KR0146493B1 - 발효법에 의한 l-알라닌의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

아쓰로박터 (Arthrobacter) 속에 속하고, L - 알라닌 디히드로게나아제 활성은 가지지만, 알라닌 라세미아제 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않으며, L-알라닌 생산성을 갖는 미생물을 배지에 배양하고, 이 배양물증에 L - 알라닌을 생성 축적시켜, 이 배양물로부터 L - 알라닌을 채취하는 것을 특징으로하는 L - 알라닌의 제조 방법.

Description

[발명의 명칭]

발효법에 의한 L - 알라닌의 제조 방법

[기술분야]

본 발명은 생체를 구성하는 아미노산 이며, 영양수액, 의약, 식품첨가물등 으로서 유용한 L - 알라닌의 제조 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

종래부터, L - 알라닌의 제조 방법으로서, L - 아스파르트산을 효소적으로 탈탄산하는 방법 (일본국 특공소 46 - 7560), 푸마르산을 L - 아스파르트산으로 유도하여, 이것을 효소적으로 탈탄산하는 방법 (특개평 2 - 268691) 등이 사용 되어 왔다. 또 이들 방법 이외에 D - 알라닌 요구성의 대장균에 의한 젖산과 암모니아공여체로 부터의 L - 알라닌 제조 방법 (특개소 62-36196), 코리네박테륨 튜메센스에 의한 탄수화물로 부터의 발효생산 방법 (특공소 36 - 14298) 등의 방법이 알려져 있다.

종래의 발효법에 의한 L - 알라닌의 제조 방법은 배양액 증에서의 축적량이 낮고, 수율이 낮고, 생산속도가 느리며, 배양에 긴 시간을 요하는등의 결점이 있어, 공업적인 제조 방법으로서는 실용성이 부족하다. 또한, D,L - 알라닌을 고수율로 발효생산한다는 보고도 있으나 (특공소 57 - 797), 생성되는 알라닌이 D,L - 체의 라세미 혼합물이기 때문에, L - 알라닌을 얻는데는 D,L - 체의 광학분할공정을 필요로하기 때문에, 공업적으로 유리한 제조 방법 이라고는 말하기 어렵다.

[발명의 개시]

본 발병에 의하여 아쓰로박터 (Arthrobacter) 속에 속하고, L - 알라닌 디히드로게나아제 활성을 가지며, 알라닌 라세마아제 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않으며, 또한 L - 알라닌 생산성을 갖는 미생물을 영양배지중에서 배양하고, 이 배양물중에 L - 알라닌을 생성 축적시켜, 이 배양물로부터 L - 알라닌을 채취하는 것을 특징으로 하는 L - 알라닌의 제조 방법을 제공한다.

이하에 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 아쓰로박터속에 속하고, L - 알라닌 디히드로게나아제 활성을 가지며, 알라닌 라세마아제 활성을 거의 또는 전혀 가지지 않으며, 또한 L - 알라닌 생산성을 갖는 미생물이면 어떤것이라도 좋다. 이와같은 미생물은 아쓰로박터 속에 속하고, L - 알라닌 디히드로게나아제 활성을 가지며, L - 알라닌 생산성을가진 미생물을 모주로 하여 유도할수가 있다. 본 발명에서 사용되는 미생물의 모주로서, 예를들면 아쓰로박터 에스피 (Arthrobacter sp.) HAP1 (미공연조기 제3644호), 아쓰로박터·우레아파시엔스 (Arthrobacter ureafaciens) ATCC 7562, 아쓰로박터·히스티디놀로보란스(Arthrobacter histidinolovorans) ATCC 11442 등을 들수 있다.

아쓰로박터·에스피 HAP1 (미공연조기 제3644호) 주는 본 발명자들에 의해서 마찌다시의 토양으로부터 새로이 분리된 균주로서, 그의 균학적 성질을 이하에 상술한다.

(a) 형태

1. 세포의 형상 및 크기 ; 간상 또는 구상이며 다형체를 취한다.

(직경 1.0∼2.0㎛, 길이 1.0∼4.0㎛혹은 그 이상)

2. 운동성 ; 없음

3. 포자 ; 형성하지 않는다.

4. 그램 염색성 ; 양성

5. 항산성 ; 거의 인정되지 않는다.

(b) 각 배지에 있어서의 생육상태

1. 육즙 한천 평판배양 ; 아이보리색의 매끄러운 집락을 형성한다. 확산성 색소는 생성되지 않는다.

2. 육즙 한천 사면배양 ; 충분히 생육한다.

3. 육즙 액체배양 ; 혼탁상으로 생육한다. 표면생육은 하지 않는다.

4. 육즙 젤라틴 천자배양 (stab culture) ; 생육한다. 젤라틴을 액화하지 않는다.

5. 리트머스 밀크 ; 리트머스를 환원시킨다. 밀크를 액화한다.

(c) 생리적 성질

1. 질산염의 환원 ; 양성

2. 탈질반응 (Denitrification reaction) ; 음성

3. MR 시험 ; 음성

4. VP 시험 ; 음성

5. 인돌의 생성 ; 음성

6. 황화수소의 생성 ; 음성

7. 전분의 가수분해 ; 양성

8. 시트르산의 이용 ; (Koser) 양성

(Christensen) 양성

9. 무기질소의 이용 ; 질산염 (양성)

암모늄염(양성)

10. 색소의 생성 ; 음성

11. 우레아제 ; 양성

12. 옥시다아제 ; 음성

13. 카탈라아제 ; 양성

14. 생육의 범위 (1)pH ; pH 5.1∼pH 10.0

(2)온도 ; 7℃∼38℃

15. 산소에대한 태도 ; 호기성

16. 0 - F 시험 : 산화

17. 당류로부터의 산 및 가스의 생성

(d) 기타의 성질

1. 탄소화합물의 자화능

자화능성 : p - 히드록시벤조에이트, 글리옥실산, L - 아스파라긴, L - 아르기닌, L - 히스티딘, D - 크실로오스, D - 리보오스, D - 갈락토오스, L - 람노오스, 글리세롤

비자화능성 : D - 아라비노오스

2. 세포벽의 아미노산조성 : 리신, 알라닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 세린, 글리신,

3. 주된퀴논 : 1 포화형 메나퀴논 - 9 [MK - 9(H)]

이상의 균학적성질을 갖는 균주에 관하여, 버제이의 매뉴얼 오브 시스테마틱 박테리올로지 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) 의 기재와 대조한 결과, 그램양성이며, 간상 혹은 구상의 다형성의 형태를 취하기 때문에, Vol.2 (1986) 의 Section 15 (Irregular, Nonsporing, Gram - Positive Rods) 에 속하는 세균이라고 판단 하였다. 다음에 호기성에서 생육되고, 혐기성에서 생육되지 않으며, 세포벽의 아미노산 조성으로서 리신, 쓰레오닌, 세린을 갖는다는 것, 또 주된 퀴논으로써 MK - 9 (H) 를 갖는것에 의거하여 검색한 결과, 본 균주는 아쓰로박터 (Arthrobacter) 속에 속하는 세균이라고 인식하고, HAP1 균주를 아쓰로박터 에스피, HAP1 (Arthrobacter sp. HAP1) 라고 명명 하였다. 본 균주는 부다페스트조약에 의거하여 1991년 11월 7일자로 공업기술원 미생물공업기술연구소 (FRI) 에 미공연조기제 3644 호 (FERM BP - 3644) 로서 기탁되어 있다.

본 발명에서 사용되는 알라닌 라세마아제활성을 거의 또는 전혀 갖지않는 미생물은 알라닌 라세마아제 활성을 갖는 야생주를 자외선조사로 N - 메틸 - N' - 니트로 - N - 니트로소구아니딘 (이하 NTG 라고 약술한다), 아질산등으로 화학처리하여 변이 유발시킨 후, D - 알라닌을 함유하지 않는 배지에서 생육할수 없는, 또는 모주에 비하여 생육이느린 균주를 선택함으로써 분리할 수가 있다. 이와같은 방법으로 얻어진 대표주로서, 아쓰로 빅터 에스피. HAP1 주로부터 LAP7 주를, 아쓰로박터 우레아파시엔스 ATCC 7562 주로부터 AU - 7 주를 각각 유도할수 있다. LAP7 주 및 AU -7 주는 HAP1 주와함께 각각, 미공연조기 제 3645 호 (FERM BP - 3645), 미공연조기 제3646호 (FERM BP - 3646)로서 부다페스트조약에 의거하여 1991년 11월 7일자로 공업기술원 미생물공업기술연구소 (미공연) 에 기탁되어 있다.

본 발명의 미생물에 의한 L - 알라닌의 생산은 통상 사용되는 미생물의 배양법으로 실시 가능하다. 사용배지로서는 탄소원, 질소원, 무기물, 적량의 D - 알라닌 또는 D,L - 알라닌 기타 사용균주가 필요로하는 미량의 영양소를 알맞게 함유하는 것이며 합성배지 또는 천연배지 어느것이라도 사용 가능하다.

탄소원으로서는 사용하는 미생물이 자화 될수 있는 것이라면 무엇이라도 좋으나, 예컨대 글루코오스, 글리세롤, 프룩토오스, 자당, 전분 가수분해물, 당밀등의 탄수화물, 피루브산, 숙신산, 젖산등의 각종 유기산이 사용가능하다.

질소원으로서는, 암모니아 또는 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 아세트산암모늄,요소등의 각종 무기 및 유기암모늄염류 혹은 펩톤, NZ - 아민, 고기추출물, 효모추출물, 콘 스티프 리쿼 (corn steep liquor), 카세인 가수분해물등의 천연 영양원을 사용할수가 있다.

무기물로서는, 인산 제1수소칼륨, 인산 제2수소칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산아연 및 염화카슘등을 첨가한다.

또 필요에따라, 비오틴, 티아민등 비타민류를 첨가한다.

배양온도는 일반적으로 20∼40℃ 가 적합하다. 배지의 pH 는 중성부근으로 유지하는 것이 바람직하다. 탄소원, 질소원 및 그외의 영양원은, 미생물의 생육에 방해가 되지 않는한, 배양개시시에 한번에 공여하여도 좋고, 여러차례로 분할하거나 혹은 배양중에 연속적으로 첨가하여도 좋다. 배양기간은, 탄소원, 질소원 및 그외의 영양원의 양에 따라 다르나, 통상 1∼6 일간 이다.

배양 종료후, 배양액으로부터 균체를 제거하고 얻어진 청징액으로부터 농축결정화 처리, 활성탄처리 혹은 이온교환 수지처리등의 공지의 정제방법을 사용하여 L - 알라닌을 단리 채취할수 있다.

[발병을 실시하기 위한 최량의 형태]

[실시예1]

아쓰로박터 에스피. HAP1 주를 완전배지 (분말 보우일론 20g 및 효모추출물 5g을 물 1ℓ에 함유시켜 pH 7.2 로 조정한 배지) 에서 30℃, 16시간 배양한 균체를 모아, 0.05M 트리스 - 말레산 완충액 (pH 6.0) 으로 세정한 후, 균체의 농도가 약 10 세포 /㎖ 로 되도록 동일한 완충액에 현탁하고, 이것에 최종농도가 500㎎ / 1 이 되도록 NTG 를 가하고, 30℃에서, 20분간 유지하여 변이처리를 하였다. 이 변이처리균체를 동일한 완충액으로 세정한후, 그 균체를 D - 알라닌 0.05g / 1 함유하는 최소 평판 한천 배지 (제2표)에 도포하였다.

30℃에서 2∼4일간 배양하여, 이 평판 배지에 생육하는 콜로니를 D - 알라닌 (0.05g /1) 함유 최소 한천 배지와 D- 알라닌을 함유하지 않는 최소 한천 배지에 도포하고, 전자 플레이트위에서는 모주와 동일하게 생육시키고, 후자 플레이트에서는 생육시키지 않거나 생육이 느린주를 조균하였다.

이와같은 변이주 중에서 알라닌 라세마아제 활성 저하 또는 불활성 원주로서 아쓰로박터 에스피. LAP7 주를 얻었다.

제3표에, 모주 HAP1 주와 변이주 LAP7 주의 알라닌 라세마아제 활성을 나타냈다.

알라닌 라세마아제의 활성측정은, Wijsman, H. J. W 의 방법 [Genet. Res., Camb. 20 : 269 - 277 (1972)] 에, L - 알라닌 디히드로게나아제의 활성측정은 Ohoshima, T. 등의 방법 [Eur. J. Biochem., 100 : 29 - 39 (1979)] 에 따라 수행 하였다.

[실시예2]

실시예1에서 취득한 변이주 아쓰로박터 에스피. LAP7 주 및 그의 모주 HAP1 주를 10㎖ 의 종배지 (글루코오스 2%, 펩톤 1%, 효모추출물 1%, NaCl 0.5%, D - 알라닌 200㎎ / l, pH 7.2) 를 포함하는 시험관에 접종하고, 30℃에서 24시간 진탕배양 하였다. 이 종배양액 1㎖을 제2표의 발효배지 20㎖을 포함하는 300㎖ 들이 3 각 플라스크에 접종하여, 30℃에서 48시간 진탕배양하였다. 배양 후, 배지여액을 Merck 사제 LiChrosorb RP - 18 칼럼 (7㎛)을 사용한 고속액체 크로마토 그래피하여 오르토프탈알데히드에 의한 포스트 칼럼 발색법에 의하여 정량하여 총 알라닌 (T - Ala)양을 측정하였다. D - 알라닌은 시판의 D - 아미노산 옥시다아제 [Boehringer Mannheim Yamanouchi 사제]를 사용하는 방법으로, DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES 사제 크라운 팩 (Crown Pack) 칼럼을 사용하여 고속액체 크로마토 그래피 (HPLC) 롤 정량 하였다. 그 결과를 제3표에 표시하였다.

[실시예3]

실시예1과 마찬가지로 아쓰로박터 우레아파시엔스 ATCC 7562를 변이처리하고, D - 알라닌을 함유하는 최소평판 한천배지 (제1표) 위에서는 모주와 동일하게 생육하나, D - 알라닌을 함유하지 않는 최소평판 한천배지상 에서는 생육하지 않거나 생육이 느린주를 조균하였다. 이와같이 변이주 중에서 알라닌 라세마아제 활성의 저하, 또는 불활성된 주 아쓰로박터 우레아파시엔 AU - 7 주를 얻었다. 제4표에 모주 ATCC 7562 와 변이주 AU - 7 주의 알라닌 라세마아제 활성을 나타냈다.

[실시예4]

실시예3에서 취득한 변이주 아쓰로박터 우레아파시엔스 AU - 7 주 및 그의 모주 ATCC 7562를 실시예2와 동일하게 배양하고 배양여액을 실시예2와 동일하게 분석하였다. 그 결과를 제5표에 표시하였다.

[실시예5]

LAP7 주를 10㎖ 의 종배지 (글루코오스 2%, 펩톤 1%, 효모추출물 1%, NaCl 0.5%, D - 알라닌 200㎎ / l, pH 7.2)를 함유하는 시험에 접종하고, 30℃에서 24시간 진탕배양 하였다. 이 종배양액 5㎖을 글루코오스 4%, 콘스티프리쿼 1%, 펩톤 0.5%, 황산암모늄 3%, 인산 제1수소칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%, 황산망간 5㎎ / l, 황산아연 10㎎ / l, 비오틴 30㎍ / l, D - 알라닌 200㎎ / l 및 탄산칼슘 2%로 이루어지는 조성의 배지 (pH 7.2) 50㎖을 함유하는 2ℓ들이 3 각 플라스크에 접종하고, 30℃에서 24시간 진탕배양 하였다. 이 배양물의 전량을 글루코오스 5%, 황산암모늄 3%, 인산 제1수소칼륨 0.08%, 황산마그네슘 0.07%, 황산 망간 7.2㎎ / l, 황산철 7.2㎎ / l, 황산아연 14.4㎎ / l, 비오틴 36㎍ / l 및 D - 알라닌 1g / l 로 이루어지는 조성의 배지 (pH 7.2) 1.83ℓ을 넣고 가열 살균한 5ℓ들이 배양조에 접종하고, 암모니아로 pH를 6.5 로 유지하면서, 30℃에서 통기 교반하에 배양 하였다. 잔여 글루코오스가 0.1% 이하로 된 시점에서, 별도로 살균한 글루코오스용액을 연속적으로 흘려 가하고, 투입 글루코오스 양이 14%로 될때까지 배양하였다. 배양종료시의 배양여액증의 L - 알라닌, D - 알라닌 양은 각각 76.7g / l, 4.4g / l (L / D + L = 94.6%) 이며, 투입 글루코오스에 대한 L - 알라닌수율은 46.2%에 상당 하였다.

[실시예6]

실시예5에서 수득한 배양액 1ℓ로 부터, 원심분리에 의해 균체를 제거하여, 얻어진 상징액을 탈색탄처리 하였다. 이 탈색탄처리액을 양이온 교환수지 Diaion SK - 1B (H 형)을 충전한 칼럼에 통과시켜 L - 알라닌을 흡착시키고, 수세후 2N 암모니아수로 용출하고, L - 알라닌 분획을 농축시켰다. 수득한 농축액에 에탄올을 가하여, 석출되는 결정을 채취하였다. 이 결정을 에탄올에 의해 재결정 함으로써 L - 알라닌의 결정 57.7g을 얻었다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명에 의하면, 영양수액, 의약, 식품첨가물로서 유용한 L - 알라닌을 공업적으로 유리하게 제조할수가 있다.

Claims (1)

1. 아쓰로박터 (Arthrobacter) 속에 속하고, L - 알라닌 디히드로게나아제 활성 및 알라닌 라세마아제 활성을 가지며, 또한 L - 알라닌 생산성을 갖는 미생물을 친주(親株) 로서 유도하고, 이 친주가 갖는 알라닌 라세마아제 활성의 1%이하로 알라닌 라세마아제 활성을 저감시킨 미생물을 배지중에 배양하고 이 배양물중에 L - 알라닌을 생성 축적시켜, 이 배양물로부터 L - 알라닌을 채취하는 것을 특징으로 하는 L - 알라닌의 제조 방법.