mg/1까지 농도별로 첨가한 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지(배지2)에서는 생육이 촉진되는 아데닌, 구아닌 반영양요구성형 변이주를 선별하였고 변이주들중에서 XMP 아미나제 활성이 불활성화된 변이주(형질1)를 선별하였다. 이때 변이주 획득율을 높이기 위해서 페니실린 농축법을 사용하였다.

이것을 다시 상기 방법에 의해 변이시킨 후 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지(배지2)에시오구아닌을 10-1000㎍/ml까지 농도별로 첨가한 시오구아닌 첨가 배지(배지3)에 도말하여 형질1을 계속 유지하고 시오구아닌에 내성이 있는(형질2) 변이주를 선별하여 다시 상기 방법에 의해 변이시킨 후 펩톤1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 150mg/ℓ, 구아닌 150mg/ℓ, 한천 2%를 첨가한 복합고체배지 (배지4)에 도말하여 각 콜로니(Colony)를 순수 분리한 후 상기 복합고체배지 (배지4)에 라이소자임을 농도별로 5-100㎍/㎖까지 첨가한 라이소자임 감수성 시험배지 (배지5)에 투스피킹(toothpicking)하여 형질2를 계속 유지하며 상대적으로 라이소자임에 감수성이 높은 변이주(형질3)를 선별하였다.

형질 3의 균주를 다시 상기 방법으로 변이시켜 상기 복합고체배지 (배지4)에 염화나트륨을 농도별로 1.0몰-2.2몰까지 첨가한 염화나트륨 첨가배지 (배지6)에 도말하여 형질 3을 유지하면서 염화나트륨에 내성이 있는 변이주를 선별하여 KFCC 10743이라 명명하였다.

위의 상술한 방법에 따라 획득 분리한 본 발명의 변이주의 생화학적 특성은 다음의 표에 기재된 바와 같다.

^*+ : 성장 - : 성장치 못함

본 발명에 사용할 수 있는 발효배지로는 공업적으로 값싼 당질원료(포도당, 과당 및 이를 구성성분으로 하는 다당류의 가수분해물)와 질소원(유기 및 무기질소원) 및 미생물의 생육에 필요한 무기염, 미량 원소, 비타민 등을 적당히 첨가한 배지라면 모두 사용이 가능하다. 배양방법은 실시예의 기재와 같이 28~35℃, PH 6~8로 유지하면서 호기적으로 3~4일간 배양하였다.

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

삼각플라스크에서의 친주, 종래균주 및 본 발명 변이주의 XMP 생산력 비교

포도당 3%, 펩톤 1.5%, 효모엑기스 1.5%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ, 우레아 0.2%로 구성되고 PH 7.2로 조정된 종배지를 5㎖씩 지름 18mm 시험관에 분주하고 살균 후 친주 ATCC 6872, 종래 균주 KFCC 10004, 본 발명의 미생물 KFCC 10743으로 된 사용균주를 각각 식균하여 150rpm으로 30℃에서 12~14시간 진탕배양하였다. (종배양)

포도당 6%, 인산제 1, 2 칼륨 각 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 10㎎/ℓ, 황산철 20㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 황산아연 10㎎/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 아데닌 30㎎/ℓ, 구아닌 30㎎/ℓ, 황산구리 1㎎/ℓ, 티아민염산염 5㎎/ℓ, 우레아 0.7%로 구성되고 PH 7.2로 조정된 발효배지를 30㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃에서 20분간 살균냉각 후 종배양에서 얻은 배양완료액을 5㎖씩 접종하고 180rpm으로 30℃에서 60~70시간 진탕 배양하였다.

배양완료 후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 ATCC 6872 균주가 3.2g/ℓ이고 종래균주 KFCC 10004 균주는 12.9g/ℓ이며, 본 발명 변이주 KFCC 10743 균주는 18.5g/ℓ이었다.(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨 7H₂O로 표시하였다).

[실시예 2]

발효조에서의 종래균주와 본 발명 변이주의 XMP 생산력 비교

실시예 1의 종배지를 40㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 살균 후 종래균주 KFCC 10004, 본 발명의 변이주 KFCC 10743으로 된 사용균주를 접종하여 180rpm으로 30℃에서 12-14시간 진탕배양하였다(종배양).

포도당 18%, 인산제 1, 2 칼륨 각 2%, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ, 황산철 20㎎/ℓ, 황산아연 15㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 황산구리 1㎎/ℓ, 비오틴 150㎍/ℓ, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 100㎎/ℓ, 티아민염산염 5㎎/ℓ, 황산아연 15㎎/ℓ으로 구성되고 PH 7.3으로 조정된 발효배지를 5리터 용량의 시험 발효조에 1.8리터씩 분주하고 121℃에서 20분간 살균냉각하여 종배양약 180㎖을 접종한 후 공기를 매분당 1-2.5 리터정도 공급하면서 회전수 분당 900회, 온도 30℃~35℃에서 배양하되 배양중 잔존 당농도가 1-2%가 되면, 살균된 포도당을 공급하여 발효배지에 첨가된 당의 합계가 24%로 조절 배양하였다. 배양중 PH는 암모니아수로 7.0~7.4로 조절하여 60~70시간 배양하였다. 배양완료 후 5'-크산틸산의 배지내 축적량은 종래균주 KFCC 10004 균주는 71.7g/ℓ이고 본 발명의 변이주 KFCC 10743 균주는 94.0g/ℓ이었다.(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨 7H₂O로 표시하였다).

Claims

브레비박테리움 암모니아게네스 변이주에 속하고 생육적으로 아데닌, 구아닌 반요구성의 크산틸산 아미나제 불활성 균주이며 세포벽 분해효소인 라이소자임에 감수성이 매우 삼투압에도 내성을 가지며 구아노신 유사체 내성을 가지고 있는 5'-크산틸산을 생산하는 미생물인 KFCC 10743.