JPH0673452B2 - 新規バチルス・ズブチリス - Google Patents
新規バチルス・ズブチリスInfo
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- JPH0673452B2 JPH0673452B2 JP4058429A JP5842992A JPH0673452B2 JP H0673452 B2 JPH0673452 B2 JP H0673452B2 JP 4058429 A JP4058429 A JP 4058429A JP 5842992 A JP5842992 A JP 5842992A JP H0673452 B2 JPH0673452 B2 JP H0673452B2
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- JP
- Japan
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- cytidine
- bacillus subtilis
- strain
- deoxycytidine
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/385—Pyrimidine nucleosides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は医薬品の合成原料等とし
て有用なシチジンおよび／またはデオキシシチジンの発
酵法による製造法に用いる微生物に関する。
て有用なシチジンおよび／またはデオキシシチジンの発
酵法による製造法に用いる微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によるシチジンの製造法として
は、バチルス・ズブチリスあるいはプロテウス・レトゲ
リーの変異株を用いる方法（特公昭３６−２１４９
９），ブレビバクテリウム属細菌から誘導されたプリン
アナログ，ピリミジンアナログおよび／またはヒスチジ
ンアナログ耐性株を用いる方法（特公昭５７−１８８７
１），ミクロバクテリウム属細菌から誘導されたプリン
アナログ耐性株を用いる方法（特公昭５７−１８８７
２）などが知られている。著量のデオキシシチジンを培
養液中に生成蓄積させる方法については従来全く知られ
ていない。
は、バチルス・ズブチリスあるいはプロテウス・レトゲ
リーの変異株を用いる方法（特公昭３６−２１４９
９），ブレビバクテリウム属細菌から誘導されたプリン
アナログ，ピリミジンアナログおよび／またはヒスチジ
ンアナログ耐性株を用いる方法（特公昭５７−１８８７
１），ミクロバクテリウム属細菌から誘導されたプリン
アナログ耐性株を用いる方法（特公昭５７−１８８７
２）などが知られている。著量のデオキシシチジンを培
養液中に生成蓄積させる方法については従来全く知られ
ていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、シチジンお
よびデオキシシチジンの製造法に関し、収率等において
工業的に一層有利な方法に用いることができる微生物を
提供しようとするものである。
よびデオキシシチジンの製造法に関し、収率等において
工業的に一層有利な方法に用いることができる微生物を
提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決しようとするための手段】本発明者らは、
シチジンおよびデオキシシチジンの生産菌について研究
を重ねた結果、バチルス属に属し、シチジンデアミナー
ゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログ耐性を有する微生
物が培地中に著量のシチジンおよび／またはデオキシシ
チジンを生成蓄積することを見出し、この知見に基づい
てさらに研究を続け、本発明を完成した。すなわち、本
発明は、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジ
ンアナログに耐性を有し、シチジンおよび／またはデオ
キシシチジン生産能を有するバチルス属の微生物を培地
に培養し、培養物中にシチジンおよび／またはデオキシ
シチジンを生成蓄積せしめ、シチジンおよび／またはデ
オキシシチジンを採取することを特徴とするシチジンお
よび／またはデオキシシチジンの製造法で用いるシチジ
ンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログに耐
性を有するバチルス・ズブチリスに関する。
シチジンおよびデオキシシチジンの生産菌について研究
を重ねた結果、バチルス属に属し、シチジンデアミナー
ゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログ耐性を有する微生
物が培地中に著量のシチジンおよび／またはデオキシシ
チジンを生成蓄積することを見出し、この知見に基づい
てさらに研究を続け、本発明を完成した。すなわち、本
発明は、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジ
ンアナログに耐性を有し、シチジンおよび／またはデオ
キシシチジン生産能を有するバチルス属の微生物を培地
に培養し、培養物中にシチジンおよび／またはデオキシ
シチジンを生成蓄積せしめ、シチジンおよび／またはデ
オキシシチジンを採取することを特徴とするシチジンお
よび／またはデオキシシチジンの製造法で用いるシチジ
ンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログに耐
性を有するバチルス・ズブチリスに関する。
【０００５】本発明にいう「シチジンデアミナーゼ活性
欠損株」とは、供試菌体を超音波処理により破壊した
後、その遠心上清画分を用いて、D. F. Wentworth らの
方法［“メソッヅ・イン・エンザイモロジー”Ｌ１巻．
ピー・エイ・ホッフィー・アンド・エム・イー・ジョン
ズ編集，アカデミック・プレス，ニューヨーク，１９７
８，４０１頁（“Methods in Enzymology”, Vol. LI,
ed. by P. A. Hoffee and M. E. Jones, Academic Pres
s, New York, 1978, p.401）］でシチジンデアミナーゼ
活性を測定した時の値が０．０１ユニット／mg−蛋白
（１分間に１ナノモルのシチジンを脱アミノ化する酵素
力を１ユニットとする。）以下の微生物をいい、また
「ピリミジンアナログ耐性株」とは、バチルス属細菌を
親株として誘導される微生物であって、親株が生育でき
ないような高い濃度のピリミジンアナログを含む培地で
も生育できるように遺伝的性質の変化した微生物をい
う。また、「ピリミジンアナログ」とはウラシルやシト
シンなどのピリミジン塩基と類似の構造を有する物質、
例えば、６−アザウラシル，２−チオウラシル，５−フ
ルオロウラシル，５−フルオロオロチン酸などやこれら
のリボサイドおよびリボタイドなどが挙げられ、これら
の少なくとも一つに耐性を有すればよい。
欠損株」とは、供試菌体を超音波処理により破壊した
後、その遠心上清画分を用いて、D. F. Wentworth らの
方法［“メソッヅ・イン・エンザイモロジー”Ｌ１巻．
ピー・エイ・ホッフィー・アンド・エム・イー・ジョン
ズ編集，アカデミック・プレス，ニューヨーク，１９７
８，４０１頁（“Methods in Enzymology”, Vol. LI,
ed. by P. A. Hoffee and M. E. Jones, Academic Pres
s, New York, 1978, p.401）］でシチジンデアミナーゼ
活性を測定した時の値が０．０１ユニット／mg−蛋白
（１分間に１ナノモルのシチジンを脱アミノ化する酵素
力を１ユニットとする。）以下の微生物をいい、また
「ピリミジンアナログ耐性株」とは、バチルス属細菌を
親株として誘導される微生物であって、親株が生育でき
ないような高い濃度のピリミジンアナログを含む培地で
も生育できるように遺伝的性質の変化した微生物をい
う。また、「ピリミジンアナログ」とはウラシルやシト
シンなどのピリミジン塩基と類似の構造を有する物質、
例えば、６−アザウラシル，２−チオウラシル，５−フ
ルオロウラシル，５−フルオロオロチン酸などやこれら
のリボサイドおよびリボタイドなどが挙げられ、これら
の少なくとも一つに耐性を有すればよい。
【０００６】本発明の微生物の具体例としては、バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＡＵ−５０（Ｉ
ＦＯ １４３９５，ＦＥＲＭ Ｐ−７９１１），バチル
ス・ズブチリスＦＵ−１１（ＩＦＯ １４３９３，ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７９１２），バチルス・ズブチリス６ＡＵ−
５００（ＩＦＯ １４４０７，ＦＥＲＭ Ｐ−７９７
１）およびバチルス・ズブチリス２ＴＵ−２００（ＩＦ
Ｏ １４４０８，ＦＥＲＭ Ｐ−７９７２）があげられ
る。これらの微生物の中で、バチルス・ズブチリスＡＵ
−５０およびＦＵ−１１株はバチルス・ズブチリス（Ｉ
ＦＯ １３７１９，ＡＴＣＣ ６０５１）を親株とし
て、また６ＡＵ−５００および２ＴＵ−２００株はバチ
ルス・ズブチリスＮｏ．１２２（ＩＦＯ １４３８６，
ＦＥＲＭ Ｐ−７９０８）を親株としてそれぞれ誘導さ
れたものである。
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＡＵ−５０（Ｉ
ＦＯ １４３９５，ＦＥＲＭ Ｐ−７９１１），バチル
ス・ズブチリスＦＵ−１１（ＩＦＯ １４３９３，ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７９１２），バチルス・ズブチリス６ＡＵ−
５００（ＩＦＯ １４４０７，ＦＥＲＭ Ｐ−７９７
１）およびバチルス・ズブチリス２ＴＵ−２００（ＩＦ
Ｏ １４４０８，ＦＥＲＭ Ｐ−７９７２）があげられ
る。これらの微生物の中で、バチルス・ズブチリスＡＵ
−５０およびＦＵ−１１株はバチルス・ズブチリス（Ｉ
ＦＯ １３７１９，ＡＴＣＣ ６０５１）を親株とし
て、また６ＡＵ−５００および２ＴＵ−２００株はバチ
ルス・ズブチリスＮｏ．１２２（ＩＦＯ １４３８６，
ＦＥＲＭ Ｐ−７９０８）を親株としてそれぞれ誘導さ
れたものである。
【０００７】なお、本願明細書において、ＩＦＯ番号は
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ 大阪府大阪市淀川区十三
本町２丁目１７番８５号）への寄託番号、また、ＦＥＲ
ＭＰ−番号は工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ、茨城県つくば市東１丁目１番３号）への寄託番号を
あらわす。ＦＲＩへの寄託は、バチルス・ズブチリスＡ
Ｕ−５０，ＦＵ−１１株および株Ｎo.１２２株について
は１９８４年１０月１９日に、またバチルス・ズブチリ
ス６ＡＵ−５００および２ＴＵ−２００株については１
９８４年１２月１日になされ、該寄託がブダペスト条約
に基づく寄託に切換えられて下記に示す受託番号として
同研究所に保管されている。 なお、上記した親株の中で、バチルス・ズブチリス（Ｉ
ＦＯ １３７１９、ＡＴＣＣ ６０５１）は、財団法人
発酵研究所（Institute for Fermentation, OSAKA）発
行のリスト・オブ・カルチャーズ，１９７８，シックス
・エディション(List of Cultures, 1978, Sixth Editi
on )およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（エイ・テイ・シー・シー）［American Type Cult
ure Collection（ＡＴＣＣ））］発行のカタログ・オブ
・ストレインズI，フィフティーンス・エディション（C
atalogue of Strains I, Fifteenth Edition）１９８２
に記載の公知株である。一方、バチルス・ズブチリスＮ
o.１２２（ＩＦＯ １４３８６、ＦＥＲＭ ＢＰ−８５
９）は本発明者らによって土壌から新しく分離された菌
であって、その菌学的性質は次の通りである。
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ 大阪府大阪市淀川区十三
本町２丁目１７番８５号）への寄託番号、また、ＦＥＲ
ＭＰ−番号は工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ、茨城県つくば市東１丁目１番３号）への寄託番号を
あらわす。ＦＲＩへの寄託は、バチルス・ズブチリスＡ
Ｕ−５０，ＦＵ−１１株および株Ｎo.１２２株について
は１９８４年１０月１９日に、またバチルス・ズブチリ
ス６ＡＵ−５００および２ＴＵ−２００株については１
９８４年１２月１日になされ、該寄託がブダペスト条約
に基づく寄託に切換えられて下記に示す受託番号として
同研究所に保管されている。 なお、上記した親株の中で、バチルス・ズブチリス（Ｉ
ＦＯ １３７１９、ＡＴＣＣ ６０５１）は、財団法人
発酵研究所（Institute for Fermentation, OSAKA）発
行のリスト・オブ・カルチャーズ，１９７８，シックス
・エディション(List of Cultures, 1978, Sixth Editi
on )およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（エイ・テイ・シー・シー）［American Type Cult
ure Collection（ＡＴＣＣ））］発行のカタログ・オブ
・ストレインズI，フィフティーンス・エディション（C
atalogue of Strains I, Fifteenth Edition）１９８２
に記載の公知株である。一方、バチルス・ズブチリスＮ
o.１２２（ＩＦＯ １４３８６、ＦＥＲＭ ＢＰ−８５
９）は本発明者らによって土壌から新しく分離された菌
であって、その菌学的性質は次の通りである。
【０００８】Ａ．形態 １）形および大きさ：短桿菌（０．７−０．８×２．５
−３．０μ） ２）多形性：単一または二連 ３）運動性：なし ４）胞子の形成：有り ５）胞子の形：楕円形 ６）胞子の位置：中心付近 ７）グラム染色：陽性 ８）抗酸性：なし Ｂ．生育状況 １）肉汁寒天平板培養：不定形で拡散状、表面粗く扁平
状、不透明で薄褐色 ２）肉汁液体培養：表面に菌膜を形成、混濁なし ３）リトマスミルク：ペプトン化、色素の還元有り Ｃ．生理的性質 １）硝酸塩の還元：有り ２）Ｖ−Ｐテスト：陽性 ３）デンプンの加水分解：有り ４）クエン酸の利用：有り ５）プロピオン酸の利用：なし ６）アンモニウム塩の利用：有り ７）ウレアーゼ：微弱 ８）カタラーゼ：有り ９）酸素に対する態度：好気性 10）塩化ナトリウム耐性：７％で生育可能 11）耐酸性：ｐＨ５．７で生育可能 上記の菌学的諸性質をR. E. Buchanan およびN. E. Gib
bons 編の「バージーズ・マニュアル・オブ・デターミ
ナテイブ・バクテリオロジー（Bergy's Mannual of Det
erminative Bacteriology）第８版（１９７４年）」に
したがって検索した結果、本菌株はバチルス・ズブチリ
スに属する微生物であると同定された。上記に例示され
た本発明の製造法で用いられるバチルス属菌の菌学的性
質は、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジン
アナログに耐性を有し、シチジンおよび／またはデオキ
シシチジンの生産能を有するほかは、その親株と同様で
ある。
−３．０μ） ２）多形性：単一または二連 ３）運動性：なし ４）胞子の形成：有り ５）胞子の形：楕円形 ６）胞子の位置：中心付近 ７）グラム染色：陽性 ８）抗酸性：なし Ｂ．生育状況 １）肉汁寒天平板培養：不定形で拡散状、表面粗く扁平
状、不透明で薄褐色 ２）肉汁液体培養：表面に菌膜を形成、混濁なし ３）リトマスミルク：ペプトン化、色素の還元有り Ｃ．生理的性質 １）硝酸塩の還元：有り ２）Ｖ−Ｐテスト：陽性 ３）デンプンの加水分解：有り ４）クエン酸の利用：有り ５）プロピオン酸の利用：なし ６）アンモニウム塩の利用：有り ７）ウレアーゼ：微弱 ８）カタラーゼ：有り ９）酸素に対する態度：好気性 10）塩化ナトリウム耐性：７％で生育可能 11）耐酸性：ｐＨ５．７で生育可能 上記の菌学的諸性質をR. E. Buchanan およびN. E. Gib
bons 編の「バージーズ・マニュアル・オブ・デターミ
ナテイブ・バクテリオロジー（Bergy's Mannual of Det
erminative Bacteriology）第８版（１９７４年）」に
したがって検索した結果、本菌株はバチルス・ズブチリ
スに属する微生物であると同定された。上記に例示され
た本発明の製造法で用いられるバチルス属菌の菌学的性
質は、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジン
アナログに耐性を有し、シチジンおよび／またはデオキ
シシチジンの生産能を有するほかは、その親株と同様で
ある。
【０００９】本発明は、上記に例示された微生物以外に
も、種々のバチルス属細菌を親株として、これに、例え
ば紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）処理などの変異操作を施すこと
によって容易に誘導することができる、シチジンデアミ
ナーゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログに耐性を有
し、シチジンおよび／またはデオキシシチジンの生産能
を有する微生物も含む。上記のようにして得られたシチ
ジンおよび／またはデオキシシチジン生産菌の培養に
は、通常の微生物の培養方法と同様の方法が用いられ
る。すなわち、培地としては、炭素源，窒素源，金属イ
オン類のほかに、必要に応じて、アミノ酸，核酸，ビタ
ミン類などの栄養源を含有する培地が用いられる。例え
ば、炭素源としては、グルコース，シュークロース，マ
ルトース，澱粉，澱粉糖化液，糖蜜などが用いられる。
窒素源としては、ペプトン，コーン・スティーブ・リカ
ー，大豆粉，酵母，尿素などの有機窒素源のほかに、硫
酸，硝酸，塩酸，炭酸などのアンモニウム塩や、アンモ
ニアガス，アンモニア水などの無機窒素源が、それぞれ
単独もしくは混合して用いられる。その他の栄養源とし
ては、菌の生育に必要な各種の無機塩類，アミノ酸類，
ビタミン類などが適宜選択の上、それぞれ単独もしくは
混合して用いられる。さらに、培地には、必要に応じ
て、シリコンオイル，ポリアルキレングリコールエーテ
ルなどの消泡剤や界面活性剤などを添加することができ
る。培養は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養など
の好気的条件下に行われる。培地のｐＨは、通常、４な
いし９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察さ
れる場合は、これを好ましい範囲に修正するために硫
酸，炭酸カルシウム，水酸化ナトリウム，アンモニアガ
ス，アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温度
は、通常、２０℃ないし４５℃の範囲から、使用される
微生物の生育およびシチジンおよび／またはデオキシシ
チジンの蓄積に好適な温度が選択される。培養は実質的
にシチジンおよび／またはデオキシシチジンの蓄積量が
最大になるまで行われるが、通常２日間ないし６日間の
培養で目的を達することができる。培養物からシチジン
および／またはデオキシシチジンを分離・採取するに
は、すでに公知にされている通常の精製手段、例えば、
沈殿法，イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフ
ィー法など［アグリク・バイオル・ケム（Agric. Biol.
Chem., 29, 742(1965)）など］の分離精製法が用いら
れる。
も、種々のバチルス属細菌を親株として、これに、例え
ば紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（ＮＴＧ）処理などの変異操作を施すこと
によって容易に誘導することができる、シチジンデアミ
ナーゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログに耐性を有
し、シチジンおよび／またはデオキシシチジンの生産能
を有する微生物も含む。上記のようにして得られたシチ
ジンおよび／またはデオキシシチジン生産菌の培養に
は、通常の微生物の培養方法と同様の方法が用いられ
る。すなわち、培地としては、炭素源，窒素源，金属イ
オン類のほかに、必要に応じて、アミノ酸，核酸，ビタ
ミン類などの栄養源を含有する培地が用いられる。例え
ば、炭素源としては、グルコース，シュークロース，マ
ルトース，澱粉，澱粉糖化液，糖蜜などが用いられる。
窒素源としては、ペプトン，コーン・スティーブ・リカ
ー，大豆粉，酵母，尿素などの有機窒素源のほかに、硫
酸，硝酸，塩酸，炭酸などのアンモニウム塩や、アンモ
ニアガス，アンモニア水などの無機窒素源が、それぞれ
単独もしくは混合して用いられる。その他の栄養源とし
ては、菌の生育に必要な各種の無機塩類，アミノ酸類，
ビタミン類などが適宜選択の上、それぞれ単独もしくは
混合して用いられる。さらに、培地には、必要に応じ
て、シリコンオイル，ポリアルキレングリコールエーテ
ルなどの消泡剤や界面活性剤などを添加することができ
る。培養は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養など
の好気的条件下に行われる。培地のｐＨは、通常、４な
いし９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察さ
れる場合は、これを好ましい範囲に修正するために硫
酸，炭酸カルシウム，水酸化ナトリウム，アンモニアガ
ス，アンモニア水などを適宜添加してもよい。培養温度
は、通常、２０℃ないし４５℃の範囲から、使用される
微生物の生育およびシチジンおよび／またはデオキシシ
チジンの蓄積に好適な温度が選択される。培養は実質的
にシチジンおよび／またはデオキシシチジンの蓄積量が
最大になるまで行われるが、通常２日間ないし６日間の
培養で目的を達することができる。培養物からシチジン
および／またはデオキシシチジンを分離・採取するに
は、すでに公知にされている通常の精製手段、例えば、
沈殿法，イオン交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフ
ィー法など［アグリク・バイオル・ケム（Agric. Biol.
Chem., 29, 742(1965)）など］の分離精製法が用いら
れる。
【００１０】
【実施例】以下に、実施例をもって本発明をさらに具体
的に説明する。 実施例１ バチルス・ズブチリス（ＩＦＯ １３７１９、ＡＴＣＣ
６０５１）を５０μｇ／mlのＮＴＧで３７℃で２０分
間処理した後（以下ＮＴＧ処理は同様の条件で行っ
た。）下記の基本培地（Ａ）に１００μｇ／mlのウラシ
ルを添加した培地に塗抹し、３７℃で３日間培養した。
出現したコロニーの中から、レプリカ法によって、ウラ
シル要求性変異株を選択した。次に、このウラシル要求
株に上記と同様の条件でＮＴＧ処理を施した後、基本培
地（Ａ）に１００μｇ／mlのウラシルを添加した培地に
塗抹し、３７℃で３日間培養した。 基本培地（Ａ） グルコース ２．０％ 硫酸アンモニウム ０．２％ 燐酸一カリウム ０．６％ クエン酸三ナトリウム ０．１％ 燐酸二カリウム １．４％ 硫酸マグネシウム ０．０２％ ビオチン ０．１mg／ｌ 寒天（ｐＨ７．０） ２．０％
的に説明する。 実施例１ バチルス・ズブチリス（ＩＦＯ １３７１９、ＡＴＣＣ
６０５１）を５０μｇ／mlのＮＴＧで３７℃で２０分
間処理した後（以下ＮＴＧ処理は同様の条件で行っ
た。）下記の基本培地（Ａ）に１００μｇ／mlのウラシ
ルを添加した培地に塗抹し、３７℃で３日間培養した。
出現したコロニーの中から、レプリカ法によって、ウラ
シル要求性変異株を選択した。次に、このウラシル要求
株に上記と同様の条件でＮＴＧ処理を施した後、基本培
地（Ａ）に１００μｇ／mlのウラシルを添加した培地に
塗抹し、３７℃で３日間培養した。 基本培地（Ａ） グルコース ２．０％ 硫酸アンモニウム ０．２％ 燐酸一カリウム ０．６％ クエン酸三ナトリウム ０．１％ 燐酸二カリウム １．４％ 硫酸マグネシウム ０．０２％ ビオチン ０．１mg／ｌ 寒天（ｐＨ７．０） ２．０％
【００１１】出現したコロニーを、基本培地（Ａ）に１
００μｇ／mlのシチジンを添加した培地にレプリカし
て、生育できない株（シチジンデアミナーゼ活性欠損
株）を選択した。次に、このようにして得られたシチジ
ンデアミナーゼ活性欠損株に上記と同様にしてＮＴＧ処
理した後、基本培地（Ａ）上に塗抹して、３７℃で３日
間培養した。出現したコロニー（ウラシル要求性の復帰
株）から一菌株を選択して上記と同様の条件下にＮＴＧ
処理を施した後、基本培地（Ａ）に０．５μｇ／mlの５
−フルオロウラシルを添加した培地（Ａ−ＦＵ）上に塗
抹して、３７℃で４日間培養した。培地（Ａ−ＦＵ）上
に出現したコロニーの中から、シチジンおよび２′−デ
オキシシチジン生産能を有する株としてバチルス・ズブ
チリスＦＵ−１１(ＩＦＯ １４３９３、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−９０８)を選択した。これらの菌株のシチジンデア
ミナーゼ活性（D. F. Wentworthらの方法（前記）によ
り測定）およびピリミジンアナログ耐性度は〔表１〕お
よび〔表２〕の通りであった。
００μｇ／mlのシチジンを添加した培地にレプリカし
て、生育できない株（シチジンデアミナーゼ活性欠損
株）を選択した。次に、このようにして得られたシチジ
ンデアミナーゼ活性欠損株に上記と同様にしてＮＴＧ処
理した後、基本培地（Ａ）上に塗抹して、３７℃で３日
間培養した。出現したコロニー（ウラシル要求性の復帰
株）から一菌株を選択して上記と同様の条件下にＮＴＧ
処理を施した後、基本培地（Ａ）に０．５μｇ／mlの５
−フルオロウラシルを添加した培地（Ａ−ＦＵ）上に塗
抹して、３７℃で４日間培養した。培地（Ａ−ＦＵ）上
に出現したコロニーの中から、シチジンおよび２′−デ
オキシシチジン生産能を有する株としてバチルス・ズブ
チリスＦＵ−１１(ＩＦＯ １４３９３、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−９０８)を選択した。これらの菌株のシチジンデア
ミナーゼ活性（D. F. Wentworthらの方法（前記）によ
り測定）およびピリミジンアナログ耐性度は〔表１〕お
よび〔表２〕の通りであった。
【表１】
【表２】
【００１２】次に、これらの微生物をグルコース１５
％、コーン・スチープ・リカー３％、尿素１％、炭酸カ
ルシウム２％からなる発酵培地２０mlを含む２００ml容
フラスコに接種して、３７℃で３日間振盪培養したとこ
ろ、〔表３〕に示す結果が得られた。
％、コーン・スチープ・リカー３％、尿素１％、炭酸カ
ルシウム２％からなる発酵培地２０mlを含む２００ml容
フラスコに接種して、３７℃で３日間振盪培養したとこ
ろ、〔表３〕に示す結果が得られた。
【表３】
【００１３】実施例２ 実施例１と同様にしてバチルス・ズブチリス（ＩＦＯ
１３７１９，ＡＴＣＣ６０５１）から得られたウラシル
要求性の消失したシチジンデアミナーゼ活性欠損株にＮ
ＴＧ処理を施した後、実施例１に示す基本培地（Ａ）に
親株が生育できない濃度（１００μｇ／ml）の６−アザ
ウラシルを添加した培地に生育できる株として、バチル
ス・ズブチリスＡＵ−５０（ＩＦＯ １４３９５，ＦＥ
ＲＭＢＰ−９０７）を選択した。この菌株のピリミジン
アナログ耐性度は〔表４〕の通りであった。
１３７１９，ＡＴＣＣ６０５１）から得られたウラシル
要求性の消失したシチジンデアミナーゼ活性欠損株にＮ
ＴＧ処理を施した後、実施例１に示す基本培地（Ａ）に
親株が生育できない濃度（１００μｇ／ml）の６−アザ
ウラシルを添加した培地に生育できる株として、バチル
ス・ズブチリスＡＵ−５０（ＩＦＯ １４３９５，ＦＥ
ＲＭＢＰ−９０７）を選択した。この菌株のピリミジン
アナログ耐性度は〔表４〕の通りであった。
【表４】 このＡＵ−５０株を実施例１と同様の条件下に培養した
ところ、１．５mg／mlのシチジンおよび２．３mg／mlの
デオキシシチジンが蓄積された。
ところ、１．５mg／mlのシチジンおよび２．３mg／mlの
デオキシシチジンが蓄積された。
【００１４】実施例３ 実施例１と同様にして、バチルス・ズブチリスＮo.１２
２（ＩＦＯ １４３８６，ＦＥＲＭ ＢＰ−８５９）か
らウラシル要求性変異株を得たのち、実施例１と同様に
してシチジンデアミナーゼ活性を欠損し、かつウラシル
要求性の復帰した株を得た。次にこの変異株にＮＴＧ処
理を施した後、実施例１に示す基本培地（Ａ）に親株が
生育できない濃度（２００μｇ/ml）の２−チオウラシ
ルを添加した培地に生育できる株としてバチルス・ズブ
チリス２ＴＵ−２００（ＩＦＯ１４４０８，ＦＥＲＭ
ＢＰ−９１０）を選択した。この株のシチジンデアミナ
ーゼ活性を測定したところ０．０１ユニット／mg−蛋白
（親株のそれは、５５．８ユニット／mg−蛋白）であっ
た。また、これらの菌株のピリミジンアナログ耐性度は
〔表５〕の通りであった。
２（ＩＦＯ １４３８６，ＦＥＲＭ ＢＰ−８５９）か
らウラシル要求性変異株を得たのち、実施例１と同様に
してシチジンデアミナーゼ活性を欠損し、かつウラシル
要求性の復帰した株を得た。次にこの変異株にＮＴＧ処
理を施した後、実施例１に示す基本培地（Ａ）に親株が
生育できない濃度（２００μｇ/ml）の２−チオウラシ
ルを添加した培地に生育できる株としてバチルス・ズブ
チリス２ＴＵ−２００（ＩＦＯ１４４０８，ＦＥＲＭ
ＢＰ−９１０）を選択した。この株のシチジンデアミナ
ーゼ活性を測定したところ０．０１ユニット／mg−蛋白
（親株のそれは、５５．８ユニット／mg−蛋白）であっ
た。また、これらの菌株のピリミジンアナログ耐性度は
〔表５〕の通りであった。
【表５】 次に、バチルス・ズブチリス２ＴＵ−２００を実施例１
と同様の条件下に培養したところ１．５mg／mlのシチジ
ンおよび０．６mg／mlのデオキシシチジンが蓄積されて
いた。
と同様の条件下に培養したところ１．５mg／mlのシチジ
ンおよび０．６mg／mlのデオキシシチジンが蓄積されて
いた。
【００１５】実施例４ 実施例３と同様にして、バチルス・ズブチリスＮo.１２
２（ＩＦＯ １４３８６，ＦＥＲＭ ＢＰ−８５９）か
ら得られたウラシル要求性の消失したシチジンデアミナ
ーゼ欠損株を実施例１と同様にしてＮＴＧ処理を施した
後、実施例１に示す基本培地（Ａ）に親株が生育できな
い濃度（２００μｇ／ml）の６−アザウラシルを添加し
た培地に生育できる株としてバチルス・ズブチリス６Ａ
Ｕ−５００（ＩＦＯ １４４０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−９
０９）を選択した。この菌株のピリミジンアナログ耐性
度は〔表６〕の通りであった。
２（ＩＦＯ １４３８６，ＦＥＲＭ ＢＰ−８５９）か
ら得られたウラシル要求性の消失したシチジンデアミナ
ーゼ欠損株を実施例１と同様にしてＮＴＧ処理を施した
後、実施例１に示す基本培地（Ａ）に親株が生育できな
い濃度（２００μｇ／ml）の６−アザウラシルを添加し
た培地に生育できる株としてバチルス・ズブチリス６Ａ
Ｕ−５００（ＩＦＯ １４４０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−９
０９）を選択した。この菌株のピリミジンアナログ耐性
度は〔表６〕の通りであった。
【表６】 次にバチルス・ズブチリス６ＡＵ−５００を実施例１と
同様の条件下に培養したところ、２．０mg／mlのシチジ
ンが蓄積された。
同様の条件下に培養したところ、２．０mg／mlのシチジ
ンが蓄積された。
【００１６】実施例５ 実施例１の発酵培地２０mlを含む２００ml容フラスコ５
０個を用い、実施例１に従ってバチルス・ズブチリスＦ
Ｕ−１１（ＩＦＯ １４３９３，ＦＥＲＭ ＢＰ−９０
８）を培養した。得られた培養物から遠心分離によって
菌体を除去し、この上清液を１Ｎの塩酸溶液によりｐＨ
２．０とし遠心分離により沈殿を除いた。得られた上清
液中のシチジン、およびデオキシシチジンを活性炭カラ
ムに吸着させた後、１．４％のアンモニア水を含む５０
％エタノール溶液により溶出させた。シチジンおよびデ
オキシシチジンの溶出画分を集め、減圧濃縮したのち濃
縮液をアンモニア水によりｐＨ８．０とし、更に等容量
の０．０１Ｍホウ酸カリウム溶液を加え、ダウエックス
（Dowex）−１×２（Ｃl-型，２００〜４００メッシ
ュ）のカラムを用いてシチジンを吸着させた後、このカ
ラムを蒸留水で洗浄した［デオキシシチジンはこのカラ
ムに吸着されないので、上記のカラム通過液とカラム洗
浄液（デオキシシチジン含有画分）から別途下記の方法
により精製する］。次にこのカラムから、１リットル中
に０．０３Ｍ塩化カリウムおよび０．０２Ｍホウ酸カリ
ウムを含む水溶液を用いてシチジンを溶出させた。シチ
ジンの溶出画分を集めて等容量のメタノールを加え、濃
縮乾固をくり返し、ホウ酸をのぞいた。得られた固形物
を少量の水にとかし冷却下にアルコールを添加し、シチ
ジンの粗結晶３．９ｇを得た。次に、これを少量の熱水
に溶解した後、再び冷却して、シチジンの結晶２．８ｇ
を得た。次に、上記のデオキシシチジン含有画分を濃縮
乾固し、得られた固形物を少量の水にとかし冷却下にア
ルコールを添加して、デオキシシチジンの粗結晶０．８
ｇを得た。次に、これを少量の熱水に溶解したのち、再
び冷却して、デオキシシチジンの結晶０．３ｇを得た。
０個を用い、実施例１に従ってバチルス・ズブチリスＦ
Ｕ−１１（ＩＦＯ １４３９３，ＦＥＲＭ ＢＰ−９０
８）を培養した。得られた培養物から遠心分離によって
菌体を除去し、この上清液を１Ｎの塩酸溶液によりｐＨ
２．０とし遠心分離により沈殿を除いた。得られた上清
液中のシチジン、およびデオキシシチジンを活性炭カラ
ムに吸着させた後、１．４％のアンモニア水を含む５０
％エタノール溶液により溶出させた。シチジンおよびデ
オキシシチジンの溶出画分を集め、減圧濃縮したのち濃
縮液をアンモニア水によりｐＨ８．０とし、更に等容量
の０．０１Ｍホウ酸カリウム溶液を加え、ダウエックス
（Dowex）−１×２（Ｃl-型，２００〜４００メッシ
ュ）のカラムを用いてシチジンを吸着させた後、このカ
ラムを蒸留水で洗浄した［デオキシシチジンはこのカラ
ムに吸着されないので、上記のカラム通過液とカラム洗
浄液（デオキシシチジン含有画分）から別途下記の方法
により精製する］。次にこのカラムから、１リットル中
に０．０３Ｍ塩化カリウムおよび０．０２Ｍホウ酸カリ
ウムを含む水溶液を用いてシチジンを溶出させた。シチ
ジンの溶出画分を集めて等容量のメタノールを加え、濃
縮乾固をくり返し、ホウ酸をのぞいた。得られた固形物
を少量の水にとかし冷却下にアルコールを添加し、シチ
ジンの粗結晶３．９ｇを得た。次に、これを少量の熱水
に溶解した後、再び冷却して、シチジンの結晶２．８ｇ
を得た。次に、上記のデオキシシチジン含有画分を濃縮
乾固し、得られた固形物を少量の水にとかし冷却下にア
ルコールを添加して、デオキシシチジンの粗結晶０．８
ｇを得た。次に、これを少量の熱水に溶解したのち、再
び冷却して、デオキシシチジンの結晶０．３ｇを得た。
【００１７】
【発明の効果】本発明によると、医薬品の合成原料等と
して有用なシチジンおよびデオキシシチジンを工業的有
利に製造できる。すなわち、本発明の製造法は、バチル
ス属に属し、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリ
ミジンアナログに耐性を有するシチジンおよび／または
デオキシシチジン生産能を有する微生物を用いることに
特徴があり、従来のバチルス属菌を用いる方法よりもこ
れら目的物を収率よく得ることができる。
して有用なシチジンおよびデオキシシチジンを工業的有
利に製造できる。すなわち、本発明の製造法は、バチル
ス属に属し、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリ
ミジンアナログに耐性を有するシチジンおよび／または
デオキシシチジン生産能を有する微生物を用いることに
特徴があり、従来のバチルス属菌を用いる方法よりもこ
れら目的物を収率よく得ることができる。
Claims (1)
- 【請求項１】シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリ
ミジンアナログに耐性を有するバチルス・ズブチリス。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59258788A JPS61135597A (ja) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | シチジンおよびデオキシシチジンの製造法 |
| CN85108240A CN1011704B (zh) | 1984-12-06 | 1985-11-16 | 胞苷和/或脱氧胞苷的生产方法 |
| US06/802,344 US4839285A (en) | 1984-12-06 | 1985-11-25 | Method for production of cytidine and/or deoxycytidine |
| CA000496215A CA1278541C (en) | 1984-12-06 | 1985-11-26 | Method for production of cytidine and/or deoxycytidine |
| AT85115244T ATE47154T1 (de) | 1984-12-06 | 1985-11-30 | Verfahren zur herstellung von cytidin und/oder desoxycytidin. |
| EP85115244A EP0188708B1 (en) | 1984-12-06 | 1985-11-30 | Method for production of cytidine and/or deoxycytidine |
| KR1019850009139A KR930005869B1 (ko) | 1984-12-06 | 1985-12-05 | 시티딘 및/또는 데옥시시티딘의 제조 방법 |
| ES549620A ES8701224A1 (es) | 1984-12-06 | 1985-12-05 | Un metodo para producir citidina y-o desoxicitidina |
| JP4058429A JPH0673452B2 (ja) | 1984-12-06 | 1992-03-16 | 新規バチルス・ズブチリス |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59258788A JPS61135597A (ja) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | シチジンおよびデオキシシチジンの製造法 |
| JP4058429A JPH0673452B2 (ja) | 1984-12-06 | 1992-03-16 | 新規バチルス・ズブチリス |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59258788A Division JPS61135597A (ja) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | シチジンおよびデオキシシチジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292945A JPH05292945A (ja) | 1993-11-09 |
| JPH0673452B2 true JPH0673452B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=26399491
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59258788A Granted JPS61135597A (ja) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | シチジンおよびデオキシシチジンの製造法 |
| JP4058429A Expired - Lifetime JPH0673452B2 (ja) | 1984-12-06 | 1992-03-16 | 新規バチルス・ズブチリス |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59258788A Granted JPS61135597A (ja) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | シチジンおよびデオキシシチジンの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4839285A (ja) |
| EP (1) | EP0188708B1 (ja) |
| JP (2) | JPS61135597A (ja) |
| KR (1) | KR930005869B1 (ja) |
| CN (1) | CN1011704B (ja) |
| CA (1) | CA1278541C (ja) |
| ES (1) | ES8701224A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH044881A (ja) * | 1990-04-23 | 1992-01-09 | Takeda Chem Ind Ltd | シチジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 |
| US7220281B2 (en) * | 1999-08-18 | 2007-05-22 | Intrinsic Therapeutics, Inc. | Implant for reinforcing and annulus fibrosis |
| US6858721B2 (en) * | 2001-05-01 | 2005-02-22 | Mitsui Chemicals, Inc. | Method for producing cytosine nucleoside compounds |
| AU2010230985B2 (en) * | 2009-04-03 | 2015-09-24 | United Kingdom Research And Innovation | Mutants of activation-induced cytidine deaminase (AID) and methods of use |
| CN103088008B (zh) * | 2011-10-31 | 2014-08-20 | 中国科学院微生物研究所 | 胞苷脱氨酶及其编码基因和它们的应用 |
| CN105505844B (zh) * | 2014-09-24 | 2019-07-30 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法 |
| CN105671008B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-03-29 | 天津科技大学 | 一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点 |
| CN105671007B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-03-29 | 天津科技大学 | 高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点 |
| CN106754602B (zh) * | 2017-01-04 | 2021-08-20 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法 |
| CN109187794B (zh) * | 2018-09-27 | 2021-08-17 | 南京医科大学 | 精浆脱氧胞苷和胞苷检测作为特发性男性不育诊断标志物及其应用 |
| WO2021034962A1 (en) * | 2019-08-19 | 2021-02-25 | Modis Therapeutics, Inc. | Polymorphic forms of deoxycytidine, compositions comprising the same and uses |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1316549A (fr) * | 1961-12-14 | 1963-02-01 | Meiji Seika Co | Procédé de fabrication de nucléosides et nucléotides |
| FR1374725A (fr) * | 1963-11-12 | 1964-10-09 | Ajinomoto Kk | Procédé de préparation de l'orotidine |
| JPS5230989A (en) * | 1975-03-28 | 1977-03-09 | Sugano Seisakusho:Kk | Paper feed device for automatic paper punching |
-
1984
- 1984-12-06 JP JP59258788A patent/JPS61135597A/ja active Granted
-
1985
- 1985-11-16 CN CN85108240A patent/CN1011704B/zh not_active Expired
- 1985-11-25 US US06/802,344 patent/US4839285A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-26 CA CA000496215A patent/CA1278541C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-30 EP EP85115244A patent/EP0188708B1/en not_active Expired
- 1985-12-05 KR KR1019850009139A patent/KR930005869B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 ES ES549620A patent/ES8701224A1/es not_active Expired
-
1992
- 1992-03-16 JP JP4058429A patent/JPH0673452B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1011704B (zh) | 1991-02-20 |
| US4839285A (en) | 1989-06-13 |
| CA1278541C (en) | 1991-01-02 |
| EP0188708B1 (en) | 1989-10-11 |
| JPH05292945A (ja) | 1993-11-09 |
| CN85108240A (zh) | 1986-07-02 |
| KR930005869B1 (ko) | 1993-06-25 |
| KR860005026A (ko) | 1986-07-16 |
| ES549620A0 (es) | 1986-11-16 |
| EP0188708A1 (en) | 1986-07-30 |
| ES8701224A1 (es) | 1986-11-16 |
| JPH058000B2 (ja) | 1993-01-29 |
| JPS61135597A (ja) | 1986-06-23 |
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