JP3006907B2 - 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−アラニンの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、L-アラニンの製造法に
関する。L-アラニンは、生体を構成するアミノ酸であ
り、栄養輸液、医薬用、食品添加物等に広い用途があ
る。
関する。L-アラニンは、生体を構成するアミノ酸であ
り、栄養輸液、医薬用、食品添加物等に広い用途があ
る。
【０００２】
【従来の技術】従来より、L-アラニンの製造法として、
Ｌ−アスパラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法（特公
昭46-7560）、フマル酸をＬ−アスパラギン酸に導き、
これを酵素的に脱炭酸する方法（特開平2-268691）など
が知られ、実用に供されている。さらに、これらの方法
以外に、D-アラニン要求性の大腸菌による乳酸とアンモ
ニア供与体からのL-アラニン製造法（特開昭62-3619
6）、コリネバクテリウム・チュメセンスによる糖質か
らの発酵生産法（特公昭36-14298）など多くの方法が知
られている。
Ｌ−アスパラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法（特公
昭46-7560）、フマル酸をＬ−アスパラギン酸に導き、
これを酵素的に脱炭酸する方法（特開平2-268691）など
が知られ、実用に供されている。さらに、これらの方法
以外に、D-アラニン要求性の大腸菌による乳酸とアンモ
ニア供与体からのL-アラニン製造法（特開昭62-3619
6）、コリネバクテリウム・チュメセンスによる糖質か
らの発酵生産法（特公昭36-14298）など多くの方法が知
られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の発酵法によるL-
アラニンの製造法は、収率が低い、生産速度が遅く培養
に長時間を要する、培養液中での蓄積量が低い等の欠点
を有し、工業的な製造法として成立しがたい。またD,L-
アラニンの高収率発酵生産の報告もある（特公昭57-79
7）が、生成するアラニンがD,L-体のラセミ混合物であ
り、L-アラニンを得るにはD,L-体の光学分割工程を要す
るため、経済的に有利な製造法とは言い難い。
アラニンの製造法は、収率が低い、生産速度が遅く培養
に長時間を要する、培養液中での蓄積量が低い等の欠点
を有し、工業的な製造法として成立しがたい。またD,L-
アラニンの高収率発酵生産の報告もある（特公昭57-79
7）が、生成するアラニンがD,L-体のラセミ混合物であ
り、L-アラニンを得るにはD,L-体の光学分割工程を要す
るため、経済的に有利な製造法とは言い難い。
【０００４】本発明の目的は、近年需要の増大している
L-アラニンをより効率的に製造する方法を提供すること
である。
L-アラニンをより効率的に製造する方法を提供すること
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ミクロ
バクテリウム属に属し、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつL-アラニン生産性を有する微生
物を栄養培地中に培養し、該培養物中にL-アラニンを生
成蓄積させ、該培養物からL-アラニンを採取することを
特徴とするL-アラニンの製造法を提供することができ
る。
バクテリウム属に属し、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつL-アラニン生産性を有する微生
物を栄養培地中に培養し、該培養物中にL-アラニンを生
成蓄積させ、該培養物からL-アラニンを採取することを
特徴とするL-アラニンの製造法を提供することができ
る。
【０００６】本発明で用いられる微生物は、ミクロバク
テリウム属細菌に属し、、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつL-アラニン生産性を有する微生
物である。このような微生物は、ミクロバクテリウム属
細菌から変異により誘導することができるが、好適な親
株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフイルム
KY7929株（微工研菌寄2408号）があげられる。
テリウム属細菌に属し、、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつL-アラニン生産性を有する微生
物である。このような微生物は、ミクロバクテリウム属
細菌から変異により誘導することができるが、好適な親
株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフイルム
KY7929株（微工研菌寄2408号）があげられる。
【０００７】本発明におけるアラニンラセマーゼ活性が
低下、または欠失した変異株は、親株を紫外線照射やN-
メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（以下NTGと略
す）、亜硝酸などの化学処理など、通常用いられる変異
処理方法により処理した後、D-アラニンを含まない培地
で生育できない、もしくは親株に比べ生育が遅い菌株を
選択することで得ることができる。
低下、または欠失した変異株は、親株を紫外線照射やN-
メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（以下NTGと略
す）、亜硝酸などの化学処理など、通常用いられる変異
処理方法により処理した後、D-アラニンを含まない培地
で生育できない、もしくは親株に比べ生育が遅い菌株を
選択することで得ることができる。
【０００８】本発明の微生物によるL-アラニンの生産
は、通常の細菌培養法で実施可能である。使用培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物、適量のD-アラニンまた
はD,L-アラニンその他使用菌株の必要とする微量の栄養
素を程よく含有するものならば合成培地または天然培地
いずれも使用可能である。炭素源としてはグルコース、
グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルト
ース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの
炭水化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマール酸、
乳酸、などの各種有機酸が使用できる。さらに微生物の
資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用いら
れる。
は、通常の細菌培養法で実施可能である。使用培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物、適量のD-アラニンまた
はD,L-アラニンその他使用菌株の必要とする微量の栄養
素を程よく含有するものならば合成培地または天然培地
いずれも使用可能である。炭素源としてはグルコース、
グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルト
ース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの
炭水化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマール酸、
乳酸、などの各種有機酸が使用できる。さらに微生物の
資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用いら
れる。
【０００９】窒素源としてはアンモニアまたは塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機及び有機アンモニウム塩類
あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプト
ン、NZ-アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールまた
はその消化物などの種々のものが使用可能である。
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機及び有機アンモニウム塩類
あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプト
ン、NZ-アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールまた
はその消化物などの種々のものが使用可能である。
【００１０】さらに無機物としては、リン酸第一水素カ
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どを使用する。培養は振とう培養または通気培養などの
好気的条件下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が
好適である。培地のpHは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間である。
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どを使用する。培養は振とう培養または通気培養などの
好気的条件下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が
好適である。培地のpHは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間である。
【００１１】培養液からL-アラニンを採取する方法は、
培養終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭
処理あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法によ
って行われる。以下に実施例をあげて本発明を具体的に
説明する。
培養終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭
処理あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法によ
って行われる。以下に実施例をあげて本発明を具体的に
説明する。
【００１２】
【００１３】実施例１ ミクロバクテリウム・アンモニアフイルムKY7929株を完
全培地（粉末ブイヨン２０g、酵母エキス５gを水１リッ
トルに含み、pH7.2に調整した培地）で３０℃、１６時
間培養した菌体を集め、0.05Mトリス−マレイン酸緩衝
液（pH6.0）で洗浄後菌体の濃度が約１０9 細胞/mlにな
るように同緩衝液に懸濁し、これにNTGを終濃度が500mg
/lになるように加え、３０℃、２０分間保持して変異処
理を行った。この変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、そ
の菌体をD-アラニン0.05g/l含有する最少平板寒天培地
（第１表）に塗布した。
全培地（粉末ブイヨン２０g、酵母エキス５gを水１リッ
トルに含み、pH7.2に調整した培地）で３０℃、１６時
間培養した菌体を集め、0.05Mトリス−マレイン酸緩衝
液（pH6.0）で洗浄後菌体の濃度が約１０9 細胞/mlにな
るように同緩衝液に懸濁し、これにNTGを終濃度が500mg
/lになるように加え、３０℃、２０分間保持して変異処
理を行った。この変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、そ
の菌体をD-アラニン0.05g/l含有する最少平板寒天培地
（第１表）に塗布した。
【００１４】
【表１】
【００１５】３０℃で２〜４日間培養し、該平板培地に
生育するコロニーをD-アラニン0.０５ｇ／ｌ含有最少平
板寒天培地とD-アラニンを含まない最少平板寒天培地に
各々塗布し、前者プレート上では親株同様に生育し、後
者プレートでは生育しない、もしくは生育の遅い株を釣
菌した。このような変異株の中からアラニンラセマーゼ
活性低下、または欠失した株を選び、ミクロバクテリウ
ム・アンモニアフイルムDA1株と命名した。
生育するコロニーをD-アラニン0.０５ｇ／ｌ含有最少平
板寒天培地とD-アラニンを含まない最少平板寒天培地に
各々塗布し、前者プレート上では親株同様に生育し、後
者プレートでは生育しない、もしくは生育の遅い株を釣
菌した。このような変異株の中からアラニンラセマーゼ
活性低下、または欠失した株を選び、ミクロバクテリウ
ム・アンモニアフイルムDA1株と命名した。
【００１６】本菌株は、平成３年４月２４日付で工業技
術院微生物工業技術研究所（微工研）微工研条寄第３３
７５号（FERM BP-３３７５)として寄託されている。第
２表に、親株KY7929株と変異株DA1株のアラニンラセマ
ーゼ活性を示した。アラニンラセマーゼの活性測定は、
Wijsman,H.J.W.の方法〔ジェネティカル・リサーチ（Ge
net.Res.,Camb.）20、269-277 (1972)〕に従って行っ
た。
術院微生物工業技術研究所（微工研）微工研条寄第３３
７５号（FERM BP-３３７５)として寄託されている。第
２表に、親株KY7929株と変異株DA1株のアラニンラセマ
ーゼ活性を示した。アラニンラセマーゼの活性測定は、
Wijsman,H.J.W.の方法〔ジェネティカル・リサーチ（Ge
net.Res.,Camb.）20、269-277 (1972)〕に従って行っ
た。
【００１７】実施例２ 実施例１で取得した変異株DA1 株及びKY7929株を１０ml
の種培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス
１％、NaCl０.５％、D-アラニン200mg/l、pH7.2）を含
む試験管に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。
この種培養液１mlを下記の発酵培地２０mlを含む300ml
容三角フラスコに接種して、４８時間３０℃で振とう培
養した。培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して総アラニ
ン（D,L-Ala）量を測定した。D-アラニンは、市販のD-
アミノ酸オキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム山之
内（株）社製）を用いる方法およびダイセル化学工業
（株）社製クラウンパックカラムを用いる高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）で定量した。その結果を第２表
に示す。
の種培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス
１％、NaCl０.５％、D-アラニン200mg/l、pH7.2）を含
む試験管に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。
この種培養液１mlを下記の発酵培地２０mlを含む300ml
容三角フラスコに接種して、４８時間３０℃で振とう培
養した。培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して総アラニ
ン（D,L-Ala）量を測定した。D-アラニンは、市販のD-
アミノ酸オキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム山之
内（株）社製）を用いる方法およびダイセル化学工業
（株）社製クラウンパックカラムを用いる高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）で定量した。その結果を第２表
に示す。
【００１８】発酵培地組成 グルコース ８％ 硫酸アンモニウム ３％ リン酸１カリウム ０.１％ 硫酸マグネシウム ０.０５％ 硫酸マンガン ５ mg/l 硫酸亜鉛 １０mg/l ビオチン ３０μg/l D-アラニン ２００mg/l ｐＨ ７.２
【００１９】
【表２】
【００２０】実施例３ DA1 株を１０mlの種培地（グルコース２％、ペプトン１
％、酵母エキス１％、NaCl０.５％、D-アラニン200mg/
l、pH7.2）を含む試験管に接種し、３０℃で２４時間振
とう培養した。この種培養液５mlをグルコース４％、コ
ーンスチープリカー１％、ペプトン０.５％、硫酸アン
モニウム３％、燐酸１カリウム０.１％、硫酸マグネシ
ウム０.０５％、硫酸マンガン５mg/l、硫酸亜鉛１０mg/
l、ビオチン３０μg/l、D-アラニン200mg/l、炭酸カル
シウム２％、pH７.２よりなる培地250mlを含む２l容三
角フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養し
た。この培養物の全量を、グルコース５％、硫酸アンモ
ニウム３％、燐酸１カリウム０.０８％、硫酸マグネシ
ウム０.０７％、硫酸マンガン７.２mg/l、硫酸鉄７.２m
g/l、硫酸亜鉛１４.４mg/l、ビオチン３６μg/l、D-ア
ラニン１g/l、pH７.２よりなる培地１.８３lを入れ加熱
殺菌した５l容ジャーファーメンターに接種し、アンモ
ニアにてpH６.５に保ちつつ、３０℃で通気攪はん下培
養を行った。残グルコースが０.１％以下になった時点
より、別途に殺菌したグルコース溶液を連続的に添加
し、投入グルコース量が１４％になるまで培養した。培
養終了時の培養濾液中のL-アラニン、D-アラニン量は各
々75.6g/l、6.2g/l （L/D+L=92.4%）であり、投入グル
コースに対するL-アラニン収率は45.3%だった。
％、酵母エキス１％、NaCl０.５％、D-アラニン200mg/
l、pH7.2）を含む試験管に接種し、３０℃で２４時間振
とう培養した。この種培養液５mlをグルコース４％、コ
ーンスチープリカー１％、ペプトン０.５％、硫酸アン
モニウム３％、燐酸１カリウム０.１％、硫酸マグネシ
ウム０.０５％、硫酸マンガン５mg/l、硫酸亜鉛１０mg/
l、ビオチン３０μg/l、D-アラニン200mg/l、炭酸カル
シウム２％、pH７.２よりなる培地250mlを含む２l容三
角フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養し
た。この培養物の全量を、グルコース５％、硫酸アンモ
ニウム３％、燐酸１カリウム０.０８％、硫酸マグネシ
ウム０.０７％、硫酸マンガン７.２mg/l、硫酸鉄７.２m
g/l、硫酸亜鉛１４.４mg/l、ビオチン３６μg/l、D-ア
ラニン１g/l、pH７.２よりなる培地１.８３lを入れ加熱
殺菌した５l容ジャーファーメンターに接種し、アンモ
ニアにてpH６.５に保ちつつ、３０℃で通気攪はん下培
養を行った。残グルコースが０.１％以下になった時点
より、別途に殺菌したグルコース溶液を連続的に添加
し、投入グルコース量が１４％になるまで培養した。培
養終了時の培養濾液中のL-アラニン、D-アラニン量は各
々75.6g/l、6.2g/l （L/D+L=92.4%）であり、投入グル
コースに対するL-アラニン収率は45.3%だった。
【００２１】実施例４ 実施例３で得られた培養液１リットルから、遠心分離に
より菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。
この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳ
Ｋ−１Ｂ（Ｈ+型）を充填したカラムに通しL-アラニン
を吸着させ、水洗後２Ｎアンモニア水で溶出し、L-アラ
ニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノールを加
え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノールに
より再結晶することにより、L-アラニンの結晶55.7gを
得た。
より菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。
この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳ
Ｋ−１Ｂ（Ｈ+型）を充填したカラムに通しL-アラニン
を吸着させ、水洗後２Ｎアンモニア水で溶出し、L-アラ
ニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノールを加
え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノールに
より再結晶することにより、L-アラニンの結晶55.7gを
得た。
Claims (1)
- 【請求項１】 ミクロバクテリウム属に属し、アラニン
ラセマーゼ活性が低下、または欠失し、かつL-アラニン
生産性を有する微生物を栄養培地中に培養し、該培養物
中にL-アラニンを生成蓄積させ、該培養物からL-アラニ
ンを採取することを特徴とするL-アラニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9852191A JP3006907B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9852191A JP3006907B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330291A JPH04330291A (ja) | 1992-11-18 |
| JP3006907B2 true JP3006907B2 (ja) | 2000-02-07 |
Family
ID=14221965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9852191A Expired - Lifetime JP3006907B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3006907B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5478733A (en) * | 1993-07-16 | 1995-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter |
| CN110982857A (zh) * | 2019-09-23 | 2020-04-10 | 安徽丰原生物化学股份有限公司 | 一种l-丙氨酸的发酵生产方法 |
-
1991
- 1991-04-30 JP JP9852191A patent/JP3006907B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04330291A (ja) | 1992-11-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19991110 |