JPH04330291A - 発酵法によるl−アラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−アラニンの製造法Info
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(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、L−アラニンの製造法
に関する。L−アラニンは、生体を構成するアミノ酸で
あり、栄養輸液、医薬用、食品添加物等に広い用途があ
る。
に関する。L−アラニンは、生体を構成するアミノ酸で
あり、栄養輸液、医薬用、食品添加物等に広い用途があ
る。
【0002】
【従来の技術】従来より、L−アラニンの製造法として
、L−アスパラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法(特
公昭46−7560)、フマル酸をL−アスパラギン酸
に導き、これを酵素的に脱炭酸する方法(特開平2−2
68691)などが知られ、実用に供されている。さら
に、これらの方法以外に、D−アラニン要求性の大腸菌
による乳酸とアンモニア供与体からのL−アラニン製造
法(特開昭62−36196)、コリネバクテリウム・
チュメセンスによる糖質からの発酵生産法(特公昭36
−14298)など多くの方法が知られている。
、L−アスパラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法(特
公昭46−7560)、フマル酸をL−アスパラギン酸
に導き、これを酵素的に脱炭酸する方法(特開平2−2
68691)などが知られ、実用に供されている。さら
に、これらの方法以外に、D−アラニン要求性の大腸菌
による乳酸とアンモニア供与体からのL−アラニン製造
法(特開昭62−36196)、コリネバクテリウム・
チュメセンスによる糖質からの発酵生産法(特公昭36
−14298)など多くの方法が知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】従来の発酵法によるL
−アラニンの製造法は、収率が低い、生産速度が遅く培
養に長時間を要する、培養液中での蓄積量が低い等の欠
点を有し、工業的な製造法として成立しがたい。またD
,L−アラニンの高収率発酵生産の報告もある(特公昭
57−797)が、生成するアラニンがD,L−体のラ
セミ混合物であり、L−アラニンを得るにはD,L−体
の光学分割工程を要するため、経済的に有利な製造法と
は言い難い。
−アラニンの製造法は、収率が低い、生産速度が遅く培
養に長時間を要する、培養液中での蓄積量が低い等の欠
点を有し、工業的な製造法として成立しがたい。またD
,L−アラニンの高収率発酵生産の報告もある(特公昭
57−797)が、生成するアラニンがD,L−体のラ
セミ混合物であり、L−アラニンを得るにはD,L−体
の光学分割工程を要するため、経済的に有利な製造法と
は言い難い。
【0004】本発明の目的は、近年需要の増大している
L−アラニンをより効率的に製造する方法を提供するこ
とである。
L−アラニンをより効率的に製造する方法を提供するこ
とである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ミクロ
バクテリウム属に属し、アラニンラセマーゼ活性が低下
、または欠失し、かつL−アラニン生産性を有する微生
物を栄養培地中に培養し、該培養物中にL−アラニンを
生成蓄積させ、該培養物からL−アラニンを採取するこ
とを特徴とするL−アラニンの製造法を提供することが
できる。
バクテリウム属に属し、アラニンラセマーゼ活性が低下
、または欠失し、かつL−アラニン生産性を有する微生
物を栄養培地中に培養し、該培養物中にL−アラニンを
生成蓄積させ、該培養物からL−アラニンを採取するこ
とを特徴とするL−アラニンの製造法を提供することが
できる。
【0006】本発明で用いられる微生物は、ミクロバク
テリウム属細菌に属し、、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつL−アラニン生産性を有する微
生物である。このような微生物は、ミクロバクテリウム
属細菌から変異により誘導することができるが、好適な
親株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフイル
ムKY7929株(微工研菌寄2408号)があげられ
る。
テリウム属細菌に属し、、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつL−アラニン生産性を有する微
生物である。このような微生物は、ミクロバクテリウム
属細菌から変異により誘導することができるが、好適な
親株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフイル
ムKY7929株(微工研菌寄2408号)があげられ
る。
【0007】本発明におけるアラニンラセマーゼ活性が
低下、または欠失した変異株は、親株を紫外線照射やN
−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以
下NTGと略す)、亜硝酸などの化学処理など、通常用
いられる変異処理方法により処理した後、D−アラニン
を含まない培地で生育できない、もしくは親株に比べ生
育が遅い菌株を選択することで得ることができる。
低下、または欠失した変異株は、親株を紫外線照射やN
−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以
下NTGと略す)、亜硝酸などの化学処理など、通常用
いられる変異処理方法により処理した後、D−アラニン
を含まない培地で生育できない、もしくは親株に比べ生
育が遅い菌株を選択することで得ることができる。
【0008】本発明の微生物によるL−アラニンの生産
は、通常の細菌培養法で実施可能である。使用培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物、適量のD−アラニンま
たはD,L−アラニンその他使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有するものならば合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。炭素源としてはグルコ
ース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、
マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などの炭水化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマー
ル酸、乳酸、などの各種有機酸が使用できる。さらに微
生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども
用いられる。
は、通常の細菌培養法で実施可能である。使用培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物、適量のD−アラニンま
たはD,L−アラニンその他使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有するものならば合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。炭素源としてはグルコ
ース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、
マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などの炭水化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマー
ル酸、乳酸、などの各種有機酸が使用できる。さらに微
生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども
用いられる。
【0009】窒素源としてはアンモニアまたは塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機及び有機アンモニウム塩類
あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン
、NZ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールまた
はその消化物などの種々のものが使用可能である。
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機及び有機アンモニウム塩類
あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン
、NZ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールまた
はその消化物などの種々のものが使用可能である。
【0010】さらに無機物としては、リン酸第一水素カ
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。培養は振とう培養または通気培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好
適である。培地のpHは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常1〜5日間である。
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。培養は振とう培養または通気培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好
適である。培地のpHは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常1〜5日間である。
【0011】培養液からL−アラニンを採取する方法は
、培養終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性
炭処理あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法に
よって行われる。以下に実施例をあげて本発明を具体的
に説明する。
、培養終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性
炭処理あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法に
よって行われる。以下に実施例をあげて本発明を具体的
に説明する。
【0012】
【0013】実施例1
ミクロバクテリウム・アンモニアフイルムKY7929
株を完全培地(粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを
水1リットルに含み、pH7.2に調整した培地)で3
0℃、16時間培養した菌体を集め、0.05Mトリス
−マレイン酸緩衝液(pH6.0)で洗浄後菌体の濃度
が約109 細胞/mlになるように同緩衝液に懸濁し
、これにNTGを終濃度が500mg/lになるように
加え、30℃、20分間保持して変異処理を行った。こ
の変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、その菌体をD−ア
ラニン0.05g/l含有する最少平板寒天培地(第1
表)に塗布した。
株を完全培地(粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを
水1リットルに含み、pH7.2に調整した培地)で3
0℃、16時間培養した菌体を集め、0.05Mトリス
−マレイン酸緩衝液(pH6.0)で洗浄後菌体の濃度
が約109 細胞/mlになるように同緩衝液に懸濁し
、これにNTGを終濃度が500mg/lになるように
加え、30℃、20分間保持して変異処理を行った。こ
の変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、その菌体をD−ア
ラニン0.05g/l含有する最少平板寒天培地(第1
表)に塗布した。
【0014】
【表1】
【0015】30℃で2〜4日間培養し、該平板培地に
生育するコロニーをD−アラニン0.05g/l含有最
少平板寒天培地とD−アラニンを含まない最少平板寒天
培地に各々塗布し、前者プレート上では親株同様に生育
し、後者プレートでは生育しない、もしくは生育の遅い
株を釣菌した。このような変異株の中からアラニンラセ
マーゼ活性低下、または欠失した株を選び、ミクロバク
テリウム・アンモニアフイルムDA1株と命名した。
生育するコロニーをD−アラニン0.05g/l含有最
少平板寒天培地とD−アラニンを含まない最少平板寒天
培地に各々塗布し、前者プレート上では親株同様に生育
し、後者プレートでは生育しない、もしくは生育の遅い
株を釣菌した。このような変異株の中からアラニンラセ
マーゼ活性低下、または欠失した株を選び、ミクロバク
テリウム・アンモニアフイルムDA1株と命名した。
【0016】本菌株は、平成3年4月24日付で工業技
術院微生物工業技術研究所(微工研)微工研条寄第33
75号(FERM BP−3375)として寄託されて
いる。第2表に、親株KY7929株と変異株DA1株
のアラニンラセマーゼ活性を示した。アラニンラセマー
ゼの活性測定は、Wijsman,H.J.W.の方法
〔ジェネティカル・リサーチ(Genet.Res.,
Camb.)20、269−277 (1972)〕に
従って行った。
術院微生物工業技術研究所(微工研)微工研条寄第33
75号(FERM BP−3375)として寄託されて
いる。第2表に、親株KY7929株と変異株DA1株
のアラニンラセマーゼ活性を示した。アラニンラセマー
ゼの活性測定は、Wijsman,H.J.W.の方法
〔ジェネティカル・リサーチ(Genet.Res.,
Camb.)20、269−277 (1972)〕に
従って行った。
【0017】実施例2
実施例1で取得した変異株DA1 株及びKY7929
株を10mlの種培地(グルコース2%、ペプトン1%
、酵母エキス1%、NaCl0.5%、D−アラニン2
00mg/l、pH7.2)を含む試験管に接種し、3
0℃で24時間振とう培養した。 この種培養液1mlを下記の発酵培地20mlを含む3
00ml容三角フラスコに接種して、48時間30℃で
振とう培養した。培養後、培養濾液をペーパークロマト
グラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して
総アラニン(D,L−Ala)量を測定した。D−アラ
ニンは、市販のD−アミノ酸オキシダーゼ(ベーリンガ
ー・マンハイム山之内(株)社製)を用いる方法および
ダイセル化学工業(株)社製クラウンパックカラムを用
いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で定量し
た。その結果を第2表に示す。
株を10mlの種培地(グルコース2%、ペプトン1%
、酵母エキス1%、NaCl0.5%、D−アラニン2
00mg/l、pH7.2)を含む試験管に接種し、3
0℃で24時間振とう培養した。 この種培養液1mlを下記の発酵培地20mlを含む3
00ml容三角フラスコに接種して、48時間30℃で
振とう培養した。培養後、培養濾液をペーパークロマト
グラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して
総アラニン(D,L−Ala)量を測定した。D−アラ
ニンは、市販のD−アミノ酸オキシダーゼ(ベーリンガ
ー・マンハイム山之内(株)社製)を用いる方法および
ダイセル化学工業(株)社製クラウンパックカラムを用
いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で定量し
た。その結果を第2表に示す。
【0018】発酵培地組成
グルコース 8%硫酸アン
モニウム 3%リン酸1カリウム
0.1% 硫酸マグネシウム 0.05% 硫酸マンガン 5 mg/l硫酸亜鉛
10mg/lビオチン
30μg/lD−アラニン
200mg/lpH 7.2
モニウム 3%リン酸1カリウム
0.1% 硫酸マグネシウム 0.05% 硫酸マンガン 5 mg/l硫酸亜鉛
10mg/lビオチン
30μg/lD−アラニン
200mg/lpH 7.2
【0019】
【表2】
【0020】実施例3
DA1 株を10mlの種培地(グルコース2%、ペプ
トン1%、酵母エキス1%、NaCl0.5%、D−ア
ラニン200mg/l、pH7.2)を含む試験管に接
種し、30℃で24時間振とう培養した。この種培養液
5mlをグルコース4%、コーンスチープリカー1%、
ペプトン0.5%、硫酸アンモニウム3%、燐酸1カリ
ウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%、硫酸マン
ガン5mg/l、硫酸亜鉛10mg/l、ビオチン30
μg/l、D−アラニン200mg/l、炭酸カルシウ
ム2%、pH7.2よりなる培地250mlを含む2l
容三角フラスコに接種し、30℃で24時間振とう培養
した。この培養物の全量を、グルコース5%、硫酸アン
モニウム3%、燐酸1カリウム0.08%、硫酸マグネ
シウム0.07%、硫酸マンガン7.2mg/l、硫酸
鉄7.2mg/l、硫酸亜鉛14.4mg/l、ビオチ
ン36μg/l、D−アラニン1g/l、pH7.2よ
りなる培地1.83lを入れ加熱殺菌した5l容ジャー
ファーメンターに接種し、アンモニアにてpH6.5に
保ちつつ、30℃で通気攪はん下培養を行った。残グル
コースが0.1%以下になった時点より、別途に殺菌し
たグルコース溶液を連続的に添加し、投入グルコース量
が14%になるまで培養した。培養終了時の培養濾液中
のL−アラニン、D−アラニン量は各々75.6g/l
、6.2g/l (L/D+L=92.4%)であり、
投入グルコースに対するL−アラニン収率は45.3%
だった。
トン1%、酵母エキス1%、NaCl0.5%、D−ア
ラニン200mg/l、pH7.2)を含む試験管に接
種し、30℃で24時間振とう培養した。この種培養液
5mlをグルコース4%、コーンスチープリカー1%、
ペプトン0.5%、硫酸アンモニウム3%、燐酸1カリ
ウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%、硫酸マン
ガン5mg/l、硫酸亜鉛10mg/l、ビオチン30
μg/l、D−アラニン200mg/l、炭酸カルシウ
ム2%、pH7.2よりなる培地250mlを含む2l
容三角フラスコに接種し、30℃で24時間振とう培養
した。この培養物の全量を、グルコース5%、硫酸アン
モニウム3%、燐酸1カリウム0.08%、硫酸マグネ
シウム0.07%、硫酸マンガン7.2mg/l、硫酸
鉄7.2mg/l、硫酸亜鉛14.4mg/l、ビオチ
ン36μg/l、D−アラニン1g/l、pH7.2よ
りなる培地1.83lを入れ加熱殺菌した5l容ジャー
ファーメンターに接種し、アンモニアにてpH6.5に
保ちつつ、30℃で通気攪はん下培養を行った。残グル
コースが0.1%以下になった時点より、別途に殺菌し
たグルコース溶液を連続的に添加し、投入グルコース量
が14%になるまで培養した。培養終了時の培養濾液中
のL−アラニン、D−アラニン量は各々75.6g/l
、6.2g/l (L/D+L=92.4%)であり、
投入グルコースに対するL−アラニン収率は45.3%
だった。
【0021】実施例4
実施例3で得られた培養液1リットルから、遠心分離に
より菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。 この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンS
K−1B(H+型)を充填したカラムに通しL−アラニ
ンを吸着させ、水洗後2Nアンモニア水で溶出し、L−
アラニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノール
を加え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノー
ルにより再結晶することにより、L−アラニンの結晶5
5.7gを得た。
より菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。 この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンS
K−1B(H+型)を充填したカラムに通しL−アラニ
ンを吸着させ、水洗後2Nアンモニア水で溶出し、L−
アラニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノール
を加え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノー
ルにより再結晶することにより、L−アラニンの結晶5
5.7gを得た。
Claims (1)
- 【請求項1】 ミクロバクテリウム属に属し、アラニ
ンラセマーゼ活性が低下、または欠失し、かつL−アラ
ニン生産性を有する微生物を栄養培地中に培養し、該培
養物中にL−アラニンを生成蓄積させ、該培養物からL
−アラニンを採取することを特徴とするL−アラニンの
製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9852191A JP3006907B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | 発酵法によるl−アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9852191A JP3006907B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | 発酵法によるl−アラニンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04330291A true JPH04330291A (ja) | 1992-11-18 |
JP3006907B2 JP3006907B2 (ja) | 2000-02-07 |
Family
ID=14221965
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9852191A Expired - Lifetime JP3006907B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | 発酵法によるl−アラニンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3006907B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5478733A (en) * | 1993-07-16 | 1995-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter |
CN110982857A (zh) * | 2019-09-23 | 2020-04-10 | 安徽丰原生物化学股份有限公司 | 一种l-丙氨酸的发酵生产方法 |
-
1991
- 1991-04-30 JP JP9852191A patent/JP3006907B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5478733A (en) * | 1993-07-16 | 1995-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter |
CN110982857A (zh) * | 2019-09-23 | 2020-04-10 | 安徽丰原生物化学股份有限公司 | 一种l-丙氨酸的发酵生产方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3006907B2 (ja) | 2000-02-07 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19991110 |