JP5958653B2 - アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 - Google Patents

Description

本発明は、アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法に関し、特に、培養槽内のアンモニア濃度を制御するアンモニア制御装置およびアンモニア制御方法に関する。

従来から、アンモニアは、発酵に用いる必須な栄養素である窒素の供給源として非常に重要である。

アンモニア濃度を測定する既存の技術としては、イオン電極を使用する技術がある。

例えば、特許文献１の方法では、発酵液中のアンモニア濃度を一定濃度以下に制御して、発酵菌をより高いｐＨ値にて培養している。これにより、塩基性物質の発酵生産時に培地へ添加する対イオンを削減し、結果として製造工程を大幅に簡略化している。

国際公開第２００６／０３８６９５号パンフレット

しかしながら、上述の従来技術では、発酵液中のアンモニア濃度を直接的にコントロールすること、すなわち、培養中において培養槽内のアンモニア濃度を直接的に測定または制御することが困難であるという問題点を有していた。

すなわち、図９（従来のアンモニア濃度制御の処理の一例を示すフローチャート）に示すように、培養液中の総アンモニア濃度（ＮＨ₃とＮＨ₄ ⁺の合計濃度）を知るためには、培養槽内から培養液をサンプリングし（ステップＳＡ−１）、そのサンプリングした培養液を強アルカリ性の反応液（例えば、ＮａＯＨ）に混合して（ステップＳＡ−２）、存在するアンモニアを非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）にした状態で、培養槽外で連続的に測定する（ステップＳＡ−３）という一連の作業が必要となるという問題点がある。すなわち、培養槽外でこのサンプリングした培養液を測定する一連の作業を無菌的に行うことは困難であり、また測定に使用した培養液は強アルカリ性の反応液（例えば、ＮａＯＨ）に混合してあるため培養槽内に戻すことができないので廃棄しなければならず、測定頻度を高めるほど培養液を無駄にすることとなるため、実際に測定できる回数が限られてしまっていた（ステップＳＡ−４）。

また、培養槽内ではアンモニアは連続的に消費されており、またアンモニア消費速度が一定でないため、図９に示すように、上述のサンプリング作業によって間隔を空けてアンモニア濃度を測定しても（ステップＳＡ−５）、短い時間における傾向（トレンド）が分からないため、培養液中のアンモニア濃度を一定にコントロールできない（ステップＳＡ−６）という問題点がある。

さらに、上記従来の問題点を鑑み、イオン電極により培養液中に一部存在する非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）を測定するとしても、培養中に発生する誤差を修正するために校正することが容易ではないという問題がある。これは、校正するために現在の正しいアンモニア濃度を知るためには培養液をサンプリングして強アルカリ性の反応液に混合して、培養液中のアンモニアを非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）にした状態で、総アンモニア濃度を測定する必要があるからである。

すなわち、一般的な発酵において、培養液中のｐＨ値は、弱酸性から弱アルカリ性（ｐＨ５〜９程度）であり、培養液中に存在するアンモニアのうち一部またはほぼ全てがイオン化した状態のアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）として存在しているため、上述のイオン電極による非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）の濃度の測定のみでは、培養液中の総アンモニア濃度（ＮＨ₃とＮＨ₄ ⁺の合計濃度）を求めることが困難であるからである。そのため、総アンモニア濃度を正しく制御することができない。

本発明は、上記に鑑みてなされたもので、培養液中のアンモニア濃度を連続的に任意にコントロールしながら培養することができるアンモニア制御装置およびアンモニア制御方法を提供することを目的とする。

このような目的を達成するため、本発明は、下記の方法および装置を提供する。
（１）培養槽内の培養液のアンモニア濃度を制御するアンモニア制御方法であって、当該培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、当該培養槽内の培養液の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサと、当該アンモニア供給器及び当該アンモニアセンサに接続された、制御部を少なくとも備えたアンモニア制御装置を用いて当該培養槽内のアンモニア濃度を制御するアンモニア制御方法であって、
前記制御部において実行される、
前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成する検量線作成ステップと、
前記アンモニアセンサからの信号を前記検量線に代入することにより、前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度を算出する非イオン化アンモニア濃度算出ステップと、
算出された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、前記アンモニア供給器に前記培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するアンモニア供給指示ステップと、
を含むことを特徴とする、アンモニア制御方法。
（２）前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成する検量線作成ステップをさらに含む、上記のアンモニア生業方法。
（３）前記アンモニア制御装置は、前記培養槽内の培養液のｐＨ値を測定するｐＨセンサに更に接続され、
前記制御部において実行される、
前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度および解離型アンモニア濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線に基づいて、前記非イオン化アンモニア濃度算出ステップにより算出された前記非イオン化アンモニア濃度および前記ｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を計算する総アンモニア濃度計算ステップと、
を更に含み、
前記アンモニア供給指示ステップにおいて、前記非イオン化アンモニア濃度の代わりに前記総アンモニア濃度が用いられることを特徴とする、上記のアンモニア制御方法。
（４）前記培養槽外に設けられた外付けアンモニアセンサであって、非解離型のアンモニア濃度を測定するアンモニアセンサを準備し、
前記培養槽から採取した後、アンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにするのに十分にアルカリ性にした培養液の非解離型のアンモニア濃度を前記外付けアンモニアセンサで測定したときの、前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として取得することを含み、
前記制御部において実行される、
前記校正用信号から前記検量線に基づいて算出される非イオン化アンモニア濃度が、前記総アンモニア濃度計算ステップにて算出された総アンモニア濃度となるよう、前記検量線を校正する校正ステップと、
を更に含むことを特徴とする、上記のアンモニア制御方法。
（５）前記アンモニア制御装置は、前記外付けアンモニアセンサに接続され、
前記制御部において実行される、
前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として入力する校正用信号入力ステップ
を更に含む上記のアンモニア制御方法。
（６）目的物質の生産能を有する微生物を培養液を含む培養槽中で培養し、培養物から目的物質を採取することを含む、発酵法により目的物質を製造する方法であって、上記のアンモニア制御の方法により前記培養液中のアンモニア濃度を制御しながら培養する、前記方法。
（７）上記目的物質が、L-アミノ酸、有機酸、核酸、アルコールまたは、タンパク質である、上記の製造方法。
（８）上記目的物質が、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジンからなる群より選択される塩基性アミノ酸である上記の製造方法。
（９）全培養工程のうち少なくとも一部の期間、培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に調整することにより、前記塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、および/または塩化物イオンの使用量を削減することを含む上記の製造方法。
（１０）上記一定濃度の範囲が、300mM以下である上記の製造方法。
（１１）上記一定濃度の範囲が、200mM以下である上記の製造方法。
（１２）上記一定濃度の範囲が、100mM以下である上記の製造方法。
（１３）培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、アンモニアセンサと、制御部とを少なくとも備えたアンモニア制御装置であって、
前記アンモニアセンサは、当該培養槽内の培養液中の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサであり、
前記制御部は、前記アンモニア供給器及び前記アンモニアセンサに接続され、
前記制御部は、
前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成し、
前記アンモニアセンサからの信号を前記検量線に代入することにより、前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出し、
算出された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、前記アンモニア供給器に前記培養槽内へアンモニアを供給するよう指示することを特徴とする、アンモニア制御装置。
（１４）前記培養槽内の培養液のｐＨ値を測定するｐＨセンサに更に接続され、
前記制御部は、さらに
前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度および解離型アンモニア濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線に基づいて、前記非イオン化アンモニア濃度算出手段により算出された非イオン化アンモニア濃度および前記ｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を計算し、
前記非解離型アンモニウム濃度の代わりに前記総アンモニア濃度を用いることを特徴とする、上記のアンモニア制御装置。
（１５）前記制御部は、さらに、
校正用信号から前記検量線に基づいて算出される非イオン化アンモニア濃度が、前記総アンモニア濃度計算手段により計算された総アンモニア濃度となるよう、当該検量線を校正し、
前記校正用信号は、
前記培養槽外に設けられた外付けアンモニアセンサであって、非解離型のアンモニア濃度を測定するアンモニアセンサを準備し、
前記培養槽から採取した後、アンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにするのに十分にアルカリ性にした培養液の非解離型のアンモニア濃度を前記外付けアンモニアセンサで測定したときの、前記外付けアンモニアセンサから取得された信号であることを特徴とする、上記のアンモニア制御装置。
（１６）前記アンモニア制御装置は、前記外付けアンモニアセンサに接続され、
前記制御部は、さらに、
前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として入力する、上記のアンモニア制御装置。
（１７）培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に保持するように構成される、上記のアンモニア制御装置。
（１８）ユーザーインターフェースをさらに備える、上記のアンモニア制御装置。
（１９）培養液中のアンモニアをリアルタイム、好ましくはin situリアルタイムで制御するように構成される、上記のアンモニア制御装置。
（２０）一つ以上の培養槽、好ましくは１〜１０の培養槽の培養液中のアンモニアを制御するように構成される、上記のアンモニア制御装置。
（２１）５分以内、好ましくは１秒以内の間隔で、培養液中のアンモニアを制御するように構成される、上記のアンモニア制御装置。
（２２）１２時間以内、好ましくは８時間以内の間隔で、検量線を校正するように構成される、上記のアンモニア制御装置。
（２３）培養期間の少なくとも一部又は全体においてアンモニアを制御するように構成される、上記のアンモニア制御装置。
（２４）目的物質を生産する能力を有する微生物を培養液を含む発酵槽中で培養し、前記培養液中に前記目的物質を生成、蓄積させる、発酵法による目的物質の製造法で、上記のアンモニア制御装置を用いて、全培養工程のうち少なくとも一部の期間、培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に調整することを含む、前記製造法。
（２５）上記一定濃度の範囲が、300mM以下である上記の製造法。
（２６）上記一定濃度の範囲が、200mM以下である上記の製造法。
（２７）上記一定濃度の範囲が、100mM以下である上記の製造法。

本発明によれば、培養槽内の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサの信号（例えば電圧）との関係を表す検量線を作成し、アンモニアセンサの信号から検量線に基づいて培養槽内の非イオン化アンモニア濃度を算出し、算出された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器に培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するので、培養槽内で一連の測定の作業を無菌的に行うことが可能になり、かつ、培養液を無駄にすることなく、培養液中のアンモニア濃度を連続的に任意にコントロールしながら培養することができるという効果を奏する。

また、本発明の一実施態様によれば、培養槽内の非イオン化アンモニア濃度を算出し、ｐＨセンサにより培養槽内のｐＨ値を測定し、算出された非イオン化アンモニア濃度および測定されたｐＨ値から、記憶部に記憶されたアンモニア解離曲線に基づいて、総アンモニア濃度を算出し、算出された総アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器に培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するので、ｐＨ値と非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）濃度からアンモニア解離曲線に基づいて、直接培養液中の総アンモニア濃度（ＮＨ₃とＮＨ₄ ⁺の合計濃度）を測定することができ、これにより、一層正確にアンモニア濃度をコントロールしながら培養することができるという効果を奏する。

また、この発明によれば、上記培養槽から採取し強アルカリ反応液に懸濁してアンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにした培養液の総アンモニア濃度を外部の一般的なアンモニア測定機を用いて調べ、その値を上記アンモニア解離式に代入し、上記ｐH値測定ステップにて記憶された培養液中のｐH値を用いて培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出し、それをもって非イオン化アンモニア濃度とセンサ出力（電圧）との関係式を示す検量線を校正することが可能であり、培養中に発生する誤差を修正することが出来る。

本発明のアンモニア濃度制御の処理の一例を示すフローチャートである。 本発明のアンモニア濃度制御の処理の他の一例を示すフローチャートである。 本発明の基本構成を示す原理構成図である。 本発明に用いられるアンモニア解離曲線の一例を示すグラフである。 本発明が適用される本アンモニア制御装置１００の構成の一例を示す論理ブロック図である。 本実施の形態における本アンモニア制御装置１００の基本動作処理の一例を示すフローチャートである。 本実施の形態における本アンモニア制御装置１００の処理の一例を詳細に示すフローチャートである。 実施例の装置を用いたアルギニン(Arg)生産におけるアンモニア濃度の制御結果を示す。 実施例の装置を用いたArg生産におけるArg蓄積を示す。 従来のアンモニア濃度制御の処理の一例を示すフローチャートである。

以下に、本発明にかかるアンモニア制御装置およびアンモニア制御方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。

［本発明の概要］
以下、本発明の概要について、図１Ａ、図１Ｂ、図２および図３を参照して説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。ここで、図１Ａは、本発明のアンモニア濃度制御の処理の一例を示すフローチャートであり、図１Ｂは、本発明のアンモニア濃度制御の処理の他の例を示すフローチャートであり、図２は、本発明装置の基本構成を示す原理構成図であり、図３は、本発明に用いられるアンモニア解離曲線の一例を示すグラフである。

本発明方法は、培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、当該培養槽内の培養液中の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサと、当該アンモニア供給器及び当該アンモニアセンサに接続された、制御部を少なくとも備えたアンモニア制御装置を用いて当該培養槽内のアンモニア濃度を制御するアンモニア制御方法である。本発明方法は、図１Ａに示すように、培養槽内の培養液中の非イオン化アンモニアに応答するアンモニアセンサからの信号の入力に基づき、アンモニア制御装置による処理を行い、培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器に指示出力することを含む。「接続」は、機能的に接続されていればよく、有線及び無線のいずれによるものでもよい。

本発明方法は、
制御部において実行される、
アンモニアセンサからの信号を、培養液中の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線に代入して、培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出する非イオン化アンモニア濃度算出ステップと、
算出された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器に培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するアンモニア供給指示ステップと、
を含む。

培養液中の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成する検量線作成ステップをさらに含んでもよい。検量線は、既知濃度のアンモニア溶液を用意し、その溶液に電極を浸して電極が示す電圧をプロットすることで検量線を作成することが出来る。

検量線作成ステップでは、培養液中の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成する。作成には、アンモニア制御装置に供えられた記憶部から検量線を読みだすことや、外部から入力することも含まれる。

アンモニアセンサは、非解離型のアンモニアに応答するものであり、通常には、アンモニア選択膜と内部電極とからなるセンサである。アンモニアセンサからの信号は、非イオン化アンモニアに応答して生じる信号であれば特に制限されず、通常には、内部電極の電圧が使用されるが、電気回路により別の電気特性に変換してもよい。また、電圧などの電気特性をアナログ信号のまま用いてもよいし、アナログ-デジタル変換により数値化した信号として用いてもよい。

このような信号と、培養液中の非イオン化アンモニア濃度との関係を予め調べることにより検量線を作成できる。このように作成した検量線を記憶部に記憶させることができる。記憶の態様は特に制限されず、テーブル形式で記憶してもよいし、検量線を演算式で表して、その演算式を記憶してもよい。

非イオン化アンモニア濃度算出ステップでは、アンモニアセンサからの信号を検量線に代入して、培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出する。検量線に代入することによる算出は、テーブル形式で記憶した場合には、代入する信号の値に対応する位置に記録された数値を読み出すことにより、演算式を記憶した場合には、入力された信号の値を演算式に代入して演算することにより、行うことができる。

アンモニア供給指示ステップでは、算出された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器に培養槽内へアンモニアを供給するよう指示する。

アンモニア供給器は、アンモニア供給指示ステップからの指示に基づき培養槽へのアンモニアの供給を制御できる限り、特に限定されない。例えば、アンモニア供給指示ステップからの指示により、アンモニアガスラインの電磁弁を解放してアンモニアを添加するように構成される。

アンモニアはガスでもよいし、水溶液でもよい。また、硫安などの、溶解したときにアンモニアイオンを生じる化合物の水溶液でもよい。アンモニア供給器によるアンモニア供給速度は、培養槽の大きさやアンモニア供給指示ステップからの指示頻度などを考慮して、アンモニア濃度が急激に変化しないように選択される。総アンモニア濃度は、通常には、アンモニア換算で培養液あたり1mM〜350mM、さらに望ましくは2.5mM〜300mM、さらに望ましくは2.5mM〜200mM、さらに望ましくは3〜100mM、さらに望ましくは3〜50mMの範囲で制御される。

指示の態様は、アンモニア供給器におけるアンモニア供給の制御に関係する弁などの手段を直接的に作動させる電気信号の出力であってもよいし、アンモニア供給器が通信機能を有する場合には、その通信機能により弁などの手段を制御する通信信号の出力であってよい。

本発明のアンモニア制御装置は、培養槽内の培養液のｐＨ値を測定するｐＨセンサに更に接続されていてもよい。この態様では、本発明方法は、制御部において実行される、
培養液中の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線に基づいて、非イオン化アンモニア濃度算出ステップにより算出された前記非イオン化アンモニア濃度および前記ｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を算出する総アンモニア濃度計算ステップと、
を更に含み、
アンモニア供給指示ステップにおいて、非イオン化アンモニア濃度の代わりに前記総アンモニア濃度が用いられる。

培養液中の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率の関係は、理論的に計算したものでもよいし、実測したものでもよい。この関係に基づき解離曲線を作成できる。

このように作成した解離曲線を記憶部に記憶する。記憶の態様は特に制限されず、二次元テーブル形式で記憶してもよいし、解離曲線を演算式で表して、その演算式を記憶してもよい。さらに、検量線記憶ステップで記憶される検量線と組み合わせて、テーブル形式で記憶してもよいし、同検量線と合わせて演算式を作成して、その演算式を記憶してもよい。

図３を参照して、アンモニア解離曲線について説明する。図３において、縦軸は、培養槽内の非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）およびアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）の存在率（％）を示し、横軸は、培養槽内のｐＨ値を示す。そして、図３のグラフ内の曲線は、それぞれ非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）およびアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）の各ｐＨにおける解離曲線を表している。図３に示すように、非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）およびアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）がほぼ均等に存在するのはｐＨ９付近であり、ｐＨ値が高くなるほど非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）は増加し、一方、アンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）は減少する。非イオン化アンモニア及びアンモニウムイオンは、それぞれ、非解離型アンモニア（ＮＨ₃）及び解離型アンモニア（ＮＨ₄ ⁺）と同義である。

上述の通り、一般的な発酵において、培養液のｐＨは、弱酸性から弱アルカリ性（ｐＨ５〜９程度）であり、培養液中に存在する大部分のアンモニアのアンモニウムイオン（ＮＨ₄ ⁺）として存在しているので、従来は、非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）の濃度の測定のみでは、直接培養液中の総アンモニア濃度（ＮＨ₃とＮＨ₄ ⁺の合計濃度）を測定することは不可能であったが、本発明においては、前処理として、使用する培養液中のアンモニア解離曲線を予め作成しておくことで、当該アンモニア解離曲線に基づいて非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）濃度から総アンモニア濃度（ＮＨ₃とＮＨ₄ ⁺の合計濃度）を計算することができる。

総アンモニア濃度計算ステップでは、非イオン化アンモニア濃度算出ステップにより算出された非イオン化アンモニア濃度およびｐＨセンサからのｐＨ値から、アンモニア解離曲線に基づいて、総アンモニア濃度を算出する。非イオン化アンモニア濃度およびｐＨ値からの解離曲線に基づく算出は、テーブル形式で記憶した場合には、入力された非イオン化アンモニア濃度およびｐＨの値に対応するアドレスに記録された数値を読み出すことにより、演算式を記憶した場合には、入力された値を演算式に代入して演算することにより、行うことができる。

総アンモニア濃度計算の一例について、以下（１）〜（３）に例示する。
（１）まず、培養槽内のアンモニアセンサの電圧（例えば、０．５Ｖ）を、検量線を示す演算式に代入し、非イオン化アンモニア濃度（例えば、３０ｍＭ）を算出する。
（２）そして、ｐＨセンサで測定された培養槽内のｐＨ値（例えば、ｐＨ６）を、アンモニア解離曲線示す演算式に代入し、非イオン化アンモニアの存在率（例えば、４０％）を推定する。
（３）推定された非イオン化アンモニアの存在率（例えば、４０％）と、（１）で算出した非イオン化アンモニア濃度（例えば、３０ｍＭ）とから、例えば、「３０ｍＭ＊（１００／４０）＝７５ｍＭ」のように計算することにより、総アンモニア濃度（この場合、７５ｍＭ）を算出する。

アンモニア供給指示ステップでは、非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器に培養槽内へアンモニアを供給するよう指示する。あるいは、総アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器に培養槽内へアンモニアを供給するよう指示してもよい。

アンモニア制御装置は、培養槽外に設けられた外付けアンモニアセンサに更に接続されていてもよく、当該外付けアンモニアセンサにより、予め培養槽から採取し強アルカリ反応液に懸濁しアンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにした培養液から、外付けアンモニアセンサの電圧を測定し、測定された電圧を作成された検量線に代入して算出される非イオン化アンモニア濃度が、計算された総アンモニア濃度となるよう、当該検量線を校正してもよい。

培養槽内の培養液のｐＨの実測値を利用して、アンモニア解離曲線に基づき総アンモニア濃度を自動計算する機能は校正する際にのみ使用し、実際の培養槽内のアンモニア濃度の制御は、非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）濃度に基づき制御してもよい。

また、本発明においては、校正を行う際には、培養液をサンプリングし、強アルカリ反応液（例えば、ＮａＯＨ）に懸濁し、当該培養液中のアンモニアを非イオン化アンモニアにした上で、外付けアンモニアセンサにて測定した電圧を検量線に代入して算出した非イオン化アンモニア濃度が、総アンモニア濃度計算にて計算された総アンモニア濃度と一致するよう、検量線を校正することができる。

本発明装置は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。すなわち、本発明装置は、培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、当該培養槽内の培養液の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサと、当該アンモニア供給器及び当該アンモニアセンサに接続された制御部を少なくとも備えて構成される。アンモニア供給器は、培養槽にアンモニアを供給するのに適合したものでよい。アンモニアセンサは、培養槽内の培養液の非解離型のアンモニアに応答するのに適合したものでよい。本発明のアンモニア制御装置は、図２に示すように、培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、当該培養槽内の培養液の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサとに接続され、記憶部および制御部を少なくとも備えて構成され得る。「接続」は、機能的に接続されていればよく、有線及び無線のいずれによるものでもよい。

前記制御部は、
前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成する検量線作成手段と、
前記アンモニアセンサからの信号からを前記検量線に基づいて、前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出する非イオン化アンモニア濃度算出手段と、
前記非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、前記アンモニア供給器に前記培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するアンモニア供給指示手段と、
を備える。

前記制御部は、
予め作成した検量線を格納するように構成した保存部、又は、前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成するように構成した検量線作成手段と、
前記アンモニアセンサからの信号からを前記検量線に基づいて、前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出するように構成した非イオン化アンモニア濃度算出手段と、
前記非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、前記アンモニア供給器に前記培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するように構成したアンモニア供給指示手段と、
を備えてもよい。

本発明装置は、培養槽内の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線をに基づいて、非イオン化アンモニア濃度算出手段により算出された非イオン化アンモニア濃度およびｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を計算する総アンモニア濃度計算手段を備えてもよい。

総アンモニア濃度計算手段は、培養槽内の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線をに基づいて、非イオン化アンモニア濃度算出手段により算出された非イオン化アンモニア濃度およびｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を計算するように構成した総アンモニア濃度計算手段であってよい。

これらの手段の構成要素については、本発明方法におけるステップに関して説明したものと同様である。

前記制御部は、さらに、
校正用信号から前記検量線に基づいて算出される非イオン化アンモニア濃度が、前記総アンモニア濃度計算手段により計算された総アンモニア濃度となるよう、当該検量線を校正するように構成された校正手段を備え、
前記校正手段は、校正用信号を用いるよう構成され、前記校正用信号は、
前記培養槽外に設けられた外付けの、非解離型のアンモニア濃度を測定するアンモニアセンサにより得られる信号であって、
前記培養槽から採取した後、アンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにするのに十分にアルカリ性にした培養液の非解離型のアンモニア濃度を測定したときの、前記外付けアンモニアセンサから取得された信号であってもよい。

前記制御部は、さらに、前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として入力するのに適合したものでよい。

アンモニア制御装置は、培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に保持するように構成されてもよい。

アンモニア制御装置は、ユーザーインターフェースをさらに備えてもよい。

アンモニア制御装置は、培養液中のアンモニアをリアルタイム、好ましくはin situリアルタイムで制御するように構成されてもよい。

アンモニア制御装置は、一つ以上の培養槽、好ましくは１〜１０の培養槽の培養液中のアンモニアを制御するように構成されてもよい。

アンモニア制御装置は、５分以内、好ましくは１秒以内の間隔で、培養液中のアンモニアを制御するように構成されてもよい。

アンモニア制御装置は、１２時間以内、好ましくは８時間以内の間隔で、検量線を校正するように構成されてもよい。

アンモニア制御装置は、培養期間の少なくとも一部又は全体においてアンモニアを制御するように構成されてもよい。

本発明においてリアルタイム及びin situ リアルタイムとは、決められた時間内にアンモニアの濃度を制御すること、すなわち培養槽内のアンモニア濃度を測定し、設定時間内に培地にアンモニアを供給することを意味する。例えばアンモニアを測定する時間は5分以内、3分以内、1分以内、30秒以内の間隔で測定するように構成してよい。さらにアンモニアを培地中に供給する時間は1分以内、30秒以内、10秒以内、5秒以内、又は、１秒以内で供給するように構成してよい。

制御全体の時間としては、5分以内、3分以内、1分以内、30秒以内、又は、１秒以内の間隔で制御するように構成してよい。

これらの時間や間隔は、培養槽内の培養液で培養中に生じ得る非イオン化アンモニア濃度又は総アンモニア濃度の変化率に応じて選択すればよく、例えば、培養中の培養液の非イオン化アンモニア濃度の変化が測定間隔内で０．５mM以下、０．２mM以下、又は、０．１mM以下になるようにしてもよく、培養中の培養液の総アンモニア濃度の変化が測定間隔内で８０mM以下、２０mM以下、又は、１０mM以下になるようにしてもよい。

次に、アンモニア制御装置の構成例について説明する。

［アンモニア制御装置１００の構成］
図４は、本発明が適用される本アンモニア制御装置１００の構成の一例を示す論理ブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。

本アンモニア制御装置１００は、図４に示すように、培養槽２００と、当該培養槽２００にアンモニアを供給するアンモニア供給器３００と、当該培養槽２００内に挿入され出電圧を測定するアンモニアセンサ１０と、当該培養槽２００内に挿入されｐＨ値を測定するｐＨセンサ２０と、に接続される。さらに、このアンモニア制御装置１００は、アンモニア制御装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の制御部１０２、アンモニア供給器３００等に接続される制御出力部１０４、アンモニアセンサ１０や外付けアンモニアセンサ１２やｐＨセンサ２０に接続される信号入力部１０８、および、各種のデータベースやテーブルなどを格納する記憶部１０６を備えて構成されており、これら各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。

図４において、アンモニア供給器３００は、アンモニアを内部に含むアンモニアタンク３０と、当該アンモニアタンク３０から供給されるアンモニア量を調節する弁３２と、当該弁３２の開閉を操作するスイッチ３１とを少なくとも備えて構成される。このアンモニア供給器３００は、アンモニア制御装置１００からの指示に従って、培養槽２００内にアンモニアを供給する機能を有する。

図４において、培養槽２００は、培養液を内部に含み、当該培養槽２００内に挿入されたアンモニアセンサ１０およびｐＨセンサ２０を介してアンモニア制御装置１００と接続される。また、培養槽２００は、アンモニアタンク３０からアンモニアを供給するパイプ等を介してアンモニア供給器３００と接続される。また、培養槽２００は、図４において、外付けアンモニアセンサ１２が内部に挿入されたサンプリング用ビーカー等に、培養液のサンプル採取用のパイプ等を介して接続される形態を一例に示しているが、必ずしも接続されていなくてもよく、利用者が培養槽２００からサンプルを抽出し、そのサンプルが移されたビーカー等に対して、外付けアンモニアセンサ１２を使用する構成であってもよい。

図４において、アンモニア制御装置１００の記憶部１０６に格納される各種のデータベースやテーブルやファイル（アンモニア解離曲線ファイル１０６ａ〜総アンモニア濃度ファイル１０６ｅ）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベース等を格納する。

これら記憶部１０６の各構成要素のうち、アンモニア解離曲線ファイル１０６ａは、制御部１０２の処理により作成された、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線を記憶するアンモニア解離曲線記憶手段である。

また、検量線ファイル１０６ｂは、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサ１０の電圧との関係を表す検量線を作成し記憶する検量線記憶手段である。

また、非イオン化アンモニア濃度ファイル１０６ｃは、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂにより、当該アンモニアセンサ１０の電圧を測定し、当該電圧を検量線に代入することにより、アンモニアセンサ１０で測定された、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度を記憶する非イオン化アンモニア濃度記憶手段である。

また、ｐＨ値ファイル１０６ｄは、ｐＨ値測定部１０２ｃにより、ｐＨセンサ２０で測定された、培養槽２００内の培養液のｐＨ値を記憶するｐＨ値記憶手段である。

また、総アンモニア濃度ファイル１０６ｅは、総アンモニア濃度計算部１０２ｄが、非イオン化アンモニア濃度１０６ｃに記憶された非イオン化アンモニア濃度およびｐＨ値ファイル１０６ｄに記憶されたｐＨ値から、アンモニア解離曲線１０６ａに記憶されたアンモニア解離曲線に基づいて、培養槽２００内の総アンモニア濃度を計算した当該総アンモニア濃度を記憶する総アンモニア濃度記憶手段である。

また、図４において、制御出力部１０４は、アンモニア制御装置１００とアンモニア供給器３００との間における通信制御を行う。すなわち、制御出力部１０４は、アンモニア制御装置１００が指示したアンモニア量をアンモニア供給器３００が培養槽２００へ供給するよう、アンモニア供給器２００のスイッチ３１を制御して弁３２の開閉を調節する信号を通信する通信する機能を有する。

また、図４において、信号入力部１０８は、アンモニアセンサ１０や外付けアンモニアセンサ１２やｐＨセンサ２０の制御を行う。ここで、アンモニアセンサ１０は、培養槽２００内の培養液中に含まれるアンモニアのうち非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）濃度を測定するセンサであり、例えば、イオン電極等で構成される。また、このアンモニアセンサ１０は、培養槽２００内で測定された非イオン化アンモニア（ＮＨ₃）濃度を表す信号を増幅させ信号入力部１０８に送信するＮＨ₃アンプ１１に接続されて構成されてもよい。なお、外付けアンモニアセンサ１２およびＮＨ₃アンプ１３の説明は同様であるので省略する。また、ｐＨセンサ２０は、培養槽２００内の培養液中のｐＨ値を測定するセンサであり、例えば、ｐＨ電極等で構成される。また、このｐＨセンサ２０は、培養槽２００内で測定されたｐＨ値を表す信号を増幅させ信号入力部１０８に送信するｐＨアンプ２１に接続されて構成されてもよい。

また、図４において、制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御部１０２は、機能概念的に、検量線作成部１０２ａ、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂ、ｐＨ値測定部１０２ｃ、総アンモニア濃度計算部１０２ｄ、アンモニア供給指示部１０２ｅ、校正用電圧測定部１０２ｆ、および、校正部１０２ｇを備えて構成されている。

このうち、検量線作成部１０２ａは、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサ１０の電圧との関係を表す検量線を作成する検量線作成手段である。

また、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂは、アンモニアセンサ１０の電圧を検量線に代入することにより、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度を算出する非イオン化アンモニア濃度算出手段である。

また、ｐＨ値測定部１０２ｃは、ｐＨセンサ２０で培養槽２００内の培養液のｐＨ値を測定するｐＨ値測定手段である。

また、総アンモニア濃度計算部１０２ｄは、非イオン化アンモニアファイル１０６ｃに記憶された非イオン化アンモニア濃度およびｐＨ値ファイル１０６ｄに記憶されたｐＨ値から、アンモニア解離曲線ファイル１０６ａに記憶されたアンモニア解離曲線に基づいて、培養槽２００内の総アンモニア濃度を計算する総アンモニア濃度計算手段である。

また、アンモニア供給指示部１０２ｅは、非解離アンモニア濃度算出部１０２ｂにより計算された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器３００に培養槽２００内へアンモニアを供給するよう指示するアンモニア供給指示手段である。また、アンモニア供給指示部１０２ｅは、総アンモニア濃度計算部１０２ｄにより計算された総アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、アンモニア供給器３００に培養槽２００内へアンモニアを供給するよう指示してもよい。

また、校正用電圧測定部１０２ｆは、予め培養槽２００から採取し強アルカリ反応液（例えば、ＮａＯＨ）に懸濁しアンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにした培養液から、外付けアンモニアセンサ１２の電圧を測定する校正用電圧測定手段である。

また、校正部１０２ｇは、校正用電圧測定部１０２ｆにより測定された電圧を、検量線ファイル１０６ｂに記憶された検量線に代入して算出される非イオン化アンモニア濃度が、総アンモニア濃度計算にて計算された総アンモニア濃度となるよう、当該検量線を校正する校正手段である。

［アンモニア制御装置１００の処理］
次に、このように構成された本アンモニア制御装置１００の処理の一例について、以下に図５および図６を参照して詳細に説明する。ここで、図５は、本実施の形態における本アンモニア制御装置１００の基本動作処理の一例を示すフローチャートであり、図６は、本実施の形態における本アンモニア制御装置１００の処理の一例を詳細に示すフローチャートである。

［基本動作処理］
まず、本実施の形態における本アンモニア制御装置１００の基本動作処理の一例について、図５を参照して説明する。

（前処理）
図５に示すように、前処理として、制御部１０２は、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線（図３参照）を作成しアンモニア解離曲線ファイル１０６ａに格納してもよい（ステップＳＢ−１）。すなわち、制御部１０２は、アンモニア解離定数に基づいて各ｐＨにおける非イオン化アンモニアおよびアンモニウムイオンの存在率を算出し、算出した各値をグラフにプロットすることにより、アンモニア解離曲線を作成してもよい。

（本処理）
そして、検量線作成部１０２ａは、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサ１０の電圧との関係を表す検量線を作成する（ステップＳＢ−２）。

そして、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂは、アンモニアセンサ１０の電圧を検量線に代入することにより、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度を算出する（ステップＳＢ−３）。その後、ステップＳＢ−６の処理へ進む。

ここで、ステップＳＢ−３にて、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂの処理により、非イオン化アンモニア濃度を算出した後、ステップＳＢ−４〜ステップＳＢ−５の処理を行ってもよい。

ここで、ｐＨ値測定部１０２ｃは、ｐＨセンサ２０で培養槽２００内の培養液のｐＨ値を測定してもよい（ステップＳＢ−４）。また、総アンモニア濃度計算部１０２ｄは、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂにより算出された非イオン化アンモニア濃度、および、ｐＨ値測定部１０２ｃにより測定されたｐＨ値から、アンモニア解離曲線ファイル１０６ａに記憶されたアンモニア解離曲線に基づいて、総アンモニア濃度を計算してもよい（ステップＳＢ−５）。

そして、制御部１０２は、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂにより測定された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回るか否かを判断する（ステップＳＢ−６）。ここで、制御部１０２は、総アンモニア測定部１０２ｄにより測定された総アンモニア濃度が所定の濃度を下回るか否かを判断してもよい（ステップＳＢ−６）。

そして、制御部１０２が、ステップＳＢ−３にて非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂにより測定された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回ると判断した場合（ステップＳＢ−６：Ｙｅｓ）、アンモニア供給指示部１０２ｅは、アンモニア供給器３００に培養槽２００内へアンモニアを供給するよう指示する（ステップＳＢ−７）。ここで、制御部１０２が、総アンモニア測定部１０２ｄにより測定された総アンモニア濃度が所定の濃度を下回ると判断した場合（ステップＳＢ−６：Ｙｅｓ）、アンモニア供給指示部１０２ｅは、アンモニア供給器３００に培養槽２００内へアンモニアを供給するよう指示してもよい（ステップＳＢ−７）。

一方、制御部１０２が、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂにより測定された非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度以上であると判断した場合（ステップＳＢ−６：Ｎｏ）、ステップＳＢ−３の処理へ戻る。

また、制御部１０２が、総アンモニア測定部１０２ｄにより測定された総アンモニア濃度が所定の濃度以上であると判断した場合（ステップＳＢ−６：Ｎｏ）、ステップＳＢ−８〜ステップＳＢ−１０の処理を行ってもよい。

ここで、制御部１０２は、ステップＳＢ−２にて作成された検量線を校正するか否かを判断してもよい（ステップＳＢ−８）。なお、図５において、アンモニア供給指示（ステップＳＢ−６）の後に校正処理の開始を判断する一例について示したが、利用者の入力に従って随時行われてもよく、予め設定された周期毎に自動で行われてもよい。

また、制御部１０２が校正すると判断した場合（ステップＳＢ−８：Ｙｅｓ）、校正用電圧測定部１０２ｆは、予め培養槽２００から採取し強アルカリ反応液（例えば、ＮａＯＨ）に懸濁しアンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにした培養液について、外付けアンモニアセンサ１２の電圧を測定してもよい（ステップＳＢ−９）。

また、校正部１０２ｇは、校正用電圧測定部１０２ｆにより測定された電圧を、検量線ファイル１０６ｂに記憶された検量線に代入して算出される非イオン化アンモニア濃度が、総アンモニア濃度計算にて計算された総アンモニア濃度となるよう、当該検量線を校正してもよい（ステップＳＢ−１０）。

一方、制御部１０２が校正しないと判断した場合（ステップＳＢ−８：Ｎｏ）、ステップＳＢ−３の処理に戻る。

この基本動作処理（ステップＳＢ−２〜ステップＳＢ−１０）は、培養中繰り返し行われる。これにより、培養槽２００内のアンモニア濃度を制御して、培養液中のアンモニア濃度を連続的に任意にコントロールしながら培養することができる。以上で、本アンモニア制御装置１００の基本動作処理の説明を終える。

［アンモニア制御処理の詳細］
続いて、本実施の形態における本アンモニア制御装置１００の処理の一例の詳細について、図６を参照して説明する。

図６に示すように、制御部１０２は、作成されたアンモニア解離曲線、および／または、計算された総アンモニア濃度を校正するか否かを判断する（ステップＳＣ−１）。このステップＳＣ−１の処理の内容は、図５のステップＳＢ−７の内容と同様である。なお、上述のように、この校正処理の開始は利用者の入力に従って随時行われてもよく、予め設定された周期毎に自動で行われてもよい。

そして、制御部１０２が校正すると判断した場合（ステップＳＣ−１：Ｙｅｓ）、培養槽２００内の培養液についての検量線を作成する（ステップＳＣ−２）。

ここで、「検量線」は、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサ１０の電圧との関係を表す関係式であり、本実施形態では、後述のステップＳＣ−７およびＳＣ−１０において、アンモニアセンサ１０が測定した電圧をこの検量線に代入することにより、非イオン化アンモニア濃度（Ｃ）を測定するために用いられる。

一方、制御部１０２が校正しないと判断した場合（ステップＳＣ−１：Ｎｏ）、ステップＳＣ−３の処理に進む。

そして、制御部１０２は、培養槽２００に対する制御パラメータを変更するか否かを判断する（ステップＳＣ−３）。

ここで、制御パラメータは、例えば、ＳＶ（Ｓｅｔ Ｖａｌｕｅ）値、ＴＣ（Ｔｉｍｅ Ｃｙｃｌｅ）値、ＯＮ（Ｏｎ Ｔｉｍｅ）値等である。ここで、ＳＶ値は、制御する総アンモニア濃度、または、非解離型のアンモニア濃度（ｍＭ）の設定値である。また、ＴＣ値は、アンモニア供給を判断するサイクル（秒）を表す。また、ＯＮ値は、１サイクルの内にアンモニア供給を行う時間（秒）を表す。具体的には、制御パラメータを、例えば、ＳＶ値：５０ｍＭ、ＴＣ値：１０ｓｅｃ、ＯＮ値：１ｓｅｃと設定した場合、１０秒に一度アンモニア供給するか否かを判断し、アンモニアの実測値が５０ｍＭよりも高ければ供給しない。すなわち、アンモニアガスのインレットの電磁弁が閉じたままとなる。また、実測値が５０ｍＭを下回った場合には、１秒間アンモニアを供給する。すなわち、電磁弁が開くことになる。

そして、制御部１０２は、制御パラメータを変更すると判断した場合（ステップＳＣ−３：Ｙｅｓ）、制御パラメータを入力する（ステップＳＣ−４）

一方、制御部１０２が制御パラメータを変更しないと判断した場合（ステップＳＣ−３：Ｎｏ）、ステップＳＣ−５の処理に進む。

そして、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂは、培養槽２００内に挿入されたアンモニアセンサ１０（例えば、イオン電極）の電圧（Ａ）を取り込む（ステップＳＣ−５）。すなわち、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂは、アンモニアセンサ１０の電圧を測定する。

そして、ｐＨ値測定部１０２ｃは、培養槽２００内に挿入されたｐＨセンサ２０のｐＨ電極からｐＨ値（Ｂ）を取り込む（ステップＳＣ−６）。すなわち、ｐＨ値測定部１０２ｃは、ｐＨセンサ２０で、培養槽２００内の培養液のｐＨ値（Ｂ）を測定する。

そして、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂは、ステップＳＣ−２にて作成された検量線に、ステップＳＣ−５にて取り込んだ電圧（Ａ）を代入し、非イオン化アンモニア濃度（Ｃ）を算出する（ステップＳＣ−７）。すなわち、非イオン化アンモニア濃度算出部１０２ｂは、アンモニアセンサ１０の電圧を検量線に代入することにより、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度（Ｃ）を算出する。

そして、総アンモニア濃度計算部１０２ｄは、ステップＳＣ−６にて取り込んだｐＨ値（Ｂ）、ステップＳＣ−７にて算出したアンモニア濃度（Ｃ）、および、前処理として制御部１０２により作成されたアンモニア解離曲線（図３参照）に基づいて、総アンモニア濃度（Ｄ）を算出する（ステップＳＣ−８）。すなわち、総アンモニア濃度計算部１０２ｄは、非イオン化アンモニアファイル１０６ｃに記憶された非イオン化アンモニア濃度（Ｃ）およびｐＨ値ファイル１０６ｄに記憶されたｐＨ値（Ｂ）から、アンモニア解離曲線ファイル１０６ａに記憶されたアンモニア解離曲線に基づいて、培養槽２００内の総アンモニア濃度（Ｄ）を計算する。

そして、制御部１０２は、１点補正を実施するか否かを判断する（ステップＳＣ−９）。

ここで、「１点補正」とは、標準化の方法のうちの１つであり、１点の標準化試料を用いて対象を標準化するものである。本実施形態においては、１点の標準化試料とは、外部計測器の計測データ（電圧（Ａ’））であり、標準化は、校正と同様の意味で用いている。

そして、制御部１０２が１点補正を実施すると判断した場合（ステップＳＣ−９：Ｙｅｓ）、校正用アンモニア濃度測定部１０２ｆおよび校正部１０２ｇは、外部計測器（外付けアンモニアセンサ１２等）の計測データ（電圧（Ａ’））を取り込み、この計測データ（電圧（Ａ’））を検量線に代入して得られる非イオン化アンモニア濃度（Ｃ’）が、ステップＳＣ−８にて計算された総アンモニア濃度（Ｄ）となるよう検量線を１点補正する（ステップＳＣ−１０）。すなわち、校正用電圧測定部１０２ｆは、予め培養槽２００から採取し強アルカリ反応液（例えば、ＮａＯＨ）に懸濁しアンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにした培養液について、外付けアンモニアセンサ１２の電圧（Ａ’）を測定し、そして、校正部１０２ｇは、校正用電圧測定部１０２ｆにより測定された電圧（Ａ’）を、検量線ファイル１０６ｂに記憶された検量線に代入して算出される非イオン化アンモニア濃度（Ｃ’）が、総アンモニア濃度計算にて計算された総アンモニア濃度（Ｄ）となるよう、当該検量線校正する。

一方、制御部１０２が１点補正しないと判断した場合（ステップＳＣ−９：Ｎｏ）、ステップＳＣ−１１の処理に進む。

そして、制御部１０２は、どのアンモニア制御モードを選択するかを判断する（ステップＳＣ−１１）。

ここで、アンモニア制御モードとは、例えば、総アンモニア濃度で制御するモード、および、非解離型のアンモニア濃度で制御モード等であり、ステップＳＣ−１１において、制御部１０２は、アンモニア制御モードを、総アンモニア濃度制御モード、または、非イオン化アンモニア濃度制御モードを選択することができる。

そして、制御部１０２は、アンモニア制御モードを総アンモニア濃度制御モードに選択した場合（ステップＳＣ−１１：総アンモニア濃度制御モード）、培養槽２００内の総アンモニア濃度に基づいて制御するモードに設定する。続いて、制御部１０２は、ステップＳＣ−８にて算出した総アンモニア濃度（Ｄ）またはステップＳＣ−１０にて校正した総アンモニア濃度（Ｄ’）と、アンモニア制御装置１００に設定された設定値や制御パラメータ（例えば、アンモニア濃度制御の指標となるＳＶ値）を用いて、培養槽２００に接続されたアンモニア供給器３００等を含む培養器への制御指示を算出する（ステップＳＣ−１２）。

そして、制御部１０２は、ステップＳＣ−１２にて算出された制御が必要か否かを判断する（ステップＳＣ−１３）。例えば、制御部１０２は、総アンモニア濃度が所定の濃度を下回るか否かを判断する。

そして、制御部１０２が制御指示は必要である（例えば、総アンモニア濃度が所定の濃度を下回る）と判断した場合（ステップＳＣ−１３：Ｙｅｓ）、アンモニア供給指示部１０２ｅは、アンモニア供給器３００に対し、アンモニアタンク３０から培養槽２００内に指示された量のアンモニアを添加するといった、制御指示を出力する。すなわち、アンモニア供給指示部１０２ｅは、制御出力部１０４を介して、弁３２の開閉を操作するスイッチ３１を操作することにより、制御指示に従った量のアンモニアをアンモニアタンク３０から培養槽２００内へと供給されるようスイッチ３１の開閉を調節する。

一方、制御部１０２が制御指示は不必要である（例えば、総アンモニア濃度が所定の濃度以上である）と判断した場合（ステップＳＣ−１３：Ｎｏ）、ステップＳＣ−５の処理に戻る。

ステップＳＣ−１１に戻り、制御部１０２は、アンモニア制御モードを非イオン化アンモニア濃度制御モードに選択した場合（ステップＳＣ−１１：非イオン化アンモニア濃度制御モード）、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度に基づいて制御するモードに設定する。続いて、制御部１０２は、ステップＳＣ−７にて算出した非イオン化アンモニア濃度（Ｃ）と、アンモニア制御装置１００に設定された設定値や制御パラメータ（例えば、アンモニア濃度制御の指標となるＳＶ値）を用いて、培養槽２００に接続されたアンモニア供給器３００等を含む培養器への制御指示を算出する（ステップＳＣ−１５）。

そして、制御部１０２は、ステップＳＣ−１５にて算出された制御が必要か否かを判断する（ステップＳＣ−１６）。例えば、制御部１０２は、非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回るか否かを判断する。

そして、制御部１０２が制御指示は必要である（例えば、非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度を下回る）と判断した場合（ステップＳＣ−１６：Ｙｅｓ）、アンモニア供給指示部１０２ｅは、アンモニア供給器３００に対し、アンモニアタンク３０から培養槽２００内に指示された量のアンモニアを添加するといった、制御指示を出力する。すなわち、アンモニア供給指示部１０２ｅは、制御出力部１０４を介して、弁３２の開閉を操作するスイッチ３１を操作することにより、制御指示に従った量のアンモニアをアンモニアタンク３０から培養槽２００内へと供給されるようスイッチ３１の開閉を調節する。

一方、制御部１０２が制御指示は不必要である（例えば、非イオン化アンモニア濃度が所定の濃度以上である）と判断した場合（ステップＳＣ−１６：Ｎｏ）、ステップＳＣ−５の処理に戻る。

以上で、本アンモニア制御装置１００の処理の一例の詳細な説明を終える。

これにて、本実施形態の説明を終える。

［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。

例えば、アンモニア制御装置１００が培養槽２００内で発酵を行う場合について説明したが、発酵法に限らず、化学工業の反応槽等といった別の用途に用いてもよい。

また、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。

このほか、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データや探索条件等のパラメータを含む情報、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。

また、アンモニア制御装置１００に関して、図示の各構成要素は機能概略的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。

例えば、アンモニア制御装置１００の各装置が備える処理機能、特に制御部１０２にて行われる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現することができ、あるいは、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現することも可能である。尚、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じてアンモニア制御装置１００に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどの記憶部１０６などは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）として協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部１０２を構成する。

また、このコンピュータプログラムは、アンモニア制御装置１００に対して任意のネットワークを介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。

また、本発明に係るプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。

また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。

記憶部１０６に格納される各種のデータベース等（アンモニア解離曲線ファイル１０６ａ〜総アンモニア濃度ファイル１０６ｅ）は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。

また、アンモニア制御装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。

更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じた任意の単位で、機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。

なお、上記アンモニア制御方法及びアンモニア制御装置は以下のような方法に使用することが可能である。例えば、発酵法による微生物を用いた目的物質の製造方法に利用可能である。具体的には、目的物質を生産する能力を有する微生物を液体培地を含む発酵槽内で培養し、同培地中に前記目的物質を生成、蓄積させる方法である。

本発明における目的物質とは、Ｌ−アミノ酸または核酸、有機酸、アルコール、タンパク質などが挙げられる。発明において、「Ｌ-アミノ酸」は、微生物を用いた発酵法において培地中に蓄積するものであれば特に制限されない。Ｌ-アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ-リジン、Ｌ-オルニチン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-シトルリンの塩基性アミノ酸、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン、Ｌ-ロイシン、グリシンの脂肪族アミノ酸、Ｌ-スレオニン、Ｌ-セリンのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ-プロリンの環式アミノ酸、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシン、Ｌ-トリプトファンの芳香族アミノ酸、Ｌ-システイン、Ｌ-シスチン、Ｌ-メチオニンの含硫アミノ酸、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-グルタミン、Ｌ-アスパラギン等の酸性アミノ酸とそのアミド体が挙げられる。

本発明に用いる微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。また、本発明においてＬ−アミノ酸とは、フリー体のＬ−アミノ酸とＬ−アミノ酸塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩を含む。

本発明において、「核酸」とは微生物を用いた発酵法において培地中に蓄積するものであれば特に制限されない。核酸とは、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの５’-燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン-５’-リン酸。以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシン-５’-リン酸。以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン-５’-モノリン酸。以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン-５’-モノリン酸。以下「AMP」ともいう）などが含まれる。

本発明において、「有機酸とは」、微生物を用いた発酵法において培地中に蓄積されるものであれば特に制限されない。有機酸とは乳酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。

本発明において、「アルコール」とは、微生物を用いた発酵法において培地中に蓄積されるものであれば特に制限されない。アルコールとは、例えば、エタノール、イソブタノール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,3-プロパンジオール、1,4-ブタンジオール、グリセロール、2,3-ブタンジオール等が挙げられる。

本発明に用いることができる微生物として具体的には、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、パントエア属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属に属する腸内細菌、コリネホルム型細菌、バチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、サッカロミセス属酵母等が挙げられる。好ましくは、遺伝子置換が可能な微生物である。

エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。エシェリヒア・コリを、遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、エシェリヒア・コリK-12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC 47076）、及びW3110株（ATCC 27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK-12株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。

エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）。

また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを、遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在はコリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。

このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシェンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタ
ミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354

これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受けることができる（住所 P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている（http://www.atcc.org/参照）。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8-120号室）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。

バチルス属細菌を用いるときは、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。

バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス168 Marburg（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスPY79（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。

以下、上述したような親株にＬ-アミノ酸又は核酸生産能を付与する方法について述べる。

Ｌ-アミノ酸又は核酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ-アミノ酸又は核酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ-アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ-アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ-アミノ酸又は核酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ-アミノ酸又は核酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ-アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

Ｌ-アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ-アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ-アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

以下、具体的に微生物にアミノ酸生産能を付与する方法とアミノ酸生産菌について例示する。

（Ｌ−リジン生産菌）
以下、Ｌ−リジン生産菌又は及びその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能を有する株としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。

また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、または発現調節配列を改変することによって達成できる。Ｌ−リジン生合成系の酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、および発現調節配列を改変することは、後述のgltP、gltS遺伝子の場合と同様の方法によって達成することができる。

Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出活性を有するタンパク質をコードするybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)(Gene23:199-209(1983))、または、これらの任意の組み合わせの遺伝子の発現レベルが増大していてもよい。カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。上記遺伝子の中ではybjE遺伝子が好ましい。

エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型AアスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。

Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。

なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。

さらに、Ｌ−アミノ酸生産菌は、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。

リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、WO2006/078039号パンフレットに記載の方法に従って行うことができる。

これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。

例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。

好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352番目のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8-120号室）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8-120号室）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。

pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。

上記のようなＬ-リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性を低下させる方法は、その他のＬ-アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同様に適用することができる。

（Ｌ-トリプトファン生産菌）
Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトフェニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ-トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。

Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ-トリプトファン及びＬ-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

また、Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、３-ホスホセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株(WO2004/090125)、グリオキシル酸経路の酵素をが構成化した的に発現する株（WO2005/103275）が挙げられる。

Ｌ-トリプトファン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ-ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３-デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５-エノール酸ピルビンシキミ酸３-リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる（欧州出願公開763127号明細書）。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。

また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸がＬ-トリプトファンの場合、Ｌ-フェニルアラニン生合成系、Ｌ-チロシン生合成系を弱化させてもよい（US4,371,614）。

本発明において、「酵素活性の上昇」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。酵素の細胞内での活性は、微生物の非改変株、例えば野生型菌株よりも上昇させることが好ましい。

また、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、aroFの場合、Ｎ末端より147位のＬ-アスパラギン酸または181位のＬ-セリンが他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より146位のＬ-アスパラギン酸、147位のＬ-メチオニン、150位のＬ-プロリンもしくは202位のＬ-アラニンの１アミノ酸残基、または157位のＬ-メチオニン及び219位のＬ-アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族生産アミノ酸生産菌を得ることができる（EP0488424）。

Ｌ-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株（特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号）も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ-トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ-トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。

コリネ型細菌としてはサルファグアニジンに耐性株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ１２１１８（FERM BP-478 特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開S63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナ-ゼをコ-ドする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。

（Ｌ-フェニルアラニン生産菌）
Ｌ-フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ-フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。

コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したCornebacterium glutamicum BPS-13株 (FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号 JP 02303495）、チロシン要求性株（JP 05049489）等を使用することができる。

また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変されたすること、例えば、Ｌ-トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB, mtrや、Ｌ-チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ-フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。

（Ｌ-チロシン生産菌）
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。

（Ｌ-バリン生産菌）
Ｌ-バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンのアテニュエーションに必要な領域を除去し、生産されるＬ-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。

Ｌ-バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼのに変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。

さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H⁺-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。

コリネ型細菌のＬ-バリン生産菌としては、例えば、Ｌ-バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ-バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNをによりコードすされるアセトヒドロキシ酸シンタ-ーゼやivlCによりコードされるイソメロリダクターゼ(ilvC)(国際公開パンフレットWO00-/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ-バリン及び/又はＬ-イソロイシン及び/又はＬ-ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ-バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。

コリネ型細菌へのＬ-バリン生産能の付与又は向上は、Ｌ-バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、Ｌ-ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD-パントセナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開パンフレットWO0050624号）。

Ｌ-バリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。

例えば、Ｌ-イソロイシンおよびＬ-メチオニン要求性，ならびにＤ-リボ-ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつＬ-バリン生産能を有する変異株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034） や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ-バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(β-フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。

また、分岐鎖アミノ酸の合成に関与する遺伝子として、ilvGMEDAオペロンが挙げられるが、同オペロンは、Ｌ-バリン及び／又はＬ-イソロイシン及び／又はＬ-ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されたilvGMEDAオペロンを微生物に保持させることによって、これらのＬ-アミノ酸の生産性を向上させることができる。

（Ｌ-イソロイシン生産菌）
Ｌ-イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６-ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。

コリネ型細菌のＬ-イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ-リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ-イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。

（Ｌ-ロイシン生産菌）
Ｌ-ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-２-チエニルアラニン、３-ヒドロキシロイシン、４-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

L-ロイシン生産菌は、Ｌ-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、L-ロイシン生産菌は、細菌の細胞からＬ-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。

コリネ型細菌のＬ-ロイシン生産菌としては、２-チアゾールアラニンかつβ-ハイドロキシロイシン耐性株（特開平8-266295）、バリンアナログ耐性株（特開昭63-248392）、バリン要求性株（特公昭38-4395）、Ｓ-（２-アミノエチル）-Ｌ-システイン（ＡＥＣ）耐性株（特公昭51-37347）、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン要求性株（特公昭54-36233）が挙げられる。

（Ｌ-グルタミン酸生産菌）
Ｌ-グルタミン酸生産菌として好適な菌株は、例えば、Ｌ-グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。Ｌ-グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられるがこれらに限定されない。

シトレートシンテターゼ遺伝子、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221A、EP1033407Aに開示されたものが挙げられる。

Ｌ-グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ-グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ-グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ-グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、イソクエン酸リアーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１-ピロリン-5-カルボン酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。

例えば、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を用いて改変すればよい。α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書参照)
パントエア・アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス AJ13355 (FERM BP-6614)
が挙げられる。

ここで、Pantoea ananatisパントエア・アナナティス AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomeransエンテロバクター・アグロメランスと同定され、Enterobacter agglomeransエンテロバクター・アグロメランス AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisパントエア・アナナティスに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransエンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisパントエア・アナナティスとして記載する。

さらにコリネ型細菌にＬ-グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490]；WO2006/070944）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である。

Ｌ-グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。

このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）

（Ｌ-スレオニン生産菌）
Ｌ-スレオニン生産菌として好ましいものとしては、Ｌ-スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する細菌が挙げられる。Ｌ-スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンに含まれるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ-スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された腸内細菌科に属する細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。

Ｌ-スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ-スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ-スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ-スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ-スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。このアテニュエーションの解除又は低減改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。

スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非固有（non-native）のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）。また、Ｌ-スレオニンによるフィ-ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α-アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸（AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても得られる。

このようにＬ-スレオニンによるフィ-ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が増大していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu-ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。

また、アスパルトキナ-ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ-リジンによるフィ-ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ-ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。

Ｌ-スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ-スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。

また、Ｌ-スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ-ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ-スレオニン耐性、及び／又はＬ-ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123-135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ-スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

Ｌ-スレオニン生産菌として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することが出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に登録番号VKPM B-3996のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ-ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ-スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。

また、エシェリヒア・コリVKPM B-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も好適なＬ-スレオニン生産菌として例示することができる。VKPM B-5318株は、1990年5月3日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、PRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。

（Ｌ-アルギニン生産菌）
Ｌ-アルギニン生産菌及びＬ-アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ-アルギニン生産菌及びL-アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。

Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンのリプレッサーを欠損したコリネ型細菌（米国特許出願公開2002-0045233号明細書）、及び、グルタミン酸デヒドロゲナー活性を上昇させたコリネ型細菌（欧州特許出願公開1057893号明細書）も、Ｌ−アルギニン生産に好適な菌株である。

具体的には、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092（FERM BP-6906）、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）が挙げられる。AJ11169株及びAJ12092株は特開昭５４−４４０９６号記載の２−チアゾールアラニン耐性株、AJ11336株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性及びサルファダイアジン耐性を有する株、AJ11345株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性、２−チアゾールアラニン耐性、サルファグアニジン耐性、及びヒスチジン要求性を有する株、及びAJ12430株は特開平２−１８６９９５号記載のオクチルグアニジン耐性及び２−チアゾールアラニン耐性を有する株である。

コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092（FERM BP-6906）は、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092株と命名され、1983年09月29日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-7273として寄託され、1999年10月01日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6906が付与されている。

Ｌ−アルギニン生産能を有すエシェリヒア属細菌としては、argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）や、酢酸資化性変異株のＬ−アルギニン生産性誘導体であるエシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）が挙げられる。２３７株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika、住所：Russia, 117545, Moscow, 1 Dorozhnyproezd, 1）にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。２３７株の誘導体であるＬ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有する株である３８２株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ３８２株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムスにVKPM B-7926の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

Ｌ−アルギニン生産能を有するセラチア属細菌としては、Ｌ−アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参照）が挙げられる。

（Ｌ-ヒスチジン生産菌）
Ｌ-ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116〜B-12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

L-ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、ホスホリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、ホスホリボシル-ATPピロホスホヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、ホスホリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。

hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素はL-ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、L-ヒスチジン生産能は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

L-ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。

（Ｌ-システイン生産菌）
Ｌ-システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

（L-セリン生産菌）
L-セリン生産菌を誘導するための親株の例としてはホスホセリンホスファターゼ遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-275689、特開平11-253187）、アザセリン又はβ-（２-チエニル）-ＤＬ-アラニンに耐性を有するＬ-セリン生産能を有するコリネ型細菌に由来する阻害解除されたＤ-３-ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼを有するコリネ型細菌（特開平11266881）、アザセリン又はチエニルアラニンに耐性を示し，かつセリン分解能を欠失しセリンを生産するコリネ型細菌（特開平10-248588）が挙げられる。

次に、微生物に核酸生産能を付与する方法と核酸生産菌について例示する。
核酸生産能を有する微生物は、上記のような微生物に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る（特公昭３８-２３０９９、特公昭５４-１７０３３、特公昭５５-４５１９９、特公昭５７-１４１６０、特公昭５７-４１９１５、特公昭５９-４２８９５参照）。例えば、栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ’-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、またはＥＭＳ(エチルメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。

プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル-ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスtrpC2株（168 Marburg）の誘導体である（特開2004-242610、US2004166575A1）。また、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772（FERM P-2555）（特開昭62-014794）等を使用することもできる。

グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰ脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌（特開平3-58787）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平4-28357）等が挙げられる。

また、プリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。

イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５’-グアニル酸（グアノシン-５’-モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６-１２４３８号公報）。

また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌の育種に用いられる方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸耐性株（特開平4-262790）、デヒドロプロリン耐性株（韓国特許公開公報2003-56490）を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。

また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。
前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase [EC:2.7.6.1]）などが挙げられる。

ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース-５-リン酸を経由して、リボース-５-リン酸となる。生合成されたリボース-５-リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が生成される。具体的には、リボース-５-リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりＰＲＰＰに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。

ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Switzer等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Roth等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開2004-242610号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。

一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるPRPPが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purDオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002。GenBank Accession No.NC_000964）、およびエシェリヒア・コリのpurレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。

したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。

プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。

プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。

例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの-35配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、-10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAATとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287）。したがって、-10配列（TAAGAT）をコンセンサス配列あるいはコンセンサス配列に近づけることにより、TATAAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。

プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる（USP6,284,495号）。

プリンペオペロンのリプレッサー（プリンリプレッサー）の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。

また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子（purR；GenBank Accession NC_000964）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。

さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。

さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。

PRPPから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。

プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子とpupG遺伝子を破壊することによって達成することができる。バチルス属細菌は、上記のようなdeoD遺伝子とpupG遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。deoD遺伝子、pupG遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;GenBank Accession No. NC_000964, pupG;GenBank Accession No. NC_000964が利用できる。

また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル-AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル-AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000964（コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。

さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。

また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる（特開2003-219876）。

本発明に用いることができる微生物としてより具体的な例には、例えば目的物質がL−リジンの場合はエシェリヒア・コリAJ11442 (NRRL B-12185, FERM BP-1543) (米国特許第4,346,170号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ3990(ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参照)等が、L−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリVKPM B-3996(RIA 1867、VKPM B-3996)(米国特許第5,175,107号参照)、コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムAJ12318(FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照)等が、L−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリAJ12604(FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第488,424号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12637(FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第2,686,898号参照)等が、L−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリAJ12624(FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,178号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12475(FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参照)等が、L−ロイシンの場合はエシェリヒア・コリAJ11478(FERM P-5274)(特公昭62-34397号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ3718(FERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照)等が、L−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141(VKPM B-4781)(欧州特許出願公開第519,l13号参照)、ブレビバクテリウム・フラバムAJ12149(FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照)等が、L−バリンの場合はエシェリヒア・コリVL1970(VKPM B-4411))(欧州特許出願公開第519,l13号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12341(FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参照)等が、Ｌ−アルギニンの場合は、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092（FERM BP-6906）が含まれる。

本発明を用いた目的物質の生産は、発酵中の全培養工程のうち少なくとも必要な時間、すなわち、少なくとも一部の期間、アンモニアの濃度を一定濃度の範囲に制御することにより培養できる。

発酵中の全培養工程のうち少なくとも必要な時間、とはアンモニア濃度を一定濃度に制御して培養すべき時間を意味するが、特に好ましくは物質の生産を行っている時間に制御することが好ましい。例えば、本発明の方法が、物質生産能を持つ微生物を増殖させる段階（増殖期）と物質を産生させる段階（物質生産期）を含む場合、物質生産期にアンモニア濃度を一定濃度に制御してもよいし、微生物を増殖させる増殖期においては、アンモニア濃度を一定以下に制御して培養してもよいし、制御しなくてもよい。

本発明における「増殖期」とは、培養開始から３時間、好ましくは６時間、特に好ましくは、１０時間以内の、炭素源が主に菌体生育に使用されている時期、すなわち微生物が対数的に増殖している時期を意味し、本発明における「生産期」とは、培養開始から３時間以降、好ましくは６時間以降、特に好ましくは１０時間以降炭素源が主に物質生産に用いられている時期を意味する。

一定濃度の範囲とは、アンモニアの濃度を一定の範囲に制御して培養する方法、ある濃度以下に設定して培養する方法、いずれに用いることもできる。

なお、本発明においては、重炭酸イオン及び又は炭酸イオンをアミノ酸のカウンタイオンになるように培養する方法にも適用できる（以下炭酸塩発酵と記載する）さらに、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも２０ｍＭ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを、塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい特開2002-65287、US2002-0025564A EP 1813677A）。

前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造する方法においての、発酵中の全培養工程のうち少なくとも必要な時間とは、所望の生産性が得られる限り特に制限されないが、具体的には、例えば本培養における全培養工程の1/10以上、好ましくは1/5以上が挙げられる。より具体的には、目的の塩基性物質の蓄積に対して、培地に使用される硫酸及び塩化物イオン等のカウンタイオンが不足することにより培地のpHが上昇する期間が含まれる。

炭酸塩発酵においては、発酵中の発酵槽内の圧力が正となるように制御すること、及び／又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することの両方を行ってもよい。いずれの場合も、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが、好ましくは20mM以上、より好ましくは30mM以上、特に好ましくは40mM以上存在する培養期があるようにすることが好ましい。発酵槽内圧力、炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスの供給量、又は制限された給気量は、例えば培地中の重炭酸イオン又は炭酸イオンを測定することや、pHやアンモニア濃度を測定することによって、決定することができる。

炭酸塩発酵によれば、従来の方法に比べて、カウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるための培地のpHを低く抑えることが可能となる。アンモニアでｐＨを制御する場合、ｐＨを高めるためにアンモニアが供給され、塩基性アミノ酸のＮ源となり得る。培地に含まれる塩基性アミノ酸以外のカチオンとしては、培地成分由来のＫ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ等が挙げられる。これらは、好ましくは総カチオンの１０％以下、望ましくは５％以下、さらに望ましくは２％以下であることが好ましい。

また、発酵中の発酵槽内圧力が正となるようにするには、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を正にすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解し、重炭酸イオン又は炭酸イオンを生じ、これらは塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなり得る。発酵槽内圧力として具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、０．０３〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０５〜０．１５ＭＰａ、さらに好ましくは０．１〜０．３ＭＰａが挙げられる。また、培養液に炭酸ガス、又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給することによって、培養液に炭酸ガスを溶解させてもよい。さらには、培養液に炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給しつつ、発酵槽内圧力が正となるように調節してもよい。

発酵槽内圧力を正に調節するには、例えば、給気圧を排気圧よりも高くするように設定すればよい。具体的には酸素分圧を二酸化炭素分圧より高く設定して培養することが望ましい。また、培養液に炭酸ガスを供給する場合は、例えば、純炭酸ガス、又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを吹き込めばよい。

尚、培地に重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを溶解させる上記の方法は、単独でもよいし、複数を組み合わせてもよい。

従来法では、通常、生成する塩基牲アミノ酸のカウンタアニオンとすべく、十分量の硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムが、又、栄養成分として蛋白等の硫酸分解物もしくは塩酸分解物が培地に添加され、これらから与えられる硫酸イオン、塩化物イオンが培地に含まれる。従って、弱酸性である炭酸イオン濃度は培養中極めて低く、ppm単位である。本発明上記態様では、これら硫酸イオン、塩化物イオンを減じ、微生物が発酵中に放出する炭酸ガスを上記発酵環境にて培地中に溶解せしめ、カウンタイオンとすることに特徴がある。したがって、本発明上記態様においては、硫酸イオンや塩化物イオンを生育に必要な量以上培地に添加する必要はない。好ましくは、培養当初は硫酸アンモニウム等を培地に適当量フィードし、培養途中でフィードを止める。あるいは、培地中の炭酸イオン又は重炭酸イオンの溶存量とのバランスを保ちつつ、硫酸アンモニウム等をフィードしてもよい。また、塩基性アミノ酸の窒素源として、アンモニアを培地にフィードしてもよい。アンモニアは、単独で、又は前記他の気体の一部としてとともに培地に供給することができる。

培地に含まれる重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン以外の他のアニオンの濃度は、微生物の生育に必要な量であれば、低いことが好ましい。このようなアニオンには、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、及び水酸化物イオン等が挙げられる。これらの他のイオンのモル濃度の合計は、好ましくは通常は９００ｍＭ以下、より好ましくは７００ｍＭ以下、特により好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは３００ｍＭ以下、特に好ましくは２００ｍＭ以下である。

本発明上記態様においては、硫酸イオン、及び／又は、塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであり、培地に含まれる硫酸イオンもしくは塩化物イオン、又はこれらの合計は、通常、７００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは１００ｍＭ以下である。

通常は、塩基性アミノ酸のカウンタイオン源として培地に硫酸アンモニウムを添加すると、硫酸イオンによって培養液中の炭酸ガスが放出してしまう。それに対して、本発明上記態様においては、過剰量の硫酸アンモニウムを培地に添加する必要がないので、炭酸ガスを発酵液中に容易に溶解させることができる。

また、本発明上記態様においては、「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」程度に培地中の総アンモニア濃度を制御することが好ましい。そのような条件としては、例えば、最適な条件において塩基性アミノ酸を生産する場合の収率及び／又は生産性の量に比べて、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の塩基性アミノ酸が蓄積する場合ような収率及び／又は生産性が得られる条件が含まれる。具体的には、培地中の総アンモニア濃度としては、例えば、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、又は５０ｍM以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、前記「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、ｐＨ毎に設定することが好ましい。しかし、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度の上限値範囲としてもよい。

一方、微生物の生育及び塩基性物質の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度としては、培養中にアンモニアが継続して枯渇しない窒素源が不足することにより微生物による目的物質の生産性を低下させない限り特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときの濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。

また、L-グルタミン酸発酵においては、Ｌ-グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ-グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ-グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。（欧州特許出願公開第1078989号明細書）

本発明装置を使用したL-アルギニンの生産

本実施例ではコリネ型細菌によるL-アルギニンの生産に本発明装置を用いたアンモニア制御培養を応用する例を示す。L-アルギニン生産株としてはコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092(FERM BP-6906)を使用した。

本実施例の本発明装置は、次の構成を有する。
アンモニアセンサ１０：
アンモニア透過膜を用いる内部電極型センサであり、非イオン化アンモニアに応答して電圧変化を生じる。培養槽２００に挿入される。
アンモニア制御装置１００：
記憶部１０６、制御部１０３、アンモニアセンサ１０と接続された信号入力部１０８、及び、アンモニア供給器３００に接続された制御出力部１０４を有するコンピュータを用いる。記憶部１０６は、培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度とアンモニアセンサ１０からの電圧との関係を表す検量線を記憶する。制御部１０２は、アンモニアセンサ１０の電圧を測定し、その電圧から検量線に基づいて培養槽２００内の非イオン化アンモニア濃度を算出するアンモニア濃度算出ステップと、算出された非イオン化アンモニア濃度が、設定した制御濃度を下回る場合、アンモニア供給器３００に培養槽２００内へアンモニアを供給するよう指示するアンモニア供給指示ステップとを行う。
アンモニア供給器３００：
硫安水溶液を収容した容器を有し、その容器から培養槽に硫安水溶液をローラーポンプを介して滴下できるように設置し、アンモニア制御装置１００からの信号に基づき、設定された滴下速度で滴下を行う。

（１）本発明装置の利用によるArg発酵におけるアンモニア濃度の制御
培養の進行とともに低下する培地中の総アンモニア濃度を、本発明装置を用いて一定に制御しL-アルギニンの生産を行った。その際、制御する培地中の総アンモニア濃度として20 mM, 100 mM及び300 mMの3条件を設定した。表１に示したL-アルギニン生産培地300 mLを入れたジャーファーメンターに1N KOHを滴下し、pHを6.9に調整した。L-アルギニン生産培地は初発の総アンモニア濃度がそれぞれ20 mM, 100 mM及び300 mMとなるように硫安を混合した。コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092株を表2に示したCM-Dex寒天培地全面に塗布し、31.5℃で24時間培養した後、ジャーファーメンターに寒天培地1枚分に生育した菌体を植菌した。培養は温度を31.5℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300 mL通気し、撹拌速度は700 rpmとして行った。培養の進行とともに低下するpHは6N KOHを添加することで6.9を維持した。また、培養の進行とともに、低下する培地中のグルコース濃度は40 g/L程度を保つように、別に殺菌した692 g/Lのグルコース溶液(0.05mL/Lの消泡剤GD-113を含む)を適宜添加した。培養は52時間行った。非イオン化アンモニア濃度が設定値を下回った場合には、本発明装置によって設定の総アンモニア濃度となるように硫安水溶液の滴下が自動で行われ、培養中の総アンモニア濃度を一定に制御した。具体的には、ジャーファーメンターに差し込まれたアンモニアセンサによって培地中の非イオン化アンモニア濃度がリアルタイムで計測され、別に殺菌した450 g/Lの硫安水溶液が、目的の総アンモニア濃度を維持するようアンモニア供給器から自動で培地に滴下された。その結果、本発明装置を用いることで図７に示すように目的とする非イオン化アンモニア濃度と総アンモニア濃度を簡便、且つ、自動的に維持してArg発酵を行うことが出来た。その際、総アンモニア濃度20 mM制御の場合には0.77 mL/hr、100 mM制御の場合には0.90 mL/hr、300 mM制御の場合には1.30 mL/hrの速度で450g/Lの硫安水溶液が滴下された(培養全体での平均速度)。300mM制御の場合には、培養途中（８時間）で、培養液を採取し、含まれるアンモニウムイオンを非解離型にするのに十分なアルカリ性にしたものを用いて、外部アンモニアセンサによる校正を行った。

本結果からL-アミノ酸の発酵生産において、本発明装置を用いることによって非常に簡便、且つ、自動的に培地中のアンモニア濃度（非イオン化アンモニア濃度及び総アンモニア濃度）を一定に制御して培養可能であることが示された。

（２）本発明装置の利用によるArg生産能の向上
次に、本発明装置を用いて総アンモニア濃度を制御した場合と一般的な人的管理方法で総アンモニア濃度を制御した場合のArg生産量を比較した。その際、制御する総アンモニア濃度として300 mMを設定した。表１に示したL-アルギニン生産培地300mLを入れたジャーファーメンターに1N KOHを滴下し、pHを6.9に調整した。L-アルギニン生産培地は初発のアンモニア濃度が300 mMとなるよう硫安を混合したものを用いた。コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092株を表2に示したCM-Dex寒天培地全面に塗布し、31.5℃で24時間培養した後、ジャーファーメンターに寒天培地1枚分に生育した菌体を植菌した。培養は、温度を31.5℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に300 mL通気し、撹拌速度は700 rpmとして行った。培養の進行とともに低下するpHは6N KOHを添加することで6.9を維持した。また、培養の進行とともに、低下する培地中のグルコース濃度は40 g/L程度を保つように、別に殺菌した692 g/Lのグルコース溶液(0.05mL/Lの消泡剤GD-113を含む)を適宜添加した。培養は52時間行った。前項と同様に本発明装置を用いて総アンモニア濃度を制御する方法と、制御値(管理値) を下回った場合には手動で450g/L硫安を3ｍL添加する人的管理方法の二つの方法で総アンモニア濃度を制御した。その結果、本発明装置を用いた場合には自動で総アンモニア濃度を制御することが出来た一方で、人的管理を行った場合には培養52時間で17回手動で硫安水溶液を添加した。また、図８に示すように人的管理を行った場合と比較して本発明装置を用いた場合にはより高くアルギニンが蓄積した。更に、総アルギニン生産量としても人的管理を行った場合には9.5 gであったのに対し、本発明装置を用いた場合には11.1 gのアルギニンが生成した。

なお、培養途中（８時間）で、培養液を採取し、含まれるアンモニウムイオンを非解離型にするのに十分なアルカリ性にしたものを用いて、外部アンモニアセンサによる校正を行った。

本結果からL-アミノ酸の発酵生産において、本発明装置を用いることによって非常に簡便、且つ、自動的に培地中のアンモニア濃度（非イオン化アンモニア濃度及び総アンモニア濃度）を一定に制御して培養を行うことが可能であることに加え、L-アミノ酸の生産能も向上することが示された。

本結果からL-アミノ酸の発酵生産において、本発明装置を用いることによって非常に簡便に培地中のアンモニア濃度を一定に制御しつつ培養を行うことが可能である。

以上詳述に説明したように、本発明によれば、培養液中のアンモニア濃度を連続的に任意にコントロールしながら培養することができるので、微生物工業等を含む化学工業の分野において利用することができる。

１００ アンモニア制御装置
１０２ 制御部
１０２ａ 検量線作成部
１０２ｂ 非イオン化アンモニア濃度算出部
１０２ｃ ｐＨ値測定部
１０２ｄ 総アンモニア濃度計算部
１０２ｅ アンモニア供給指示部
１０２ｆ 校正用電圧測定部
１０２ｇ 校正部
１０４ 制御出力部
１０６ 記憶部
１０６ａ アンモニア解離曲線ファイル
１０６ｂ 検量線ファイル
１０６ｃ 非イオン化アンモニア濃度ファイル
１０６ｄ ｐＨ値ファイル
１０６ｅ 総アンモニア濃度ファイル
１０８ 信号入力部
１０ アンモニアセンサ
１１、１３ ＮＨ₃アンプ
１２ 外付けアンモニアセンサ
２０ ｐＨセンサ
２１ ｐＨアンプ
２００ 培養槽
３００ アンモニア供給器
３０ アンモニアタンク
３１ スイッチ
３２ 弁

Claims (25)

1. 培養槽内の培養液のアンモニア濃度を制御するアンモニア制御方法であって、当該培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、当該培養槽内の培養液の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサと、当該アンモニア供給器及び当該アンモニアセンサに接続された、制御部を少なくとも備えたアンモニア制御装置を用いて当該培養槽内のアンモニア濃度を制御するアンモニア制御方法であって、
   前記アンモニア制御装置は、前記培養槽内の培養液のｐＨ値を測定するｐＨセンサに接続され、
   前記制御部において実行される、
   前記アンモニアセンサからの信号を、前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線に代入することにより、前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度を算出する非イオン化アンモニア濃度算出ステップと、
   前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線に基づいて、前記非イオン化アンモニア濃度算出ステップにより算出された前記非イオン化アンモニア濃度および前記ｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を計算する総アンモニア濃度計算ステップと、
   算出された総アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、前記アンモニア供給器に前記培養槽内へアンモニアを供給するよう指示するアンモニア供給指示ステップと、
   を含むことを特徴とする、アンモニア制御方法。
2. 前記培養槽内の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成する検量線作成ステップをさらに含む、請求項１記載のアンモニア制御方法。
3. 前記培養槽外に設けられた外付けアンモニアセンサであって、非解離型のアンモニア濃度を測定するアンモニアセンサを準備し、
   前記培養槽から採取した後、アンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにするのに十分にアルカリ性にした培養液の非解離型のアンモニア濃度を前記外付けアンモニアセンサで測定したときの、前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として取得することを含み、
   前記制御部において実行される、
   前記校正用信号から前記検量線に基づいて算出される非イオン化アンモニア濃度が、前記総アンモニア濃度計算ステップにて算出された総アンモニア濃度となるよう、前記検量線を校正する校正ステップと、
   を更に含むことを特徴とする、請求項１又は２記載のアンモニア制御方法。
4. 前記アンモニア制御装置は、前記外付けアンモニアセンサに接続され、
   前記制御部において実行される、
   前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として入力する校正用信号入力ステップ
   を更に含む請求項３記載のアンモニア制御方法。
5. 目的物質の生産能を有する微生物を培養液を含む培養槽中で培養し、培養物から目的物質を採取することを含む、発酵法により目的物質を製造する方法であって、請求項１〜４の方法により前記培養液中のアンモニア濃度を制御しながら培養する、前記方法。
6. 上記目的物質が、L-アミノ酸、有機酸、核酸、アルコールまたは、タンパク質である、請求項５に記載の方法。
7. 上記目的物質が、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジンからなる群より選択される塩基性アミノ酸である請求項６に記載の方法。
8. 全培養工程のうち少なくとも一部の期間、培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に調整することにより、前記塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、および/または塩化物イオンの使用量を削減することを含む請求項７に記載の方法。
9. 前記一定濃度の範囲が300mM以下である請求項８に記載の方法。
10. 前記一定濃度の範囲が200mM以下である請求項８に記載の方法。
11. 前記一定濃度の範囲が100mM以下である請求項８に記載の方法。
12. 培養槽にアンモニアを供給するアンモニア供給器と、アンモニアセンサと、制御部とを少なくとも備えたアンモニア制御装置であって、
    前記アンモニアセンサは、当該培養槽内の培養液中の非解離型のアンモニアに応答するアンモニアセンサであり、
    前記アンモニア制御装置は、前記培養槽内の培養液のｐＨ値を測定するｐＨセンサに接続され、
    前記制御部は、前記アンモニア供給器及び前記アンモニアセンサに接続され、
    前記制御部は、
    前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度と前記アンモニアセンサからの信号との関係を表す検量線を作成し、
    前記アンモニアセンサからの信号を前記検量線に代入することにより、前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度を算出し、
    前記培養液中の非イオン化アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の各ｐＨ値における存在率を示すアンモニア解離曲線に基づいて算出された非イオン化アンモニア濃度および前記ｐＨセンサからのｐＨ値から、総アンモニア濃度を計算し、
    算出された総アンモニア濃度が所定の濃度を下回る場合、前記アンモニア供給器に前記培養槽内へアンモニアを供給するよう指示することを特徴とする、アンモニア制御装置。
13. 前記制御部は、さらに、
    校正用信号から前記検量線に基づいて算出される非イオン化アンモニア濃度が、前記総アンモニア濃度計算手段により計算された総アンモニア濃度となるよう、当該検量線を校正し、
    前記校正用信号は、
    前記培養槽外に設けられた外付けアンモニアセンサであって、非解離型のアンモニア濃度を測定するアンモニアセンサを準備し、
    前記培養槽から採取した後、アンモニウムイオンを非イオン化アンモニアにするのに十分にアルカリ性にした培養液の非解離型のアンモニア濃度を前記外付けアンモニアセンサで測定したときの、前記外付けアンモニアセンサから取得された信号であることを特徴とする、請求項１２に記載のアンモニア制御装置。
14. 前記アンモニア制御装置は、前記外付けアンモニアセンサに接続され、
    前記制御部は、さらに、
    前記外付けアンモニアセンサからの信号を校正用信号として入力する請求項１３記載のアンモニア制御装置。
15. 培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に保持するように構成される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
16. ユーザーインターフェースをさらに備える、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
17. 培養液中のアンモニアをリアルタイムで制御するように構成される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
18. 一つ以上の培養槽の培養液中のアンモニアを制御するように構成される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
19. ５分以内の間隔で、培養液中のアンモニアを制御するように構成される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
20. １２時間以内の間隔で、検量線を校正するように構成される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
21. 培養期間の少なくとも一部又は全体においてアンモニアを制御するように構成される、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置。
22. 目的物質を生産する能力を有する微生物を培養液を含む発酵槽中で培養し、前記培養液中に前記目的物質を生成、蓄積させる、発酵法による目的物質の製造法で、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載のアンモニア制御装置を用いて、全培養工程のうち少なくとも一部の期間、培養液中の総アンモニア濃度を一定濃度の範囲に調整することを含む、前記製造法。
23. 前記一定濃度の範囲が、300mM以下である請求項２２に記載の方法。
24. 前記一定濃度の範囲が、200mM以下である請求項２２に記載の方法。
25. 前記一定濃度の範囲が、100mM以下である請求項２２に記載の方法。
    

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