JPH022598B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるＬ−ヒスチジンの製造法
に関する。更に詳しくは、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、RNAポリ
メラーゼ阻害剤の生育阻害に対して耐性を有する
かまたはアデニン要求性を有するＬ−ヒスチジン
生産菌を栄養培地に培養して培養液中にＬ−ヒス
チジンを蓄積せしめ、該培養液からＬ−ヒスチジ
ンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
ヒスチジンの製造法に関する。その目的とすると
ころは、食品、医薬品として有用なＬ−ヒスチジ
ンを工業的に安価に製造する方法を提供すること
にある。

従来、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属するヒスチジンアナログ耐性株が
著量のＬ−ヒスチジンを蓄積することはよく知ら
れており（西ドイツ特許出願公開第21019034号）、
またこのＬ−ヒスチジン生産菌にさらに別の性質
を付与することによつて菌のＬ−ヒスチジン生産
能を向上させる試みが行われている。例えば、プ
リンアナログ耐性またはピリミジンアナログ耐性
を付与する方法（特公昭52−18798）、アルギニン
要求性、メチオニン要求性、トリプトフアン要求
性、フエニルアラニン要求性、チロシン要求性、
ロイシン要求性、リジン要求性、あるいはウラシ
ル要求性を付与する方法（特開昭49−41592）、サ
ルフア剤耐性を付与する方法（特開昭50−
49490）、５−メチルトリプトフアン耐性、α−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、イミダゾール
耐性、あるいはアミノトリアゾール耐性を付与す
る方法（特開昭50−49491）、スレオニン要求性、
プロリン要求性、シキミ酸要求性、あるいはキサ
ンチンもしくはグアニン要求性を付与する方法
（特開昭50−69292）、コバラミン耐性を付与する
方法（特開昭50−70591）らがあげられる。

しかしながら、これらの方法ではまだその生成
収率も低く、安価なＬ−ヒスチジンの製造方法と
して満足すべきものではない。

本発明者らは、Ｌ−ヒスチジンの製造方法につ
いてさらに研究を進めた結果、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属し、RNA
ポリメラーゼ阻害剤の生育阻害に耐性の性質を有
するＬ−ヒスチジン生産菌またはアデニン要求性
の性質を有するＬ−ヒスチジン生産菌のＬ−ヒス
チジン生産能が、それらの性質を有しないそれぞ
れの親株のＬ−ヒスチジン生産能より著しく優れ
ていることを見い出し本発明を完成した。

RNAポリメラーゼ阻害剤の生育阻害剤耐性の
性質あるいはアデニン要求性の性質を有するＬ−
ヒスチジン生産菌のＬ−ヒスチジン生産性が優れ
ていることはこれまで全く知られておらず、本発
明はかかる新規な知見に基づいて完成されたもの
である。

次に本発明をさらに詳しく説明する。

本発明に使用する微生物は、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属するRNA
ポリメラーゼ阻害剤に耐性の性質を有しかつＬ−
ヒスチジン生産性を有する変異株、あるいはアデ
ニン要求性を有しかつＬ−ヒスチジン生産性を有
する変異株である。これらの変異株は元来Ｌ−ヒ
スチジン生産能を有する変異株（例えばヒスチジ
ンアナログ耐性株、サルフア剤耐性株）あるいは
その改良株を親株として、これにRNAポリメラ
ーゼ阻害剤（例えば、リフアマイシン、ストレプ
トバリシン、リフアンピシン、ストレプトリジギ
ン、アクチノマイシン、クロモマイシン、ドーノ
マイシン、アドリアマイシン、プルラマイシン、
カンカノマイシン、エキノマイシン、フオルマイ
シン等）の中から選ばれる少なくも１つの化合物
に耐性の性質を合わせて付与せしめるか、または
アデニン要求性の性質を合わせて付与せしめるこ
とによつて得ることができる。また、その逆の方
法すなわちRNAポリメラーゼ阻害剤に耐性の変
異株またはアデニン要求性の変異株に上記のヒス
チジン生産性に関わる性質を付与した変異株を誘
導して本発明に使用することも可能である。ま
た、本発明の使用菌としては、上記の性質の組合
わせに加えて他の性質（例えば各種栄養要求性、
薬剤耐性、薬剤感受性、薬剤依存性等）を合わせ
て持つ変異株も当然使用できる。

このようにして得られる菌株を培養して、Ｌ−
ヒスチジン生産能が各々の親株より顕著に向上し
た菌株を選択して本発明に使用する。

このような菌株を得る具体的な操作例をコリネ
バクテリウム属の変異株について説明すれば次の
とおりである。

操作例 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032をＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンを用いて常法どおり変異処理
し、さらに常法どおりＬ−ヒスチジンのアナログ
である２−チアゾールアラニン耐性株を分離し、
それらの培養試験を経てＬ−ヒスチジン生産菌例
えばATCC21607（２−チアゾールアラニン耐性
株）を得る。さらに、ATCC21607を親株として
その変異処理と、Ｌ−ヒスチジン生産試験を経
て、２−チアゾールアラニン耐性、６−メルカプ
トグアニン耐性、６−アザグアニン耐性、６−ア
ザウラシル耐性、６−メチルプリン耐性、５−メ
チルトリプトフアン耐性を順次付与したＬ−ヒス
チジン生産菌GAUPTr−113（微工研菌寄第1874
号）を得る（なお、本変異株の誘導方法の詳細に
ついては、特公昭52−18798に記載がある）。この
変異株の細胞懸濁液を、RNAポリメラーゼ阻害
剤であるリフアンピシン100μｇ／mlを含む寒天
培地（酵母エキス0.5ｇ／dl、肉エキス0.7ｇ／
dl、ペプトン１ｇ／dl、NaCl0.3ｇ／dl、PH7.0、
寒天２ｇ／dl）に平板当り10⁷個の細胞をまいて
30℃の温度条件下で２〜３日間培養して、生育し
てくるリフアンピシン耐性細胞の集落を50個釣菌
する。次に、実施例１に示すと同様の方法でＬ−
ヒスチジン生産試験を行い、同時に試験する親株
（GAUPTr−113）よりＬ−ヒスチジン生産能の
顕著に向上した変異株を分離する。かくして得ら
れる変異株の代表株を2R−18と命名した。

同様にしてブレビバクテリウム・スペシーズ
ATCC14902から誘導した２−フルオロヒスチジ
ン耐性のＬ−ヒスチジン生産菌Ｂ−39（微工研菌
寄第6228）よりリフアンピシン耐性変異株BR−
６を得た。

また常法によりGAUPTr−113株よりアデニン
要求性変異株HDA−５を得た。

上記コリネバクテリウム・グルタミクム2R−
18、コリネバクテリウム・グルタミクムHDA−
５およびブレビバクテリウム・スペシーズBR−
６は工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ
微工研条寄第240号、241号および242号として寄
託されている。

本発明に使用する培地としては、実施例に示す
如く炭素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必
要とする微量の栄養素を程よく含有するものであ
れば、天然培地または合成培地のいずれも使用可
能である。培地に使用する炭素源、窒素源は使用
菌株の利用可能なものであればいずれの種類を用
いてもよい。すなわち、炭素源としてはシユクロ
ース、フラクトース、グルコース、マルトース、
マンノース、殿粉、殿粉加水分解物、糖蜜等の炭
水化物；グリセリン、ソルビトール等の糖アルコ
ール；ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸等
の有機酸；エタノール、メタノール等の低級アル
コールなどが使用できる。これらの炭素源は単独
でもまた種々の量比に混合しても使用でき、また
全量を培地に添加する方法や分割して添加する方
法によつても使用できる。

窒素源としては、塩化アンモニウム、アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩
類、尿素、ならびにペプトン、肉エキス、コー
ン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、大
豆粕加水分解物等の天然物由来の窒素含有物等
種々のものが使用可能である。無機物質として
は、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウム等を利用
する。

使用菌がアミノ酸、核酸、ビタミン等の栄養物
質を要求する場合には、これらの物質を適量培地
に添加する必要がある。

培養温度は20〜40℃であり、振盪培養または通
気撹拌培養などの好気的条件下で１〜８日間培養
される。培養後、培養液よりＬ−ヒスチジンを採
取するには公知のイオン交換樹脂法などの方法が
用いられる。

以下に実施例を示す。

実施例 １ 種菌としてコリネバクテリウム・グルタミクム
2R−18を用いる。この菌株をグルコース４ｇ／
dl、ポリペプトン２ｇ／dl、KH₂PO₄0.15ｇ／
dl、K₂HPO₄0.05ｇ／dl、ＭｇSO₄・7H₂0.05ｇ／
dl、ビチオン50μｇ／、尿素0.3ｇ／dl、酵素エ
キス0.5ｇ／dl（PH7.2）の組成の培地で30℃で24
時間振盪培養した種培養１mlを20mlの下記の発酵
培地を含む250ml容三角フラスコに移して、30℃
で４日間振盪培養したときのＬ−ヒスチジンの生
成量は10.5mg／mlであつた。

発酵培地の組成は下記のとおり： 廃糖蜜（グルコース換算）７ｇ／dl、肉エキス
0.5ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄4ｇ／dl、KH₂PO₄0.15
ｇ／dl、K₂HPO₄0.05ｇ／dl、ＭｇSO₄・
7H₂O0.05ｇ／dl、尿素0.3ｇ／dl、CaCO₃3ｇ／
dl（PH7.4）。

対照として親株であるGAUPTr−113を同様に
培養した場合のＬ−ヒスチジンの蓄積量は8.9
mg／mlであつた。

実施例 ２ 種菌としてコリネバクテリウム・グルタミクム
HDA−５を用い、生産培地に150μｇ／mlのアデ
ニンを添加する他は実施例１と同様にＬ−ヒスチ
ジン生産試験を行なつた結果9.7mg／mlのＬ−ヒ
スチジンが蓄積した。

この場合対照として親株であるGAUPTr−113
を同様に培養した場合のＬ−ヒスチジン蓄積量は
8.7mg／mlであつた。

実施例 ３ 種菌として、ブレビバクテリウム・スペシーズ
BR−６を用いた他は実施例１と同様に実施した
結果4.3mg／mlのＬ−ヒスチジンが蓄積した。親
株であるＢ−39のＬ−ヒスチジン蓄積量は2.9
mg／mlであつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
   ウム属に属し、RNAポリメラーゼ阻害剤の生育
   阻害に対して耐性を有するかまたはアデニン要求
   性を有するＬ−ヒスチジン生産菌を栄養培地に培
   養して培養液中にＬ−ヒスチジンを蓄積せしめ、
   該培養液からＬ−ヒスチジンを採取することを特
   徴とする発酵法によるＬ−ヒスチジンの製造法。