NL1008054C2 - Werkwijze voor het produceren van alanine, alsmede hierbij toegepaste micro-organismen en recombinant DNA moleculen. - Google Patents

Description

V

Titel: Werkwijze voor het produceren van alanine, alsmede hierbij toegepaste micro-organismen en recombinant DNA moleculen.

De onderhavige aanvrage betreft een werkwijze voor het bereiden van alanine, 5 in het bijzonder L-alanine, door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro-organisme, dat alanine kan produceren uitgaande van een koolstofbron.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit Uhlenbusch et al., Appl. Environ, Microbiol. 57:1360-1366 (1991). Hierin wordt L-alanine geproduceerd door het kweken van een micro-organisme (Zymomonas mobilis), dat zodanig genetisch is 10 gemodificeerd, dat het een alanine dehydrogenase gen tot expressie brengt. Het tot expressie gebrachte alanine dehydrogenase zet glucose uit het medium, na coversie tot pyruvaat, om tot een mengsel van alanine en ethanol, met een maximale opbrengst aan alanine van 16 %, betrokken op de omgezette hoeveelheid glucose.

Zymomonas mobilis is echter geen "food-grade" organisme. Ook is 15 Zymomonas mobilis niet homo-fermentatief, daar het per gevormd ethanol molecule een molecule C02 vormt, zodat het -gemeten aan de koostofbalans- 66% ethanol en 33% C02 vormt.

L-alanine wordt gebruikt voor farmaceutische en veterinaire toepassingen. Zo wordt het bijvoorbeeld samen met andere aminozuren opgenomen in preparaten voor 20 parenterale toediening als klinische pre- en post-operatieve voedingen, en als voedingssupplement voor dieren. Verder wordt alanine vanwege zijn zoete smaak gebruikt als toevoegsel in voedingsmiddelen.

L-alanine wordt industrieel geproduceerd door decarboxylering van L-aspartaat door middel van geïmmobiliseerde cellen of celsuspensies van 25 Pseudomonas dacunhae. Hierbij kunnen opbrengsten aan L-alanine van meer dan 90% worden verkregen, uitgaande van asparaginezuur, hetgeen echter een kostbaar substraat is.

D/L-alanine kan ook door chemische synthese worden bereid, of door de directe fermentatie van suikers. De bij deze fermentatie betrokken micro-30 organismen, zoals Corynebacterium gelatinosium, Arthrobacter oxydans,

Brevibacterium lactofermentum, Clostridium sp., Pyrococcus furiosus, produceren D/L-alanine met een maximale omzettingsgraad van 50 tot 60 %, waarschijnlijk onder katalyse van een endogeen alanine dehydrogenase.

1008054 2

Doel van de uitvinding is het verschaffen van een verbeterde werkwijze voor het produceren van alanine, in het bijzonder L-alanine.

Gevonden is nu dat een dergelijke werkwijze kan worden verschaft door, in een geschikt micro-organisme, de natieve metabolische omzetting(en) van suikers in 5 de daarvan afgeleide producten (zoals lactaat) te vervangen door de vorming van alanine, in het bijzonder L-alanine.

De uitvinding betreft derhalve een werkwijze voor het bereiden van alanine, in het bijzonder L-alanine, door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro-organisme, dat alanine kan produceren uitgaande van een koolstofbron, met het 10 kenmerk, dat als het micro-organisme een micro-organisme wordt toegepast, waarin het natieve suikermetabolisme is omgeleid naar de vorming van alanine, in het bijzonder L-alanine, zodanig dat in wezen meer dan 40%, bij voorkeur meer dan 60%, met meer voorkeur meer dan 75% van de verbruikte koolstof uit het medium wordt omgezet in alanine.

15 In het bijzonder wordt/worden volgens de uitvinding de natieve metabolische omzetting(en) van pyruvaat (afkomstig uit de omzetting van glucose of een andere geschikte suikerbron in het medium) omgeleid naar de vorming van alanine, waarbij in wezen meer dan 40 %, bij voorkeur meer dan 60 %, met meer voorkeur meer dan 75% van het gevormde pyruvaat in alanine wordt omgezet, op basis van 20 koolstof in het gevormde pyruvaat.

De werkwijze geeft alanine in een hoge zuiverheid en opbrengst, en bij een aanzienlijk verbeterde efficiëntie van koolstofgebruik, vergeleken met bekende werkwijzen. Hierbij is het mogelijk een omleiding van meer dan 80%, of zelfs meer dan 90%, van de als suikerbron ingebrachte koolstof naar alanine te verkrijgen, of 25 zelfs een in wezen volledige (>99%) omleiding.

Ook verschaft de uitvinding in een voorkeursuitvoeringsvorm een verbeterde stereospecificiteit naar L-alanine in het eindproduct, waarbij zelfs een stereospecificiteit van meer dan 95%, of zelfs 99% of meer, kan worden bereikt.

Verder verschaft de uitvinding in een bijzondere uitvoeringsvorm een 30 geschikte techniek voor de in situ bereiding van alanine tijdens de bereiding van gefermenteerde voedingsproducten of -preparaten.

De verbruikte koolstofbron kan iedere metaboliseerbare/fermenteerbare koolstofbron zijn, waarvan het natieve metabolisme kan worden omgeleid naar de 10Ü 8054 3 vorming van alanine zoals hierin beschreven. Dit zal in de regel een koolstofbron zijn die door het micro-organisme natief wordt omgezet tot pyruvaat, onder andere via omzettingen uit de glycolyse. De koolstofbron zal in de regel een op zichzelf gebruikelijke metaboliseerbare/fermenteerbare suikerbron zijn, zoals glucose, lactose 5 (zie voor melkzuurbacteriën: de Vos en Simons, in "Genetics and Biotechnology of lactic acid bacteria", Gasson and de Vos, eds., p. 52-106, Chapman and Hall, 1994), sucrose (zie voor melkzuurbacteriën: Rauch en de Vos, 1992a, J.Bacteriol., 174: 1280-1287 en Rauch en de Vos, 1992b. Gene, 121: 55-61), maltose of ook zetmeel (zie voor melkzuurbacteriën: van Asseldonk et al., 1993, Mol. Gen. Genet., 10 240:428-434). Glucose, lactose en sucrose zullen in de regel de voorkeur verdienen.

De omleiding van het suikermetabolisme naar de vorming van alanine wordt volgens de uitvinding uitgedrukt op basis van koolstof (de koolstofbalans), zoals gebruikelijk in het vakgebied, d.w.z. als [de hoeveelheid koolstof(atomen) in het gevormde alanine] / [de hoeveelheid koolstof(atomen) in de verbruikte suikerbron] x 15 100%.

De gevormde hoeveelheid alanine ( in gram of mol) per gram of mol verbruikte suiker zal afhangen van (het aantal koolstofatomen in) de gebruikte suikerbron. Zo zal, uitgaande van een conversie van 100%, 1 mol glucose 2 mol alanine geven, terwijl 1 mol sucrose of lactose 1 mol 4 mol alanine zal geven.

20 De omleiding van het natieve suikermetabolisme naar de vorming van alanine kan worden uitgevoerd door een (versterkte) alanine-producerende activiteit aan het micro-organisme te verlenen, en bij voorkeur tegelijkertijd de natieve omzetting(en) van pyruvaat te verstoren of te onderdrukken.

Het verlenen van de (versterkte) alanine-producerende activiteit kan worden 25 uitgevoerd door een of meer homologe of heterologe genen, die coderen voor een alanine-vormende activiteit, in het micro-organisme tot (verhoogde) expressie te brengen.

Dit zullen met name (een of meer) structuurgenen zijn die coderen voor een op zichzelf bekend enzym dat de vorming van alanine, in het bijzonder L-alanine, 30 katalyseert, in het bijzonder een enzym dat alanine kan produceren uit een fermenteerbare suikerbron in het medium, zoals hierboven omschreven, of een metaboliet hiervan.

Bij voorkeur wordt een enzym toegepast dat alanine kan produceren door de 1008054 4 omzetting van pyruvaat in alanine, met meer voorkeur een alanine-dehydrogenase. Het hiervoor coderende structurele gen kan uit ieder geschikt micro-organisme afkomstig zijn, maar is bij voorkeur een alanine dehydrogenase uit een melkzuurbacterie, dan wel uit een bacterie van het genus Bacillus, in het bijzonder 5 Bacillus sphaericus. In het bijzonder zal een alanine dehydrogenase uit een "food grade" micro-organisme worden toegepast. Ook kan het aan het gebruikte micro-organisme endogene alanine-dehydrogenase worden gebruiktm dat hiertoe desgewenst tot overexpressie kan worden gebracht, door voorafgaaande inductie en/of onder de regeling van een geschikte homologe of heterologe promoter.

10 Het onderdrukken van de natieve omzetting(en) van het pyruvaatmetabolisme kan worden uitgevoerd door de betreffende metabolische route te remmen of te blokkeren, bijvoorbeeld door de aanwezigheid in het medium van reversibel of irreversibel inhibiterende factoren voor de bij deze route betrokken enzymen, of door het verstoren en/of onderdrukken van de natieve expressie van deze enzymen.

15 Bij voorkeur worden echter micro-organismen gebruikt die genetisch zodanig zijn gemanipuleerd dat zij een deficiëntie in de natieve omzetting(en) van pyruvaat vertonen, bijvoorbeeld omdat zij de hierbij betrokken enzymen niet, in sterk verminderde mate of defectief tot expressie brengen, en dergelijke mutanten zullen aan deskundigen duidelijk zijn.

20 Een voorbeeld is de lactaat dehydrogenase-deficiënte L.lactis stam beschreven door Platteeuw et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61: 3967-3971. Volgens deze literatuurplaats wordt het pyruvaatmetabolisme van deze stam door overproductie van a//a-acetolactate synthase omgeleid (voor ongeveer 60-80%, afhankelijk van de groeicondities) naar productie van diacetyl. Hierbij worden echter 25 naast diacetyl ook andere producten gevormd, zodat slechts een klein deel van de vwerbruikte koolstofbron in het beoogde product (diacetyl) wordt omgezet, terwijl de uitgevoerde omzetting ook leidt tot een verstoring van de redox-balans van het micro-organisme, hetgeen een aanzienlijk nadeel is.

Het toegepaste micro-organisme kan verder ieder op zichzelf bekend micro-30 organisme zijn, of een op zichzelf bekende mutant hiervan, en kan zowel een homo-als een hetero-fermentatief micro-organisme zijn.

Onder homo-fermentatieve micro-organismen worden micro-organismen verstaan die suikers via pyruvaat in hoofdzaak (d.w.z. voor meer dan 80%, gemeten 1008054 5 aan de koolstofbalans) omzetten in één metabool product. Dit omvat bijvoorbeeld melkzuurbacterieën zoals L. Lactis en S. Cremoris, die pyruvaat in wezen volledig omzetten in melkzuur/lactaat. Verwezen wordt naar H.G. Schlegel: Allgemeine Microbiologie, 5e Aufl., Thieme Verlag, 1981; in het bijzonder blz. 255-295.

5 Andere voorbeelden zijn Clostridia species zoals C.acidi-urici, C.

cylinrosporum en de homo-fermentatieve subspecies van C.formicoaceticum, C.thermoaceticum, die homo-fermentatief acetaat vormen uitgaande van waterstofequivalenten (uit substraatoxidatie) en kooldioxide volgens het reactieschema 10 8 [H-equiv.] + 2 C02 ~> CH3COOH + 2 H20.

Deze Clostridia species zijn echter in het algemeen niet "food grade".

Onder hetero-fermentatieve micro-organismen worden micro-organismen verstaan die vanuit pyruvaat meerdere voornaamste om_;ettingsproducten vormen. In breedste zin zijn dit alle micro-organismen die volgens de bovenstaande definitie niet 15 tot de homo-fermentatieve micro-organismen worden gerekend.

Volgens de uitvinding zal het gebruik van een homo-fermentatief micro-organisme in de regel zeer de voorkeur verdienen, daar hierbij het vervangen van de omzetting van pyruvaat in het voornaamste daarvan afgeleide product door de omzetting naar alanine reeds tot productie van alanine in zeer goede opbrengst zal 20 leiden. Hiervoor hoeft bovendien slechts één natieve route van het pyruvaat- metabolisme te worden omgeleid, onderdrukt en/of verstoord. Echter, het gebruik van hetero-fermentatieve micro-organismen, waarbij een of meerdere van de voornaamste natieve omzettingen van pyruvaat wordt/worden omgeleid naar de productie van alanine, valt eveneens binnen het gebied van de uitvinding.

25 Verder zijn er nog zg. "semi-homo-fermentatieve" micro-organismen bekend, die naast één hoofdzakelijk product (organisch molecule) ook C02 produceren. Hoewel deze micro-organismen volgens de bovengenoemde definitie (vorming van meer dan 80% van één metabool product, bepaald op basis van totaal koolstof) strikt genomen niet tot de homo-fermentatieve organismen kunnen worden gerekend, 30 kunnen zij volgens de uitvinding equivalent worden beschouwd aan zuiver homo-fermentatieve micro-organismen, wanneer zij meer dan 80% van één metabool product vormen, bepaald op basis van de koolstofbalans, waarbij C02 buiten beschouwing wordt gelaten. Dit is mede omdat -bij de omleiding van het 1008054 6 metabolisme in een dergelijk organisme volgens de uitvinding- het uiteindelijke kweekmedium in wezen alleen alanine als voornaamste product zal bevatten, daar de gevormde C02 vanuit het medium aan de omgeving zal worden afgegeven. Echter, gebruik van zuiver homo-fermentatieve organismen zal nog steeds de voorkeur 5 verdienen.

Het toegepaste micro-organisme is bij voorkeur een melkzuurbacterie, zoals L. lactis, L.bulgaricus, L.acidophilus, L.helveticus, S.cremoris, of S.thermophilus, of een ander homo-fermentatief micro-organisme dat lactose, sucrose, glucose en/of pyruvaat als substraat kan gebruiken. Voor sommige toepassingen zal het gebruik 10 van van "food grade" micro-organismen de voorkeur verdienen.

Het toegepaste micro-organisme is bij voorkeur deficiënt in activiteit(en) en/of enzymen die met het alanine-producerend enzym (kunnen) concurreren voor beschikbaar substraat. Bijvoorbeeld, wanneer het alanine-producerend enzym een L-alanine-dehydrogenase gen is, is het gebruikte micro-organisme bij voorkeur 15 deficiënt in het enzym lactaat dehydrogenase, dat pyruvaat -het substraat voor L-alanine dehydrogenase- kan omzetten in lactaat.

Voor de stereoselectieve productie productie van L-alanine bevat het toegepaste micro-organisme bij voorkeur ook geen wezenlijke alanine-racemase activiteit. Hiertoe kan eventueel natief aanwezige racemase activiteit op een op 20 zichzelf bekende wijze worden onderdrukt, bijvoorbeeld door de aanwezigheid in het medium van reversibel of irreversibel inhibiterende factoren; door het verstoren en/of onderdrukken van de natieve expressie van de racemase-activiteit; dan wel door het gebruik van micro-organismen die genetisch zodanig zijn gemanipuleerd, dat zij een eventuele natieve racemase activiteit niet, in sterk verminderde mate of 25 defectief tot expressie brengen. Dergelijke mutanten zullen opnieuw aan deskundigen duidelijk zijn.

De een of meer homologe of heterologe genen, die voor de alanine-vormende activiteit coderen, kunnen op een op zichzelf bekende wijze in het gebruikte micro-organisme tot (over)expressie worden gebracht, bijvoorbeeld onder de regeling van 30 een op zichzelf bekende, in het gebruikte micro-organisme werkzame, homologe of heterologe promoter.

Hiertoe worden de een of meer structurele genen op werkzame wijze met de promoter verbonden, bijvoorbeeld door het coderend gen in de juiste oriëntatie en in 1008054 7 het juiste afleesraam in een plasmide of een andere geschikte vector, die reeds de promoter bevat, in te brengen. Het micro-organisme wordt vervolgens op een op zichzelf bekende wijze met het aldus verkregen recombinant DNA molecule getransformeerd, waarbij het recombinante DNA in het bacteriële genoom kan 5 worden opgenomen of als een afzonderlijk plasmide in de cel kan worden gehandhaafd. Bij dit alles kunnen op zichzelf bekende recombinant-technieken worden toegepast, zoals beschreven in Sambrook et al., "Molecular cloning: A laboratory manual", 2e editie, delen 1-3, Cold Spring Harbor (1989).

Hierbij kan in principe iedere geschikte constitutieve of induceerbare promoter 10 worden gebruikt, die in het gebruikte micro-organisme werkzaam is. Voorbeelden van geschikte constitutieve promoters zijn de w.sp45-promoter (van Asseldonk et al., 1990, Gene 95:155-160); de «/sR-promoter (de Ruyter et al., 19967, J.Bacteriol.

178: 3434-3439) en depepN-promoter (Tan et al., 1992, FEBS Lett. 306; 9-16) als ook de promoters genoemd in de Vos en Simons, in "Genetics and Biotechnology of 15 lactic acid bacteria", Gasson and de Vos, eds., p. 52-106, Chapman and Hall, 1994. Voorbeelden van geschikte gereguleerde promoters zijn de φ31 "middle promoter and ori based expression system" (O’Sullivan et al., 1996, Biotechnology 14:82-87); de xylA-promoter (Lokman et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 245:117-125) en het repressor/operator φ rit systeem (Nauta et al.,1996, Mol. Microbiol. 19:1331-1341). 20 De gebruikte promoter is bij voorkeur zodanig dat de alanine-producerende activiteit tot verhoogde expressie kan worden gebracht, meer bij voorkeur tot geregelde overexpressie.

Een zeer geschikte klasse van promoters - auto-induceerbare promoters zoals beschreven in bijvoorbeeld Kuipers et al., TIBTECH 15: 135-140 - zal hieronder 25 worden besproken.

Een belangrijk alternatief voor het gebruik van zelfstandig replicerende recombinante structuureenheden (plasmiden) die voor het alanine dehydrogenase coderen is het opnemen van het alanine dehydrogenase gen in het chromosomale DNA van het gebruikte micro-organisme. Dit kan op een op zichzelf bekende wijze 30 worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door het gebruik van geschikte faag-vectoren, F-factor plasmides of transposons, of door conjugatie met een geschikte donor-stam. Voorbeelden zijn het nisin-sucrose conjugatief transposon Tn5276 (Rauch en de Vos, J. BacterioL, 174: 1280-1287), transposon Tn9/9 (Hill et al., 1985, FEMS

1 0 0 6 G 5 4 δ

Microbiol. Lett. 30: 115-119), en pGHOST intergratieve vectoren (Magiun et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 5633-5638).

Hierbij zal het alanine dehydrogenase gen doorgaans onder de regeling van een endogene promoter in het bacteriële DNA tot expressie worden gebracht, hoewel 5 chromosomale insertie van het alanine dehydrogenase gen gekoppeld aan een geschikte homologe of heterloge promoter (zoals de hierboven genoemde promoters) ook mogelijk is.

Volgens een bijzondere uitvoeringsvorm wordt het structurele gen, dat codeert voor het natieve enzym dat met het alanine dehydrogenase gen kan concurreren voor 10 substraat (pyruvaat), zoals het voor lactaat dehydrogenase coderende gen in melkzuurbacteriën, in het chromosomale DNA vervangen door het alanine dehydrogenase gen, waarbij het alanine dehydrogenase gen desgewenst onder de regeling van de natieve promoter voor het vervangen gen kan worden gebracht.

De aldus getransformeerde micro-organismen, die een alanine-producerende 15 activiteit tot verhoogde expressie kunnen brengen -vergeleken met het oorspronkelijke/natieve micro-organisme- en die bij voorkeur tevens deficiënt zijn in enig concurrerend natief metabolisme, in het bijzonder in het natieve pyruvaatmetabolisme, vormen een verder aspect van de uitvinding.

Het micro-organisme wordt vervolgens gekweekt onder omstandigheden die 20 inductie van de promoter en daarmee expressie van het coderende gen geven, waarna men het tot expressie gebrachte enzym alanine laat produceren, uitgaande van componenten in het kweekmedium of metabolieten hiervan, in het bijzonder glucose of een andere geschikte fermenteerbare koolstof/suikerbron. Het kweekmedium kan verder alle op zichzelf bekende bestanddelen van kweekmedia 25 bevatten, zoals een geschikte stikstofbron, alsmede sporenelementen en dergelijke.

Wanneer het alanine-producerende enzym een L-alanine dehydrogenase is, bevat het voedingsmedium naast een metaboliseerbare koolstofbron of een andere bron van pyruvaat tevens een bron van ammoniumionen. Deze zijn bij voorkeur in het medium aanwezig in een verhouding van de koolstofbron tot ammoniumionen 30 van ten minste 1:3, betrokken op verbruikte koolstof. Bijvoorbeeld, met glucose als de koolstofbron, is de verhouding glucose:ammonium ten minste 1:2, terwijl met sucrose of lactose als koolstofbron deze verhouding ten minste 1:4 zal zijn.

De expressie van het alanine-producerende enzym en de vorming van het L- 1008054 9 alanine kunnen afzonderlijk worden geregeld door het toevoegen van respectivelijk de inducerende factor voor de promoter en het substraat voor het alanine-producerend enzym. Hierbij kunnen de expressie en de L-alanine-productie tegelijkertijd, dan wel achtereenvolgens worden geïnduceerd/verkregen, zoals 5 hieronder nader omschreven.

Het expressieniveau van het alanine dehydrogenase is op zichzelf niet essentieel, zolang voldoende productie van alanine wordt verkregen. Dit zal in de regel alhankelijk zijn van het gebruikte micro-organisme. Zo kan het zijn dat -na het onderdrukken/verstoren van de natieve concurrerende routes- reeds de endogeen in 10 het gebruikte micro-organisme aanwezige alanine-vormende activiteit voldoende productie van alanine geeft. Bij verhoogde expressie van homoloog of heteroloog alanine dehydrogenase kan dit enzym tot 30/40% of meer van het cellulaire eiwit uitmaken.

De vorming van het L-alanine kan verder op een op zichzelf bekende wijze 15 worden uitgevoerd, door toepassing van bekende micro-biologische technieken en reactoren voor het kweken/handhaven van het gebruikte micro-organisme, of hieraan analoge werkwijzen. Zo kunnen ladingsgewijze of continue processen worden toegepast.

Ook kunnen de micro-organismen volgens de uitvinding in geïmmobiliseerde 20 vorm op een geschikte drager worden toegepast, bijvoorbeeld in een geschikte celreactor of in een kolom.

Wel zal in de regel de toepassing van intacte cellen van het micro-organisme volgens de uitvinding de voorkeur verdienen boven het gebruik van celextracten, zoals "cell-free" extracten.

25 Het gevormde alanine kan vervolgens uit het fermentatiemedium worden gewonnen en eventueel verder worden gezuiverd, op een op zichzelf bekende wijze.

De werkwijze volgens de uitvinding geeft alanine in hoge zuiverheid (> 90%, bij voorkeur >99%), en bij een hoge efficiëntie van glucoseverbruik (>75%).

Ook geeft de werkwijze -met name wanneer eventueel natief aanwezige racemase 30 activiteit wordt onderdrukt zoals hierboven omschreven- een hoge stereospecifïciteit, waarbij een eindproduct met meer dan 80% van, in het bijzonder meer dan 95% van, of zelfs in wezen uitsluitend de L-isomeer (betrokken op totaal alanine) kan worden verkregen (totaal stereospecifieke productie).

1008054 10

De uitvinding betreft in verdere aspecten het alanine verkregen volgens de hierin beschreven werkwijze, alsmede preparaten, in het bijzonder voedingsmiddelen en/of gezondheidsbevorderende preparaten, als ook toevoegsels hiervoor, die het alanine volgens de werkwijze omvatten. Verder kan de uitvinding ook worden 5 toegepast voor de bereiding op grote schaal van het alanine-producerende enzym, zoals hierboven omschreven.

Tenslotte betreft de uitvinding in een verder aspect een zeer geschikt systeem voor het regelen van de expressie van de alanine-producerende activiteit, met name wanneer de werkwijze volgens de uitvinding wordt toegepast in melkzuurbacteriën.

10 Dit aspect omvat de toepassing van een zogenaamde auto-induceerbare promoter, waaronder wordt verstaan een promoter die kan worden geïnduceerd door het expressieproduct van het coderende gen, dat natief door deze promoter wordt geregeld, met inbegrip van eventuele post-translatie-gemodificeerde expressieproducten, als ook analoga en derivaten van deze expressieproducten.

15 Dit aspect van de uitvinding betreft derhalve een werkwijze voor het bereiden van alanine, in het bijzonder L-alanine, door het kweken van een alanine-producerend genetisch gemodificeerd micro-organisme, waarbij als het micro-organisme een micro-organisme wordt toegepast, dat een gen bevat dat codeert voor een alanine-producerend enzym, onder regeling van een in het micro-organisme 20 werkzame auto-induceerbare promoter, waarbij deze promoter afkomstig is van een gencluster die codeert voor een anti-microbieel peptide of een soortgelijk signaaleiwit.

Volgens dit aspect worden in het bijzonder auto-induceerbare promoters toegepast die natief de expressie regelen van genclusters die coderen voor anti-25 microbiële peptiden. Dergelijke promoters kunnen worden geïnduceerd door het anti-microbiële eiwit zelf, als ook analoga en derivaten hiervan, doorgaans via een twee-componenten signaaltransductiesysteem.

Niet-beperkende voorbeelden zijn de promoters uit de bacteriocine-gencluster van Camobacterium piscicola, de Sakaricine-gencluster uit Lactobacillus sake, als 30 ook (naar wordt aangenomen) de Subtiline-gencluster van Bacillus subtilis. Volgens de uitvinding worden hieronder tevens verstaan promoters voor soortgelijke, niet-bacteriocide signaaleiwitten die betrokken zijn bij "quorum sensing" in micro-organismen, zoals de promoter voor Plantaricine A uit de bacteriocine gencluster 1008054 11 van Lactobacillus plantarum. Verwezen wordt naar Kleerebezem et al, Molecular Microbiology (1997) 24(5), 895-904 en de hierin genoemde referenties.

De bij voorkeur toegepaste promotors zijn de auto-induceerbare promotors van de nisine-gen cluster uit L. lactis, in het bijzonder de nisA en nisF promotors, 5 zoals beschreven in de Europese aanvrage 0 712 935 van aanvraagster (nis A), als ook in De Ruyter et al., Appl. Environ. Microbiol., 62:3662-3667 (1996); Kuipers et al., Tibtech, April 1997 (Vol. 15):135-140, en de hierin genoemde referenties ( nisA en nisF). Deze promotoren zijn reeds toegepast voor de geregelde (over)expressie van homologe en heterologe eiwitten (zoals het gusA reporter gen 10 van E.coli, pepN, en de lytische genen lytH en lytA) in melkzuurbacteriën, als ook voor de nisine-geïnduceerde expressie in heterologe gastheren zoals Lactobacillus helveticus en Leuconostoc lactic. Volgens de uitvinding wordt dit auto-induceerbare promotorsysteem met voordeel toegepast voor de geregelde (over)expressie van de alanine-producerende activiteit, d.w.z. van het alanine-producerende enzym.

15 Het gen dat voor het alanine dehydrogenase codeert kan op de hierboven beschreven wijze onder de regeling van de nisine-promotor worden gebracht, door het op werkzame wijze met deze promoter te verbinden. Zo kan het coderend gen in het juiste afleesraam worden ingebracht in een plasmide of vector die reeds een auto-induceerbare promoter bevat, in wezen analoog aan de werkwijzen beschreven in 20 EP-A-0 712 935 en het bovengenoemde artikel van De Ruyter et al..

Een verder aspect van de uitvinding betreft derhalve recombinant DNA moleculen of sequenties, die een of meer genen omvatten die coderen voor een alanine-producerende activiteit, in het bijzonder voor een alanine-producerend enzym zoals L-alanine dehydrogenase, die onder de regeling van een auto-induceerbare 25 promotor zijn gebracht, in het bijzonder van een promotor van de nisine-gencluster zoals hierboven omschreven.

Het recombinant DNA molecuul is bij voorkeur in de vorm van een vector, zoals een plasmide, die tevens selecteerbare markeringen en andere op zichzelf bekende componenten van vectoren kan omvatten. Bij voorkeur toegepaste piasmi den 30 worden hieronder nader beschreven.

De micro-organismen kunnen op een op zichzelf bekende wijze met deze vectoren volgens de uitvinding worden getransformeerd, bijvoorbeeld zoals beschreven in EP-A-0 712 935 en het bovengenoemde artikel van De Ruyter et al..

1008054 12

De aldus getransformeerde micro-organismen -die een verder aspect van de uitvinding vormen- kunnen worden gebruikt voor de productie van L-alanine, door deze te kweken in een medium dat ten minste één inducerende factor voor de auto-induceerbare promoter bevat, bij een inducerende concentratie. Hierbij zal expressie 5 van de alanine-producerende activiteit worden verkregen, dat vervolgens kan worden gebruikt voor de vorming van L-alanine, uitgaande van een geschikt substraat, dat in het medium kan worden opgenomen.

Geschikte inducerende factoren zijn met name (maar niet beperkt tot) de expressieproducten van het gen/de genen, die natief door de gebruikte promoter 10 wordt/worden geregeld, als ook analoga en derivaten hiervan. Dit zijn in de regel anti-microbiële eiwitten of soortgelijke "peptide feromonen", zoals -voor de nis-promoters- nisine A, nisine Z en analoga/derivaten hiervan, als ook mutanten, varianten en/of fragmenten hiervan.

De inductie kan verder worden uitgevoerd zoals beschreven in EP-A-0 712 15 935 en het bovengenoemde artikel van De Ruyter et al., of analoog hieraan. Hierbij wordt bij voorkeur een verhoogde expressie of overexpressie van de gewenste L-alanine-producerende activiteit verkregen, vergeleken met het natieve micro-organisme.

Wanneer een auto-induceerbare promoter wordt toegepast bevatten de cellen 20 van het toegepaste micro-organisme bij voorkeur (de genen voor) een signaaltransductiesysteem, dat inductie van de promoter geeft als respons op de extracellulaire aanwezigheid van de inducerende factor. Dit systeem zal vaak uit twee componenten ( d.w.z. een sensor eiwit en een respons regulator) bestaan, zoals de bekende nisK en nisR genen/eiwitten van de nisine gencluster. Dit 25 signaaltransductiesysteem kan reeds natief in het gebruikte micro-organisme aanwezig zijn, of door geschikte expressie van heterologe genen aan het mciro-organisme worden verleend. Bij voorkeur wordt het signaaltransductiesysteem gebruikt dat natief bij de regeling van de gebruikte promoter is betrokken. Verwezen wordt naar het reeds genoemde artikel van Kleerebezem et al. en de hierin 30 genoemde referenties.

Het gebruik van het auto-induceerbare promotersysteem bij de uitvinding geeft verder alle op zichzelf bekende voordelen van dit systeem, zoals beschreven in EP-A-0 712 935. Zo kan de expressie van de alanine-producerende activiteit op ieder 1008054 13 gewenst moment van de fermentatie worden geïnduceerd en is deze expressie in wezen linear met de concentratie van de inducerende factor in het medium (positive inductie).

Ook zijn de bij voorkeur toegepaste inducerende factoren (nisine A en Z en 5 analoga/derivaten hiervan) aanvaardbaar voor toepassing in voedselproducten, daar zij natief worden gevormd bij de fermentatie van melkproducten door melkzuurbacteriën. Hierdoor kan de uitvinding ook met voordeel in situ worden toegepast bij de bereiding van -in het bijzonder gefermenteerde- voedingsmiddelen, bijvoorbeeld voor de geregelde productie in situ van alanine als zoetstof in 10 melkproducten, in het bijzonder in kaas of gefermenteerde melkproducten zoals yoghurt. Een verder voordeel hierbij is, dat de alanine-productie kan worden geïnduceerd zonder dat hiervoor wezenlijke veranderingen in het voedingsmiddel(medium) vereist zijn.

Hierbij kan het micro-organisme in combinatie met de gebruikelijke 15 verzurende micro-organismen worden toegepast, waarbij het micro-organisme volgens de uitvinding ook van deze gebruikelijke verzuurders kan zijn afgeleid.

De uitvinding zal nu worden toegelicht aan de hand van de volgende niet-beperkende voorbeelden, alsmede de figuren, waarin:

Fig. 1 een kaart toont van plasmide pNZalaD.

20 Fig. 2 een door electroforese in 10% SDS-PAGE verkregen gel toont (10 ftg totaal eiwit/monster), die de (overproductie van AlaDH in NZ3900/LDH'[pNZalaD] laat zien voor verschillende nisine-concentraties in het medium (de getallen op de horizontale as).

Fig. 3A-3E de invloed van respectivelijk de nisine A concentratie (Fig. 3A en 25 3B), de ammoniumacetaatconcentratie (Fig. 3C), de toegepaste ammoniumbron (Fig.

3D) en de pH van het uitgangsmengsel (Fig. 3E) laten zien op de alanineproductie, voor een omzetting van 10 mM glucose in kleinschalige celsuspensies.

Fig. 4 het verloop in de tijd van het verbruik van glucose en de productie van alanine en lactaat laat zien voor pNZ3900(pNZalaD) (Fig. 4A) en NZ3900/LDH' 30 (pNZalaD) (Fig. 4B), in celsuspensies (pH op 7,5 gehouden met NaOH) aangevuld met 100 mM glucose en 100 mM ammoniumsulfaat.

Fig. 5 een NMR spectrum laat zien van de eindproducten die na 17 uur werden verkregen uit een celsuspensie ( pH 7,5) van NZ3900/LDH (pNZalaD) 1008054 14 aangevuld met 100 mM glucose en 150 mM ammoniumsulfaat.

Experimentele gedeelte.

Melkzuurbacteriën zijn betrokken bij verschillende processen in de 5 voedselfermentatie. Zo is L.lactis direct betrokken bij de productie van melkproducten zoals Gouda kaas of karnemelk. L.lactis vertoont een homolactische fermentatie, waarbij lactaat wordt gevormd als het voornaamste eindproduct, uitgaande van glucose.

Volgens de uitvinding wordt deze natieve metabolische route (van pyruvaat 10 naar lactaat) bij voorkeur omgeleid van pyruvaat naar alanine. Hiertoe wordt een L-alanine dehydrogenase gen tot expressie gebracht in -bij voorkeur- een wild-type melkzuurbacterie, dan wel een mutant hiervan die deficiënt is in lactase hydrogenase.

De enzymatische omzetting van pyruvaat naar alanine verloopt volgens het 15 volgende reactieschema: pyruvaat + NH4+ + NADH -* L-alanine + H20 -I- NAD+.

Wanneer een L.lactis stam wordt toegepast die deficiënt is in lactaat dehydrogenase zal -met geschikte regeling van de pH zoals hieronder omschreven-overwegend, en bij voorkeur in wezen uitsluitend, alanine worden geproduceerd, 20 uitgaande van glucose; zonder regeling van de pH zal een mengsel van acetoine en alanine worden gevormd. In beide gevallen zal een omleiding van het natieve glucose metabolisme van 50 tot 60 % worden verkregen. Wanneer een wild-type stam van L.lactis wordt gebruikt zal, uitgaande van glucose, een mengsel van lactaat en alanine worden geproduceerd, met een omleiding van het metabolisme van 25 30 tot 40%.

De productie van alanine door deze micro-organismen kan als een continu of een ladingsgewijs proces worden uitgevoerd. In een ladingsgewijs proces onder toepassing van celsuspensies van L. lactis in een geschikte buffer kan een in wezen volledige omzetting van glucose tot alanine (18 g/1) (homoalanine fermentatie) 30 worden verkregen, waarbij het verkregen alanine een zuiverheid van ongeveer 99,5 % heeft.

Voorbeeld I: Overexpressie van het L-alanine dehydrogenase gen uit Bacillus 1008054 15 sphaericus (alaD) in wild-type en LDH-deficiënte stammen van L.lactis.

Het nisine-induceerbare overexpressie-systeem beschreven door De Ruyter et al. werd gebruikt voor de expressie van het alaD gen.

5 Hiertoe werd het alaD gen in plasmide pNZ8020 op werkzame wijze verbonden met de nisA promotor, waarbij plasmide pNZalaD werd verkregen (Fig. 1). Dit plasmide werd overgebracht in stam NZ3900, die de noodzakelijke regelelementen nisRK bevat, geïntegreerd in de pepN locus. Zowel plasmide pNZ8020 als stam NZ3900 worden beschreven door de Ruyter et al..

10 Tevens werd een isogene LDH-deficiënte stam geconstrueerd door enkelvoudige overdracht ("cross-over") met plasmide pNZ2007 (beschreven door Platteeuw et al., Appl.Environ.Microbiol. 61:3967-3971 (1995)). Deze LDH-deficiënte stam werd vervolgens getransformeerd met plasmide pNZalaD. Twee isogene stammen gaven overexpressie van het alanine dehydrogenase, waarbij een 15 lineaire dose respons tussen de productie van L-alanine dehydrogenase en de concentratie van nisine in het medium werd verkregen. Maximale overexpressie van LDH, overeenkomend met ongeveer 40% van totaal geproduceerd eiwit, werd verkregen bij 0,75 ng nisineA/ml in het medium (Fig. 2).

20 Voorbeeld II: Alanine-productie in de LDH-positieve stam NZ3900[pNZalaD].

Een twee-staps procedure werd ontwikkeld voor het beoordelen van de eindproducten van de glucose-fermentatie.

De eerste stap omvat het beladen van de cellen met L-alanine dehydrogenase door inductie met nisine A. In de tweede stap werden de cellen verzameld, 25 geconcentreerd (tot een A600 = 10) en opnieuw gesuspendeerd in fosfaatbuffer (100 mM, pH 7,0), aangevuld met glucose (100 mM) en een bron van ammoniumionen (100 mM). Deze suspensie werd gedurende 1 uur bij 30°C geïncubeerd zonder regeling van de pH. De vorming van eindproducten, uitgaande van glucose, werd gevolgd door HPLC analyse.

30 Op deze wijze werden de invloed van de nisine A concentratie, de ammonium concentratie, de gebruikte ammoniumbron en de toegepaste pH onderzocht. Hierbij werd gevonden dat de productie van alanine direct gerelateerd was aan de hoeveelheid nisine A, die gedurende het beladen van de cellen met alanine 1008054 16 dehydrogenase was toegevoegd (Fig. 3A). Bij maximale inductie zijn de eindproducten, uitgaande van glucose, een mengsel van lactaat en alanine, met een omleiding van het natieve glucosemetabolisme van 30% (Tabel 1).

Bij een constante nisine concentratie houdt de geproduceerde hoeveelheid 5 alanine verband met de extracellulaire ammoniumconcentratie (in het traject van 0 tot 200 mM ammoniumacetaat, zie Fig. 3C). Verder heeft de toegepaste ammoniumbron (ammoniumacetaat, ammoniumsulfaat of ammoniumchloride) een wezenlijke invloed op de uiteindelijke alanineconcentratie (zie Fig. 3D).Bij voorkeur wordt derhalve ammoniumacetaat toegepast.

10 Tenslotte wordt de alanine-productie beïnvloed door de pH van het medium, in het bijzonder de pH van het uitgangsmengsel (in het traject van pH 5 tot 8, zie Fig. 3E). Maximale productie wordt verkregen met een begin pH van 8 (overeenkomend met een interne pH van ongeveer 8,5), hetgeen in het optimale pH traject van het toegepaste enzym (tussen 8,5 en 9) ligt.

15 De bovenstaande procedure werd herhaald, waarbij de pH werd ingesteld op 7,5 en constant werd gehouden door toevoegen van NaOH. De aanvankelijke glucose en ammoniumsulfaat-concentratie werden beide ingesteld op 100 mM. De productie in de tijd van de meest belangrijke uitgangsstoffen en producten (glucose, alanine en lactaat) is weergegeven in Fig. 4A. De fermentatie met 20 pNZ3900[pNZalaD] eindigt na 11 uur en geeft een mengsel van lactaat (88,6 mM), alanine (60 mM) en acetaat (8 mM) met een omleiding van het natieve metabolisme naar alanine van 36%.

Voorbeeld III: Alanineproductie in de LDH-deficiënte stam NZ3900/LDH' 25 [pNZalaD],

De twee-staps procedure van voorbeeld II werd gebruikt voor het onderzoeken van de alanineproductie in een LDH-deficiënte stam.

De invloed van de nisine A concentratie, de ammonium-concentratie, de toegepaste ammoniumnbron en de pH van het uitgangsmengsel werden onderzocht, 30 in wezen zoals beschreven in Voorbeeld II voor de LDH-positieve stam.

De productie van alanine houdt direct verband met de hoeveelheid nisine A in het medium gedurende het beladen van de cellen met alanine dehydrogenase (Fig. 3B). Bij maximale inductie zijn de eindproducten van glucose voornamelijk een 1008054 17 mengsel van acetoine en alanine, overeenkomend met een omleiding van het metabolisme van 50% (Tabel 1).

Bij constante nisine-concentratie houdt de geproduceerde hoeveelheid alanine levens verband met de cxtraccllulairc ammoniumconcentratic (traject 0 tot 200 mM 5 ammoniumacetaat, Fig. 3C), maar vergeleken met de LDH-positieve stam is een lagere concentratie van ammoniumionen vereist voor het verkrijgen van de alaninc-productie. Verder hebben de toegepaste ammoniumbron (ammoniumacetaat, ammoniumsulfaat of ammoniumchloride) en de pH van het uitgangsmengsel minder invloed op de uiteindelijke alanineconcentratie, dan met de wild-type stam (Fig. 3D 10 cn 3E). Maximale alanineproduclie wordt opnieuw verkregen bij een pH van het uitgangsmengsel van 8.

Het regelen van de pH lijkt van aanzienlijk belang voor de productie van alanine met de hier beschreven micro-organismcn. Een soorgelijke procedure als in Voorbeeld II werd toegepast, waarbij de pH op 7,5 werd gehouden. De 15 oorspronkelijke glucose en ammoniumsulfaatconccnlratie werden beide op 100 mM gehouden. Hel tijdsverloop van de belangrijkste uitgangsstoffen en producten (glucose, alanine en laclaat) is weergegeven in Fig. 4B. De fermentatie met NZ3900/LDH [pNZalaD] eindigt na 17 uur en resulteert voornamelijk in productie van alanine, overeenkomend met een omleiding van het metabolisme van 80%.

20 Verdere fermentaties met hogere concentraties ammoniumsulfaat werden uitgevoerd, daar 100 mM ammoniumsulfaat een beperkende factor zou kunnen zijn. Zo zou voor de volledige omzetting van 100 mM glucose in 200 mM alanine 200 mM ammoniumionen vereist zijn.

Derhalve werd een fermentatie met 150 mM ammoniumsulfaat 25 (overeenkomend met 300 mM ammoniumionen) uitgevoerd, waarbij een omzetting van glucose (100 mM) naar alanine (200 mM, 18 g/1) van in wezen 100% werd verkregen. Een monster genomen na 17 uur fermenteren werd geanalyseerd door ’’C NMR (Fig. 5), waarbij het alanine als een enkelvoudig product met een zuiverheid van bijna 99,5% werd verkregen.

30 De slam NZ9300 (LDH-), pNZalaD is op 16 januari 1998 gedeponeerd bij het

Centraal Bureau voor de Schimmelcultures (CBS) te Baarn.

Voorbeeld IV: Productie van L-alanine isomeren in stammen NZ3900/ALR' 10ü 8054 18 [pNZalaD] en NZ3900/LDH/ALR[pNZaIaD].

Het L-isomeer van alanine is het meest interessant voor practische toepassingen. Echter, L.lactis bevat een alanine racemase-activiteit. De productie 5 van zowel de L- als de D-isomeer in het eindproduct werd vastgesteld in de bij Voorbeelden II en III verkregen monsters, door middel van enzymatische assays die specifiek zijn voor ieder isomeer. Een mengsel van beide isomeren wordt verkregen, waarbij de D-isomeer ongeveer 10-15% van het eindproduct uitmaakt. Deze racemisatie is het resultaat van een enzymatische omzetting, daar de aanwezigheid 10 van specifieke remmers van alanine racemase activiteit gedurende de alanineproductie, zoals D-chlooralanine, leidt tot een aanzienlijke vermindering van de verkregen hoeveelheid D-isomeer (tot minder dan 3 %). Om deze racemisatie te voorkomen werd het alanine racemase gen (air) verstoord door homologe recombinatie. Hiertoe werd een "suicide disruption vector" als volgt geconstrueerd.

15 Een PCR fragment van ongeveer 660 bp, overeenkomend met het interne fragment van het air gen, werd verkregen onder toepassing van de volgende twee primers: primer 1: 5’-CGAGGATCCGGCCGGTTGAGGTTTCTAAAGCGG-3’ primer 2:5’-CGCGAGCTCACTTGTTTCATAAGTTGCACCGTAACC-3 ’.

20

Dit PCR fragment werd vervolgens geknipt met BamHI en SstI en in de overeenkomstige restrictieplaatsen van het "suicide"-plasmide pJDC9 (Chen en Morrison, Gene 64:155-165 (1988)) ingebracht. De alanine racemase-negatieve stammen van NZ3900[pNZalaD] en NZ3900/LDH'[pNZalaD] werden verkregen en 25 onderzocht op de productie van alleen L-alanine, in wezen volgens de procedures van Voorbeelden II en III. Beide deficiënte stammen produceerden in wezen uitsluitend de L-isomeer van alanine, volgens de enzymatische assays toegepast in Voorbeelden II en II.

30 Voorbeeld V: In situ productie van alanine.

Een B.subtilis alaD-gen wordt ingebracht in een lacF-nisine promotor plasmide, zodanig dat het stucturele gen onder de regeling van de nisinepromoter (nis A of nis F) wordt gebracht.

1008054 19

Dit plasmide wordt gebruikt voor het transformeren van een "food grade" LDH-deletie stam van L. lactis, die het wjFF-signaaltransductiesysteem bevat, door een twee-staps homologe recombinatie. Hierbij wordt een "food grade" L. lactis stam verkregen (LDH+ of LDH-), die het B.subtilis alaD-gen tot expressie brengt onder 5 regeling van de auto-induceerbare «w-promotor.

Alternatief het natieve, voor lactaat dehydrogenase-coderende gebied op het chromosomale DNA van de L. lactis stam worden vervangen door een voor het B.subtilis alaD coderende sequentie, bijvoorbeeld door op zichzelf bekende "gene replacement" technieken, en onder toepassing van een /acF-selectiemarkering in een 10 /acF-mutante stam, waarbij ook een L. lactis stam met "food grade" expressie van B.subtilis alaD kan worden verkregen.

De aldus verkregen alanine-producerende L. lactis stammen worden, eventueel na in vitro karakterisatie, toegepast in de bereiding van gefermenteerde melkproducten zoals karnemelk. Hierbij zal de alanine-producerende stam in de 15 regel als "adjunct starter" worden toegepast, naast de gebruikelijke verzuurders die normaal in starter cultures voor de fermentatie van dergelijke producten aanwezig zijn.

Tijdens de fermentatie, die verder op een op zichzelf bekende wijze wordt uitgevoerd, wordt de alanine-productie geïnduceerd door het toevoegen van een sub-20 inhibiterende hoeveelheid nisine aan het medium.

Aldus wordt een karnemelk verkregen met een verhoogd alaninegehalte en hierdoor een zoetere smaak dan gebruikelijke karnemelk.

De alanine-producerende L. lactis stammen kunnen ook worden toegepast/onderzocht in een Gouda kaas modelsysteem (CH-EASY model), waarbij 25 de gevormde hoeveelheid alanine in het gefermenteerde product, alsmede de smaak en de overige eigenschappen van de kaas, worden bepaald afhankelijk van factoren zoals de fermentatieomstandigheden en de gebruikte nisine-concentratie in het medium.

1 0 0 S G 5 4 "

Claims (24)

1. Werkwijze voor het bereiden van alanine, in het bijzonder L-alanine, door het kweken van een genetisch gemodificeerd micro-organisme, dat alanine kan 5 produceren uitgaande van glucose, met het kenmerk, dat als het micro-organisme een micro-organisme wordt toegepast, waarin het natieve suikermetabolisme is omgeleid naar de vorming van alanine, in het bijzonder L-alanine, zodanig dat in wezen meer dan 40%, bij voorkeur meer dan 60 %, met meer voorkeur meer dan 75% van de verbruikte koolstof uit het medium wordt omgezet in alanine.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij in het micro-organisme de natieve metabolische omzetting(en) van pyruvaat zijn omgeleid naar de vorming van alanine, waarbij in wezen meer dan 40 %, bij voorkeur meer dan 60 %, met meer voorkeur meer dan 75% van het gevormde pyruvaat, op basis van koolstof, in alanine wordt omgezet.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de omleiding van het natieve suiker- of pyruvaatmetabolisme naar de vorming van alanine wordt uitgevoerd door een (versterkte) alanine-producerende activiteit aan het micro-organisme te verlenen, en bij voorkeur tegelijkertijd de natieve omzetting(en) van pyruvaat te verstoren of te onderdrukken.

4. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, waarbij het micro- organisme een micro-organisme met een genetische deficiëntie in de natieve omzetting(en) van pyruvaat is, waarin een of meer homologe of heterologe genen, die coderen voor een alanine-vormend enzym, tot (verhoogde) expressie worden gebracht.

5. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, waarbij het micro- organisme een homo-fermentatief micro-organisme is, in het bijzonder een melkzuurbacterie, meer in het bijzonder (een stam van) L. lactis is.

6. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, waarbij het alanine-vormende enzym een alanine-dehydrogenase is, bij voorkeur een alanine 30 dehydrogenase uit een melkzuurbacterie, dan wel uit een bacterie van het genus Bacillus, in het bijzonder Bacillus sphaericus.

7. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, waarbij een eventueel natief in het micro-organisme aanwezige alanine racemase activiteit is onderdrukt. 1008C54

8. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, waarbij het micro-organisme een "food grade" micro-organisme is.

9. Micro-organisme voor toepassing bij de werkwijze volgens een der conclusies 1-8, zijnde een micro-organisme dat een alanine-producerende activiteit 5 tot verhoogde expressie kan brengen, vergeleken met het natieve micro-organisme, en dat genetisch deficiënt is in enig concurrerend natief metabolisme.

10. Micro-organisme volgens conclusie 9, dat een L-alanine dehydrogenase tot verhoogde expressie kan brengen, en dat deficient is in het natieve pyruvaat-metabolisme, in het enzym lactaat dehydrogenase.

11. Werkwijze voor het bereiden van alanine, in het bijzonder L-alanine, door het kweken van een alanine-producerend genetisch gemodificeerd micro-organisme, waarbij als het micro-organisme een micro-organisme wordt toegepast, dat een gen bevat dat codeert voor een alanine-producerend enzym, onder regeling van een in het micro-organisme werkzame auto-induceerbare promoter, waarbij deze promoter 15 afkomstig is van een gencluster die codeert voor een anti-microbieel peptide of een soortgelijk signaaleiwit.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij de promoter een promoter van de nisine-gencluster in L. lactis is, in het bijzonder de nisA of nisF promotor.

13. Werkwijze volgens conclusies 11 of 12, waarbij het micro-organisme een 20 homo-fermentatief micro-organisme is, in het bijzonder een melkzuurbacterie, meer in het bijzonder (een stam van) L. lactis is.

14. Werkwijze volgens een der conclusies 11-13 voor de in situ productie van alanine tijdens de bereiding van voedselproducten.

15. Recombinant DNA molecule of sequentie, omvattende een gen dat 25 codeert voor een alanine-producerend enzym, dat op werkzame wijze is verbonden met een auto-induceerbare promotor, waarbij de promoter afkomstig is van een gencluster die codeert voor een anti-microbieel peptide of een soortgelijk signaaleiwit.

16. Recombinant DNA molecule of sequentie volgens conclusie 15, zijnde 30 een vector, zoals een plasmide.

17. Recombinant DNA molecule of sequentie volgens conclusie 15 of 16, waarbij de auto-induceerbare promotor een promoter van de nisine gencluster in L. lactis is, in het bijzonder de nisA of nisF promotor. 1 0 0 8 ü 5 4

18. Recombinant DNA molecule of sequentie volgens een der conclusies 15-17, waarbij het gen voor het alanine-producerende enzym een voor een L-alanine dehydrogenase coderend gen is.

19. Micro-organisme, in het bijzonder een melkzuurbacterie of een ander 5 homo-fermentatief micro-organisme, omvattende een recombinant DNA molecule of sequentie volgens een der conclusies 7-11.

20. Micro-organisme volgens conclusie 12, zijnde een "food grade" micro-organisme.

21. Starter culture voor de bereiding van gefermenteerde producten, in het 10 bijzonder gefermenteerde voedselproducten, die ten minste een micro-organisme volgens een der conclusies 9, 10 en/of 19 bevat, en eventueel verdere micro-organismen die op zichzelf bekend zijn als verzuurders voor de beoogde fermentatie.

22. Starter culture volgens conclusie 21, waarbij het micro-organisme volgens conclusie 9, 10 en/of 19 aanwezig is als "adjunct starter".

23. Toepassing van een micro-organisme volgens een der conclusies 9, 10, 18 en/of 19, en/of een starter culture volgens conclusie 21 of 22, bij de bereiding van alanine, in het bijzonder L-alanine, en/of alanine-bevattende voedingsmiddelen, gezondheidsbevorderende preparaten en/of toevoegsels hiervoor.

24. Alanine, verkregen volgens de werkwijze volgens een der conclusies 1-8 20 of 11-14, of de toepassing volgens conclusie 23; alsmede preparaten, in het bijzonder voedingsmiddelen, gezondheidsbevorderende preparaten en/of toevoegsels hiervoor, die dit alanine bevatten. 1008054