JPH058000B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は医薬品の合成原料等として有用なシチ
ジンおよび／またはデオキシシチジンの発酵法に
よる製造法に関する。 従来の技術 発酵法によるシチジンの製造法としては、バチ
ルス・スブチリスあるいはブロテウス・レトゲリ
ーの変異株を用いる方法（特公昭36−21499）、ブ
レビバクテリウム属細菌から誘導されたプリンア
ナログ、ピリミジンアナログおよび／またはヒス
チジンアナログ耐性株を用いる方法（特公昭57−
18871）、ミクロバクテリウム属細菌から誘導され
たブリンアナログ耐性株を用いる方法（特公昭57
−18872）などが知られている。 著量のデオキシシチジンを培養液中に生成蓄積
させる方法については従来全く知られていない。 発明が解決しようとする問題点 本発明は、シチジンおよびデオキシシチジンの
製造法に関し、収率等において工業的に一層有利
な方法を提供しようとするものである。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、シチジンおよびデオキシシチジ
ンの生産菌について研究を重ねた結果、バチルス
属に属し、シチジンデアミナーゼ活性を欠損し、
ピリミジンアナログ耐性を有する微生物が培地中
に著量のシチジンおよび／またはデオキシシチジ
ンを生成蓄積することを見出し、この知見に基づ
いてさらに研究を重ね続け、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、(1)バチルス属に属し、シ
チジンデアミナーゼ活性を欠損し、ピリミジンア
ナログに耐性を有し、シチジンおよび／またはデ
オキシシチジン生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中にシチジンおよび／またはデオキ
シシチジンを生成蓄積せしめ、シチジンおよび／
またはデオキシシチジンを採取することを特徴と
するシチジンおよびデオキシシチジンの製造法、
(2)微生物がシチジンデアミナーゼ活性を欠損し、
ピリミジンアナログに、耐性を有するバチルス・
ズブチリスである第１項記載の製造法に関する。 本発明にいう「シチジンデアミナーゼ活性欠損
株」とは、供試菌体を超音波処理により破壊した
後、その遠心上清画分を用いて、デイ・エフ・ウ
エントワース（D.F.Wentworth）らの方法〔“メ
ソツヅ・イン・エンザイモロジー”，LI巻．ピ
ー・エイ・ホツフイー・アンド・エム・イー・ジ
ヨンズ編集、アカデミツク・プレス・ニユーヨー
ク，1978.401頁（“Methods in Enzymology”
Vol.LI，ed.byP.A.Hoffee and M.E.Jones，
Academic press，New York，1978.p.401）で
シチジンデアミナーゼ活性を測定した時の値が
0.01ユニツト／mg−蛋白（１分間に１ナノモルの
シチジンを脱アミノ化する酵素力を１ユニツトと
する。）以下の微生物をいい、また「ピリミジン
アナログ耐性株」とは、バチルス属細菌を親株と
して誘導される微生物であつて、親株が生育でき
ないような高い濃度のピリミジンアナログを含む
培地でも生育できるように遺伝的性質の変化した
微生物をいう。また、「ピリミジンアナログ」と
はウラシルやシトシンなどのピリミジン塩基と類
似の構造を有する物質、例えば、６−アザウラシ
ル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、
５−フルオロオロチン酸、などやこれらのリボサ
イドおよびリボタイドなどが挙げられ、これらの
少なくとも一つに耐性を有すればよい。 本発明で使用される微生物の具体例としては、
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）AU
−50（IFO14395、FERM Ｐ−7911）、バチルス・
ズブチリスFU−11（IFO14393、FERM Ｐ−
7912）、バチルス・ズブチリス6AU−500
（IFO14407、FERM Ｐ−7971）およびバチル
ス・ズブチリス2TU−200（IFO14408、FERM
Ｐ−7972）があげられる。 これらの微生物の中で、バチルス・ズブチリス
AU−50およびFU−11株はバチルス・ズブチリ
ス（IFO13719、ATCC6051）を親株として、ま
た6AU−500および2TU−200株はバチルス・ズ
ブチリスNo.122（IFO14386、FERM Ｐ−7098）を
親株としてそれぞれ誘導されたものである。 なお、本願明細書において、IFO番号は財団法
人発酵研究所（IFO大阪府大阪市淀川区十三本町
２丁目17番85号）への寄託番号、また、FERM
Ｐ−番号は工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号）
への寄託番号あらわす。 FRIへの寄託は、バチルス・ズブチリスAU−
50、FU−11株および株No.122株については1984年
10月19日に、またバチルス・ズブチリス6AU−
500および2TU−200株については1984年12月１
日になされ、該寄託がブダペスト条約に基づく寄
託に切換えられ下記に示す受託番号として同研究
所に保管されている。

【表】 なお、上記した親株の中で、バチルス・ズブチ
リス（IFO13719、ATCC6051）は、財団法人発
酵研究所（Institute For Fermentation，
OSAKA）発行のリスト・オブ・カルチヤーズ，
1978，シツクス・エデイシヨン．（List of
Cultures，1978，Sixth Editionおよびアメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（エイ・
テイ・シー・シー）〔American Type Culture
Collection（ATCC）〕発行のカタログ・オブ・ス
トレインズＩ，フイフテイーンス・エデイシヨン
（Catalogue of Strains Ｉ，Fifteenth
Edition），1982に記載の公知株である。一方、バ
チルス・ズブチリスNo.122（IFO14386、FERM
BP−859）は本発明者らによつて土壌から新しく
分離された菌であつて、その菌学的性質は次の通
りである。 Ａ 形態 １ 形および大きさ：短桿菌（0.7−0.8×2.5−
3.0μ） ２ 多形性：単一まれに二連 ３ 運動性：なし ４ 胞子の形成：有り ５ 胞子の形：楕円形 ６ 胞子の位置：中心付近 ７ グラム染色：陽性 ８ 抗酸性：なし Ｂ 生育状況 １ 肉汁寒天平板培養：不定形で拡散状、表面粗
く扁平状、不透明で薄褐色 ２ 肉汁液体培養：表面に菌膜を形成、混濁なし ３ リトマスミルク：ペプトン化、色素の還元有
り Ｃ 生理的性質 １ 硝酸塩の還元：有り ２ Ｖ−Ｐテスト：陽性 ３ デンプンの加水分解：有り ４ クエン酸の利用：有り ５ プロピオン酸の利用：なし ６ アンモニウム塩の利用：有り ７ ウレアーゼ：微弱 ８ カタラーゼ：有り ９ 酸素に対する態度：好気性 10 塩化ナトリウム耐性：７％で生育可能 11 耐酸性：PH5.7で生育可能 上記の菌学的諸性質をR.E.BuchananおよびN.
E.Gibbons編の「バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デターミナテイブ・バクテリオロジー
（Bergy's Mannual of Determinative
Bacteriology）第８版（1974年）」にしたがつて
検策した結果、本菌株はバチルス・ズブチリスに
属する微生物であると同定された。 上記に例示された本発明の製造法で用いられる
バチルス属菌の菌学的性質は、シチジンデアミナ
ーゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログに耐性を
有し、シチジンおよび／またはデオキシシチジン
の生産能を有するほかは、その親株と同様であ
る。 本発明においては、上記に例示された微生物以
外にも、種々のバチルス属細菌を親株として、こ
れに、例えば紫外線照射、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）処理な
どの変異操作を施すことによつて、シチジンデア
ミナーゼ活性を欠損し、ピリミジンアナログに耐
性を有し、シチジンおよび／またはデオキシチジ
ンの生産能を有する微生物を容易に誘導すること
ができる。 上記のようにして得られたシチジンおよび／ま
たはデオキシシチジン生産菌の培養には、通常の
微生物の培養方法と同様の方法が用いられる。す
なわち、培地としては、炭素源、窒素源、金属イ
オン類のほかに、必要に応じて、アミノ酸、核
酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用
いられる。 例えば、炭素源としては、グルコース、シユー
クロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜
などが用いられる。窒素源としては、ペプトン、
コーン・ステイーブ・リカー、大豆粉、酵母、尿
素などの有機窒素源のほかに、硫酸、硝酸、塩
酸、炭酸などのアンモニウム塩や、アンモニアガ
ス、アンモニア水などの無機窒素源が、それぞれ
単独もしくは混合して用いられる。その他の栄養
源としては、菌の生育に必要な各種の無機塩類、
アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、そ
れぞれ単独もしくは混合して用いられる。さら
に、培地には、必要に応じて、シリコンオイル、
ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤
や界面活性剤などを添加することができる。培養
は、通常、振盪あるいは通気撹拌深部培養などの
好気的条件下に行われる。培地のPHは、通常、４
ないし９の範囲が好ましい。培養中にPHの変動が
観察される場合は、これを好ましい範囲に修正す
るために、硫酸、炭酸カルシウム、水酸化ナトリ
ウム、アンモニアガス、アンモニア水などを適宜
添加してもよい。培養温度は、通常、20℃ないし
45℃の範囲から使用される微生物の生育およびシ
チジンおよび／またはデオキシシチジンの蓄積に
好適な温度が選択される。培養は実質的にシチジ
ンおよび／またはデオキシシチジンの蓄積量が最
大になるまで行われるが、通常２日間ないし６日
間の培養で目的を達することができる。 培養物からシチジンおよび／またはデオキシシ
チジンを分離・採取するには、すでに公知にされ
ている通常の精製手段、例えば、沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフイー法な
ど〔アグリク・バイオル・ケム（Agric.Biol.
Chem.），29，742（1965）〕の分離精製法が用いら
れる。 実施例 以下に、実施例をもつて本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例 １ バチルス・ズブチリス（IFO13719、
ATCC6051）を50μｇ／mlのNTGで37℃で20分
間処理した後（以下NTG処理は同様の条件で行
つた。））下記の基本培地(A)に100μｇ／mlのウラ
シルを添加した培地に塗抹し、37℃で、３日間培
養した。出現したコロニーの中から、レプリカ法
によつて、ウラシル要求性変異株を選択した。次
に、このウラシル要求株に上記と同様の条件で
NTG処理を施した後、基本培地(A)に100μｇ／ml
のウラシルを添加した培地に塗抹し、37℃で、３
日間培養した。 基本培地(A) グルコース 2.0％ 硫酸アンモニウム 0.2％ 燐酸一カリウム 0.6％ クエン酸三ナトリウム 0.1％ 燐酸二カリウム 1.4％ 硫酸マグネシウム 0.02％ ビチオン 0.1mg／ 寒 天 2.0％ （PH7.0） 出現したコロニーを、基本培地(A)に100μｇ／
mlのシチジンを添加した培地にレプリカして、生
育できない株（シチジンデアミナーゼ活性欠損
株）を選択した。次に、このようにして得られた
シチジンデアミナーゼ活性欠損株に上記と同様に
してNTG処理を施した後、基本培地(A)上に塗抹
して、37℃で３日間培養した。出現したコロニー
（ウラシル要求性の復帰株）から一菌株を選択し
て上記と同様の条件下にNTG処理を施した後、
基本培地(A)に0.5μｇ／mlの５−フルオロウラシル
を添加した培地（Ａ−FU）上に塗抹して、37℃
で４日間培養した。培地（Ａ−FU）上に出現し
たコロニーの中から、シチジンおよび2′−デオキ
シシチジン生産能を有する株としてバチルス・ズ
ブチリスFU−11（IFO14393、FERM BP−908）
を選択した。これらの菌株のシチジンデアミナー
ゼ活性（D.F.Wentworthらの方法（前記）によ
り測定）およびピリミジンアナログ耐性度は表１
および表２の通りであつた。

【表】 ＊ ユニツト／mg−蛋白

【表】 ＊ ＋：生育あり −：生育なし
次に、これらの微生物をグルコース15％、コー
ン・スチーブ・リカー３％、尿素１％、炭酸カル
シウム２％からなる発酵培地20mlを含む200ml容
フラスコに接種して、37℃で３日間振盪培養した
ところ、表３に示す結果が得られた。

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様にしてバチルス・ズブチリス
（IFO13719、ATCC6051）から得られたウラシル
要求性の消失したシチジンデアミナーゼ活性欠損
株をNHG処理を施した後、実施例１に示す基本
培地(A)に親株が生育できない濃度（100μｇ／ml）
の６−アザウラシルを添加した培地に生育できる
株として、バチルス・ズブチリスAU−50
（IFO14395、FERM BP−907）を選択した。こ
の菌株のピリミジンアナログ耐性度は表４の通り
であつた。

【表】 ＊ ＋：生育あり −：なし
このAU−50株を実施例１と同様の条件下に培
養したところ、1.5mg／mlのシチジンおよび2.3
mg／mlのデオキシシチジンが蓄積された。 実施例 ３ 実施例１と同様にして、バチルス・ズブチリス
No.122（IFO14386、FERM Ｐ−7908）からウラシ
ル要求性変異株を得たのち、実施例１と同様にし
てシチジンデアミナーゼ活性を欠損し、かつウラ
シル要求性の復帰した株を得た。次にこの変異株
にNTG処理を施した後、実施例１に示す基本培
地(A)に親株が生育できない濃度（200μｇ／ml）
の２−チオウラシルを添加した培地に生育できる
株としてバチルス・ズブチリス2TU−200
（IFO14408、FERM BP−910）を選択した。こ
の株のシチジンデアミナーゼ活性を測定したとこ
ろ0.01ユニツト／mg−蛋白（親株のそれは、55.8
ユニツト／mg−蛋白）であつた。また、これらの
菌株のピリミジンアナログ耐性度は表５の通りで
あつた。

【表】

【表】 ＊ ＋：成育あり −：成育なし
次に、バチルス・ズブチリス2TU−200を実施
例１と同様の条件下に培養したところ1.5mg／ml
のシチジンおよび0.6mg／mlのデオキシシチジン
が蓄積されていた。 実施例 ４ 実施例３と同様にして、バチルス・ズブチリス
No.122（IFO14386、FERM Ｐ−7908）から得られ
ウラシル要求性の消失したシチジンデアミナーゼ
欠損株を実施例１と同様にしてNTG処理を施し
た後、実施例１に示す基本培地(A)に親株が生育で
きない濃度（200μｇ／ml）の６−アザウラシル
を添加した培地に生育できる株としてバチルス・
ズブチリス6AU−500（IFO14407、FERM BP−
909）を選択した。この菌株のピリミジンアナロ
グ耐性度は表６の通りであつた。

【表】 ＊ ＋：生育あり
次にバチルス・ズブチリス6AU−500を実施例
１と同様の条件下に培養したところ、2.0mg／ml
のシチジンが蓄積された。 実施例 ５ 実施例１の発酵培地20mlを含む200ml容フラス
コ50個を用い、実施例１に従つてバチルス・ズブ
チリスFU−11（IFO14393、RERM BP−908）を
培養した。得られた培養物から遠心分離によつて
菌体を除去し、この上清液を1Nの塩酸溶液によ
りPH2.0とし遠心分離により沈殿を除いた。得ら
れた上清液中のシチジン、およびデオキシシチジ
ンを活性炭カラムに吸着させた後、1.4％のアン
モニア水を含む50％エタノール溶液により溶出さ
せた。シチジンおよびデオキシシチジンの溶出画
分を集め、減圧濃縮したのち濃縮液をアンモニア
水によりPH8.0とし、更に等容量の0.01Mホウ酸
カリウム溶液を加え、ダウエツクス（Dowex）−
１×２（Cl^-型、200〜400メツシユ）のカラムを用
いてシチジンを吸着させた後、このカラムを蒸留
水で洗浄した〔デオキシシチジンはこのカラムに
吸着されないので、上記のカラム通過液とカラム
洗浄液（デオキシシチジン含有画分）から別途下
記の方法により精製する〕。 次にこのカラムから、１中に0.03M塩化カリ
ウムおよび0.02Mホウ酸カリウムを含む水溶液を
用いてシチジンを溶出させた。シチジンの溶出画
分を集めて等容量のメタノールを加え、濃縮乾固
をくり返し、ホウ酸をのぞいた。得られた固形物
を少量の水にとかして冷却下にアルコールを添加
し、シチジンの粗結晶3.9ｇを得た。次に、これ
を少量の熱水に溶解した後、再び冷却して、シチ
ジンの結晶2.8ｇを得た。 次に、上記のデオキシシチジン含有画分を濃縮
乾固し、得られた固形物を少量の水にとかし冷却
下にアルコールを添加して、デオキシシチジンの
粗結晶0.8μｇを得た。次に、これを少量の熱水に
溶解したのち、再び冷却して、デオキシシチジン
の結晶0.3μｇを得た。 発明の効果 本発明によると、医薬品の合成原料等として有
用なシチジンおよびデオキシシチジンを工業的有
利に製造できる。すなわち、本発明の製造法は、
バチルス属に属し、シチジンデアミナーゼ活性を
欠損し、ピリミジンアナログに耐性を有するシチ
ジンおよび／またはデオキシシチジン生産能を有
する微生物を用いることに特徴があり、従来のバ
チルス属菌を用いる方法よりもこれら目的物を収
率よく得ることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス属に属し、シチジンデアミナーゼ活
   性を欠損し、ピリミジンアナログに、耐性を有
   し、シチジンおよび／またはデオキシシチジン生
   産能を有する微生物を培地に培養して、培養物中
   にシチジンおよび／またはデオキシシチジンを生
   成蓄積させ、シチジンおよび／またはデオキシシ
   チジンを採取することを特徴とするシチジンおよ
   び／またはデオキシシチジンの製造法。 ２ 微生物がシチジンデアミナーゼ活性を欠損
   し、ピリミジンアナログに、耐性を有するバチル
   ス・ズブチリスである特許請求の範囲第１項に記
   載の製造法。