JPH04330291A

JPH04330291A - 発酵法によるｌ−アラニンの製造法

Info

Publication number: JPH04330291A
Application number: JP9852191A
Authority: JP
Inventors: Ryoichi Katsumata; 勝亦　瞭一; Shinichi Hashimoto; 信一橋本
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1991-04-30
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 1992-11-18
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: JP3006907B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−アラニンの製造法
に関する。Ｌ−アラニンは、生体を構成するアミノ酸で
あり、栄養輸液、医薬用、食品添加物等に広い用途があ
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より、Ｌ−アラニンの製造法として
、Ｌ−アスパラギン酸より酵素的に脱炭酸する方法（特
公昭４６−７５６０）、フマル酸をＬ−アスパラギン酸
に導き、これを酵素的に脱炭酸する方法（特開平２−２
６８６９１）などが知られ、実用に供されている。さら
に、これらの方法以外に、Ｄ−アラニン要求性の大腸菌
による乳酸とアンモニア供与体からのＬ−アラニン製造
法（特開昭６２−３６１９６）、コリネバクテリウム・
チュメセンスによる糖質からの発酵生産法（特公昭３６
−１４２９８）など多くの方法が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の発酵法によるＬ
−アラニンの製造法は、収率が低い、生産速度が遅く培
養に長時間を要する、培養液中での蓄積量が低い等の欠
点を有し、工業的な製造法として成立しがたい。またＤ
，Ｌ−アラニンの高収率発酵生産の報告もある（特公昭
５７−７９７）が、生成するアラニンがＤ，Ｌ−体のラ
セミ混合物であり、Ｌ−アラニンを得るにはＤ，Ｌ−体
の光学分割工程を要するため、経済的に有利な製造法と
は言い難い。

【０００４】本発明の目的は、近年需要の増大している
Ｌ−アラニンをより効率的に製造する方法を提供するこ
とである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ミクロ
バクテリウム属に属し、アラニンラセマーゼ活性が低下
、または欠失し、かつＬ−アラニン生産性を有する微生
物を栄養培地中に培養し、該培養物中にＬ−アラニンを
生成蓄積させ、該培養物からＬ−アラニンを採取するこ
とを特徴とするＬ−アラニンの製造法を提供することが
できる。

【０００６】本発明で用いられる微生物は、ミクロバク
テリウム属細菌に属し、、アラニンラセマーゼ活性が低
下、または欠失し、かつＬ−アラニン生産性を有する微
生物である。このような微生物は、ミクロバクテリウム
属細菌から変異により誘導することができるが、好適な
親株としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフイル
ムＫＹ７９２９株（微工研菌寄２４０８号）があげられ
る。

【０００７】本発明におけるアラニンラセマーゼ活性が
低下、または欠失した変異株は、親株を紫外線照射やＮ
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以
下ＮＴＧと略す）、亜硝酸などの化学処理など、通常用
いられる変異処理方法により処理した後、Ｄ−アラニン
を含まない培地で生育できない、もしくは親株に比べ生
育が遅い菌株を選択することで得ることができる。

【０００８】本発明の微生物によるＬ−アラニンの生産
は、通常の細菌培養法で実施可能である。使用培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物、適量のＤ−アラニンま
たはＤ，Ｌ−アラニンその他使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有するものならば合成培地または天
然培地いずれも使用可能である。炭素源としてはグルコ
ース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、
マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などの炭水化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマー
ル酸、乳酸、などの各種有機酸が使用できる。さらに微
生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども
用いられる。

【０００９】窒素源としてはアンモニアまたは塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機及び有機アンモニウム塩類
あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン
、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールまた
はその消化物などの種々のものが使用可能である。

【００１０】さらに無機物としては、リン酸第一水素カ
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。培養は振とう培養または通気培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好
適である。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間である。

【００１１】培養液からＬ−アラニンを採取する方法は
、培養終了後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性
炭処理あるいはイオン交換樹脂処理などの公知の方法に
よって行われる。以下に実施例をあげて本発明を具体的
に説明する。

【００１２】

【実施例】

【００１３】実施例１ミクロバクテリウム・アンモニアフイルムＫＹ７９２９
株を完全培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを
水１リットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地）で３
０℃、１６時間培養した菌体を集め、０．０５Ｍトリス
−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後菌体の濃度
が約１０９　細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁し
、これにＮＴＧを終濃度が５００ｍｇ／ｌになるように
加え、３０℃、２０分間保持して変異処理を行った。こ
の変異処理菌体を同緩衝液で洗浄後、その菌体をＤ−ア
ラニン０．０５ｇ／ｌ含有する最少平板寒天培地（第１
表）に塗布した。

【００１４】

【表１】

【００１５】３０℃で２〜４日間培養し、該平板培地に
生育するコロニーをＤ−アラニン０．０５ｇ／ｌ含有最
少平板寒天培地とＤ−アラニンを含まない最少平板寒天
培地に各々塗布し、前者プレート上では親株同様に生育
し、後者プレートでは生育しない、もしくは生育の遅い
株を釣菌した。このような変異株の中からアラニンラセ
マーゼ活性低下、または欠失した株を選び、ミクロバク
テリウム・アンモニアフイルムＤＡ１株と命名した。

【００１６】本菌株は、平成３年４月２４日付で工業技
術院微生物工業技術研究所（微工研）微工研条寄第３３
７５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３３７５）として寄託されて
いる。第２表に、親株ＫＹ７９２９株と変異株ＤＡ１株
のアラニンラセマーゼ活性を示した。アラニンラセマー
ゼの活性測定は、Ｗｉｊｓｍａｎ，Ｈ．Ｊ．Ｗ．の方法
〔ジェネティカル・リサーチ（Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．，
Ｃａｍｂ．）２０、２６９−２７７　（１９７２）〕に
従って行った。

【００１７】実施例２実施例１で取得した変異株ＤＡ１　株及びＫＹ７９２９
株を１０ｍｌの種培地（グルコース２％、ペプトン１％
、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０．５％、Ｄ−アラニン２
００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２）を含む試験管に接種し、３
０℃で２４時間振とう培養した。この種培養液１ｍｌを下記の発酵培地２０ｍｌを含む３
００ｍｌ容三角フラスコに接種して、４８時間３０℃で
振とう培養した。培養後、培養濾液をペーパークロマト
グラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して
総アラニン（Ｄ，Ｌ−Ａｌａ）量を測定した。Ｄ−アラ
ニンは、市販のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム山之内（株）社製）を用いる方法および
ダイセル化学工業（株）社製クラウンパックカラムを用
いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量し
た。その結果を第２表に示す。

【００１８】発酵培地組成グルコース　　　　　　　　　　　　　　８％硫酸アン
モニウム　　　　　　　　３％リン酸１カリウム　　　
　　０．１％硫酸マグネシウム　　　０．０５％硫酸マンガン　　　　　　　　　５　ｍｇ／ｌ硫酸亜鉛
　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ／ｌビオチン　　　
　　　　　　　　３０μｇ／ｌＤ−アラニン　　　　　
　　　２００ｍｇ／ｌｐＨ　　７．２

【００１９】

【表２】

【００２０】実施例３ＤＡ１　株を１０ｍｌの種培地（グルコース２％、ペプ
トン１％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０．５％、Ｄ−ア
ラニン２００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２）を含む試験管に接
種し、３０℃で２４時間振とう培養した。この種培養液
５ｍｌをグルコース４％、コーンスチープリカー１％、
ペプトン０．５％、硫酸アンモニウム３％、燐酸１カリ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸マン
ガン５ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／ｌ、ビオチン３０
μｇ／ｌ、Ｄ−アラニン２００ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウ
ム２％、ｐＨ７．２よりなる培地２５０ｍｌを含む２ｌ
容三角フラスコに接種し、３０℃で２４時間振とう培養
した。この培養物の全量を、グルコース５％、硫酸アン
モニウム３％、燐酸１カリウム０．０８％、硫酸マグネ
シウム０．０７％、硫酸マンガン７．２ｍｇ／ｌ、硫酸
鉄７．２ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１４．４ｍｇ／ｌ、ビオチ
ン３６μｇ／ｌ、Ｄ−アラニン１ｇ／ｌ、ｐＨ７．２よ
りなる培地１．８３ｌを入れ加熱殺菌した５ｌ容ジャー
ファーメンターに接種し、アンモニアにてｐＨ６．５に
保ちつつ、３０℃で通気攪はん下培養を行った。残グル
コースが０．１％以下になった時点より、別途に殺菌し
たグルコース溶液を連続的に添加し、投入グルコース量
が１４％になるまで培養した。培養終了時の培養濾液中
のＬ−アラニン、Ｄ−アラニン量は各々７５．６ｇ／ｌ
、６．２ｇ／ｌ　（Ｌ／Ｄ＋Ｌ＝９２．４％）であり、
投入グルコースに対するＬ−アラニン収率は４５．３％
だった。

【００２１】実施例４実施例３で得られた培養液１リットルから、遠心分離に
より菌体を除去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。この脱色炭処理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳ
Ｋ−１Ｂ（Ｈ＋型）を充填したカラムに通しＬ−アラニ
ンを吸着させ、水洗後２Ｎアンモニア水で溶出し、Ｌ−
アラニン分画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノール
を加え、析出する結晶を採取した。この結晶をエタノー
ルにより再結晶することにより、Ｌ−アラニンの結晶５
５．７ｇを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ミクロバクテリウム属に属し、アラニ
ンラセマーゼ活性が低下、または欠失し、かつＬ−アラ
ニン生産性を有する微生物を栄養培地中に培養し、該培
養物中にＬ−アラニンを生成蓄積させ、該培養物からＬ
−アラニンを採取することを特徴とするＬ−アラニンの
製造法。