JPS6279788A - アミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸の製造法Info
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- JPS6279788A JPS6279788A JP22142485A JP22142485A JPS6279788A JP S6279788 A JPS6279788 A JP S6279788A JP 22142485 A JP22142485 A JP 22142485A JP 22142485 A JP22142485 A JP 22142485A JP S6279788 A JPS6279788 A JP S6279788A
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- brevibacterium
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- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１、２
，１，１１ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙ
ｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：以下ＡＳＤと略す
）はβ−アスパラチルリン酸からアスパラギン酸β−セ
ミアルデヒド（以下、 ＡＳＡと略す）への生合成経
路を触媒する酵素であり、ＡＳＡを前駆体とするアミノ
酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシンなどの
生産に重要な役割を持っている。また、アスパラギン酸
アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，６，１，１ａｓｐ
ａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：
以下ΔΔＴと略す）はオキザロ酢酸にアミノ基を転移す
る酵素であり、アスパラギン酸の供給に重要な役割を果
たしている。従って、アスパラギン酸を前駆体とするア
ミノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシンな
どの生産にも重要な役割をもっている。本発明は、ＡＳ
ＤまたはＡＡＴをコードする遺伝子とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属するコリネ型細菌に保有させ、該微
生物を培養することによってＬ−リジン、Ｌ−スレオニ
ンおよびＬ−インロイシンを生産する方法に関する。本
発明は医薬、家畜飼料、食品工業にふいて特に有用な上
記アミノ酸の製造分野に対して有用な手段を提供する。
，１，１１ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙ
ｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：以下ＡＳＤと略す
）はβ−アスパラチルリン酸からアスパラギン酸β−セ
ミアルデヒド（以下、 ＡＳＡと略す）への生合成経
路を触媒する酵素であり、ＡＳＡを前駆体とするアミノ
酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシンなどの
生産に重要な役割を持っている。また、アスパラギン酸
アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２，６，１，１ａｓｐ
ａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：
以下ΔΔＴと略す）はオキザロ酢酸にアミノ基を転移す
る酵素であり、アスパラギン酸の供給に重要な役割を果
たしている。従って、アスパラギン酸を前駆体とするア
ミノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロイシンな
どの生産にも重要な役割をもっている。本発明は、ＡＳ
ＤまたはＡＡＴをコードする遺伝子とベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属するコリネ型細菌に保有させ、該微
生物を培養することによってＬ−リジン、Ｌ−スレオニ
ンおよびＬ−インロイシンを生産する方法に関する。本
発明は医薬、家畜飼料、食品工業にふいて特に有用な上
記アミノ酸の製造分野に対して有用な手段を提供する。
従来の技術
］リネ型細菌を用いた発酵法によるし一リジン生産には
、ホモセリン要求性変異株、リジンのアナログ物質に対
する耐性変異株あるいはこれらの変異を併有する菌株が
利用されている。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシ
ン生産には、それぞれスレオニンおよびインロイシンの
アナログ物質に対する耐性株が用いられている（Ｎａｋ
ａｙａｍａ、 Ｋ。
、ホモセリン要求性変異株、リジンのアナログ物質に対
する耐性変異株あるいはこれらの変異を併有する菌株が
利用されている。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシ
ン生産には、それぞれスレオニンおよびインロイシンの
アナログ物質に対する耐性株が用いられている（Ｎａｋ
ａｙａｍａ、 Ｋ。
Ｉｎ Ｇ、Ｒｅａｄ （ｅｄ、）、 Ｐｒｅｓｃｏｔｔ
ａｎｄ Ｄｕｎｎ、 ：インダストリアル・マイク
ロバイオロジイ（ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ）、 ４ｔｈ ｅｄ、 ｐ、７４８
（１９８２） ＾ＶＩＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、
、 Ｗｅｓｔｐｏｒｔ、Ｃｏｎｎ、 ） 。さらに、
組換えＤＮＡ技術によりコリネ型細菌のリジン、スレオ
ニンまたはインロイシン生合成に係る遺伝子の組換え体
ＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを保有させた菌株により上記
アミノ酸を製造する方法も特許出願されている（特願昭
６０−４７５１７および特願昭６Ｏ−１２１６７４） 発明が解決しようとする問題点 近年、リジン、スレオニン、インロイシンの需要が増大
するにつれて、その製造法の改善が強く望まれている。
ａｎｄ Ｄｕｎｎ、 ：インダストリアル・マイク
ロバイオロジイ（ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ）、 ４ｔｈ ｅｄ、 ｐ、７４８
（１９８２） ＾ＶＩＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、
、 Ｗｅｓｔｐｏｒｔ、Ｃｏｎｎ、 ） 。さらに、
組換えＤＮＡ技術によりコリネ型細菌のリジン、スレオ
ニンまたはインロイシン生合成に係る遺伝子の組換え体
ＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを保有させた菌株により上記
アミノ酸を製造する方法も特許出願されている（特願昭
６０−４７５１７および特願昭６Ｏ−１２１６７４） 発明が解決しようとする問題点 近年、リジン、スレオニン、インロイシンの需要が増大
するにつれて、その製造法の改善が強く望まれている。
本発明者らは、このような状況を考慮し、組換えＤＮＡ
技術を有効に活用し、すぐれたリジン、スレオニンまた
はイソロイシン生産菌株を造成するため鋭意研究を重ね
た。
技術を有効に活用し、すぐれたリジン、スレオニンまた
はイソロイシン生産菌株を造成するため鋭意研究を重ね
た。
問題点を解決するための手段
］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
のＡＳＤまたはＡＡＴをコードする遺伝子とベクターＤ
ＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネ型細菌に保有させれば
、リジン、スレオニンまたはインロイシンの生産性が向
上することを見出し、本発明を完成した。
のＡＳＤまたはＡＡＴをコードする遺伝子とベクターＤ
ＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネ型細菌に保有させれば
、リジン、スレオニンまたはインロイシンの生産性が向
上することを見出し、本発明を完成した。
以下に、本発明の詳細な説明する。
本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のＡＳＤまたはＡＡＴの合成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの
組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、
培養物中にＬ−リジン、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イン
ロイシンを生成蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採
取することを特徴とするし一リジン、Ｌ−スレオニンお
よびＬ−イソロイシンの製造法を提供する。
ウム属に属する微生物のＡＳＤまたはＡＡＴの合成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの
組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、
培養物中にＬ−リジン、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イン
ロイシンを生成蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採
取することを特徴とするし一リジン、Ｌ−スレオニンお
よびＬ−イソロイシンの製造法を提供する。
宿主微生物としては、コリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属などのコリネ型細菌は全て用いることがで
きるが、好適には下記の菌株が用いられる。
クテリウム属などのコリネ型細菌は全て用いることがで
きるが、好適には下記の菌株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス＾ＴＣＣ１３８６８
コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０
ブレビバクテリウム・ディバリカラムＡＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６
７ブレピバクテリウム・イマリオフィラム＾ＴＣＣ１４
０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１５
３５４ 通常、これらの微生物から誘導されるリジン、スレオニ
ンまたはイソロイシン生産性変異株を用いる。これらの
変異株は、アナログ耐性変異の付与などの公知の方法に
よって造成できる。
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス＾ＴＣＣ１３８６８
コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０
ブレビバクテリウム・ディバリカラムＡＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６
７ブレピバクテリウム・イマリオフィラム＾ＴＣＣ１４
０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１５
３５４ 通常、これらの微生物から誘導されるリジン、スレオニ
ンまたはイソロイシン生産性変異株を用いる。これらの
変異株は、アナログ耐性変異の付与などの公知の方法に
よって造成できる。
本発明において、ＡＳＤまたはＡＡＴをコードする遺伝
子の供給源となる微生物としては、コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属し、ＡＳＤまたはＡ
ＡＴの活性を有するものであればいかなる微生物でもよ
く、例えばコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣ
Ｃ３１８３３を用いることができる。
子の供給源となる微生物としては、コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属し、ＡＳＤまたはＡ
ＡＴの活性を有するものであればいかなる微生物でもよ
く、例えばコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣ
Ｃ３１８３３を用いることができる。
ＡＳＤまたはＡＡＴをコードする遺伝子の供給源となる
染色体ＤＮＡは、ＡＳＤまたはＡＡＴの活性を有する微
生物から、本発明者らが特開昭５８−１２６７８９に示
した方法に従って単離できる（具体的には実施例に示す
）。
染色体ＤＮＡは、ＡＳＤまたはＡＡＴの活性を有する微
生物から、本発明者らが特開昭５８−１２６７８９に示
した方法に従って単離できる（具体的には実施例に示す
）。
ベクターとしては、コリネ型細菌中で複製できるもので
あれば特に限定されないが、例えば本発明者が先に開発
したプラスミドｐｃＧ１（特開昭５７−１３４５００）
、ｐｃＧ２ （特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４、
ｐｃｃｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９）、ｐ
ＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５
９９９）ｐｃＥ５１（特開昭６Ｏ−３４１９７）および
ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３（いずれもモレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍａｔ、 Ｇｅｎ。
あれば特に限定されないが、例えば本発明者が先に開発
したプラスミドｐｃＧ１（特開昭５７−１３４５００）
、ｐｃＧ２ （特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４、
ｐｃｃｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９）、ｐ
ＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５
９９９）ｐｃＥ５１（特開昭６Ｏ−３４１９７）および
ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３（いずれもモレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍａｔ、 Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、） １９６．１７５（１９８４） Ｅな
どが用いられる。
どが用いられる。
ＡＳＤをコードする遺伝子とベクターとの組換え体ＤＮ
Ａは、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの試験管内組換
え混合物を用いて、通常の変異操作により誘導されるＡ
ＳＤ活性の欠損したコリネ型細菌を形質転換し、ＡＳＤ
活性欠損に基づくホモセリンおよびジアミノピメリン酸
要求性が復帰した形質転換株を選択することによって取
得できる。特にｐＣＥ５３のようなニジエリシア・コリ
とコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトルベクターを
使用する場合は、ニジエリシア・コリのＡＳＤ欠損変異
の相補性によってＡＳＤの遺伝子をクローニングした後
、コリネ型細菌に導入することもできる。
Ａは、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの試験管内組換
え混合物を用いて、通常の変異操作により誘導されるＡ
ＳＤ活性の欠損したコリネ型細菌を形質転換し、ＡＳＤ
活性欠損に基づくホモセリンおよびジアミノピメリン酸
要求性が復帰した形質転換株を選択することによって取
得できる。特にｐＣＥ５３のようなニジエリシア・コリ
とコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトルベクターを
使用する場合は、ニジエリシア・コリのＡＳＤ欠損変異
の相補性によってＡＳＤの遺伝子をクローニングした後
、コリネ型細菌に導入することもできる。
ＡＡＴをコードする遺伝子とベクターとの組換え体ＤＮ
Ａは、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの試験管内組換
え混合物を用いて、通常の変異操作により誘導されるＡ
ＡＴ活性の欠損したコリネ型細菌を形質転換し、ＡＡＴ
活性欠損に基づくアスパラギン酸要求性が復帰した形質
転換株を選択、することによって取得できる。特にｐＣ
Ｅ５３のようなニジエリシア・コリとコリネ型細菌の両
方で複製可能なシャトルベクターを使用する場合は、ニ
ジエリシア・コリのアミノトランスフェラーゼ欠損変異
の相補性によってＡＡＴの遺伝子をクローニングした後
、コリネ型細菌に導入することもできる。
Ａは、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの試験管内組換
え混合物を用いて、通常の変異操作により誘導されるＡ
ＡＴ活性の欠損したコリネ型細菌を形質転換し、ＡＡＴ
活性欠損に基づくアスパラギン酸要求性が復帰した形質
転換株を選択、することによって取得できる。特にｐＣ
Ｅ５３のようなニジエリシア・コリとコリネ型細菌の両
方で複製可能なシャトルベクターを使用する場合は、ニ
ジエリシア・コリのアミノトランスフェラーゼ欠損変異
の相補性によってＡＡＴの遺伝子をクローニングした後
、コリネ型細菌に導入することもできる。
コリネ型細菌へ組換え体ＤＮＡを導入する形質転換法と
しては本発明者らが開発したプロトプラストを使用する
方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１
８６４８９、具体的には実施例に示す）により実施する
ことができる。
しては本発明者らが開発したプロトプラストを使用する
方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１
８６４８９、具体的には実施例に示す）により実施する
ことができる。
これら組換え体プラスミド保有株によるリジン、スレオ
ニンまたはイソロイシン生産は、従来のこれらアミノ酸
の発酵法に用いられる培養方法に従って行うことができ
る。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物
、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好
気的条件下に、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行え
ば、培養物中に目的とするアミノ酸が蓄積するのでこれ
を採取する。
ニンまたはイソロイシン生産は、従来のこれらアミノ酸
の発酵法に用いられる培養方法に従って行うことができ
る。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物
、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好
気的条件下に、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行え
ば、培養物中に目的とするアミノ酸が蓄積するのでこれ
を採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ホリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水素
、アルコール類なども用いうる。特に廃糖蜜は好適に用
いられる。
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ホリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水素
、アルコール類なども用いうる。特に廃糖蜜は好適に用
いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種アンモニウム塩類あるいは尿素等の窒素含
有物質ならびにペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵
母エキス、コーン・スチーブ・リカー、カゼイン加水分
解物、フィツシユミールあるいはその消化物、蛸加水分
解物など種々のものが使用可能である。
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種アンモニウム塩類あるいは尿素等の窒素含
有物質ならびにペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵
母エキス、コーン・スチーブ・リカー、カゼイン加水分
解物、フィツシユミールあるいはその消化物、蛸加水分
解物など種々のものが使用可能である。
さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化す） ＩＪウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どの塩類を使用する。微生物の生育に必要なビタミン、
アミノ酸などは前記したような他の培地成分によって、
必要量が供給されれば特に加えなくてもよい。
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化す） ＩＪウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どの塩類を使用する。微生物の生育に必要なビタミン、
アミノ酸などは前記したような他の培地成分によって、
必要量が供給されれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養時のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養時のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−リジン、Ｌ−
スレオニンｔ タＩｔ Ｌ−インロイシンが蓄積する。
スレオニンｔ タＩｔ Ｌ−インロイシンが蓄積する。
培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養物中に蓄積したアミノ酸
を回収する。
脂処理などの公知の方法で培養物中に蓄積したアミノ酸
を回収する。
このようにして、ＡＳＤまたはＡＡＴをコードする遺伝
子を含む組換え体ＤＮＡを保有させたコリネ型細菌を用
いることにより、非保有株に比べ高い収率でＬ−リジン
、Ｌ−スレオニンおヨヒＬ−インロイシンを生産するこ
とができる。本発明の実施例にふいてはコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのし一リジン、Ｌ−スレオニンおよ
びＬ−イソロイシン生産菌に、それぞれコリネバクテリ
ウム・グルタミクム由来のＡＳＤまたはＡＡＴをコード
する遺伝子を保有させることで、これらアミノ酸の生産
能を強化する方法について記載しであるが、本発明者ら
が先に示したように（特開昭５７−１８３７９９、特願
昭５９−６８６６９）、コリネバクテリウム属細菌の遺
伝子およびプラスミドベクターはブレビバクテリウム属
細菌中でも機能することが知られており、本発明はブレ
ビバクテリウム属細菌にも適用可能であることは明白で
ある。
子を含む組換え体ＤＮＡを保有させたコリネ型細菌を用
いることにより、非保有株に比べ高い収率でＬ−リジン
、Ｌ−スレオニンおヨヒＬ−インロイシンを生産するこ
とができる。本発明の実施例にふいてはコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのし一リジン、Ｌ−スレオニンおよ
びＬ−イソロイシン生産菌に、それぞれコリネバクテリ
ウム・グルタミクム由来のＡＳＤまたはＡＡＴをコード
する遺伝子を保有させることで、これらアミノ酸の生産
能を強化する方法について記載しであるが、本発明者ら
が先に示したように（特開昭５７−１８３７９９、特願
昭５９−６８６６９）、コリネバクテリウム属細菌の遺
伝子およびプラスミドベクターはブレビバクテリウム属
細菌中でも機能することが知られており、本発明はブレ
ビバクテリウム属細菌にも適用可能であることは明白で
ある。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１
（１） コリネバクテリウム・グルタミクムのＡＳＤ
をコードする遺伝子のクローニング クローニングはニジエリシア・コリに１２株の宿主−ベ
クター系にて実施した。供与体ＤＮＡである染色体ＤＮ
Ａはコリネバクテリウム・グルタミクムΔＴＣＣ１３０
３２から本発明者が先に示した方法〔特開昭５８−１２
６７８９）に従って単離した。すなわち、ＮＢ培地（粉
末ブイヨン２０ｇ１酵母エキス５ｇを水１１に含み、ｐ
Ｈ７，２に調整した培地）で堆層したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の種培養を４０
０ｍｌの半合成培地ＳＳＭ〔グルコース２０ｇ、（ＮＨ
４）２Ｓ０４ Ｌｏｇ、尿素３ｇ。
をコードする遺伝子のクローニング クローニングはニジエリシア・コリに１２株の宿主−ベ
クター系にて実施した。供与体ＤＮＡである染色体ＤＮ
Ａはコリネバクテリウム・グルタミクムΔＴＣＣ１３０
３２から本発明者が先に示した方法〔特開昭５８−１２
６７８９）に従って単離した。すなわち、ＮＢ培地（粉
末ブイヨン２０ｇ１酵母エキス５ｇを水１１に含み、ｐ
Ｈ７，２に調整した培地）で堆層したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の種培養を４０
０ｍｌの半合成培地ＳＳＭ〔グルコース２０ｇ、（ＮＨ
４）２Ｓ０４ Ｌｏｇ、尿素３ｇ。
酵母エキス１ ｇＳＫＨ２ＰＯ４１ｇＳＭｇＣｊ！２・
６Ｈ２００，４ｇ、Ｆｅ３Ｏ３−７ＨｚＯ１０ｍｇＳＭ
ｎｓｏ４・４〜６Ｈ２００，２ｍｇ５ＺｎＳＯ４・７Ｈ
２００，９＋＋＋ｇ、Ｃｕ５Ｏｎ ・５ Ｈ２００，４
ｍｇ、 Ｎ ａ２Ｂ４０ｒ ・１０ Ｈ２Ｏ０，０９ｍ
ｇ、（ＮＨ４）６ＭＯ？０２４・４Ｈ２００、０４ｍｇ
、ビオチン３０μｇ１サイアミン塩酸塩１ｍｇを水１β
に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地〕に接種して３０
℃で振盪培養した。東京光電社製比色計で６６０ｎｍに
おける吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になった
時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍｌの濃度となるよ
うに添加した。さらに培養を続け、ＯＤが０．６となる
まで生育させた。
６Ｈ２００，４ｇ、Ｆｅ３Ｏ３−７ＨｚＯ１０ｍｇＳＭ
ｎｓｏ４・４〜６Ｈ２００，２ｍｇ５ＺｎＳＯ４・７Ｈ
２００，９＋＋＋ｇ、Ｃｕ５Ｏｎ ・５ Ｈ２００，４
ｍｇ、 Ｎ ａ２Ｂ４０ｒ ・１０ Ｈ２Ｏ０，０９ｍ
ｇ、（ＮＨ４）６ＭＯ？０２４・４Ｈ２００、０４ｍｇ
、ビオチン３０μｇ１サイアミン塩酸塩１ｍｇを水１β
に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地〕に接種して３０
℃で振盪培養した。東京光電社製比色計で６６０ｎｍに
おける吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になった
時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍｌの濃度となるよ
うに添加した。さらに培養を続け、ＯＤが０．６となる
まで生育させた。
菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液（０，０３Ｍ）リス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略す）、０
．００５Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム）、０．０５ＭＮａ（Ｊ！５ｐＨ８，０）で洗
浄後、リゾチーム溶液（２５％ショ糖、０．ＩＭ Ｎ
ａＣｆ、０．０５Ｍトリス、０．８ ｍ＋ｒ／＋ｎｌリ
ゾチーム、ｐ Ｈ８，０、以下同じ）１０ｍｌに懸濁し
、３７℃で４時間反応させた。リゾチーム処理菌体を集
菌し、斎藤−三浦の方法〔バイオキミ力・工・バイオフ
ィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
＾ｃｔａ） 、ユ、６１９９（１９６３） ）に従って
染色体ＤＮＡを単離した。
ロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略す）、０
．００５Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム）、０．０５ＭＮａ（Ｊ！５ｐＨ８，０）で洗
浄後、リゾチーム溶液（２５％ショ糖、０．ＩＭ Ｎ
ａＣｆ、０．０５Ｍトリス、０．８ ｍ＋ｒ／＋ｎｌリ
ゾチーム、ｐ Ｈ８，０、以下同じ）１０ｍｌに懸濁し
、３７℃で４時間反応させた。リゾチーム処理菌体を集
菌し、斎藤−三浦の方法〔バイオキミ力・工・バイオフ
ィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
＾ｃｔａ） 、ユ、６１９９（１９６３） ）に従って
染色体ＤＮＡを単離した。
ベクタープラスミドはニジエリシア・コリとコリネバク
テリウム・グルタミクムのンヤトルブラスミドｐＣＥ５
３（モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティク
ス（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）。
テリウム・グルタミクムのンヤトルブラスミドｐＣＥ５
３（モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティク
ス（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）。
旦ａ 、１７５（１９８４） ）を用いた。同プラス
ミドは、ニジエリシア・コリのベクタープラスミドｐＧ
Ａ２２［ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｈ４０，４００（１９７９）、同
プラスミド保有菌株ニジエリシア・コリに５７は工業技
術院微生物工業技術研究所（微工研ンに昭和６０年９月
４日付でＦＥＲＭ−ＢＰ８９８として寄託しである〕の
カナマイシン耐性遺伝子近傍の制限酵素ＢａｍＨｒ切断
部位にコリネバクテリウム・グルタミクムのベクタープ
ラスミドｐｃＧ１（特開昭５７−１３４５００）のＢｇ
ＩｌＩＩ切断産物を挿入させて作製した多剤耐性（カナ
マイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、
アンピシリン）のシャトルプラスミドである（第１図参
照）。ｐＣＥ５３は、同プラスミドを保有するニジエリ
シア・コリに１２株からシイ・アン（Ｇ、 Ａｎ）らの
方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ。
ミドは、ニジエリシア・コリのベクタープラスミドｐＧ
Ａ２２［ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｈ４０，４００（１９７９）、同
プラスミド保有菌株ニジエリシア・コリに５７は工業技
術院微生物工業技術研究所（微工研ンに昭和６０年９月
４日付でＦＥＲＭ−ＢＰ８９８として寄託しである〕の
カナマイシン耐性遺伝子近傍の制限酵素ＢａｍＨｒ切断
部位にコリネバクテリウム・グルタミクムのベクタープ
ラスミドｐｃＧ１（特開昭５７−１３４５００）のＢｇ
ＩｌＩＩ切断産物を挿入させて作製した多剤耐性（カナ
マイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、
アンピシリン）のシャトルプラスミドである（第１図参
照）。ｐＣＥ５３は、同プラスミドを保有するニジエリ
シア・コリに１２株からシイ・アン（Ｇ、 Ａｎ）らの
方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１４０．４００（１９７９）
）に従い、単離した。
）に従い、単離した。
上記で調製したｐＣＥ５３プラスミドＤＮＡ ４眉を含
む制限酵素反応液（１０ｍＭ）リス−塩酸、６ｍＭ
ＭｇＣｌ１ｚ 、１００ｍＭＮａＣｌ１゜２ｍＭ ２
−メルカプトエタノーノｂ、ｐＨ８，０）５０ρに８単
位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加え３７℃で
６０分間反応させた。同様に、染色体ＤＮＡ４■を含む
制限酵素反応液５０ρに８単位の制限酵素Ｂｇｊ２Ｉ［
（宝酒造社製）を加え、３７℃６０分間反応させた。各
々６５℃で１０分間加温して反応を停止させた後、混和
し、さらにＴ４’Ｊガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ）リス
−塩酸、５５ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１ａ、１００ｍＭ
ジチオスレイトール、ｐ Ｈ７，６＞３０ｍ、５ｍＭ
ＡＴＰ３０ＡＩ！、Ｔ４リガーゼ１単位（宝酒造社製
）およびＨ２０１４０ρを加え、４℃で２４時間反応さ
せた。反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た。
む制限酵素反応液（１０ｍＭ）リス−塩酸、６ｍＭ
ＭｇＣｌ１ｚ 、１００ｍＭＮａＣｌ１゜２ｍＭ ２
−メルカプトエタノーノｂ、ｐＨ８，０）５０ρに８単
位の制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加え３７℃で
６０分間反応させた。同様に、染色体ＤＮＡ４■を含む
制限酵素反応液５０ρに８単位の制限酵素Ｂｇｊ２Ｉ［
（宝酒造社製）を加え、３７℃６０分間反応させた。各
々６５℃で１０分間加温して反応を停止させた後、混和
し、さらにＴ４’Ｊガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ）リス
−塩酸、５５ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ１ａ、１００ｍＭ
ジチオスレイトール、ｐ Ｈ７，６＞３０ｍ、５ｍＭ
ＡＴＰ３０ＡＩ！、Ｔ４リガーゼ１単位（宝酒造社製
）およびＨ２０１４０ρを加え、４℃で２４時間反応さ
せた。反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た。
同リガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
受容菌としてはＡＳＤ欠損変異および宿主特異的制限欠
損変異を併せ持つニジエリシア・コリに１２株亜株Ｋ
５８ （Ｐ−ａｓｄ ｈｓｄ Ｒ）を用いた。
損変異を併せ持つニジエリシア・コリに１２株亜株Ｋ
５８ （Ｐ−ａｓｄ ｈｓｄ Ｒ）を用いた。
同株は微工研に昭和６０年９月４日付でＦＥＲＭ−ＢＰ
８９９として寄託されている。同株のコンピテントな
細胞はエム・ダジェルト（Ｍ。
８９９として寄託されている。同株のコンピテントな
細胞はエム・ダジェルト（Ｍ。
Ｄａｇｅｒｔ） らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ） 、
６ 、２３ 。
６ 、２３ 。
（１９７９） ）に従って調製した。
コンピテントな細胞１０’／＋＋＋１を含む液０．２１
１１１に上記で調製したりガーゼ反応混合物１００μＱ
を加え、水冷下１０分間放置した。次いで３７℃で５分
間加温処理した後、Ｌ Ｂ培地（バクトドリブトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ１塩化ナトリウム５ｇおよびブドウ
糖１ｇを水１１に含み、ｐＨ７゜２に調整した培地）２
ｍｌを加え３０℃で１２０分間静置した。菌体を生理食
塩水で２回遠心洗浄後、５０■／ｍｌのアンピシリンを
含むＭ９平板培地（ブドウ糖２ｇ、ＮＨａＣＩ２ １ｇ
、ＮａｘＨＰ○４ ６ ｇＳＫＨ２Ｐ０４ ３ｇ１Ｍｇ
５Ｏ１’７ＨｚＯ０，１ｇ、ＣａＣＣ・２Ｈ２０１５ｍ
ｇ、サイアミン塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５ｇを水１１
に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地）に塗布した。Ｍ
９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１０
０Ｊ１ｇ／ｍｌあるいはテトラサイクリン２０■／ｍｌ
を含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地で
生育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロニ
ーを選択した。
１１１に上記で調製したりガーゼ反応混合物１００μＱ
を加え、水冷下１０分間放置した。次いで３７℃で５分
間加温処理した後、Ｌ Ｂ培地（バクトドリブトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ１塩化ナトリウム５ｇおよびブドウ
糖１ｇを水１１に含み、ｐＨ７゜２に調整した培地）２
ｍｌを加え３０℃で１２０分間静置した。菌体を生理食
塩水で２回遠心洗浄後、５０■／ｍｌのアンピシリンを
含むＭ９平板培地（ブドウ糖２ｇ、ＮＨａＣＩ２ １ｇ
、ＮａｘＨＰ○４ ６ ｇＳＫＨ２Ｐ０４ ３ｇ１Ｍｇ
５Ｏ１’７ＨｚＯ０，１ｇ、ＣａＣＣ・２Ｈ２０１５ｍ
ｇ、サイアミン塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５ｇを水１１
に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地）に塗布した。Ｍ
９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１０
０Ｊ１ｇ／ｍｌあるいはテトラサイクリン２０■／ｍｌ
を含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地で
生育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロニ
ーを選択した。
選択した形質転換株から前記のシイ・アン（Ｇ、Ａｎ）
らの方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一
株から得たプラスミドｐＡＳＤ２を各種制限酵素で消化
後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５
３の唯一ケ所のＢａｍＨＩ切断部位に約７．７ Ｋ ｂ
のＢｇＡＩｒ ＤＮＡ断片が挿入した構造を有してい
ることが判明した（第１図参照）。
らの方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一
株から得たプラスミドｐＡＳＤ２を各種制限酵素で消化
後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５
３の唯一ケ所のＢａｍＨＩ切断部位に約７．７ Ｋ ｂ
のＢｇＡＩｒ ＤＮＡ断片が挿入した構造を有してい
ることが判明した（第１図参照）。
さらに、ｐＡＳＤ２を用いてに５８株を再形質転換した
とき、同株のホモセリンおよびジアミノピメリン酸要求
性が回復することから１）ＡＳＤ２プラスミド上にはコ
リネバクテリウム・グルタミクム由来のＡＳＤをコード
する遺伝子がクローン化されていることが明らかとなっ
た。
とき、同株のホモセリンおよびジアミノピメリン酸要求
性が回復することから１）ＡＳＤ２プラスミド上にはコ
リネバクテリウム・グルタミクム由来のＡＳＤをコード
する遺伝子がクローン化されていることが明らかとなっ
た。
（２） コリネバクテリウム・グルタミクムＲ８６株
へのｐＡＳＤ２プラスミドの導入 リジン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミクム
ＲＨ６（特顎昭６０−４７５１７、ＦＥＲＭ ＢＰ−
７０４）をＮＢ培地にて３０℃で１６時間振盪培養した
。同培養液をホモセリン２０Ｌｃｇ／ｍｌを補った３３
Ｍ培地に接種し、３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．２
になった時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍｌになる
ように添加した。さらに培養を続け、ＯＤが０．６にな
った時点で集菌し、ＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、ＫＨ２Ｐ○４１．
５ｇ、に２ＨＰ○４３．５ｇ−ＭｇＣｊ！２・６ Ｈ２
Ｏ０，４１ｇＳＦ ｅ Ｓｏ４’ ７Ｈ２０１０ｍｇ５
Ｍｎ５Ｏ＜’ ４〜６ＨｚＯ２ｍｇＳ Ｚ ｎ ＳＯ４
・７ Ｈ２Ｏ０，９ｍｇ５ Ｃｕ ５０４・５Ｈ２００
，４ｍｇ５ ＮａｚＢ＜Ｏｉ・ １０Ｈ２００゜０９
ｍｇ、 （ＮＨ４）６Ｍ ０１０２４−４ Ｈ２Ｏ０，
０４ｍｇ、ビオチン３０ＪｕＺ、サイアミン塩酸塩２ｍ
ｇ％コハク酸２ナトリウム１３５ ｇ、ポリビニルピロ
リドンに１５（東京化成社製）３０ｇを水１βに含みｐ
Ｈ７，３に調整した培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチー
ムを添加した液に約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁
し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１４時時間巾かに振盪
してプロトプラスト化した。このプロトプラスト懸濁液
０．５ｍｌを小試験管にとり、２．５００Ｘｇで５分間
遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５３ｍＭトリス−塩酸、
４００ｍＭショ糖、ｐ Ｈ７，５）１ｍｌに再懸濁して
遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１ｍｌに再懸濁した。
へのｐＡＳＤ２プラスミドの導入 リジン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミクム
ＲＨ６（特顎昭６０−４７５１７、ＦＥＲＭ ＢＰ−
７０４）をＮＢ培地にて３０℃で１６時間振盪培養した
。同培養液をホモセリン２０Ｌｃｇ／ｍｌを補った３３
Ｍ培地に接種し、３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．２
になった時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍｌになる
ように添加した。さらに培養を続け、ＯＤが０．６にな
った時点で集菌し、ＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、ＫＨ２Ｐ○４１．
５ｇ、に２ＨＰ○４３．５ｇ−ＭｇＣｊ！２・６ Ｈ２
Ｏ０，４１ｇＳＦ ｅ Ｓｏ４’ ７Ｈ２０１０ｍｇ５
Ｍｎ５Ｏ＜’ ４〜６ＨｚＯ２ｍｇＳ Ｚ ｎ ＳＯ４
・７ Ｈ２Ｏ０，９ｍｇ５ Ｃｕ ５０４・５Ｈ２００
，４ｍｇ５ ＮａｚＢ＜Ｏｉ・ １０Ｈ２００゜０９
ｍｇ、 （ＮＨ４）６Ｍ ０１０２４−４ Ｈ２Ｏ０，
０４ｍｇ、ビオチン３０ＪｕＺ、サイアミン塩酸塩２ｍ
ｇ％コハク酸２ナトリウム１３５ ｇ、ポリビニルピロ
リドンに１５（東京化成社製）３０ｇを水１βに含みｐ
Ｈ７，３に調整した培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチー
ムを添加した液に約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁
し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１４時時間巾かに振盪
してプロトプラスト化した。このプロトプラスト懸濁液
０．５ｍｌを小試験管にとり、２．５００Ｘｇで５分間
遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５３ｍＭトリス−塩酸、
４００ｍＭショ糖、ｐ Ｈ７，５）１ｍｌに再懸濁して
遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１ｍｌに再懸濁した。
この懸濁液に２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上記ｐＡｓＤ
２プラスミドＤＮＡの１対１混和液１００ｍを加え、次
いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％ポリエチレングリコール
６、０００を含む液Ｑ、３ｍｌを混合した。３分後、Ｒ
ＣＧＰ培地２培地２添ｌし、２．５００Ｘｇで５分間遠
心分離にかけ、沈澱したプロトプラストを１ｍｌのＲＣ
ＧＰ培地に再懸濁した。３０℃で２時間放置した後、同
プロトプラスト懸濁液のＱ、２ｍｌをカナマイシン３０
０ｇ／＋ｎｌを含むＲＣＧ、Ｐ寒天培地（ＲＣＧＰ培地
に寒天１．４％を含む培地）に塗布し、３０℃で１０日
間培養した。出現したコロニーの中からカナマイシン２
０ＪＬｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が
得られた。
２プラスミドＤＮＡの１対１混和液１００ｍを加え、次
いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％ポリエチレングリコール
６、０００を含む液Ｑ、３ｍｌを混合した。３分後、Ｒ
ＣＧＰ培地２培地２添ｌし、２．５００Ｘｇで５分間遠
心分離にかけ、沈澱したプロトプラストを１ｍｌのＲＣ
ＧＰ培地に再懸濁した。３０℃で２時間放置した後、同
プロトプラスト懸濁液のＱ、２ｍｌをカナマイシン３０
０ｇ／＋ｎｌを含むＲＣＧ、Ｐ寒天培地（ＲＣＧＰ培地
に寒天１．４％を含む培地）に塗布し、３０℃で１０日
間培養した。出現したコロニーの中からカナマイシン２
０ＪＬｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が
得られた。
カナマイシン耐性の形質転換株から、先に本発明者が示
した方法〔特開昭５７−１３４５００ ）に従ってプラ
スミドを単離した。すなわち、上記の形質転換株をＮＢ
培地にて３０℃で１６時間振盪培養した。
した方法〔特開昭５７−１３４５００ ）に従ってプラ
スミドを単離した。すなわち、上記の形質転換株をＮＢ
培地にて３０℃で１６時間振盪培養した。
同培養液を４０ Ｑｍｌの３３Ｍ培地に接種し、３０℃
で振盪培養した。ＯＤが０．２になった時点でペニシリ
ンＧを０．５単位／ｍｌとなるように添加し、さらにＯ
Ｄが０．６になるまで培養を続けた。菌体を集菌し、Ｔ
ＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム溶液Ｉ Ｑｍｌに懸濁
し、３７℃で２時間反応させた。反応液に５Ｍ Ｎａ
（１２，４ｍｌ、 ０．５Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，
５） ０．６ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウムと０，
７Ｍ ＮａＣ＃からなる溶液４．４ｍｌを順次加え、
緩やかに混和してから氷水上に１５時間放置した。４℃
で６０分間６９．４００Ｘｇの遠心にかけ上清を回収し
た。これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ） ６．０００ （半井化学薬品社製）を
加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１０時
間後、１．５００Ｘｇで１０分間遠心した。沈澱物にＴ
ＢＳ緩衝緩衝液５奢ｌえて、再溶解した後、１．５ｍｇ
／ｍ＋エチジウムブロマイド２，０１１１１を添加した
。さらに塩化セシウムを加え、密度を１．５８０に合わ
せた。同溶液を１０５．ＯＯＯｘｇ、１８℃で４８時間
遠心し、紫外線照射下に検知される。遠心チューブ下方
の密度の高い位置の螢光バンドを分取することでプラス
ミドＤＮＡを分離した。同分画液に等容量のイソプロピ
ルアルコール液（容量百分１１９０％イソプロピルアル
コール、１０％ＴＥＳ＠衝液）を加えてエチジウムブロ
マイドを抽出除去した。同抽出操作を５回繰り返した後
、ＤＮＡ液をＴＥＳＩ衝液に対して透析して、最終的な
プラスミドＤＮＡ標品を得た。得られたプラスミドを制
限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、ｐＡｓＤ２と同一構造を有していることがわかった
。
で振盪培養した。ＯＤが０．２になった時点でペニシリ
ンＧを０．５単位／ｍｌとなるように添加し、さらにＯ
Ｄが０．６になるまで培養を続けた。菌体を集菌し、Ｔ
ＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム溶液Ｉ Ｑｍｌに懸濁
し、３７℃で２時間反応させた。反応液に５Ｍ Ｎａ
（１２，４ｍｌ、 ０．５Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，
５） ０．６ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウムと０，
７Ｍ ＮａＣ＃からなる溶液４．４ｍｌを順次加え、
緩やかに混和してから氷水上に１５時間放置した。４℃
で６０分間６９．４００Ｘｇの遠心にかけ上清を回収し
た。これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ） ６．０００ （半井化学薬品社製）を
加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１０時
間後、１．５００Ｘｇで１０分間遠心した。沈澱物にＴ
ＢＳ緩衝緩衝液５奢ｌえて、再溶解した後、１．５ｍｇ
／ｍ＋エチジウムブロマイド２，０１１１１を添加した
。さらに塩化セシウムを加え、密度を１．５８０に合わ
せた。同溶液を１０５．ＯＯＯｘｇ、１８℃で４８時間
遠心し、紫外線照射下に検知される。遠心チューブ下方
の密度の高い位置の螢光バンドを分取することでプラス
ミドＤＮＡを分離した。同分画液に等容量のイソプロピ
ルアルコール液（容量百分１１９０％イソプロピルアル
コール、１０％ＴＥＳ＠衝液）を加えてエチジウムブロ
マイドを抽出除去した。同抽出操作を５回繰り返した後
、ＤＮＡ液をＴＥＳＩ衝液に対して透析して、最終的な
プラスミドＤＮＡ標品を得た。得られたプラスミドを制
限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、ｐＡｓＤ２と同一構造を有していることがわかった
。
（３） ｐ Ａ Ｓ Ｄ ２を保有するコリネバクテ
リウム・グルタミクムＲＨＢ株によるリジン生産上記の
工程で得られた形質転換株ＲＨ６／ｐＡｓＤ２および親
株のプラスミド非保有株ＲＨ６の１−ＩＪリジン産試験
を行った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
種培養０．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｌｌ（グルコース
１００ｇ、（ＮＨ４）２ ＳＯ４３０ｇ５ＫＨ２ＰＯ４
０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ５Ｍｇ５ｏ４・７Ｈ２
０１ｇ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ。
リウム・グルタミクムＲＨＢ株によるリジン生産上記の
工程で得られた形質転換株ＲＨ６／ｐＡｓＤ２および親
株のプラスミド非保有株ＲＨ６の１−ＩＪリジン産試験
を行った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
種培養０．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｌｌ（グルコース
１００ｇ、（ＮＨ４）２ ＳＯ４３０ｇ５ＫＨ２ＰＯ４
０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ５Ｍｇ５ｏ４・７Ｈ２
０１ｇ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ。
ＭｎＳ○ａ１〜６８２０ １０ｍｇ、ビオチン１００ｇ
、ホモセリン２００ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇを水１
１に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地〕に接種し、３
０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養ｐ液中のＬ
−’Ｊジン生成量を酸性鋼ニンヒドリン法〔ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 。
、ホモセリン２００ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇを水１
１に含み、ｐ Ｈ７，２に調整した培地〕に接種し、３
０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養ｐ液中のＬ
−’Ｊジン生成量を酸性鋼ニンヒドリン法〔ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ、 Ｂｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 。
１９９．９１ （１９５２）］により比比色量した。結
果を第１表に示す。第１表からＡＳＤをコードする遺伝
子を含む組換え体プラスミドｐＡｓＤ２がＬ−ＩＪリジ
ン産能増強効果を示すことが明らかである。
果を第１表に示す。第１表からＡＳＤをコードする遺伝
子を含む組換え体プラスミドｐＡｓＤ２がＬ−ＩＪリジ
ン産能増強効果を示すことが明らかである。
第 １ 表
菌 株 し−リジン（ｍｇ／ｍ１）（４
） ｐＡｓＤ２を導入したコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ２１６６０によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミ
クＡＡＴＣＣ２１６６０を上記（２）ト同様にして、メ
チオニン２００■／ｒｎ Ｉ ヲ補っり８３Ｍ培地にて
培養し、プロトプラストを調整して、形質転換を行い、
ｐＡＳＤ２の形質転換株ＡＴＣＣ２１６６０／ｐＡＳＤ
２を得た。形質転換株がプラスミドを保有することは前
記と同様にして確認した。
） ｐＡｓＤ２を導入したコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ２１６６０によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株、コリネバクテリウム・グルタミ
クＡＡＴＣＣ２１６６０を上記（２）ト同様にして、メ
チオニン２００■／ｒｎ Ｉ ヲ補っり８３Ｍ培地にて
培養し、プロトプラストを調整して、形質転換を行い、
ｐＡＳＤ２の形質転換株ＡＴＣＣ２１６６０／ｐＡＳＤ
２を得た。形質転換株がプラスミドを保有することは前
記と同様にして確認した。
親株と形質転換株のスレオニン生産試験を次のように行
った。ＮＢ培地で３０ｔ、１６時間振盪培養した種培養
０．５ｍｌを生産培地Ｔ１〔グルコース１０ ｏｇ、（
ＮＨ４）２ ＳＯ４２０ｇ。
った。ＮＢ培地で３０ｔ、１６時間振盪培養した種培養
０．５ｍｌを生産培地Ｔ１〔グルコース１０ ｏｇ、（
ＮＨ４）２ ＳＯ４２０ｇ。
ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ−に２ＨＰＯ４０，５ｇ−Ｍｇ５
０４・７Ｈ２０１ｇ５ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ０ １０ｍｇ
、 Ｍｎ ＳＯ４’ ４〜６ Ｈ２Ｏ１０ｍｇ１ビオチ
ン１０１００ＪＬメチオニン１ｏ。
０４・７Ｈ２０１ｇ５ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ０ １０ｍｇ
、 Ｍｎ ＳＯ４’ ４〜６ Ｈ２Ｏ１０ｍｇ１ビオチ
ン１０１００ＪＬメチオニン１ｏ。
■および炭酸カルシウム２０ｇを水１１に含み、ｐ Ｈ
７，２に調整した培地３５ｍｌに接種し、３０℃で７２
時間振盪培養した。培養後、培養ν液をペーパークロマ
トグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色による比色定量
法を用いてし一スレオニン生成量を測定した。結果を第
２表に示す。
７，２に調整した培地３５ｍｌに接種し、３０℃で７２
時間振盪培養した。培養後、培養ν液をペーパークロマ
トグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色による比色定量
法を用いてし一スレオニン生成量を測定した。結果を第
２表に示す。
第２表からＡＳＤをコードする遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドｐＡＳＤ２がスレオニン生産能を増強すること
がわかる。
ラスミドｐＡＳＤ２がスレオニン生産能を増強すること
がわかる。
第 ２ 表
（５） ｐＡ Ｓ Ｄ ２を導入したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムに４０によるインロイシンの生産イ
ソロイシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミク
ＡＫ４０（ＦＥＲＭ Ｐ−７１６０として微工研に寄
託されている）を上記（２）と同様にして、３３Ｍ培地
にて培養、プロトプラストを調製して形質転換を行い、
ｐＡＳＤ２の形質転換株、Ｋ４０／ｐＡＳＤ２を得た。
ウム・グルタミクムに４０によるインロイシンの生産イ
ソロイシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミク
ＡＫ４０（ＦＥＲＭ Ｐ−７１６０として微工研に寄
託されている）を上記（２）と同様にして、３３Ｍ培地
にて培養、プロトプラストを調製して形質転換を行い、
ｐＡＳＤ２の形質転換株、Ｋ４０／ｐＡＳＤ２を得た。
形質転換株がプラスミドを保有することは前記と同様に
してｍ認した。
してｍ認した。
親株と形質転換株のインロイシン生産試験を生産培地Ｉ
ｆ（生産培地Ｔ１からメチオニンを除いた培地〕を用い
て上記（４）と同様にして行った。結果を第３表に示す
。第３表から、ｐＡｓＤ２プラスミドがイソロイシン生
産性を増大させることがわかる。
ｆ（生産培地Ｔ１からメチオニンを除いた培地〕を用い
て上記（４）と同様にして行った。結果を第３表に示す
。第３表から、ｐＡｓＤ２プラスミドがイソロイシン生
産性を増大させることがわかる。
第 ３ 表
実施例２
（１） コリネバクテリウム・グルタミクムのＡＡＴ
をコードする遺伝子のクローニング 供与体ＤＮＡである染色体ＤＮＡとして、コリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３を用いる他は
、実施例１の（１）と同様の方法で染色体ＤＮＡを単離
した。また、ベクタープラスミドも実施例１で用いたニ
ジエリシア・コリとコリネバクテリウム・グルタミクム
のシャトルプラスミドｐＣＥ５３を、実施例１の（１）
と同様の方法で調製して用いた。
をコードする遺伝子のクローニング 供与体ＤＮＡである染色体ＤＮＡとして、コリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３を用いる他は
、実施例１の（１）と同様の方法で染色体ＤＮＡを単離
した。また、ベクタープラスミドも実施例１で用いたニ
ジエリシア・コリとコリネバクテリウム・グルタミクム
のシャトルプラスミドｐＣＥ５３を、実施例１の（１）
と同様の方法で調製して用いた。
単離した染色体ＤＮＡと調製したｐＣＥ５３プラスミド
ＤＮＡを用い、実施例１の（１）と同様の方法で制限酵
素反応を行い、さらにＴ４リガーゼ反応を行い、このリ
ガーゼ反応混合物を形質転換に供した。受容菌としては
、アミノトランスフェラーゼの多重欠損変異および宿主
特異的制限欠損変、異を併せ持つニジエリシア・コリＫ
１２株亜株Ｋ ５９ （Ｆ−ｔｈｒ Ｉｅｕ ｔｈｉ
ｐｒｏ＾ａｒｇＥ ｈｉｓＧ ｒｅｃＤ ｒｅｃ
Ｃ５ｄｃＢ ｈｓｄＳ ｈｐｐＴ １ｌｖＢｔｙ
ｒｅ ａｓｐＣ） （ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １３０ 、４２９
（１９７７））を用した。同株は微工研に昭和６０年９
月４日付でＦＥＲＭ ＢＰ−９００として寄託されて
いる。
ＤＮＡを用い、実施例１の（１）と同様の方法で制限酵
素反応を行い、さらにＴ４リガーゼ反応を行い、このリ
ガーゼ反応混合物を形質転換に供した。受容菌としては
、アミノトランスフェラーゼの多重欠損変異および宿主
特異的制限欠損変、異を併せ持つニジエリシア・コリＫ
１２株亜株Ｋ ５９ （Ｆ−ｔｈｒ Ｉｅｕ ｔｈｉ
ｐｒｏ＾ａｒｇＥ ｈｉｓＧ ｒｅｃＤ ｒｅｃ
Ｃ５ｄｃＢ ｈｓｄＳ ｈｐｐＴ １ｌｖＢｔｙ
ｒｅ ａｓｐＣ） （ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １３０ 、４２９
（１９７７））を用した。同株は微工研に昭和６０年９
月４日付でＦＥＲＭ ＢＰ−９００として寄託されて
いる。
同株のコンピテントな細胞はエム・ダジェルト（Ｍ、
Ｄａｇｅｒｔ ）らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ６
．２３（１９７９） 〕に従って調製した。
Ｄａｇｅｒｔ ）らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、 ６
．２３（１９７９） 〕に従って調製した。
コンピテントな細胞１０”／ｍｌを含む液０．２ｍｌに
上記で調製したりガーゼ反応混合物１００ρを加え、水
冷下１０分間放置した。次いで３７℃で５分間加温処理
した後、ＬＢ培地２＋１１１を加え３０℃で１２０分間
静置した。菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、５０■
／＋Ｉのアンピシリン、スレオニン、ロイシン、フロリ
ン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよび
チロシンを含むＭ９平板培地に塗布した。
上記で調製したりガーゼ反応混合物１００ρを加え、水
冷下１０分間放置した。次いで３７℃で５分間加温処理
した後、ＬＢ培地２＋１１１を加え３０℃で１２０分間
静置した。菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、５０■
／＋Ｉのアンピシリン、スレオニン、ロイシン、フロリ
ン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよび
チロシンを含むＭ９平板培地に塗布した。
Ｍ９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１
００ｇ／ｍｌあるいはテトラサイクリン２０■／ｍｌを
含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地で生
育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロニー
を選択した。
００ｇ／ｍｌあるいはテトラサイクリン２０■／ｍｌを
含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地で生
育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロニー
を選択した。
選択した形質転換株から前記のシイ・アン（Ｇ、Ａｎ）
らの方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一
株から得たプラスミドｐＡＴｌを各種制限酵素で消化後
、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５３
の唯一ケ所のＢａｍＨＩ切断部位に約６．３ＫｂのＢｇ
ｌｌｎ ＤＮＡ断片が挿入した構造を有していること
が判明した（東２図参照）。
らの方法に従いプラスミドを単離した。形質転換株の一
株から得たプラスミドｐＡＴｌを各種制限酵素で消化後
、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５３
の唯一ケ所のＢａｍＨＩ切断部位に約６．３ＫｂのＢｇ
ｌｌｎ ＤＮＡ断片が挿入した構造を有していること
が判明した（東２図参照）。
さらに、ｐＡＴｌを用いてに５９株を再形質転換したと
き、アミノトランスフェラーゼ欠損に基づく、アスパラ
ギン酸要求性が回復することおよびゲルファント（−Ｇ
ｅｌｆａｎｄ）らの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、：１３０ 、４２
９ （１９７７））に従ってＡＡＴ活性の測定を行うと
、親株のに５９株では同活性が検出されないのに対し、
再形質転換株では、同活性が観察されたこととから、ｐ
ＡＴ１プラスミド上にはコリネバクテリウム・グルタミ
クム由来のＡＡＴ遺伝子がクローン化されていることが
明らかとなった。
き、アミノトランスフェラーゼ欠損に基づく、アスパラ
ギン酸要求性が回復することおよびゲルファント（−Ｇ
ｅｌｆａｎｄ）らの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、：１３０ 、４２
９ （１９７７））に従ってＡＡＴ活性の測定を行うと
、親株のに５９株では同活性が検出されないのに対し、
再形質転換株では、同活性が観察されたこととから、ｐ
ＡＴ１プラスミド上にはコリネバクテリウム・グルタミ
クム由来のＡＡＴ遺伝子がクローン化されていることが
明らかとなった。
（２）コリネバクテリウム・グルタミクムＲ８６株への
ｐＡＴ１プラスミドの導入 実施例１の（２）と同様の方法で、ｐＡＴｌプラスミド
をコリネ４イクテリウム・グルタミクムＲＨＧ株へ導入
した。
ｐＡＴ１プラスミドの導入 実施例１の（２）と同様の方法で、ｐＡＴｌプラスミド
をコリネ４イクテリウム・グルタミクムＲＨＧ株へ導入
した。
得られたカナマイシン耐性の形質転換株のプラスミドを
、実施例１の（２）と同様の方法で単離し、制限酵素で
切断後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＡ
Ｔｌと同一構造を有していることがわかった。
、実施例１の（２）と同様の方法で単離し、制限酵素で
切断後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＡ
Ｔｌと同一構造を有していることがわかった。
（３）ｐＡＴｌを保有するコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＲＨＢ株によるリジン生産 上記の工程で得られた形質転換株ＲＨ６／ｐＡＴｌおよ
び親株のプラスミド非保有株ＲＨ６のＬＩＪジン生産試
験を行った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養し
た種培養Ｑ、５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｌ１に接種し、
３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養Ｆ液中の
し−リジン生成量を酸性鋼ニンヒドリン法〔ジャーナル
・オプ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ。
ミクムＲＨＢ株によるリジン生産 上記の工程で得られた形質転換株ＲＨ６／ｐＡＴｌおよ
び親株のプラスミド非保有株ＲＨ６のＬＩＪジン生産試
験を行った。ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養し
た種培養Ｑ、５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｌ１に接種し、
３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養Ｆ液中の
し−リジン生成量を酸性鋼ニンヒドリン法〔ジャーナル
・オプ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、 １９９ 、９１ （１９５
２） ）により比色定量した。結果を第４表に示す。第
４表からＡＡＴをコードする遺伝子を含む組換え体プラ
スミドｐＡＴ１がＬ−リジン生産能増強効果を示すこと
が明らかである。
２） ）により比色定量した。結果を第４表に示す。第
４表からＡＡＴをコードする遺伝子を含む組換え体プラ
スミドｐＡＴ１がＬ−リジン生産能増強効果を示すこと
が明らかである。
第 ４ 表
コリネバクテリウム・
グルタミクムＲ１（６１４，８
（４） ｐＡＴｌを導入したコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ２１６６０によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ２１８６０を実施例１の（２）と同様にして
、メチオニン２００１Ｌｇ／ｍｌを補った５３Ｍ培地に
て培養し、プロトプラストを調製して、形質転換を行い
、ｐＡＴｌの形質転換株ＡＴＣＣ２１６６０／ｐＡＴ１
を得た。形質転換株がプラスミドを保有することは前記
と同様にして確認した。
タミクムＡＴＣＣ２１６６０によるスレオニンの生産 スレオニン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ２１８６０を実施例１の（２）と同様にして
、メチオニン２００１Ｌｇ／ｍｌを補った５３Ｍ培地に
て培養し、プロトプラストを調製して、形質転換を行い
、ｐＡＴｌの形質転換株ＡＴＣＣ２１６６０／ｐＡＴ１
を得た。形質転換株がプラスミドを保有することは前記
と同様にして確認した。
親株と形質転換株のスレオニン生産試験を次のように行
った。ＮＢ培地で３０℃、１６時間振盪培養した種培養
０．５ｆｆ１１を生産培地ＴＩ ５ｍｌに接種し、３
０℃で７２時間振盪培養した。
った。ＮＢ培地で３０℃、１６時間振盪培養した種培養
０．５ｆｆ１１を生産培地ＴＩ ５ｍｌに接種し、３
０℃で７２時間振盪培養した。
培養後、培養ν液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ−スレ
オニン生成量を測定した。結果を第５表に示す。第５表
からＡＡＴをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドｐＡＴ １がスレオニン生産能を増強することが示さ
れる。
、ニンヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ−スレ
オニン生成量を測定した。結果を第５表に示す。第５表
からＡＡＴをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドｐＡＴ １がスレオニン生産能を増強することが示さ
れる。
第 ５ 表
コリネバクテリウム・
グルタミクムＡＴＣＣ２１６６０６，３（５）ｐＡＴｌ
を導入したコリネバクテリウム・グルタミクムに４０に
よるイソロイシンの生産イソロイシン生産性菌株コリネ
バクテリウム・グルタミクムに４０（ＦＥＲＭ Ｐ−
７１６０）を実施例１の（２）と同様にして、５３Ｍ培
地にて培養し、プロトプラストを調製して形質転換を行
い、ｐＡＴｌの形質転換株に４０／ｐ八Ｔ１を得た。形
質転換株がプラスミドを保有することは前記と同様にし
て確認した。
を導入したコリネバクテリウム・グルタミクムに４０に
よるイソロイシンの生産イソロイシン生産性菌株コリネ
バクテリウム・グルタミクムに４０（ＦＥＲＭ Ｐ−
７１６０）を実施例１の（２）と同様にして、５３Ｍ培
地にて培養し、プロトプラストを調製して形質転換を行
い、ｐＡＴｌの形質転換株に４０／ｐ八Ｔ１を得た。形
質転換株がプラスミドを保有することは前記と同様にし
て確認した。
親株と形質転換株のインロイシン生産試験を生産培地■
１を用いて上記（４）と同様にして行った。結果を第６
表に示す。第６表から、ｐＡＴ１プラスミドがイソロイ
シン生産性を増大させることがわかる。
１を用いて上記（４）と同様にして行った。結果を第６
表に示す。第６表から、ｐＡＴ１プラスミドがイソロイ
シン生産性を増大させることがわかる。
第６表
コリネバクテリウム・
グルタミクム Ｋ２Ｏ１，２
本発明によれば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテ
リウム属などのコリネ型細菌のＡＳＤまたはＡＡＴの合
成に関与する遺伝子とベクタープラスミドとの組換え体
ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡをコリネ型１ｍ菌に
保有させて、Ｌ−リジジ、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシンの生産性を向上させることができる。
リウム属などのコリネ型細菌のＡＳＤまたはＡＡＴの合
成に関与する遺伝子とベクタープラスミドとの組換え体
ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡをコリネ型１ｍ菌に
保有させて、Ｌ−リジジ、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシンの生産性を向上させることができる。
第１図はｐＡＳＤ２の制限酵素ＢｇＩＩＩ、ＢａｍＨｌ
および５ａｊ２ Ｉの切断点地図と同プラスミドの作製
工程を示す。 第２図はｐＡＴｌの制限酵素ＢｇＡ Ｉｆ、ＢａｍＨＩ
および５ａＩＩの切断点地図と同プラスミドの作製工程
を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（Ｋｂ）で示されてい
る。ｐＡＳＤ２およびｐＡＴｌの太い実線部分は、染色
体ＤＮＡに由来し、それぞれＡＳＤ、ＡＡＴをコードす
る遺伝子を含むクローン化ＤＮＡ部分を示す。Ｂａ７８
ｇは、ＢａｍＨＩとＢｇＡ ｎの同一粘着末端での結合
部位を示す。 Ｂａ ／Ｂｑ 第２図 ａ７ｅｇ
および５ａｊ２ Ｉの切断点地図と同プラスミドの作製
工程を示す。 第２図はｐＡＴｌの制限酵素ＢｇＡ Ｉｆ、ＢａｍＨＩ
および５ａＩＩの切断点地図と同プラスミドの作製工程
を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（Ｋｂ）で示されてい
る。ｐＡＳＤ２およびｐＡＴｌの太い実線部分は、染色
体ＤＮＡに由来し、それぞれＡＳＤ、ＡＡＴをコードす
る遺伝子を含むクローン化ＤＮＡ部分を示す。Ｂａ７８
ｇは、ＢａｍＨＩとＢｇＡ ｎの同一粘着末端での結合
部位を示す。 Ｂａ ／Ｂｑ 第２図 ａ７ｅｇ
Claims (4)
- （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水
素酵素またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培地
に培養し、培養物中にＬ−リジン、Ｌ−スレオニンまた
はＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、該培養物から該ア
ミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。 - （２）ベクターが、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属に属する微生物内で複製可能なｐＣＧ１
、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５
２、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１およびそれ
らから誘導されるプラスミドから選ばれる特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （３）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水
素酵素またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ。 - （４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水
素酵素またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221424A JPH06102028B2 (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | アミノ酸の製造法 |
| EP86113808A EP0219027A3 (en) | 1985-10-04 | 1986-10-06 | Process for producing amino acids |
| DE1986113808 DE219027T1 (de) | 1985-10-04 | 1986-10-06 | Verfahren zur herstellung von aminosaeuren. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221424A JPH06102028B2 (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6279788A true JPS6279788A (ja) | 1987-04-13 |
| JPH06102028B2 JPH06102028B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=16766524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60221424A Expired - Fee Related JPH06102028B2 (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | アミノ酸の製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0219027A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06102028B2 (ja) |
| DE (1) | DE219027T1 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5411304A (en) * | 1992-10-15 | 1995-05-02 | Totetsu Koun Co., Ltd. | Grab bucket of electrohydraulic pressure type with lifting magnet |
| JP2004500072A (ja) * | 1999-12-30 | 2004-01-08 | アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 |
| JP2007513601A (ja) * | 2003-12-05 | 2007-05-31 | 味の素株式会社 | エシェリヒア属に属するｌ−スレオニン生産菌及びｌ−スレオニンの製造法 |
| JP2010503395A (ja) * | 2006-09-15 | 2010-02-04 | シージェイ チェイルジェダン コーポレイション | Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法 |
| JP2010516274A (ja) * | 2007-01-24 | 2010-05-20 | シージェイ チェイルジェダン コーポレイション | コリネバクテリアを利用してグリセロールを含む炭素源から発酵産物を生産する方法 |
| US8323933B2 (en) | 2008-04-10 | 2012-12-04 | Cj Cheiljedang Corporation | Vector for transformation using transposons, microorganisms transformed by the vector, and method for producing L-lysine using the same |
| US8932861B2 (en) | 2008-04-10 | 2015-01-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism |
| JP2017169595A (ja) * | 2013-04-23 | 2017-09-28 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｌ−アルギニン産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ−アルギニンの産生方法 |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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