CZ293268B6 - Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu - Google Patents

Abstract

Schopnost produkovat L-lyzin a rychlost produkce L-lyzinu se zlepší u koryneformní bakterie nesoucí aspartokinázu, u které je zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem v podstatě vyřazena z činnosti, postupným zesílením DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu, dihydrodipikolinát syntázu, diaminopimelát dekarboxylázu a diaminopimelát dehydrogenázu.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby L-lyzinu kultivací mikroorganismu, získaného modifikací koryneformní bakterie, používané pro fermentativní výrobu aminokyseliny apod., použitím techniky založené na genetickém inženýrství.

Dosavadní stav techniky

L-lyzin, který se používá jako přídavná látka do krmiv, se obvykle vyrábí fermentativním způsobem použitím mutantního kmene náležejícího ke koryneformním bakteriím, produkujícího L-lyzin. V současnosti je známo mnoho bakterií produkujících L-lyzin, které byly vytvořeny umělou mutací standardního kmene, náležejícího ke koryneformním bakteriím.

Co se týče koiyneformních bakterií, jsou známy vektorové plazmidy, které se autonomně replikují v bakteriálních buňkách a mají markerový gen rezistence vůči léku (viz US patent 4 514 502), a způsob zavádění genu do bakteriálních buněk (například zveřejněná japonská patentová přihláška 2-207791). Popisuje se také možnost šlechtění bakterií produkujících Lthreonin nebo L-izoleucin použitím výše popsaných způsobů (viz US patenty 4 452 890 a 4 442 208). Co se týče šlechtění bakterie produkující L-lyzin, je znám způsob, při kterém se vloží gen účastnící se biosyntézy L-lyzinu do plazmidového vektoru pro zesílení genu v bakteriálních buňkách (např. uveřejněná japonská patentová přihláška 56-160997).

Známými geny pro biosyntézu L-lyzinu jsou např. gen pro dihydrodipikolinát reduktázu (japonská zveřejněná patentová přihláška 7-75578) a gen pro diaminopimelát dehydrogenázu (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987), ve kterém je klonován gen účastnící se biosyntézy L-lyzinu a gen pro fosfoenolpyruvát karboxylázu (japonská zveřejněná patentová přihláška 60-87788), gen pro dihydrodipikolinát syntézu (japonská zveřejněná patentová přihláška 6-55149) a gen pro diaminopimelát dekarboxylázu (japonská zveřejněná patentová přihláška 60-62994), u kterých amplifikace genu ovlivňuje míru produkce L-lyzinu.

Co se týče enzymů účastnících se biosyntézy L-lyzinu, je znám příklad enzymu, který podléhá zpětnovazební inhibicí při použití ve formě standardního typu. V takovém případě je výtěžnost L-lyzinu zlepšena zavedením genu enzymu s takovou mutací, že zpětnovazebná inhibice se vyřadí. Takovými známými geny jsou zvláště například gen aspartokinázy (zveřejněná mezinárodní přihláška WO 94/25605).

Jak se popisuje výše, určité pozitivní výsledky byly získány pomocí amplifikace genů biosyntetického systému L-lyzinu nebo zavedením mutantních genů. Značné množství L-lyzinu (přibližně 25 g/1) např. produkuje koryneformní bakterie, která nese mutantní gen pro aspartokináz s vyřazenou spřaženou inhibicí lyzinem a threoninem. Nevýhodou této bakterie je však pokles růstové rychlosti při porovnání s bakterií, která mutantní gen aspartokinázy nemá. Popisuje se také, že výtěžnost L-lyzinu se zlepší dalším zavedením genu dihydrodipikolinát syntázy navíc k mutantnímu genu pro aspartokinázu (Applied and Environmental Microbiology. 57(6), 1746 - 1752 (1991). Rovněž tato bakterie však trpí dalším snížením růstové rychlosti.

Co se týče genu pro dihydrodipikolinát reduktázu, bylo ukázáno, že aktivita dihydrodipikolinát reduktázy se v koryneformní bakterii se zavedeným genem zvýší, avšak chybí údaje o vlivu na produktivitu L-lyzinu (zveřejněná japonská patentová přihláška 7-75578).

V současnosti tedy není znám žádný případ koryneformní bakterie, u které by se někomu podařilo významně zlepšit výtěžek L-lyzinu kombinací většího počtu genů biosyntézy L-lyzinu

-1 CZ 293268 B6 bez omezení růstu. Stejně tak není znám případ, který by se zabýval zvýšením růstu zesílením genu pro biosyntézu L-lyzinu.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je zlepšení schopnosti produkovat L-lyzin a růstové rychlosti koryneformní bakterie použitím genetických materiálů sekvencí DNA kódujících aspartokinázu (dále označovanou jako „AK“, s tím, že gen kódující protein AK se dále v případě potřeby označuje jako JysC“). dihydrodipikolinát reduktázu (dále označovanou jako „DDPR“, s tím, že gen kódující protein DDPR se dále v případě potřeby označuje jako „dapB“), dihydrodipikolinát syntázu (zde zkracovanou jako „DDPS“, s tím, že gen kódující protein DDPS se dále v případě potřeby označuje jako „dapA“). diaminopimelát dekarboxylázu, (dále označovanou jako „DDC“, s tím, že gen kódující protein DDC se dále v případě potřeby označuje jako „IvsA) a diaminopimelát dehydrogenázu (dále označovanou jako „DDH“, s tím, že gen kódující protein DDH se dále v případě potřeby označuje jako „ddh“), které jsou v buňkách koryneformních bakterií důležitými enzymy pro biosyntézu L-lyzinu. Pokud se fermentačním způsobem s použitím mikroorganizmu produkuje určitá látka, rychlost produkce, stejně jako výtěžek této látky vzhledem ke vloženému materiálu je extrémně důležitý faktor. Náklady na produkci určité látky mohou být značně sníženy zvýšením produkční rychlosti na jednotku objemu fermentačního zařízení. Je tedy pro průmyslové využití extrémně důležité, aby výtěžek fermentace a lychlost produkce byly vzájemně kompatibilní. Předkládaný vynález navrhuje řešení tohoto problému, aby bylo možno dosáhnout zlepšení fermentativního způsobu výroby L-lyzinu s použitím koryneformních bakterií.

Podstatou předkládaného vynálezu je skutečnost, že růst koryneformní bakterie je možno zlepšit a tím zvýšit rychlost produkce L-lyzinu dosažením zesílení kombinací dapB s mutantním lysC (dále v případě potřeby jednoduše označovaným jako „mutantní lysC), kódující mutantní AK (dále v případě potřeby jednoduše označovanou jako „AK mutantního typu“), přičemž touto kombinací se vyřadí z činnosti spřažená inhibice lyzinem a threoninem ve srovnání s případem, kdy se zesílí lysC samotný, a že rychlost produkce L-lyzinu může být dále zvyšována po krocích postupným zesilováním dapA. lysA a ddh.

Předkládaný vynález spočívá jmenovitě v rekombinantní DNA autonomně replikovatelné v buňkách koryneformní bakterie, obsahující sekvenci DNA kódující aspartokinázu, ve které je zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem v podstatě vyřazena z činnosti a sekvenci DNA, kódující dihydrodipikolinát reduktázu.

Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která dále navíc kvýše popsaným sekvencím DNA obsahuje sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu. Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která navíc ke třem výše popsaným sekvencím DNA dále obsahuje sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu. Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která dále navíc kvýše popsaným čtyřem sekvencím DNA obsahuje sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.

V dalším hledisku poskytuje předkládaný vynález koryneformní bakterii nesoucí aspartokinázu, ve které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a obsahující zesílenou DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA kódující ve výše uvedené koryneformní bakterii dihydrodipikolát syntázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA, kódující ve výše uvedené koryneformní bakterii navíc ke třem výše popsaným DNA diaminopimelát dekarboxylázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA, která ve výše uvedené koryneformní bakterii navíc ke čtyřem DNA popisovaným výše kóduje diaminopimelát dehydrogenázu.

-2CZ 293268 B6

V ještě dalším hledisku poskytuje vynález způsob výroby L-lyzinu, který zahrnuje kroky kultivace jakékoliv výše popsané koryneformní bakterie ve vhodném médiu, produkce a akumulace

L-lyzinu v bakteriální kultuře a izolace L-lyzinu z kultury.

Korynemorfní bakterie v předkládaném vynálezu jsou skupinou mikroorganizmů, jak je definována v publikaci: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. vyd., str. 599 (1974), tedy aerobní grampozitivní tyčinky, které nejsou odolné vůči kyselinám a nemají schopnost tvořit spory. Mezi koryneformní bakterie spadají bakterie náležející k rodu Corynebacterium, bakterie náležející k rodu Brevibacterium, které byly dosud zatříděny do rodu Brevibacterium, ale nyní náležejí krodu Corynebacterium, a bakterie náležející krodu Brevibacterium blízce příbuzné k bakteriím náležejícím k rodu Corynebacterium.

Dále následuje podrobný popis vynálezu:

(1) Příprava genů biosyntézy L-lyzinu používaných v předkládaném vynálezu

Geny biosyntézy L-lyzinu používané v předkládaném vynálezu se získávají izolací chromozomální DNA z bakterie (donor DNA), vytvořením knihovny chromozomální DNA použitím plazmidového vektoru nebo jiným způsobem, selekcí kmene nesoucího požadovaný gen, a izolací rekombinantní DNA z vybraného kmene, do které je gen vložen. Volba donoru DNA pro gen biosyntézy L-lyzinu používaný v předkládaném vynálezu není nějak specificky limitována pod podmínkou, že požadovaný gen biosyntézy L-lyzinu exprimuje protein enzymu, který v buňkách koryneformní bakterie funguje. S výhodou je však donorem DNA koryneformní bakterie.

Všechny geny lysC, dapA a dapB, pocházející z koryneformních bakterií, mají známé sekvence. Mohou být tedy získány provedením amplifíkace metodou polymerázové řetězové reakce (PCR; viz White, T. J. a další, Trends Genet, 5, 185 (1989).

Každý z genů pro biosyntézu L-lyzinu používaný v předkládaném vynálezu je možno získat podle některé metody, jejich příklady se uvádějí níže.

1. Příprava mutantního lysC

Fragment DNA obsahující mutantní gen lysC je možno připravit z mutantního kmene, ve kterém byla v podstatě vyřazena z činnosti synergická zpětnovazební inhibice aktivity AK L-lyzinem a L-threoninem (mezinárodní publikovaná přihláška WO 94/25605). Takový mutantní kmen může být například získán ze skupiny buněk, které pocházejí ze standardního kmene koryneformní bakterie, vystaveného působení mutace použitím obvyklých metod mutace, jako je ozáření UV a působení mutačních činidel, jako je N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Aktivita AK může být měřena pomocí metody popsané v: Miyajima, R. a další, v The Joumal of Biochemistrv (1968), 63(21 139 - 148. Jako takový mutantní kmen je nejvýhodnější kmen, představovaný bakterií produkující L-lyzin AJ3445 (FERM P—1944), odvozený pomocí mutačního působení z kmene Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 standardního typu (dnes označované novým názvem Corynebacterium glutamicum).

Alternativně je možno mutantní lysC získat mutací plazmidové DNA, obsahující gen lysC standardního typu in vitro. V dalším hledisku je známa specifická informace o mutaci, vedoucí k vyřazení synergické zpětnovazební inhibice AK L-lyzinem a L-threoninem z činnosti (mezinárodní zveřejněná patentová přihláška WO 94/25605). Mutantní gen lysC může být tedy také připraven na základě informace například metodou místně specifické mutageneze.

Fragment obsahující lysC může být izolován z koryneformní bakterie přípravou chromozomální DNA například metodou Saito H. a Miura K., Biochem. Biophvs. Acta, 72, 619 (1963), a ampli-3CZ 293268 B6 fikací lysC metodou polymerázové řetězové reakce (PCR; viz White, T. J. a další, Trends Genet..

5, 185 (1989).

Jako příklad primerů DNA je možno uvést jednořetězcové DNA 23-meru a 21-meru s nukleoti5 dovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No.: 1 a 2 ve výpisu sekvencí pro amplifikaci například oblasti o velikosti přibližně 1643 bp, kódující lysC, založené na sekvenci známé pro Corynebacterium glutamicum (viz Molecular Microbiology (1991), 5(5). 1197 - 1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317 - 324). DNA je možno syntetizovat obvyklými způsoby použitím šyntezátoru DNA model 380B firmy Applied Biosystems a použitím fosfoamiditové metody (viz Tetrahedron 10 Letters (1981), 22, 1859). PCR je možno provádět s použitím přístroje DNA Thermal Cycler

Model PJ2000 firmy Takara Shuzo, a Taq DNA polymerázy metodou doporučenou výrobcem. Je výhodné, když je pro přípravu rekombinantní DNA gen lysC, amplifikovaný PCR, ligován s vektorem DNA, který se autonomně replikuje v buňkách E. coli a/nebo koryneformní bakterie, a rekombinantní DNA se předem zavede do buněk E. coli. Dodržení této podmínky usnadní nás15 ledující postup. Vektorem autonomně se replikujícím v buňkách E. coli ie s výhodou plazmidový vektor, který se s výhodou autonomně replikuje v buňkách hostitele, včetně například plazmidů pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 a RSF1010.

Pokud se do těchto vektorů vloží fragment DNA, který má schopnost umožnit plazmidu auto20 nomní replikaci v koryneformní bakterii, může být vektor použit jako tzv. kyvadlový vektor, který se autonomně replikuje jak v E. coli, tak i koryneformní bakterii.

Takový kyvadlový vektor zahrnuje následující vektory.

Mikroorganizmus nesoucí každý takovj' vektor a depozitní čísla uložení v mezinárodních institucích pro ukládání mikroorganizmů jsou uvedena v závorkách.

pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)

Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)

Tyto vektory je možno získat z mikroorganizmů uložených ve sbírce následujícím způsobem. Buňky oddělené v logaritmické fázi růstu byly lyžovány použitím lysozymu a SDS a poté centrifugací lyzátu při 30 000 x g pro získání supematantu, ke kterému byl přidán polyethylenglykol. 40 Potom byla provedena frakcionace a purifikace centrifugaci v rovnovážném hustotním gradientu chloridu česného - ethidiumbromidu.

Buňky E. coli mohou být transformovány například zavedením plazmidu metodou D. M. Morrison, Methods in Enzymology. 68, 326 (1979) nebo metodou, kdy se pro zvýšení permeability 45 pro DNA působí na buňky příjemce chloridem vápenatým (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol,,

53,159(1970).

Gen lysC standardního typu se získá izolací genu lysC z AK kmene standardního typu, zatímco mutantní lysC se získá při izolaci lysC zAK mutantního kmene některou zvýše popsaných 50 metod.

Příklad sekvence nukleotidů fragmentu DNA obsahujícího standardní typ lysC je uveden ve výpisu sekvencí v SEQ ID No.: 3. Sekvence aminokyselin α-subjednotky proteinu AK standardního typu se odvozuje ze sekvence nukleotidů, ukázané ve výpisu sekvencí v SEQ ID No.: 4

-4CZ 293268 B6 spolu se sekvencí DNA. V SEQ ID No.: 5 je uvedena pouze sekvence aminokyselin. Aminokyselinová sekvence β-podjednotky proteinu AK standardního typu se odvozuje ze sekvence nukleotidů DNA, která je uvedena v SEQ ID NO.: 6 výpisu sekvencí spolu s DNA. SEQ ID NO.: 7 uvádí pouze sekvenci aminokyselin. V každé podjednotce je jako iniciační kodon použit GTG a odpovídající aminokyselina je methionin. Totéž platí pro methionin, valin nebo formylmethionin.

Výběr mutantního genu lysC použitého v předkládaném vynálezu není zvlášť omezován za předpokladu, že kóduje AK, u které je vyřazena synergická zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem. Jako příklad mutantního genu lysC je uveden gen s mutací, ve které je 279. zbytek alaninu počítáno od N-konce zaměřen za zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina v α-podjednotce a 30. zbytek alaninu je zaměřen za zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina v β-podjednotce aminokyselinové sekvence AK standardního typu. Sekvence aminokyselin AK standardního typu specificky zahrnuje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID No.: 5 ve výpisu sekvencí jako α-podjednotka a sekvenci aminokyselin, ukázanou v SEQ ID NO.: 7 ve výpisu sekvencí jako β-podjednotka. Aminokyseliny, které s výhodou představují zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina, jsou zbytky aminokyselin threonin, arginin, cystein, fenylalanin, prolin, serin, tyrozin a valin.

Kodon odpovídající zbytku aminokyseliny, která má být substituována není u tohoto typu specificky omezen kromě podmínky, že kóduje zbytek aminokyseliny. Předpokládá se, že sekvence aminokyselin u standardního typu AK se může mírně lišit v závislosti na rozdílu v bakteriálních druzích a bakteriálních kmenech. AK, které mají mutaci založenou např. na substituci, deleci nebo inzerci jednoho nebo více zbytků aminokyselin v jedné nebo více polohách, které nemají vztah k aktivitě enzymu jak je popsáno výše, mohou být v předkládaném vynálezu použity také. Jiné AK, které mají mutaci založenou například na substituci, deleci nebo inzerci jiných jedné nebo více zbytků aminokyselin mohou být použity také za předpokladu, že změny podstatně neovlivní aktivitu AK a vyřazení synergické zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem.

Kmen AJ12691, získaný zavedením plazmidu p399AK9B nesoucího mutantní gen lysC do kmene AJ12036 (FERM BP-734) standardního typu Brevibacterium lactofermentum. byl uložen 10.4. 1992 pod depozitním číslem FERM P-12918 vNational Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko), a převeden 10. 2. 1995 na mezinárodní uložení založené na Budapešťské smlouvě pod depozitním číslem FERM BP-4999.

2. Příprava dapB

Fragment DNA obsahující gen dapB je možno připravit z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Výběr donoru DNA není specificky omezen, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Sekvence DNA kódující DDPR je pro Brevibacterium lactofermentum známa (Joumal of Bacteriology. 175(9), 2743 - 2749 (1993), a na jejím základě je možno připravit primery DNA pro PCR. Příklady takových primerů DNA jsou 23-mery DNA, které mají sekvence nukleotidů uvedené ve výpisu sekvencí pod SEQ ID No. 8 a 9. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný dapB může být provedena stejným způsobem, jak bylo popsáno výše pro lysC.

Nukleotidová sekvence fragmentu DNA obsahujícího dapB a z ní odvozená aminokyselinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 10. Pouze aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 11. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto aminokyselinovou sekvenci může předkládaný vynález ekvivalentně používat fragmenty DNA kódující sekvenci aminokyselin v podstatě stej-5CZ 293268 B6 nou jako je aminokyselinová sekvence ukázaná v SEQ ID No: 11, totiž sekvenci aminokyselin s mutací, založenou například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že změny nemají podstatný vliv na aktivitu DDPR.

Transformovaný kmen AJ13107, získaný zavedením plazmidu pCRDAPB obsahujícího dapB získaný v dále popisovaných příkladech do E. coli JM109, je od 26. 5. 1995 uložen u mezinárodně uznané instituce pod depozitním číslem FERM BP-5114 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chromě, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonsko).

3. Příprava dapA

Fragment DNA obsahující dapA je možno připravit z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Donor DNA nemusí být zvláště vybírán, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Sekvence DNA kódující DDPS je známa pro Corynebacterium glutamicum (viz Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL No. X53993), a na jejím základě je možno připravit primery pro PCR. Takové DNA primery se jako příklady uvádějí prostřednictvím DNA 23-merů s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No: 12 a 13 ve výpisu sekvencí. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný dapA může být provedena stejným způsobem jako v případě lysC popsaném výše.

Příklad nukleotidové sekvence fragmentu DNA obsahujícího dapA a z nich odvozené sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 14. Pouze aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID No: 15. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto sekvenci aminokyselin může předkládaný vynález ekvivalentně využívat fragmenty DNA kódující v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako je sekvence uvedená v SEQ ID No: 15, totiž sekvence aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že nemají podstatný vliv na aktivitu DDPS.

Transformovaný kmen AJ13106, získaný zavedením plazmidu pCRDAPA, obsahujícího dapA. který byl získán podle dále uvedeného příkladu, do kmene E. coli JMI09, byl uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5113 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 -3, Higashi 1-chrome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.

4. Příprava lysA

Fragment DNA obsahující lysA může být připraven z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Výběr donoru DNA není zvláště omezen, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

V koryneformní bakterii tvoří gen lysA operon spolu s argS (gen pro arginyl-tRNA syntázu), přičemž lysA je po směru translace vzhledem k argS. Exprese lysA je řízena promotorem, který se vyskytuje proti směru translace vzhledem k argS (viz Joumal of Bacteriology, Nov., 7356 7362 (1993). Sekvence DNA těchto genů jsou známy pro Corynebacterium glutamicum (viz Molecular Microbiology. 4(11). 1819 - 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics. 212. 112- 119 (1988), a na základě těchto sekvencí je možno připravit primery pro PCR. Takové primery DNA jsou v příkladech specificky uváděny jako DNA 23-merů, které mají nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 16 ve výpisu sekvencí (odpovídající číslům nukleotidů 11 až 33 v nukleotidové sekvenci popsané v Molecular Microbiology, 4(11), 1819 - 1830 (1990) a SEQ ID No: 17 (odpovídající číslům nukleotidů 1370 až 1392 v nukleotidové sekvenci popsané

-6CZ 293268 B6 v Molecular and Generál Genetics, 212, 112 - 119 (1988). Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidů obsahujícího získaný gen lysA může být provedena stejným způsobem jako u výše popsaného lysC.

Pro zesílení lysA byl v dále uvedených příkladech použit fragment DNA, obsahující promotor, argS a lysA. Pro předkládaný vynález však argS není nezbytný. Je možné použít fragmentu DNA ve kterém je lysA ligován právě po směru translace vzhledem k promotoru.

Příklad nukleotidové sekvence fragmentu DNA obsahujícího argS a lysA a aminokyselinové sekvence odvozené ze sekvence nukleotidů, jsou uvedeny v SEQ ID No: 18. Příklad sekvence aminokyselin kódovaný argS ie uveden v SEQ ID No: 19 a příklad aminokyselinové sekvence kódované lysA je uveden v SEQ ID No: 20. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tyto aminokyselinové sekvence mohou být v předkládaném vynálezu ekvivalentně použity fragmenty DNA kódující v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako sekvence aminokyselin uvedená v SEQ ID No: 20, totiž sekvence aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že tyto změny nemají podstatný vliv na aktivitu DDC.

5. Příprava ddh

Fragment DNA obsahující ddh je možno připravit z chromozomu koiyneformní bakterií pomocí PCR. Výběr donoru DNA není zvláště omezen, avšak v příkladech se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Gen DDH je znám pro Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res.. 15, 3917 (1987) a na jeho základě je možno připravit příměry pro PCR. Příklady těchto příměrů DNA jsou uvedeny jako DNA 20-merů s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No: 21 a 22 ve výpisu sekvencí. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidů obsahujícího získaný ddh může být provedena stejným způsobem jako pro výše popsaný lysC.

Sekvence nukleotidů fragmentu DNA kódujícího ddh a sekvence aminokyselin odvozená z této nukleotidové sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 24. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto sekvenci aminokyselin může předkládaný vynález ekvivalentně použít fragmenty DNA kódující v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako je sekvence aminokyselin ukázaná v SEQ ID No: 24, totiž sekvenci aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že nemají podstatný vliv na aktivitu DDH.

(2) Rekombinantní DNA a koryneformní bakterie podle předkládaného vynálezu

Koryneformní bakterie podle předkládaného vynálezu nese aspartokinázu (mutantní AK), ve které je v podstatě vyřazena zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, zatímco DNA (dapB). kódující dihydrodipikolinát reduktázu je zesílena. V předkládaném vynálezu je koryneformní bakterií ve výhodném provedení koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (dapA). kódující dihydrodipikolinát syntázu. V ještě výhodnějším provedení je koryneformní bakterii podle předkládaného vynálezu koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (lysA), kódující diaminopimelát dekarboxylázu. V ještě výhodnějším provedení je koryneformní bakterií podle předkládaného vynálezu koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (ddh), kódující diaminopimelát dehydrogenázu.

Termín „zesílení“ DNA zde označuje skutečnost, že intracelulámí aktivita enzymu, kódovaného DNA, je zvýšena například zvýšením počtu kopií v genu, použitím silného promotoru, použitím genu kódujícího enzym s vysokou specifickou aktivitou nebo použitím kombinace těchto prostředků.

Koryneformní bakterii nesoucí mutantní AK může být bakterie, která produkuje mutantní aspartokinázu v důsledku mutace nebo bakterie, které jsou transformovány zavedením mutantního lysC.

Příklady koryneformní bakterie použité pro zavedení výše uvedené DNA například zahrnují následující kmeny produkující lyzin standardního typu.:

Corvnebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;

Corvnebacterium callunae ATCC 15991;

Corvnebacterium glutamicum ATCC 13032;

(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;

(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;

(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;

(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;

Brevibacterium roesum ATCC 13825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Corvnebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).

Kromě výše uvedených bakteriálních kmenů zahrnují kmeny použitelné jako hostitelské například mutantní kmeny se schopností produkovat L-lyzin, odvozené zvýše uvedených kmenů. Takové umělé mutantní kmeny zahrnují následující: mutantní kmeny rezistentní k S-(2-aminoethyl)-cysteinu (zde zkracované jako „AEC“) (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL Β—1147), japonská zveřejněná přihláška 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 a 7-112438); mutantní kmeny, které jsou rezistentní k AEC a vyžadují aminokyseliny jako je L-leucin, Lhomoserin, L-prolin, L-serin, L-arginin, L-alanin a L-valin (US patenty 3,708,395 a 3,825,472); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou rezistentní na DL-a-amino-εkaprolaktam, α-amino-lauryllaktam, aspartátový analog, sulfoléčiva, chinoid a N-lauroylleucin; mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou rezistentní na inhibitory oxyaloacetát dekarboxylázy nebo enzymů respiračního systému (japonská zveřejněná patentová přihláška 5053588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 a 56-39778 a japonská zveřejněná přihláška 53—43591 a 53-1833); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které vyžadují inozitol nebo kyselinu octovou (japonská zveřejněné patentové přihlášky 55-9784 a 56-8692); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou citlivé na fluoropyruvát nebo teploty, které nejsou menší než 34 °C (japonská zveřejněná patentová přihláška 55-9783 a 53

-8CZ 293268 B6

86090); a produkční mutantní kmeny náležející do rodu Brevibacterium nebo Corynebacterium, které jsou rezistentní k ethylenglykolu a produkují L-lyzin (US patent 4 411 997).

Ve specifickém provedení se pro zesílení genů biosyntézy L-lyzinu u hostitele jak je popsáno výše zavádějí geny do hostitele použitím plazmidového vektoru, transpozonu nebo fágového vektoru apod. Po zavedení se očekává, že dojde k zesílení do určité míry i v případě použití vektoru s nízkým počtem kopií. Je však výhodné použít vektoru s větším počtem kopií. Takové vektory zahrnují například plazmidové vektory pAJ655, pAJ1844, pAJóll, pAJ3148 a pAJ440 popsané výše. Mimoto se v mezinárodních zveřejněných přihláškách WO 02/02627 a WO 93/18151, evropské zveřejněné přihlášce 445385, japonské patentové zveřejněné přihlášce 46867, Vertes, A. A. a další, Mol. Microbiol., 11, 739 - 746 (1994, Bonamy, C., a další, Mol. Microbiol., 14, 571 - 581 (1994), Vertes, A. A. a další, Mol. Gen. Genet., 245, 397 - 405 (1994), Jagar, W. a další, FEMS Microbiology Letters, 126, 1 - 6 (1995), japonská zveřejněná patentová přihláška 7-107976, japonská zveřejněná patentová přihláška 7-327680 apod. popisují transpozony odvozené z koryneformní bakterie.

V předkládaném vynálezu není nezbytné, aby byl mutantní lysC nutně zesílen. Je možné použít kmeny, které mají mutaci na lysC nebo chromozomální DNA, nebo ve kterých je mutantní lysC včleněn do chromozomální DNA. Alternativně může být mutantní lysC zaveden použitím plazmidového vektoru. Na druhé straně pro produkci L-lyzinu s vysokou účinností je výhodné zesílení dapA, dapB. lysA a ddh.

Každý z genů lysC, dapA, dapB, lysA a ddh může být do hostitele úspěšně zaveden s použitím různých vektorů. Alternativně mohou být dva, tři, čtyři nebo pět z těchto genů zavedeny společně použitím jediného vektoru. Jestliže se použije různých vektorů, geny mohou být zaváděny v jakémkoliv pořadí, je však výhodné použít vektory, které jsou v hostiteli stabilní a které jsou schopny vzájemné koexistence.

Koryneformní bakterie nesoucí mutantní AK a dále obsahující zesílený dapB se například získává zavedením rekombinantní DNA obsahující mutantní lysC a dapB, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený dapA navíc kmutantnímu lysC a dapB se například získá zavedením rekombinantní DNA obsahující mutantní lysC, dapB a dapA, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený lysA navíc k mutantnímu lysC, dapB a dapA se například získá zavedením rekombinační DNA, obsahující mutantní lysC, dapB, dapA a lysA, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený ddh navíc kmutantnímu lysC. dapB, dapA, a lysA se například získá zavedením rekombinační DNA, obsahující mutantní lysC, dapB, dapA, lysA a ddh, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelského koryneformní bakterie.

Výše uvedené rekombinantní DNA mohou být získány například vložením každého z genů, který se účastní biosyntézy L-lyzinu, do vektoru jako je plazmidový vektor, transpozon nebo fágový vektor, jak bylo popsáno výše.

V případě, že se jako vektoru použije plazmidu, rekombinantní DNA může být do hostitele zavedena pomocí elektropulzní metody (Sugimoto a další, japonská zveřejněná patentová přihláška 2-207791).

-9CZ 293268 B6

Zesílení genu s použitím transpozonu je možno provést zavedením plazmidu, nesoucího transpozon, do hostitelské buňky a indukcí transpozice transpozonu.

(3) Způsob výroby L-lyzinu

L-lyzin může být účinně vyráběn kultivací koryneformní bakterie, obsahující zesílené geny biosyntézy L-lyzinu jak bylo popsáno výše ve vhodném médiu, produkcí a akumulací L-lyzinu v kultuře bakterií a izolací L-lyzinu z kultury.

Příkladem použitelného média je obvyklé médium obsahující zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické ionty a popřípadě další organické složky.

Jako zdroj uhlíku je možné použít cukry jako je glukóza, fruktóza, sacharóza, melasa a hydrolyzovaný škrob; a organické kyseliny jako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantarová.

Jako zdroj dusíku je možné použít anorganické amonné soli jako je síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný; a organické zdroje dusíku jako sojový hydrolyzát; dále plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.

Jako zdroje stopových živin je vhodné použít látek, které obsahují například vitamin B] a Lhomoserin nebo kvasničný extrakt apod. ve vhodném množství. Pokud je nutné, mohou být z jiných stopových látek v malých množstvích použity fosforečnan draselný, síran hořečnatý, iont železa, manganu apod.

Kultivace se s výhodou provádí za aerobních podmínek po dobu přibližně 30 až 90 hod. Kultivační teplota se v průběhu kultivace s výhodou řídí při 25 až 37 °C a pH při 5 až 8. Pro nastavení pH je možno použít organických, kyselých nebo alkalických látek nebo plynného amoniaku apod. L-lyzin je možno z kultury izolovat kombinací běžného způsobu založeného na iontoměničového pryskyřici, srážecí metody a jiných známých způsobů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ilustruje způsob konstrukce plazmidů p399AKYB a p399AK9B, obsahujících mutantní lysC.

Obr. 2 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pDPRB, obsahující dapB a Brevi.-ori.

Obr. 3 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pDPSB, obsahující dapA a Brevi.-ori.

Obr. 4 ilustruje způsob konstrukce plazmidu p299LYSA, obsahující lysA.

Obr. 5 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pLYSAB, obsahující lysA a Brevi.-ori.

Obr. 6 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pPK4D, obsahující ddh a Brevi.-ori.

Obr. 7 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCRCAB, obsahující lysC. dapB a Brevi.-ori.

Obr. 8 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCB, obsahující mutantní lysC, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 9 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pAB, obsahující dapA, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 10 ilustruje způsob konstrukce plazmidu p399DL, obsahující ddh, a lysA.

-10CZ 293268 B6

Obr. 11 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pDL, obsahující ddh, lysA a Brevi.-ori.

Obr. 12 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCAB, obsahující mutantní lysC, dapA, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 13 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCABL, obsahující lysC. dapA, dapB, lysA a Brevi.-ori.

Obr. 14 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCABDL, obsahující lysC, dapA, dapB, ddh, lysA a Brevi.-ori.

Předkládaný vynález bude podrobněji vysvětlen níže na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava genu lysC standardního typu a mutantního genu lysC z bakterie Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava genů lysC standardního a mutantního typu a příprava plazmidů, které je obsahují

Kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a L-lyzin produkující mutantní kmen AJ3445 (FERM P—1944), získaný z kmene ATCC 13869 mutací byly použity jako dárci chromozomální DNA. Mutace kmene AJ3445 byla provedena tak, aby byl gen lysC změněn pro dosažení v podstatě úplného vyřazení spřažené inhibice lyzinem a threoninem (Joumal of Biochemistry. 68, 701 - 710 (1970).

Pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce; viz White, T. J. a další, Trends Genet., 5, 185 (1989) byl z chromozomální DNA amplifikován fragment DNA obsahující lysC. Jako primery byly pro amplifíkaci syntetizovány jednořetězcový 23-mer a 21-mer DNA s nukleotidovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No: 1 a 2, aby došlo k amplifíkaci oblasti o velikosti přibližně 1644 BP kódující lysC, založený na sekvenci známé pro Corynebacterium glutamicum (viz Molecular Microbiologv (1991), 5(5), 1197 - 1204; a Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317 - 324). DNA byla syntetizována obvyklým způsobem s použitím DNA syntezátoru model 380B firmy Applied Biosystems použitím fosfoamiditové metody (viz Tetrahedron Letters (1981), 22,1859).

Gen byl amplifikován pomocí PCR použitím přístroje DNA Thermal Cycler Model PJ2000 firmy Takara Shuzo a Taq DNA polymerázy v souladu s doporučením dodavatele. Vznik zesíleného genového fragmentu o velikosti 1643 kb byl potvrzen elektroforézou na agarózovém gelu. Potom byl obvyklým způsobem fragment vyříznutý z gelu vyčištěn a štěpen restrikčními enzymy Nrul (firmy Takara Shuzo) a EcoRI (firmy Takara Shuzo).

Jako klonovacího vektoru pro genový fragment bylo použito plazmidu pHSG399 (viz Takeshita, S. a další, Gene (1987), 61, 63 - 64). pHSG399 byl štěpen restrikčními enzymy Smál (firmy Takara Shuzo) a EcoRI a byl ligován s amplifíkovaným fragmentem lysC. DNA byla ligována s použitím ligačního kitu DNA (firmy Takara Shuzo) podle doporučené metody. Byly tedy připraveny plazmidy, ve kterých byly fragmenty lysC, amplifíkované z chromozomů Brevibacterium lactofermentum ligovány s pHSG399. Plazmid obsahující gen lysC z ATCC 13869 (kmen standardního typu) byl označen jako p399AKY a plazmid obsahující lysC zAJ3463 (bakterie produkující L-lyzin) byl označen jako p399AK9.

Fragment DNA (zde označovaný jako „Brevi.-ori“) se schopností vytvářet plazmid autonomně se replikující v bakterii rodu Corynebacterium byl zaveden do p399AKY a p399AK9 s cílem připravit plazmidy nesoucí lysC, které se autonomně replikují v bakterii rodu Corynebacterium.

-11 CZ 293268 B6

Brevi.-ori byl připraven z plazmidového vektoru pHK4 obsahujícího Brevi.-ori a autonomně se replikujícího v buňkách jak Escherichia coli tak i v bakteriích rodu Corynebacterium. pHK4 byl zkonstruován štěpením pHC4 KpnI (firmy Takara Shuzo) a BamHl (firmy Takara Shuzo), extrakcí fragmentu Brevi.-ori a jeho ligaci s pHSG298, který byl rovněž štěpen KpnI a BamHl (viz japonská zveřejněná přihláška 5-7491). pHK4 hostiteli poskytuje rezistenci na kanamycin. Escherichia coli nesoucí pHK4 byla označena jako Escherichia coli AJ13136 a uložena 1.8. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5186 vNational Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chrome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy KpnI a BamHl a štěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno s použitím soupravy DNA Blunting kit (firmy Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření rovných konců byl ligován fosforylovaný BamHl linker (firmy Takara Shuzo) pro dosažení takové úpravy, že DNA fragment odpovídající části Brevi.ori může být vyštěpen z pHK4 štěpením samotným BamHl. Tento plazmid byl štěpen BamHl a vytvořený DNA fragment Brevi.-ori byl ligován s p399AKY a p399AK9, které byly rovněž štěpeny BamHl za vytvoření plazmidů, které vždy obsahovaly gen IvsC autonomně se replikující v bakterii rodu Corynebacterium.

Plazmid obsahující gen IvsC standardního typu pocházející zp399AKY byl označen jako p399AKYB a plazmid obsahující mutantní gen IvsC pocházející z p399AK9 byl označen jako p399AK9B. Způsob konstrukce p399AK9B a p399AKYB je ukázán na obr. 1. Kmen AJ12691 získaný zavedením mutantního plazmidu IvsC p399AK9B do kmene Brevibacterium lactofermentum standardního typu (kmen AJ 12036, FERM BP-374) byl uložen 10. 4. 1993 pod depozitním číslem FERM P-12918 u National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chrome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) a převeden na mezinárodní uložení podle Budapešťské dohody 10.2. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-4999.

(2) Stanovení nukleotidových sekvencí lysC standardního typu a mutantního typu z Brevibacterium lactofermentum

Plazmid p399AKY obsahující lysC standardního typu a plazmid p399AK9 obsahující mutantní IvsC byly připraveny z příslušných transformantů s cílem určit nukleotidové sekvence mutantního a standardního lysC. Stanovení nukleotidové sekvence bylo provedeno Sangerovou metodou (například. F. Sanger a další, Proč. Nati. Acad. Sci.. 74,5463 (1977).

Nukleotidová sekvence lysC standardního typu kódovaného p399AKY je ukázána v SEQ ID No: 3 ve výpisu sekvencí. Nukleotidová sekvence mutantního IvsC kódovaného p399AK9 měla jedinou mutaci na jednom nukleotidu, kde G v poloze 1051 byl změněn v SEQ ID No: 3 na A ve srovnání s IvsC standardního typu. Je známo, že lysC Corynebacterium glutamicum má dvě podjednotky (α, β), kódované v identickém čtecím rámci na identickém řetězci DNA (viz Kalinowski, J. a další, Molecular Microbiologv (1991) 5(5), 1197 - 1204). Pokud se usuzuje z homologie, předpokládá se, že zde sekvenovaný gen má také dvě podjednotky (α, β) kódované ve stejném čtecím rámci na identickém řetězci DNA.

Sekvence aminokyselin podjednotky α proteinu AK standardního typu, odvozená se sekvence nukleotidů DNA, je ukázána v SEQ ID No: 4 spolu se sekvencí DNA. Pouze sekvence aminokyselin je uvedena v SEQ ID No: 5. Sekvence aminokyselin β-podjednotky proteinu AK standardního typu, odvozená z nukleotidové sekvence dna, je uvedena v SEQ ID No: 6 spolu s DNA. Pouze aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID No: 7. V každé z podjednotek se jako iniciační kodon používá GTG a odpovídající aminokyselina je methionin. Toto přiřazení však označuje methionin, valin nebo formylmethionin.

- 12CZ 293268 B6

Na druhé straně mutace sekvence mutantního genu lysC výskytem substituce aminokyselinového zbytku spočívá v tom, že zbytek alaninu v poloze 279 α-podjednotky je zaměněn za zbytek threoninu a zbytek alaninu v poloze 30 β-podjednotky je zaměněn za zbytek threoninu v sekvenci aminokyselin standardního typu proteinu AK. (SEQ ID No: 5 a 7).

Příklad 2: Příprava dapB z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava dapB a konstrukce plazmidu obsahujícího dapB

Jako donor chromozomální DNA byl použit kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 standardního typu. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 standardní metodou. Fragment DNA obsahující dapB byl amplifíkován z chromozomální DNA metodou PCR. Pro amplifikaci byly použity DNA primery založené na 23-merech DNA s nukleotidovými sekvencemi uvedenými ve výpisu sekvencí jako SEQ ID No: 8 a 9, které byly syntetizovány pro zesílení oblasti o velikosti přibližně 2,0 kb, kódující DDPR podle sekvence známé pro Brevibacterium lactofermentum (viz Joumal of Bacteriology. 157(9), 2743 - 2749 (1993). Syntéza DNA a PCR byly prováděny stejným způsobem jak se popisuje v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 2001 bp, který byl ligován s amplifikovaným fragmentem dapB, byl použit plazmid pCR-Script (firma Invitrogen).

Byl tedy zkonstruován plazmid, ve kterém byl fragment dapB o velikosti 2001 bp, amplifikovaný z chromozomu Brevibacterium lactofermentum, ligován s plazmidem pCR-Script. Plazmid získaný výše popsaným způsobem, jehož dapB pochází z ATCC 13869, byl označen jako pCRDAPB. Transformantní kmen AJ13107, získaný zavedením pCRDAPB do E. coli JMI09 byl mezinárodně uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5114 vNational Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industries Science and Technolog}' of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305,1 -3, Higashi 1-chrome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.

Štěpením pCRDAPB enzymem EcoRV a Sphl byl extrahován fragment o velikosti 1101 bp obsahující strukturní gen DDPR. Tento fragment byl ligován s pHSG399, který byl štěpen HincII a Sphl pro přípravu plazmidu. Připravený plazmid byl označen jako p399DPR.

Do připraveného p399DPR byl zaveden Brevi.-ori za vytvoření plazmidu nesoucího dapB, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčním enzymem KpnI (firma Takara Shuzo) a štěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo vytvořeno použitím sady DNA Blunting Kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření tupého konce byl ligován fosforylovaný linker BamHI (firmy Takara Shuzo) pro vytvoření takové modifikace, aby fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori mohl být z pHK4 vyříznut pouze enzymem BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399DPR, který byl také štěpen BamHI za vytvoření plazmidu, obsahujícího dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Připravený plazmid byl označen jako pDPRB. Postup konstrukce pDPRB je ukázán na obr. 2.

(2) Stanovení nukleotidové sekvence dapB z Brevibacterium lactofermentum

Plazmidová DNA byla připravena z kmene AH13107 nesoucího p399DPR a nukleotidová sekvence byla určena stejným způsobem, jak bylo popsáno v příkladu 1. Zjištění nukleotidová sekvence a z ní odvozená aminokyselinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 10. Samotná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 11.

-13CZ 293268 B6

Příklad 3: Příprava dapA z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava dapA a konstrukce plazmidů obsahuj ícího dapA

Jako donoru chromozomální DNA bylo použito kmene Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 obvyklou metodou. Fragment DNA obsahující gen dapA byl pomocí PCR amplifikován z chromozomální DNA. Jako primery DNA použité pro amplifikaci byly syntetizovány 20-mery DNA s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No: 12 a 13 ve výpisu sekvencí, aby bylo dosaženo amplifikace oblasti o velikosti přibližně 1,5 kb kódující DDPS, založené na sekvenci známé pro Corvnebacterium glutamicum (viz Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL No. X53993). Syntéza DNA a PCR byly provedeny stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 1411 bp, který byl ligován s amplifíkovaným fragmentem dapA, byl použit pCRlOOO (firma Invitrogen, viz Bio/Technology, 9, 657 - 663 (1991). Ligace DNA byla provedena s použitím sady DNA ligation kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Byl tedy zkonstruován plazmid, ve kterém byl fragment dapA o velikosti 1411 bp amplifikovaný z chromozomu Brevibacterium lactofermentum ligován spCRlOOO. Plazmid získaný uvedeným postupem, který obsahoval gen dapA pocházející z ATCC 13869, byl označen jako pCRDAPA.

Transformovaný kmen AJ13106, získaný zavedením pCRDAPA do E. coli JMI09 byl podle mezinárodních předpisů uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP—5113 vNational Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305,1 - 3, Higashi 1-chrome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.

Do připraveného pCRDAPA byl vložen Brevi.-ori pro vytvoření plazmidů, nesoucího dapA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy KpnI a BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Smál (firma Takara Shuzo) pro vytvoření modifikace, aby mohl být fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori vyříznut z pHK4 štěpením pouze Smál. Tento plazmid byl štěpen Smál a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s pCRDAPA, kteiý byl rovněž štěpen Smál, za vytvoření plazmidů obsahujícího dapA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Tento plazmid byl označen jako pDPSB. Způsob konstrukce pDPSB(Km') je ukázán na obr. 3.

(2) Stanovení nukleotidové sekvence dapA z Brevibacterium lactofermentum

Byla připravena plazmidová DNA z kmene AJ13106, nesoucího pCRDAPA a stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1 byla určena její nukleotidová sekvence. Zjištěná nukleotidová sekvence a z ní odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 14. Samotná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 15.

Příklad 4: Příprava lysA z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava lysA a konstrukce plazmidů obsahujícího lysA

Jako dárce chromozomální DNA byl použit kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 standardního typu. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 obvyklým způsobem. Potom byl pomocí PCR z chromozomální DNA amplifikován fragment DNA, obsahující argS, lysA a promotor operonu, který je obsahuje. Jako DNA primery použité pro amplifikaci byly syntetizovány 23-mery DNA s nukleotidovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID No: 16 a 17 ve výpisu sekvencí, aby bylo dosaženo amplifikace oblasti o velikosti přibližně 3,6

-14CZ 293268 B6 kb kódující arginyl-tRNA syntázu a DDC, založené na sekvenci známé pro Corynebacterium glutamicum (viz Molecular Microbiology, 4(11), 1819 - 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212, 112 - 119 (1988). Syntéza DNA a PCR byly provedeny stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 3579 bp byl použit pHSG399. pHSG399 byl štěpen restrikčním enzymem Smál (firma Takara Shuzo), a byl ligován s fragmentem DNA obsahujícím amplifikovaný lysA. Plazmid získaný postupem, který byl popsán výše, který obsahoval lysA pocházející z ATCC 13869, byl označen jako p399LYSA.

Fragment DNA obsahující lysA byl extrahován štěpením p399LYSA KpnI (firma Takara Shuzo) a BamHI (firma Takara Shuzo). Tento fragment DNA byl ligován s pHSG, který byl rovněž štěpen KpnI a BamHI. Získaný plazmid byl označen jako p299LYSA. Způsob konstrukce p299LYSA je ukázán na obr. 4.

Do získaného p299LYSA byl zaveden Brevi.-ori pro vytvoření plazmidu, nesoucího lysA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy KpnI a BamHI a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker KpnI (firma Takara Shuzo) pro získání takové modifikace, aby mohl být fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori vyříznut zpHK4 štěpením samotným KpnI. Tento plazmid byl štěpen KpnI a získaný fragment Brevi.-ori DNA byl ligován s p299LYSA, který byl rovněž štěpen KpnI, za vytvoření plazmidu obsahujícího lysA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Připravený plazmid byl označen jako pLYSAB. Způsob konstrukce pLYSAB je uveden v obr. 5.

(2) Stanovení nukleotidové sekvence lysA z Brevibacterium lactofermentum

Byla připravena plazmidová DNA p299LYSA a stejným způsobem jako v příkladu 1 byla určena její nukleotidová sekvence. Zjištěná nukleotidová sekvence a zní odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 18. Co se týče nukleotidové sekvence, sekvence aminokyselin kódovaná argó a sekvence aminokyselin kódovaná lysA jsou uvedeny v SEQ ID No: 19 a 20.

Příklad 5: Příprava ddh z Brevibacterium lactofermentum

Gen ddh byl získán amplifikací ddh genu z chromozomální DNA bakterie Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 metodou PVT použitím dvou oligonukleotidových primerů (SEQ ID No: 21 a 22), připravených podle známé nukleotidové sekvence genu ddh Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987). Získaný amplifikovaný fragment DNA byl štěpen EcoT22I a Aval a rozštěpené konce byly zarovnány. Potom byl fragment vložen do místa Smál plazmidu pMWl 19 za získání plazmidu pDDH.

Potom byl pDDH štěpen Sall a EcoRI. a vytvořené konce byly zarovnány. Získaný fragment byl pak ligován spUC18, štěpeným enzymem Smál. Takto získaný plazmid byl označen jako pUC18DDH.

Do pUC18DDH byl zaveden Brevi.-ori za vytvoření plazmidu nesoucího ddh, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy KpnI a BamHI a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaného konce byl ligován fosforylovaný linker Pstl (firma Takara Shuzo) tak, že byl vložen do místa Pstl pHSG299. Takto zkonstruovaný plazmid byl označen jako pPK4. Potom byl pUC18DDH štěpen Xbal a KpnI a vytvořený fragment byl ligován s pPK4, který byl štěpen rovněž KpnI a Xbal. Takto byl získán plazmid obsahující gen ddh, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Tento plazmid byl označen jako pPK4D. Způsob konstrukce pPK4D je uveden na obr. 6.

-15CZ 293268 B6

Příklad 6: Konstrukce plazmidu obsahující kombinaci mutantního lysC a dapA

Plazmid obsahující mutantní lvsC, dapA a počátek replikace koryneformní bakterie byl zkonstruován z plazmidu pCRDAPA, obsahujícího dapA a plazmidu p399AK9B, obsahujícího mutantní lysC a Brevi.-ori. p399AK9B byl úplně degradován Sáli a potom byly vytvořeny zarovnané konce, ke kterým byl ligován linker EcoRI pro vytvoření plazmidu, ve kterém bylo místo Sáli modifikováno na štěpící místo EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako p399AK9BSE. Mutantní lysC a Brevi.-ori byly vyříznuty jako jeden fragment částečným štěpením p399AK9BSE enzymem EcoRI. Tento fragment byl ligován s pCRDAPA, štěpeným rovněž EcoRI. Tento fragment byl ligován s pCRDAPA, štěpeným rovněž EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako pCRCAB. Tento plazmid je schopný autonomní replikace v E. coli a koryneformní bakterie a poskytuje hostiteli kanamycinovou rezistenci, přičemž obsahuje kombinaci mutantního lysC a dapA. Způsob vytvoření pCRCAB je uveden v obr. 7.

Příklad 7: Konstrukce plazmidu obsahujícího mutantní lysC a dapB

Plazmid obsahující mutantní lysC a dapB byl zkonstruován z plazmidu p399AK9 s mutantním lysC a plazmidu p399DPR s dapB. Fragment o velikosti 1101 bp nesoucí strukturní gen DDPR byl extrahován štěpením p399DPR EcoRV a SphI. Tento fragment byl ligován s p399AK9, který byl štěpen Sáli a rozštěpené konce byly potom zarovnány a dále byl štěpen SphI pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC a dapB. Tento plazmid byl označen jako p399AKDDPR.

Do získaného p399AKDDPR byl zaveden Brevi.-ori. Plazmid pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem KpnI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím soupravy DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker BamHI (firma Takara Shuzo) pro vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyříznut z pHK4 štěpením samotnou BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený fragment Brevi.-ori DNA byl ligován s p399AKDDPR, který byl rovněž štěpen BamHI, za vytvoření plazmidu obsahujícího mutantní lysC a dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCB. Způsob konstrukce pCB ukazuje obr. 8.

Příklad 8: Konstrukce plazmidu, obsahujícího kombinaci dapA a dapB

Plazmid pCRDAPA obsahující dapA byl štěpen KpnI a EcoRI pro vyříznutí fragmentu DNA obsahujícího dapA, který byl ligován s vektorovým plazmidem pHSG399, který byl předtím rovněž rozštěpen KpnI a EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako p399DPS.

Na druhé straně byl plazmid pCRDAPB, obsahující dapB, štěpen SacII a EcoRI pro vyštěpení fragmentu DNA o velikosti 2,0 kb, obsahující oblast kódující DDPR, která byla ligována s p399DPS, který byl předtím také štěpen SacII a EcoRII pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci dapA a dapB. Získaný plazmid byl označen jako p399AB.

Potom byl do p399AB zaveden Brevi.-ori. pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno použitím soupravy DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaného konce byl ligován fosforylovaný linker KpnI (firma Takara Shuzo) za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen zpHK4 štěpením pouze KpnI. Tento plazmid byl štěpen KpnI a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399AB, který byl předtím rovněž rozštěpen

-16CZ 293268 B6 enzymem KpnI, za vytvoření plazmidu obsahujícího dapA a dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pAB. Způsob konstrukce pAB ukazuje obr. 9.

Příklad 9: Konstrukce plazmidu obsahujícího kombinací ddh a lysA

Plazmid pUC18DDH obsahující ddh byl štěpen EcoRI a Xbal pro vyštěpení fragmentu DNA obsahujícího ddh. Tento fragment ddh byl ligován s plazmidem p399LYSA obsahujícím lysA, předem štěpeným BamHI a Xbal, přičemž po štěpení byly vzniklé konce zarovnány. Získaný plazmid byl označen jako p399DL. Způsob konstrukce p399DL je uveden v obr. 10.

Potom byl do p399DL zaveden Brevi.-ori. pHK4 byl štěpen Xbal a BamHI a štěpené konce byly zarovnány. Po vytvoření rovných konců byl ligován fosforylovaný linker Xbal za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen zpHK4 štěpením samotným Xbal. Tento plazmid byl štěpen Xbal a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399DL, který byl předtím rovněž štěpen Xbal za vytvoření plazmidu, obsahujícího ddh a lysA, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pDL. Postup konstrukce pDL je ukázán na obr. 11.

Příklad 10: Konstrukce plazmidu obsahujícího mutantní lysC, dapA a dapB p399DPS byl štěpen EcoRI a Sphl za vytvoření zarovnaných konců a poté bylo provedeno vyštěpení genu dapA. Tento fragment byl ligován s p399AK9, který byl štěpen Sáli a vytvořené konce byly zarovnány, za vytvoření plazmidu p399CA, ve kterém koexistují mutantní lysC a dapA.

Plazmid pCRDAPB obsahující dapB byl štěpen EcoRI a konce byly zarovnány a potom následovalo štěpení Sací pro získání fragmentu DNA o velikosti 2,0 kb, obsahujícího dapB. Plazmid p399CA obsahující dapA a mutantní lysC byl štěpen Spěl a byly vytvořeny zarovnané konce, a získaný produkt byl štěpen Sací a ligován s vyštěpením fragmentem dapB za získání plazmidu obsahujícího mutantní lysC, dapA a dapB. Tento plazmid byl označen jako p399CAB.

Potom byl do p399CAB zaveden Brevi.-ori. Plazmid pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno soupravou DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker KpnI (firma Takara Shuzo) za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyříznut z pHK4 štěpením samotným KpnI. Tento plazmid byl štěpen KpnI a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399CAB, který byl rovněž štěpen KpnI za vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA a dapB, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen pCAB. Způsob konstrukce pCAB je ukázán na obr. 12.

Příklad 11: Konstrukce plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB a lysA

Plazmid p299LYSA obsahující lysA byl štěpen KpnI a BamHI a byly zarovnány rozštěpené konce a potom byl vyštěpen fragment genu lysA. Tento fragment byl ligován s pCAB, štěpeným Hpal (produkt Takara Shuzo) a byly zarovnány jeho konce pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB a lysA, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCABL. Způsob vytvoření pCABL je uveden v obr. 13. Je nutno uvést, že gen lysA je vložen do místa Hpal ve fragmentu DNA obsahem dapB

-17CZ 293268 B6 v pCABL, avšak místo Hpal je umístěno proti směru translace vůči promotoru pro gen dapB (polohy nukleotidů 611 až 616 v SEQ ID No: 10).

Příklad 12: Vytvoření plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB, ddh a lysA pHSG299 byl štěpen Xbal a KpnI a byl ligován s p399DL, obsahujícím ddh a lysA, který byl rovněž štěpen Xbal a KpnI. Vytvořený plazmid byl označen p299DL. p299DL byl štěpen Xbal a KpnI a rozštěpené konce byly zarovnány. Po vytvoření zarovnaných konců byl vyříznut fragment DNA obsahující ddh a lysA. Tento fragment DNA byl ligován s plazmidem pCAB, obsahujícím kombinaci mutantního lysC, dapA a dapB, který byl také štěpen Hpal a jeho konce byly zarovnány, za vytvoření plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB, lysA a ddh, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCABDL. Způsob konstrukce pCABDL je uveden v obr. 14.

Příklad 13: Zavedení plazmidů obsahujících geny pro biosyntézu L-lyzinu do bakterie produkující L-lyzin Brevibacterium lactofermentum

Plazmidy obsahující geny pro biosyntézu L-lyzinu vytvořené podle výše uvedeného popisu, totiž p399AK9B(Cm^r), pDPSB(Km^r), pDPRB(Cm^r), pLYSAB(Cm^r), pPK4D(Cm^r), pCRCAB(Km^r), pAB(Cm^r), pCB(Cm^r), pDL(Cm^r), pCAB(Cm^r), pCABL(Cm^r), pCABDL(Cm^r) byly zavedeny do bakterie produkující L-lyzin AJ11082 (NRRL B-l 1470) Brevibacterium lactofermentum. Kmen AJ11082 se vyznačuje rezistencí na AEC. Plazmidy byly zaváděny elektropulzní metodou (Sugimoto a další, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 2-207791). Byly zvoleny transformanty s příslušnou rezistencí na markéry, dodanou jednotlivými plazmidy. Selekce transformantů probíhala na úplném médiu obsahujícím 5 pg/ml chloramfenikolu pokud byl prováděn výběr bakterií obsahujících plazmid s rezistencí na chloramfenikol nebo byla selekce prováděna na úplném médiu obsahujícím 25pg/ml kyanamycinu, jestliže byl v bakterii přítomen plazmid obsahující gen na rezistenci vůči kyanamycinu.

Příklad 14: Produkce L-lyzinu

Každý z transformantů získaných v příkladů 13 byl kultivován v produkčním médiu pro L-lyzin pro zhodnocení schopností produkovat L-lyzin. Složení produkčního média pro L-lyzin bylo následující:

Produkční médium pro L-lyzin

Složky podle následujícího seznamu kromě uhličitanu vápenatého byly rozpuštěny a pH bylo hydroxidem draselným upraveno na 8,0 (všechny údaje se vztahují na 1 1). Médium bylo sterilizováno 15 min při 115 °C a potom byl přidán uhličitan vápenatý (50 g), který byl odděleně sterilizován v suchém stavu horkým vzduchem.

-18CZ 293268 B6

Glukóza	100 g
(NH4)2SO4)	55 g
kh2po4	ig
MgSO4.7H2O	1 g
Biotin	500 pg
Thiamin	2000 pg
FeSO4.7H2O	0,01 g
MnSO4.7H2O	0,01 g
Nikotinamid	5 mg
Proteinový hydrolyzát (Mámenou)	30 ml
Uhličitan vápenatý	50 mg

Každý z různých typů transformantů a rodičovský kmen byl zaočkován do média s výše uvedeným složením a na třepačce byla provedena kultivace při 31,5 °C. Množství vyprodukovaného lyzinu po 40 nebo 72 hodinách kultivace a růst po 72 hodinách (OD₅₆₂) jsou uvedeny v tabulce 1. V tabulce lysC* představuje mutantní lysC. Růst byl kvantitativně určován měřením OD při 560 nm po 101 násobném zředění.

Tabulka 1

Akumulace L-lyzinu po kultivaci 40 nebo 72 hod

Bakteriální kmen/plazmid	Zavedený kmen	Vytvořený Llyzin (g/1) po 40 hod po 72 hod	Růst (OD562/101)
AJ11082		22,0	29,8	0,450
AJ11082/p399AK9B	lysC*	16,8	34,5	0,398
AJ11082/pDPSB	dapA	18,7	33,8	0,410
AJ11082/pDPRB	dapB	19,9	29,9	0,445
AJ11082/pLYSAB	lysA	19,8	32,5	0,356
AJ11082/pPK4D	ddh	19,0	33,4	0,330
AJ11082/pCRCAB	lysC*, dapA	19,7	36,5	0,360
AJ11082/pAB	dapA, dapB	19,0	34,8	0,390
AJ11082/pCB	lysC*, dapB	23,3	35,0	0,440
AJ11082/pDL	ddh. lysA	23,3	31,6	0,440
AJ11082/pCAB	lysC*. dapA. dapB	23,0	45,0	0,425
AJ11082/pCABL	lvsC*. dapA, dapB. lysA	26,2	46,5	0,379
AJ11082/pCABDL	lysC*. dapA,	26,5	47,0	0,409

dapB, lysA, ddh

Jak je uvedeno v tabulce 1, pokud se samostatně zesílí mutantní lysC, dapA, nebo dapB, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo větší nebo rovno množství vyprodukovanému rodičovským genem po 72 hodinách kultivace, avšak množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo menší, než bylo vytvořeno rodičovským kmenem po 40 hod kultivace. Při krátkodobé kultivaci byla totiž rychlost produkce L-lyzinu snížena. Podobně, když byly společně zesíleny mutantní lysC a dapA nebo dapA a dapB, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo po 72 hod kultivace větší než u rodičovského kmene, avšak po 40 hodinách kultivace bylo množství vytvořeného Llyzinu menší než u rodičovského kmene. Rychlost produkce L-lyzinu byla tedy snížena.

-19CZ 293268 B6

Na druhé straně, pokud byly lysA nebo ddh zesíleny samostatně, nebo při kombinaci zesílení lysA a ddh, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo po 40 hod kultivace větší než množství vytvořené rodičovským kmenem, avšak množství vytvořeného lyzinu bylo menší než množství vyprodukované rodičovským genem v případě dlouhodobé kultivace, protože došlo ke snížení růstu.

Naopak v případě, když byl dapB zesílen spolu smutantním lysC, došlo ke zlepšení růstu, rychlost produkce L-lyzinu byla při krátkodobé kultivaci úspěšně zachována a množství nahromaděného L-lyzinu bylo rovněž zvýšeno v případě dlouhodobé kultivace. V případě kmenu, u kterého byly současně zesíleny geny mutantní lysC, dapA a dapB. došlo k dalšímu zlepšení produkce. Jak rychlost produkce L-lyzinu, tak i množství nahromaděného L-lyzinu se postupně zvyšovalo postupným zesilováním lysA a ddh·

Průmyslová využitelnost

Podle předkládaného vynálezu je možno zvýšit produkční schopnost L-lyzinu koryneformní bakterie a její růstovou rychlost.

Rychlost produkce L-lyzinu a produktivita může být u koryneformní bakterie produkující L-lyzin rovněž zvýšena zesílením dapB spolu s mutantním lysC. Rychlost produkce L-lyzinu a produktivita může být dále zvýšena postupným zvýšením dapA, lysA a ddh navíc k uvedeným genům.

VÝPIS SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: Ajinomoto Co., Inc.

(ii) Název vynálezu: Způsob výroby L-lysinu (iii) Počet Sekvencí: 24 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Jméno:

(B) Ulice:

(C) Město:

(E) Země:

(F) PSČ:

(v) Počítačová forma:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, verze #1.30 (vi) Údaje o předkládané přihlášce (A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Zařazení do třídění:

-20CZ 293268 B6 (vii) Údaje o předchozí přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: JP 7-140614 (B) Datum podání: 7. července 1995 (viii) Informace o zástupci:

(A) Jméno:

(B) Registrační číslo:

(ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon (B) Telefax:

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:1:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná .. syntetická DNA (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

ACGGAATTCA ATCTTACGGC C

-21 CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1643 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý' (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:3:

TCGCGAAGTA TGTTTATTGG GCAGAAAGAA GTAACTGTCA GGCGGTTCCT ACCAAGAAGG GAACTTCTAG CTCCTGACTG GGCGCAGAAG GGAAACGCAC AAGATCTGCA TTGGGTCGTG GTGTGTGAGA AATGCACAGA TCCAAGATTT GTACGCTCGT CCTGTQGAAG GTTCTGGCTA

GCAGAAATCA ACATTGACAT GACATCACGT CTTCAGGTTC CTCGTGGCTG CGCGATGTCA ATCCGTGAAG GGCGAAGACG TTACAATGAC CCCTTTTGGA OCGCAQGCCG

CTTTTGTCTC AGTGGCTGAG TGGCTAGGTA CGAAAGGTGC TGCGGAACGC

GCACCTGTCA AACGCATCCC AACACTCCTC GCACGTAGAT CGCTTGAGAG

CTGG&AATGA TGTCCTGGTT AACTTGCAGC CTGGTGAGCG CTCAATCITT GCMTGTTGA TTGTTGCTGG GTGGTTCTGA TTTACTCGGA AGCTGGAAAA TCGTGCTGCG CTTATAGTAA AAGCAGTCCT TTTCOGATAA

TCACCTGCCC AGGGCAACTG CTGGCATCAA ACGTGAACAT ATGATCTGGA AAGCCGTCGT CACCATCGCA AGAGCGCAAT TAAGATTGAA

GGCAGTGAAT TATTTCrAAC CACTGGCTCT CGICACACCG •miOGQST CAOCACTGCA CGTTGACGGT GCTQGCTTC CACTGTTGAA TGATCOOGGC TACCGGTGTC GCCAGGCGAG GGTTCTGCAG TCGOGCTGAC GACCAATGTG gictcacoca CGAATTGATT TGCTGCTGCA TTATGCAGGC

GTTGTTGCTG caaccggcca TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTC

AAATATTAAA

ACGCATCCGC GACACACTTT ACAAAGGTGG ATTAGAAACG GTCTGCTCCG COCCTTCCGC

CAGGCTGCTG GGrOGTGTGC GTTAATAAAG GITGOOTTOG GTGTATACCG GAAGAAATGC TACGCTCGTG ACTTTGATTG GCAACCGACA GCTGOCAAGG AACGTCTOCT GGACGCCGTG CITTACGACG GGTGTTACCG TCCAOCTCTG CGTGCATTGC ACCGGACGCT

TCGAATATCA TAAAGCCCCA ATAAAGGTAG CCCTCGTCCT TCGCTGAACG CAATGGGAGA CAGCTCCTGA CCATGGCTAT TGCTCACCAC CTGAAGCACT AAACCCGCGA CAGCTGCTTT CTGACOOGCG TGGAACTTGC CATTCAATGT COGGCTCTAT AGTOOGAAGC TTTICOGrGC CTGTGGAAGA CGATGGAGAT ACCAGGTOGG CAGAGTTCAT AGATCCGCAT ATGAGCAGTT AAAGTTTTAA GGTOGGCCAG TTTCTTTGCT

ATATACGGTC GGAACCCTGT ACTTGAGCGG ACAGAAATAT GATOGCTGCC CACCACGGAT AATGGATATG TCACTCCCTT CGAGCGCCAC CGATGAGGGC TGTCACCACG GAAOGCTGAT CATCGTTCCT TGCTOTTGGC GCCACTTCGC GGAGGATATT CAAAGTAACC GITCQCTGAT CGGCACCACC CTTGAAGAAG CAAACTCTCC GGAAGCTCTG TrOCGTGCTG CCAGCTGGGC AGGAGTAGTT GTTATGCGCA TCOCCGCGTT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620

1643

-22CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1643 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 217..1482

-23CZ 293268 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

TCGCGAACTA GCACCTGTCA CHTICTCTC ΑΑΑΤΑΤΓΑΑΑ TOGAATATCA ATATACGGTC60 tgtttattgg aacgcatocc agtggctgag acgcatccgc TAAAGOCCCA GGAACCCTCT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGCTA GACACACTTT ATAAAGGTAG ACTTGAGOGG18G

GTAACTGTCA GCAOCTAGAT OGAAAGCTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG234

Met Ala Leu Val Val Gin

5

AAA

TAT

GGC

GCT

TCC

TCG CTT GAG

ACT

GCG

GAA CGC ATT

AGA AAC

GTC

282

Lys

Tyr Gly Gly

Ser

Ser Leu Glu

Ser Ala

Glu Arg Ile

Arg Asn

Val

10

15

20

GCT

GAA

CGG

ATC

GTT

GCC ACC AAG

AAG

GCT

GGA AAT GAT

GTC

CTG

CTT

330

Ala

Glu

Arg

Ile

Val

Ala Thr Lys

Lys

Ala

Gly Asn Asp

Val

Val

Val

25

30

35

CTC

TGC

TCC

GCA

ATG

GGA GAC ACC

ACG

GAT

GAA CTT CTA

GAA

CTT

GCA

37 š

Val

cys

Ser

Ala

Met

Gly Asp Thr

Thr

Asp

Glu Leu Leu

Glu

Leu

Ala

40

45

50

GOG

GCA

CTG

AAT

CCC

CTT CCG CCA

GCT

CCT

GAA ATG GAT

ATG

CTC

CTG

42tí

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Val Pro Pro

Ala

Arg

Glu Met Asp

Met

Leu

Leu

55

60

65

70

ACT

GCT

GCT

GAG

CCT

ATT TCT AAC

GCT

CTC

GTC GCC ATG

GCT

ATT

GAG

474

Thr

Ala

Gly

Glu

Arg

Ile Ser Asn

Ala

Leu

Val Ala Met

Ala

Ile

Glu

75

80

85

TCC

CTT

GGC

GCA

GAA

GCT CAA TCT

TTC

ACT

GGC TCT CAG

GCT

GCT

CTG

522

Ser

Leu

Gly

Ala

Glu

Ala Gin Ser

Phe

Thr

Gly Ser Gin

Ala

Gly

Val

90

95

100

CTC

ACC

ACC

GAG

CGC

CAC GGA AAC

GCA

CGC

ATT CTT GAC

GTC

ACA

CCG

570

Leu

Thr

Thr

Glu

Arg

His Gly Asn

Ala

Arg

Ile Val Asp

Val

Thr

Pro

105

110

115

GGT

CCT

GTG

CCT

GAA

GCA CTC GAT

GAG

GGC

AAG ATC TGC

ATT

GTT

GCT

513

Gly Arg

Val

Arg

G1U

Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys

Ile

Val

Ala

120

125

130

GCT

ΤΓΓ

CAG

GCT

CTT

AAT AAA GAA

ACC

CGC

GAT GTC ACC

ACG

TTG

GCT

566

Gly

Phe

Gin

Gly

Val

Asn Lys Glu

Thr

Arg

Asp Val Thr

Thr

Leu

Gly

135

140

145

150

CCT

GCT

GCT

TCT

GAC

ACC ACT GCA

GTT

GCG

TTG GCA GCT

GCT

TTG

AAC

714

Arg Gly Gly

Ser

Asp

Thr Thr Ala

Val

Ala

Leu Ala Ala

Ala

Leu

Asn

155

160

165

-24CZ 293268 B6

GCT	GAT	GTG	TCT	GAG	ATT	TAC TCG GAC GTT	GAC GCT	GTG	TAT ACC	GCT	762
Ala	Asp	Val	Cys	G1U	Ile	Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val	Tyr Thr	Ala
			170			175			180
GAC	CCG	CGC	ATC	GTT	CCT	AAT GCA CAG AAG	CTG GAA	AAG	CTC AGC	TTC	810
Asp	Pro	Arg	Ile	Val	Pro	Asn Ala Gin Lys	Leu Glu	Lys	Leu Ser	Phe
		185				190		195
GAA	GAA	ATG	CTG	GAA	CTT	GCT GCT GTT GGC	TCC AAG	ATT	TTG GTG	CTG	353
Glu	Glu	Mat	Leu	Glu	Leu	Ala Ala Val Gly	Ser Lys	Ile	Leu Val	Leu
	200					205	210
CGC	AGT	GTT	GAA	TAC	GCT	CCT GCA TTC AAT	GTG CCA	CTT	CGC OTA	CGC	'3ÚÓ
Arg	Ser	Val	Glu	Tyr	Ala	Arg Ala Phe Asn	Val Pro	Leu	Arg Val	Arg
215					220		225			230
TCG	TCT	TAT	ACT	AAT	GAT	CCC GGC ACT TTG	ATT GCC	GGC	TCT ATG	GAG	954
Ser	Ser	Tyr	Ser	Asn.	Asp	Pro Gly Thr Leu	Ile Ala	Gly	Ser Met	Glu
				235		240		245
GAT	ATT	CCT	GTG	GAA	GAA	GCA GTC CIT ACC	GGT GTC	GCA	ACC GAC	AAG	1002
Asp	Ile	Pro	Val	Glu	Glu	Ala Val Leu Thr	Gly Val	Ala	Thr Asp	Lys
			250			255			260
TCC	GAA	GCC	AAA	GTA	ACC	GIT CTG GGT ATT	TCC GAT	AAG	CCA GGC	GAG	1050
Ser	Glu	Ala	Lys	Val	Thr	Val Leu Gly Ile	Ser Asp	Lys	Pro Gly	Glu
		265				270		275
GCT	GCC	AAG	GIT	TTC	CCT	GCG TTG GCT GAT	GCA GAA	ATC	AAC ATT	GAC	1098
Ala	Ala	Lys	val	Phe	Arg	Ala Leu Ala Asp	Ala Glu	Ile	Asn Ile	Asp
	280					285	290
ATG	GIT	CTG	CAG	AAC	CTC	TCC TCT GTG GAA	GAC GGC	ACC	ACC GAC	ATC	11Í.-6
Met	Val	Leu	Gin	Asn	Val	Ser Ser Val Glu	Asp Gly	Thr	Thr Asp	Ile
295					300	305			310
ACG	TTC	ACC	TGC	CCT	CGC	GCT GAC GGA CGC	CCT GCG	ATG	GAG ATC	TTG	1194
Thr	Phe	Thr	Cys	Pro	Arg	Ala Asp Gly Arg	Arg Ala	Met	Glu Ile	Leu
				315	320		325
AAG	AAG	CTT	CAG	GIT	CAG	GGC AAC TGG ACC	AAT CTG	CTT	TAC GAC	GAC	1242
Lys	Lys	Leu	Gin	Val	Gin	Gly Asn Trp Thr	Asn Val	Leu	Tyr Asp	Asp
			330		335			340
CAG	GTC	GGC	AAA	CTC	TCC	CTC CTG GCT GCT	GGC ATG	AAG	TCT CAC	CCA	1290
Gin	Val	Gly	Lys	Val	Ser	Leu Val Gly Ala	Gly Met	Lys	Ser His	Pro
		345				350		355
GGT	GTT	ACC	GCA	GAG	TTC	ATG GAA GCT CTG	CGC GAT	CTC	AAC GTG	AAC	1338
Gly	Val	Thr	Ala	Glu	Phe	Met Glu Ala Leu	Arg Asp	Val	Asn Val	Asn
	360					365	370

-25CZ 293268 B6

ATC

GAA

TTG

ATT

TCC

ACC

TCT

GAG

ATC

CGC

ATT TCC

GTG

CTG

ATC

CGT

Ile

Glu

Leu

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

Ile Ser

Val

Leu

Ile

Arg

375

380

385

390

GAA

GAT

GAT

CTG

GAT

GCT

GCT

GCA

CGT

GCA

TTG CAT

GAG

CAG

TTC

CAG

Glu

Asp

Asp

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu His

Glu

Gin

Phe

Gin

395

400

405

CTG

GGC

GGC

GAA

GAC

GAA

GCC

GTC

GTT

TAT

GCA GGC

ACC

GGA

CGC

TAA

Leu

Gly Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

Ala Gly

Thr

Gly Arg

410

415

420

AGTTITAAAG GAGTAGTTIT ACAATGACCA CCATCGCACT TGTTGCTGCA ACCGGCCAGG TCGGCCAGGT TATGOGCAOC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGMTGAATT C

1386

1434

1482

1542

1602

1643 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 421 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-26CZ 293268 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDN0:5:

Met Ala 1	Leu	Val Val Gin Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
5	10	15
Glu	Arg	Ile	Azg	Asn	Val	Ala Glu Arg Ile Val	Ala Thr	Lys Lys	Ala
			20			25			30
Gly	Asn	Asp	Val	Val	Val	Val Cys Ser	Ala Met	Gly Asp	Thr Thr	Asp
		35				40		45
Glu	Leu	Leu	Glu	Leu	Ala	Ala Ala Val	Asn Pro	Val Pro	Pro Ala	Arg
	50					55		60
Glu	Met	Asp	Met	Leu	Leu	Thr Ala Gly	Glu Arg	Ile Ser	Asn Ala	Leu
65					70		75		80
Val	Ala	Met	Ala	Ile	Glu	Ser Leu Gly	Ala Glu	Ala Gin	Ser Phe	Thr
				85			90		95
Gly	Ser	Gin	Ala	Gly	Val	Leu Thr Thr	Glu Arg	His Gly	Asn Ala	Arg
			100			105		110
Ile	Val	Asp	Val	Thr	Pro	Gly Arg Val Arg Glu	Ala Leu	Asp Glu	Gly
		115				120		125
Lys	Ile	Cys	Ile	Val	Ala	Gly Phe Gin Gly Val	Asn Lys	Glu Thr	Arg
	130					135		140
Asp	Val	Thr	Thr	Leu	Gly Arg Gly Gly Ser Asp	Thr Thr	Ala Val	Ala
145					150	155		160
Leu	Ala	Ala	Ala	Leu	Asn Ala Asp Val Cys Glu	Ile Tyr Ser Asp	Val
				165		170		175
Asp	Gly	Val	Tyr	Thr	Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gin Lys
			180		185		190

-27CZ 293268 B6

Leu Glu Lys Leu	Ser Phe	Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
	195	200	205
Ser	Lys Ile Leu	Val Leu	Arg Ser Val Glu Tyr Ala	Arg Ala Phe Asn
	210		215 220
Val	Pro Leu Arg	Val Arg	Ser Ser Tyr Ser Asn Asp	Pro Gly Thr Leu
225		230	235	240
Ile	Ala Gly Ser	Met Glu	Asp Ile Pro Val Glu Glu	Ala Val Leu Thr
		245	250	255
Gly	Val Ala Thr	Asp Lys	Ser Glu Ala Lys Val Thr	Val Leu Gly Ile
	260		265	270
Ser	Asp Lys Pro	•Gly Glu	Ala Ala Lys Val Phe Arg	Ala Leu Ala Asp
	275		280	285
Ala	Glu Ile Asn	Ile Asp	Met Val Leu Gin Asn Val	Ser Ser Val Glu
	290		295 300
Asp	Gly Thr Thr	Asp Ile	Thr Phe Thr Cys Pro Arg	Ala ASp Gly Arg
305		310	315	320
Arg	Ala Met Glu	Ile Leu	Lys Lys Leu Gin Val Gin	Gly Asn Trp Thr
		325	330	335
Asn	Val Leu Tyr Asp Asp	Gin Val Gly Lys Val Ser	Leu Val Gly Ala
	340		345	350
Gly	Met Lys Ser	His Pro	Gly Val Thr Ala Glu Phe	Met Glu Ala Leu
	355		360	365
Arg	Asp Val Asn	Val Asn	Ile Glu Leu Ile Ser Thr	Ser Glu Ile Arg
	370		375 380
Ile	Ser Val Leu	Ile Axg	Glu Asp Asp Leu Asp Ala	Ala Ala Arg Ala
385		390	i 395	400
Leu	His Glu Gin	Phe Gin	Leu Gly Gly Glu Asp Glu	Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1643 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

-28CZ 293268 B6 (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 964..1482 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:6:

TCGCGAAGTA GCACCTCTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60

TGTITAITGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAAOtXTGT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG ACTTGAGCGG180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240

GGCGGITCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAAOG GATCGTTGCC300

ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCCTGGTT GTCTCCTCOG CAATGGGAGA CACCACGGAT360

GAACTTCTAG AACITGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420

CTCCTGACTG CTCCTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCCTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480

GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCAOCAC CGAGCGCCAC540

GGAAACGCAC GCATTGTTCA CGTCACACCG GGTCGTGTGC CTGAAGCACT CGATGAGGGC600

AAGATCTGCA ITGTTGCTGG TT1TCAGGGT GITAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660

TTGGGTCGTC GTGGTTCTGA CACCACTGCA CTTGCGTTCG CAGCTGCTTT GAAOGCTGAT720

CTGTGTGAGA TITACTCGGA CGTTGACGGT CTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780

AATGCACAGA AGCTQGAAAA GCTCAGCITC GAAGAAATGC TGGAACTTCC TGCTOITGGC840

TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CACTCTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GOCACTTCGC900

CTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG COGGCTCTAT GGAGGATATT960

CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA1008

Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu

5 1015

GCC AAA GTA ACC GIT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC1056

Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu AlaAla

2530

AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT1104

Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp MetVal

4045

CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC1152

Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe

5560

ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CCT GCG ATC GAG ATC TTG AAG AAG1200

Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys

7075

CTT CAG GIT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC1248

Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val

85 9095

GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GIT1296

Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro GlyVal

100 105110

ACC GCA GAG TTC ATC GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTC AAC ATC GAA1344

Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu

-29CZ 293268 B6

115

TTG ATT TCC ACC TCT

Leu Ile Sec Thr Ser

130

GAT CTG GAT GCT GCT

Asp Leu Asp Ala Ala 145

GGC GAA GAC GAA GCC Gly Glu Asp Glu Ala 160

120 GAG ATC CGC ATT TCC Glu Ile Arg Ile Ser 135

GCA CGT GCA TTG CAT Ala Arg Ala Leu His

150

GTC GTT TAT GCA GGC Val Val Tyr Ala Gly

165

125

GTG CTG ATC CGT GAA GAT

Val Leu Ile Arg Glu Asp 140

GAG CAG TTC CAG CTG GGC

Glu Gin Phe Gin Leu Gly 155

ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA

Thr Gly Arg

170

139 2

1440

1490

AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGOCA GCTOGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCHTTGGA AGAGCGCAAT TTOOCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610

TCCOCGCGIT COGCAGGCOG TAAGATTCAA TTC

1643 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 172 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Met	Glu	Glu	Ala	Val	Leu	Thr Gly Val	Ala Thr	Asp Lys	Ser Glu	Ala
1				5			10		15
Lys	Val	Thr	Val	Leu	Gly	Ile Ser Asp	Lys	Pro	Gly Glu	Ala Ala	Lys
			20			25				30
Val	Phe	Arg	Ala	Leu	Ala	Asp Ala Glu	Ile	Asn	Ile Asp	Met Val	Leu
		35				40			45
Glu	Asn	Val	Ser	Ser	Val	Glu Asp Gly	Thr	Thr	Asp Ile	Thr Phe	Thr
	50					55			60
Cys	Pro	Arg	Ala	Asp Gly Arg Arg Ala	Met	Glu	Ile Leu	Lys Lys	Leu
65					70			75		80
Gin	Val	Gin	Gly	Asn	Trp Thr Asn Val	Leu	Tyr Asp Asp	Gin Val	Gly
				85			90		95
Lys	Val	Ser	Leu Val	Gly Ala Gly Met Lys	Ser	His Pro	Gly Val Thr
			100			105			110
Ala	Glu	Phe	ř-fet Glu	Ala	Leu Arg Asp	Val	Asn	Val Asn	Ile Glu	Leu
		115				120			125
Ile	Ser	Thr	Ser	Glu	Ile	Arg Ile Ser	Val	Leu	Ile Arg Glu Asp Asp
	130					135			140
Leu	Asp	Ala	Ala Ala	Arg	Ala Leu His	Glu	Gin	Phe Gin Leu Gly Gly
145					150		155		160
Glu	Asp	Glu	Ala Val	Val	Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
				165		170

-30CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:9:

CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2001 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869

-31 CZ 293268 B6 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 730..1473 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:10:

GGATCOOCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT50

GACGITGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG120

ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC180

TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC240

AACTTGAGCC TGCTGCITCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AAOGGCGGCA AAGCAGTGGG300

GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGOG ACGGGGCAGC360

ATCTGAAQGC GTGCGAGITG TGGTGftOCGG GTTAGCGGIT TCAGITTCTG TCACAACTGG420

AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGITGA GCOGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA480

AGAGGCGGAA AOCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT540

AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT600

GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT660

TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCITCGCCCC ACGAAAATGA720

AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GIT GGC GIT CTC GGA GCC AAA GGC CGT768

Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg 1510

GTT GGT CAA ACT ATT GIG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG816

Val Gly Gin Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp LeuGlu

2025

CTT GIT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC864

Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu ValAsp

35 4045

-32CZ 293268 B6

AAC	GGC	GCT	GAA CTT	GTC GTT	GAC	TTC ACC	ACT CCT	AAC	GCT	CTG ATG	912
Asn	Gly	Ala	G1U Val	Val Val	Asp	Phe Thr	Thr Pro	Asn	Ala	Val Met
			50			55				60
GGC	AAC	CTG	GAG TTC	TGC ATC	AAC	AAC GGC	ATT TCT	GCG	GTT	CTT GGA	960
Gly	Asn	Leu	Glu Phe	Cys Ile	Asn	Asn Gly	Ile Ser	Ala	Val	Val Gly
			65			70			75
ACC	ňCG	GGC	TTC GAT	GAT GCT	CCT	TTG GAG	CAG GTT	CGC	GCC	TGG CTT	1008
Thr	Thr	Gly	Phe Asp	Asp Ala	Arg	Leu Glu	Gin Val	Arg	Ala	Trp Leu
		80			85			90
GAA	GGA	AAA	GAC AAT	CTC GCT	GTT	CTG ATC	GCA CCT	AAC	TTT	GCT ATC	1056
Glu	Gly	Lys	Asp Asn	Val Gly Val	Leu Ile	Ala Pro	Asn	Phe	Ala Ile
	95			100			105
TCT	GCG	GTG	TTG ACC	ATG GTC	TTT	TCC AAG	CAG GCT	GOC	CGC	TTC TTC	1104
Ser	Ala	Val	Leu Thr	Met Val	Phe	Ser Lys	Gin Ala	Ala	Arg	Phe Phe
110				115			120			125
GAA	TCA	GCT	GAA GTT	ATT GAG	CTG	CAC CAC	CCC AAC	AAG CTG	GAT GCA	1152
Glu	Ser	Ala	Glu Val	Ile Glu	Leu	His His	Pro Asn.	Lys	Leu	Asp Ala
			130			135			140
CCT	TCA	GGC	ACC GCG	ATC CAC	ACT	GCT CAG	GGC ATT	GCT	GCG	GCA CGC	1200
Pro	Ser	Gly	Thr Ala	Ile His	Thr	Ala Gin	Gly Ile	Ala	Ala	Ala Arg
			145			150			1SS
AAA	GAA	GCA	GGC ATG	GAC GCA	CAG	CCA GAT	GOG ACC	GAG	CAG	GCA CTT	1248
Lys	Glu	Ala	Gly Met	Asp Ala	Gin	Pro Asp	Ala Thr	Glu	Gin	Ala Leu
		160			165		170
GAG	GGT	TOC	CCT GGC	GCA AGC	CTA	GAT GGA	ATC CCA	GTT	CAC	GCA CTC	1296
Glu	Gly	Ser	Arg Gly	Ala Ser	Val	Asp Gly	Ile Pro	val	His	Ala Val
	175			180		185
CGC	ATG	TCC	GGC ATG	CTT GCT	CAC	GAG CAA	CTT ATC	TTT	GGC	ACC CAG	1344
Arg	Met	Ser	Gly Met	Val Ala	His	Glu Gin	Val Ile	Phe	Gly	Thr Gin
190				195			200			205
GGT	CAG	ACC	TTG ACC	ATC AAG	CAG	GAC TCC TAT GAT	CGC	AAC	TCA TTT	1392
Gly	Gin	Thr	Leu Thr	Ile Lys	Gin	Asp Ser Tyr Asp Arg	Asn	Ser Phe
			210		215			220
GCA	CCA	GCT	GTC TTG	CTG GCT	GTG	CGC AAC	ATT GCA CAG	CAC	CCA GGC	1440
Ala	Pro	Gly	Val Leu	Val Gly Val	Arg Asn	Ile Ala Gin His	Pro Gly
			225			230			235
CTA	GTC	CTA	GGA CTT	GAG CAT TAC	CTA GGC	CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC	1493
Leu	Val	Val	Gly Leu	Glu His Tyr Leu Gly	Leu
		240			245

GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGAGTTGATA GCCTGCAGTT CITITACTCC TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GACCCATGAA TTGCTCCGAC ACCGCCATTT GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC TGAACTTITC ATGCACGCCA TGGATGAGTC GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG

GGCTGTGGCC GAACAACTTA AATTGAGCGT1553

ACOCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT1613

GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA1673

GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA1733

GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGCTCCGC1793

TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCCTTTCCT1853

CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG1913

TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC1973

2001

-33CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 248 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Met

Gly

Ile

Lys

Val

Gly

Val

Leu

Gly

Ala

Lys

Gly

Arg

Val

Gly

Gin

1

5

10

1!

Thr

Ile

Val

Ala

Ala

Val

Asn

Glu

Ser

Asp

Asp

Leu

Glu

Leu

Val

Ala

20

25

30

Glu

Ile

Gly

Val

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Val

Asp

Asn

Gly

Ala

35

40

45

Glu

Val

Val

Val

Asp

Phe

Thr

Thr

Pro

Asn

Ala

Val

Met

Gly

Asn

Leu

50

55

60

Glu

Phe

Cys

Ile

Asn

Asn

Gly

Ile

Ser

Ala

Val

Val

Gly

Thr

Thr

Gly

65

70

75

81

Phe

Asp

Asp

Ala

Arg

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Ala

Trp

Leu

Glu

Gly

Lys

85

90

9

5

Asp

Asn

Val

Gly

Val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

Ile

Ser

Ala

Val

100

105

11<

3

Leu

Thr

Met

Val

Phe

Ser

Lys

Gin

Ala

Ala

Arg

Phe

Phe

Glu

Ser

Ala

115

120

12!

5

Glu

Val

Ile

Glu

Leu

His

His

Pro

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

Pro

Ser

Gly

130

135

140

Thr

Ala

Ile

His

Thr

Ala

Gin

Gly

Ile

Ala

Ala

Ala

Arg

Lys

Glu

Ala

145

150

155

16

Gly

Met

Asp

Ala

Gin

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

Gin

Ala

Leu

Glu

Gly

Ser

165

170

17

5

Arg

Gly

Ala

Ser

Val

Asp

Gly

Ile

Pro

Val

His

Ala

Val

Arg

Met

Ser

180

185

19

0

Gly

Met

Val

Ala

His

Glu

Gin

Val

Ile

Phe

Gly

Thr

Gin

Gly

Gin

Thr

195

200

205

Leu

Thr

Ile

Lys

Gin

Asp

Ser

Tyr

Asp

Arg

Asn

Ser

Phe

Ala

Pro

Gly

210

215

220

Val

Leu

Val

Gly

Val

Arg

Asn

Ile

Ala

Gin

His

Pro

Gly

Leu

Val

Val

225 230 235 240

Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

245

-34CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1411 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869

-35CZ 293268 B6 (ix) VLASTNOSTI:

(A)NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 311..1213 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTnTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60 TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGOC CCTATGTCAT GGACTTITAA CGCAAAGCTC 120 ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC 180 GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTCTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT 240 GCAAAAGTTG TTAGCTTT1T TGCGGGCTTG TITAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC 300 CTTGAACTCT ATG AGC ACA GCT ΊΤΑ ACA GCT AAG ACC GGA CTA GAG CAC 343

Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His 15 10

TTC

GGC

ACC

GIT

GGA

OTA

GCA ATG

GTT

ACT

CCA

TTC ACG

GAA

TCC

GGA

397

Phe

Gly

Thr

Val

Gly

Val

Ala Met

Val

Thr

Pro

Phe Thr

Glu

Ser

Gly

15

20

25

GAC

ATC

GAT

ATC

GCT

GCT

GGC CGC

GAA

GTC

GCG

GCT

TAT

TTG

GTT

GAT

Asp

Ile

Asp

Ile

Ala

Ala

Gly Arg

Glu

Val

Ala

Ala

Tyr

Leu

Val

Asp

30

35

40

45

AAG

GGC

TTG

GAT

TCT

TTG

GTT

CTC

GCG

GGC

ACC

ACT

GCT

GAA

TCC

CCA

493

Lys

Gly

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Pro

50

55

60

ACG

ACA

ACC

GCC

GCT

GAA

AAA

CTA

GAA

CTG

CTC

AAG

GCC

GIT

CCT

GAG

541

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Glu

Lys

Leu

Glu

Leu

Leu

Lys

Ala

Val

Arg

Glu

65

70

75

GAA

GTT

GGG

GAT

CGG

GCG

AAC

GTC

ATC

GCC

GCT

GTC

GGA

ACC

AAC

AAC

589

Glu

Val

Gly

Asp

Arg

Ala

Asn

Val

Ile

Ala

Gly

Val

Gly

Thr

Asn

Asn

80

85

90

ACG

CGG

ACA

TCT

GTG

GAA CIT

GCG

GAA

GCT

GCT

GCT

TCT GCT

GGC

GCA

637

Thr

Arg

Thr

Ser

Val

Glu

Leu

Ala

Glu Ala Ala

Ala

Ser Ala

Gly

Ala

95

100

105

-36CZ 293268 B6

GAC

GGC

CIT

ΊΤΑ GTT

OTA

ACT

CCT TAT

TAC TCC AAG

CCG AGC

CAA

GAG

685

Asp

Gly

Leu

Leu Val

Val

Thr

Pro Tyr Tyr Ser Lys

Pro Ser Gin

Glu

110

115

120

125

GGA

TTG

CTG

GCG CAC

TTC

GOT

GCA ATT

GCT GCA

GCA

ACA GAG

GTT

CCA

733

Gly

Leu

Leu

Ala His

Phe

Gly

Ala Ile

Ala Ala

Ala

Thr Glu

Val

Pro

130

135

140

ATT

TGT

CTC

TAT GAC

ATT

CCT

GOT CGG

TCA GCT

ATT

CCA ATT

GAG

TCT

781

Ile

Cys

Leu

Tyr _Asp

Ile

Pro

Gly Arg

Ser Gly

Ile

Pro Ile

Glu

Ser

145

150

155

GAT

ACC

ATG

AGA CGC

CTG

ACT

GAA TTA

CCT ACG

ATT

TTG GCG

GTC

AAG

829

Asp

Thr

Met

Arg Arg

Leu

Ser

Glu Leu

Pro Thr

Ile

Leu Ala

Val

Lys

160

165

170

GAC

GCC

AAG

GGT GAC

CTC

GTT

GCA GCC

ACG TCA

TTG

ATC AAA

GAA

ACG

877

Asp

Ala

Lys

Gly Asp

Leu

Val

Ala Ala

Thr Ser

Leu

Ile Lys

Glu

Thr

175

180

185

GGA

CTT

GCC

TGG TAT

TCA

GGC GAT GAC

CCA CTA AAC

CTT CTT

TGG

cit

925

Gly

Leu

Ala

Trp Tyr

Ser

Gly Asp Asp

Pro Leu Asn

Leu Val

Trp

Leu

190

195

200

205

GCT

TTG

GGC

GGA TCA

GCT

TTC

ATT TCC

CTA ATT

GGA

CAT GCA

GCC

CCC

973

Ala

Leu

Gly

Gly Ser

Gly

Phe

Ile Ser

Val Ile

Gly

His Ala

Ala

Pro

210

215

220

ACA

GCA

TTA

OGT GAG

TTG

TAC

ACA AGC

TTC GAG

GAA

GGC GAC

CTC

GTC

1021

Thr

Ala

Leu

Arg Glu

Leu

Tyr

Thr Ser

Phe Glu

Glu

Gly Asp

Leu

Val

225

230

235

OGT

GCG

CGG

GAA ATC

AAC

GCC

AAA OTA

TCA CCG

CTG

CTA GCT

GCC

CAA

1069

Arg

Ala

Arg

Glu Ile

Asn

Ala

Lys Leu

Ser Pro

Leu

Val Ala

Ala

Gin

240

245

250

GGT

CGC

TTG

GGT GGA

CTC

AGC

TTG GCA

AAA GCT

GCT

CTG CCT

CTG

CAG

1117

Gly Arg

Leu

Gly Gly

Val

Ser

Leu Ala

Lys Ala

Ala

Leu Arg

Leu

Gin

255

260

265

GGC

ATC

AAC

OTA GGA

GAT

CCT

CGA CTT

CCA ATT

ATG

GCT CCA

AAT

GAG

1165

Gly

Ile

Asn

Val Gly Asp

Pro

Arg Leu

Pro Ile

Met

Ala Pro

Asn

Glu

270

275

280

285

CAG

GAA

CIT

GAG GCT CTC

CGA

GAA GAC

ATG AAA

AAA

GCT GGA

GTT

CTA

1213

Gin

Glu

Leu

Glu Ala Leu

Arg

Glu Asp

Met Lys

Lys

Ala Gly

Val

Leu

290 295 300

TAAATATGAA TGATTCCCGA AATOGCGGOC GGAAGCTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA1273

AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TCTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA1333

CCAGAGCGCT CTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC1393

TCAAGGATCC CAACATTC1411 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 301 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-37CZ 293268 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

Met Ser Thr Gly“Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val	Glu His Phe Gly Thr 15
1	5	10
Val Gly Val Ala Met	Val Thr Pro Phe Thr Glu	Ser Gly Asp Ile Asp
20		25	30
Ile Ala Ala Gly Arg	Glu Val Ala Ala Tyr Leu	Val Asp Lys Gly Leu
35		40	45
Asp Ser Leu Val	Leu	Ala Gly Thr Thr Gly Glu	Ser Pro Thr Thr Thr
50		55	60
Ala Ala Glu Lys	Leu	Glu Leu Leu Lys Ala Val	Arg Glu Glu Val Gly
65		70 75	i 80
Asp Arg Ala Asn	Val	Ile Ala Gly Val Gly Thr	Asn Asn Thr Arg Thr
	85	90	95
Ser Val Glu Leu	Ala	Glu Ala Ala Ala Ser Ala	Gly Ala Asp Gly Leu
100		105	110
Leu Val Val Thr	Pro	Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser	Gin Glu Gly Leu Leu
115		120	125
Ala His Phe Gly	Ala	Ile Ala Ala Ala Thr Glu	Val Pro Ile Cys Leu
130		135	140
Tyr Asp Ile Pro	Gly	Arg Ser Gly Ile Pro Ile	Glu Ser Asp Thr Met
145		150 155	i 160
Arg Arg Leu Ser	Glu	Leu Pro Thr Ile Leu Ala	Val Lys Asp Ala Lys
	165	170	175
Gly Asp Leu Val	Ala	Ala Thr Ser Leu Ile Lys	Glu Thr Gly Leu Ala
180		185	190
Trp Tyr Ser Gly Asp	Asp Pro Leu Asn Leu Val	Trp Leu Ala Leu Gly
195		200	205
Gly Ser Gly Phe	Ile	Ser Val Ile Gly His Ala	Ala Pro Thr Ala Leu
210		215	220
Arg Glu Leu Tyr	Thr	Ser Phe Glu Glu Gly Asp	Leu Val Arg Ala Arg
225		230 235 240
Glu Ile Asn Ala	Lys	Leu Ser Pro Leu Val Ala	Ala Gin Gly Arg Leu
	245	250	255
Gly Gly Val Ser	Leu	Ala Lys Ala Ala Leu Arg	Leu Gin Gly Ile Asn
260		265	270
Val Gly Asp Pro	Arg	Leu Pro Ile Met Ala Pro	Asn Glu Gin Glu Leu
275		280	285
Glu Ala Leu Arg	Glu	Asp Met Lys Lys Ala Gly	Val Leu
290		295	300

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

-38CZ 293268 B6 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

CCAAAACCCGC CCTCCACGGC GAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3579 párů bází (Β) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 533..2182

-39CZ 293268 B6 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 2188..3522 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGriTTG GTACATGGCT60

TCTGGCCACT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA120

GTTACOGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT180

GATATCGCCA ACTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC240

GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGITTTCTT GCGCTGCTGC300

AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC360

CCTHTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGITITCT GGGTCAGTTA420

CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGGAGGG ATITGTTATA480

AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTOT ňCCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG535

Met

ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GOG GTA GAG GIT583

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val GluVal

1015

TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT631

Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin ValVal

2530

GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAG GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT679

-40CZ 293268 B6

Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile

35

40

45

GCA

TTG

CAG GTG

GCT

AAA

AAG

GTC

GGT

CAG AAC CCT CGG

GAT

TTG

GCT

727

Ala

Leu

Gin

Val

Ala

Lys

Lys

Val

Gly

Gin Asn Pro Arg

Asp

Leu

Ala

50

55

60

65

ACC

TGG

CTG

GCA

GAG

GCA

TTG

GCT

GCA

GAT GAC GCC ATT

GAT

TCT

GCT

775

Thr

Trp

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Ala

Asp Asp Ala Ile

Asp

Ser

Ala

70

75

80

GAA

ATT

GCT

GGC

CCA

GGC

TTT

TTG

AAC

ATT CGC CTT GCT

GCA

GCA

GCA

823

Glu

Ile

Ala

Gly

Pro

Gly

Phe

Leu

Asn

Ile Arg Leu Ala

Ala

Ala

Ala

85

90

95

CAG

GCT

GAA

ATT

GTG

GCC

AAG

ATT

CTG

GCA CAG GGC GAG

ACT

TTC

GGA

871

Gin

Gly

Glu

ile

Val

Ala

Lys

Ile

Leu

Ala Gin Gly Glu

Thr

Phe

Gly

100

105

110

AAC

TCC

GAT

CAC

CTT

TCC

CAC

TTG

GAC

GIG AAC CTC GAG

TTC

CTT

TCT

919

Asn

Ser

Asp

His

Leu

Ser

His

Leu

Asp

Val Asn Leu Glu

Phe

val

Ser

115

120

125

GCA

AAC

CCA

ACC

GGA

CCT

ATT

CAC

CTT

GGC GGA ACC CGC

TGG

GCT

GCC

967

Ala

Asn

Pro

Thr

Gly

Pro

Ile

His

Leu

Gly Gly Thr Arg

Trp

Ala

Ala

130

135

140

145

CTG

GGT

GAC

TCT

TTG

GGT

OCT

GTG

CTG

GAG GCT TCC GGC

GCG

AAA

CTG

1015

Val

Gly Asp

Ser

Leu

Gly Arg

Val

Leu

Glu Ala Ser Gly

Ala

Lys

Val

150

155

160

ACC

CGC

GAA

TAC

TAC

TTC

AAC

GAT

CAC

GCT CGC CAG ATC

GAT

CCT

TTC

1063

Thr

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

His

Gly Arg Gin Ile

Asp Arg

Phe

165

170

175

GCT

TTG

TOC

CTT

CTT

GCA

GCG

GCG

AAG

GGC GAG CCA ACG

CCA

GAA

GAC

1111

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu

Ala Ala

Ala

Lys

Gly Glu Pro Thr

Pro

Glu

Asp

180

185

190

GCT

TAT

GGC

GGC

GAA

TAC

ATT

AAG

GAA

ATT GCG GAG GCA

ATC

GTC

GAA

1159

Gly Tyr

Gly Gly

Glu

Tyr

Ile

Lys

Glu

Ile Ala Glu Ala

Ile

Val

Glu

195

200

205

AAG

CAT

CCT

GAA

GCG

TTG

GCT

TTG

GAG

CCT GCC GCA ACC

CAG

GAG

CTT

1207

Lys

His

Pro

Glu

Ala

Leu

Ala

Leu

Glu

Pro Ala Ala Thr

Gin

Glu

Leu

210

215

220

225

TTC

CGC

GCT

GAA

GGC

GTG

GAG ATG

ATG

TTC GAG CAC ATC

AAA

TCT

TCC

1255

Phe

Arg

Ala

Glu

Gly

Val

Glu

Met

Met

Phe Glu His Ile

Lys

Ser

Ser

230

235

240

CTG

CAT

GAG

TTC

GGC

ACC

GAT

TTC

GAT

GIC TAC TAC CAC

GAG

AAC

TCC

1303

Leu

His

Glu

Phe

Gly

Thr

Asp

Phe

Asp

Val Tyr Tyr His

Glu

Asn

. Ser

245

250

255

CTG

TTC

GAG

TCC

GCT

GCG

: CTG

GAC

AAG

GCC GTG CAG GTG

; ctg

: AAG

: GAC

1351

Leu

. Phe

Glu

Ser

Gly Ala Val

Asp Lys

; Ala Val Gin Val

. Leu

Lys

; Asp

260

265

270

AAC

: GGC

: AAC

: ctg

ί TAC GAA AAC

: GAG GGC GCT TGG TGG CTG CCT

’ TOC AOC

1399

-41 CZ 293268 B6

Asn	Gly Asn Leu Tyr	Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser	Thr
	275				280		285
GAA	TTC	GGC GAT GAC	AAA GAC	CGC GTG GTG	ATC AAG	TCT GAC GGC	GAC	1447
Glu	Phe	Gly Asp Asp	Lys Asp	Arg Val Val	Ile Lys	Ser Asp Gly Asp
290					295		300		305
GCA	GCC	TAC	ATC	GCT	GGC GAT	ATC GCG TAC	GTG GCT	GAT AAG TTC	TCC	1495
Ala	Ala	Tyr	Ile	Ala	Gly Asp	Ile Ala Tyr	Val Ala	Asp Lys Phe Ser
				310		315	320
CGC	GGA	CAC	AAC	CTA	AAC ATC	TAC ATG TTG	GGT GCT	GAC CAC CAT	GGT	1543
Arg Gly	His	Asn-Leu	Asn Ile	Tyr Met Leu	Gly Ala	Asp His His	Gly
			325			330		335
TAC	ATC	GCG	CGC	CTG	AAG GCA	GCG GCG GCG	GCA CIT	GGC TAC AAG	CCA	1591
Tyr	Ile	Ala	Arg	Leu	Lys Ala	Ala Ala Ala	Ala Leu	Gly Tyr Lys	Pro
		340				345		350
GAA	GGC	GTT	GAA	GTC	CTG ATT	GGC CAG ATG	GTG AAC	CTG CTT OGC	GAC	1639
Glu	Gly	Val	Glu	Val	Leu Ue	Gly Gin Met	Val Asn	Leu Leu Arg	Asp
	355				360		365
GGC	AAG	GCA	GTG	CGT	ATG TCC	AAG CGT GCA	GGC ACC	GTG GTC ACC	CTA	1687
Gly Lys	Ala	Val	Arg	Met Ser	Lys Arg Ala	Gly Thr	Val Val Thr	Leu
370					375		380		385
GAT	GAC	CTC	GIT	GAA	GCA ATC	GGC ATC GAT	GCG GCG	CGT TAC TCC	CTG	1735
Asp Asp	Leu	Val	Glu	Ala Ile	Gly Ile Asp	Ala Ala	Arg Tyr Ser	Leu
				390		395	400
ATC	CGT	TCC	TCC	GTG	GAT TCT	TCC CTG GAT	ATC GAT	CTC GGC CTG	TGG	1783
Ile	Arg	Ser	Ser	Val	Asp Ser	Ser Leu Asp	Ile Asp	Leu Gly Leu	Trp
			405			410		415
GAA	TCC	CAG	TCC	TCC	GAC AAC	CCT GTG TAC	TAC GIG	CAG TAC GGA	CAC	1831
Glu	Ser	Gin	Ser	Ser	Asp Asn	Pro Val Tyr	Tyr Val	Gin Tyr Gly	His
		420				425		430
GCT	CGT	CTG	TGC	TCC	ATC GCG	CGC AAG GCA	GAG ACC	TTG GGT GTC	ACC	1879
Ala	Arg	Leu	Cys	Ser	Ile Ala	Arg Lys Ala	Glu Thr	Leu Gly Val	Thr
	435				440	445
GAG	GAA	GGC	GCA	GAC	CTA TCT	CTA CTG ACC	CAC GAC	CGC GAA GGC	GAT	1927
Glu	Glu	Gly	Ala	Asp	Leu Ser	Leu Leu Thr	His Asp	Arg Glu Gly Asp
450					455		460		465
CTC	ATC	CGC	ACA	CTC	GGA GAG	TTC CCA GCA	GTG GTG	AAG GCT GCC GCT	1975
Leu	Ile	Arg	Thr	Leu	Gly Glu	Phe Pro Ala	Val Val	Lys Ala Ala Ala
				470	475	480
GAC	CTA	CGT	GAA	CCA	CAC CGC	ATT GCC OGC	TAT GCT	GAG GAA TTA	GCT	2023
Asp	Leu	Arg	Glu	Pro	His Arg	Ile Ala Arg	Tyr Ala	Glu Glu Leu	Ala
			485		490		495
GGA	ACT	TTC	CAC	OGC	TTC TAC	GAT TCC TGC	CAC ATC	CIT CCA AAG	GIT	2071
Gly	Thr	Pbe	His	Arg	Phe Tyr	Asp Ser Cys	His Ile	Leu Pro Lys	Val
		500			505		510
GAT	GAG	GAT	ACG	GCA CCA ATC	CAC ACA GCA	CGT CTG	GCA CTT GCA	GCA	2119

-42CZ 293268 B6

Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala

515 520 525

GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167

Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser

530 535 540 545

GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GIT GAA AAT TTC AAT GAA2214

Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu

550 15

CIT CCT GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCT GTG CGC CAA GAA GAC GGC2262

Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gin Glu Asp Gly

15 2025

GIT GTC ACC GTC GCT GGT GIG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC2310

Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu GluTyr

3540

GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TCT2358

Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser ArgCys

5055

CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA2406

Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His TyrAla

6570

TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CCT TGG GTT GAT GAA GAG2454

Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu

8085

GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCT ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCT CTG2502

Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu

95 100105

GCT GCT GGT TTC CCT GCT AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA2550

Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys

110 115120

GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GIT CAA AAC GCT GIG GGA CAC CTG2593

Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val

125 130135

GTG CTG GAC TCT GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCT GCT 26-5,0

Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala

140 145150

GCT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC CTA AAG CCA GGC ATC2694

Gly Glu Gly Lys Ile Gin Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile

155 160165

GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCT ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG2742

Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys

170 175 180185

TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCT GCT TCT GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCT2790

Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala

190 195200

GCT AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT2833

-43CZ 293268 B6

Ala

Asn

Asn

Ala

Glu Asn

Leu

Asn

Leu Val

Gly

Leu

His

Cys His

Val

205

210

215

GGT

TCC

CAG

GIG

TTC GAC

GCC

GAA

GGC

TTC

AAG

CTG

GCA

GCA

GAA

CGC

2886

Gly

Ser

Gin

Val

Phe Asp

Ala

Glu

Gly

Phe

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Arg

220

225

230

CTG

TTG

GGC

CTG

TAC TCA

CAG

ATC

CAC

AGC

GAA

CTG

GGC

GTT

GCC

CTT

2934

Val

Leu

Gly

Leu

Tyr Ser

Gin

Ile

His

Ser

Glu

Leu

Gly

Val

Ala

Leu

235

240

245

CCT

GAA

CTG

GAT

CTC GCT

GGC GGA

TAC

GGC

ATT

GCC

TAT

ACC

GCA

GCT

2982

Pro

Glu

Leu

Asp

Leu Gly

Gly Gly

Tyr

Gly

Ile

Ala

Tyr

Thr

Ala

Ala

250

255

260

265

GAA

GAA

CCA

CTC

AAC CTC

GCA

GAA

CTT

GCC

TCC

GAC

CTG

CTC

ACC

GCA

3030

Glu

Glu

Pro

Leu

Asn Val

Ala

Glu

Val

Ala

Ser

Asp

Leu

Leu

Thr

Ala

270

275

280

GTC

GGA

AAA

ATG

GCA GCG

GAA

CTA

GGC

ATC

GAC

GCA

CCA

ACC

GTG

CTT

3078

Val

Gly

Lys

Met

Ala Ala

Glu

Leu

Gly

Ile

Asp

Ala

Pro

Thr

Val

Leu

285

290

295

GTT

GAG

CCC

GGC

CGC GCT

ATC

GCA

GGC

CCC

TCC

ACC

CTG

ACC

ATC

TAC

3126

Val

Glu

Pro

Gly

Arg Ala

Ile

Ala

Gly

Pro

Ser

Thr

Val

Thr

Ile

Tyr

300

305

310

GAA

GTC

GGC

ACC

ACC AAA

GAC

GTC

CAC

CTA

GAC

GAC

GAC

AAA

ACC

CGC

3174

Glu

Val

Gly

Thr

Thr Lys

Asp

Val

His

Val

Asp

Asp

Asp

Lys

Thr

Arg

315

320

325

CCT

TAC

ATC

GCC

GTG GAC

GGA

GGC

ATG

TCC

GAC

AAC

ATC

CGC

CCA

GCA

3222

Arg

Tyr

Ile

Ala

Val Asp

Gly

Gly

Met

Ser

Asp

Asn

Ile

Arg

Pro

Ala

330

335

340

345

CTC

TAC

GGC

TCC

GAA TAC

GAC

GCC

CGC

CTA

CTA

TCC

CGC

TTC

GCC

GAA

3270

Leu

Tyr Gly

Ser

Glu Tyr Asp

Ala

Arg

Val

Val

Ser

Arg

Phe

Ala

Glu

350

355

360

GGA

GAC

CCA

GTA

AGC ACC CGC

ATC

GTG

GGC

TCC

CAC

TGC

GAA

TCC

GGC

3318

Gly Asp

Pro

Val

Ser Thr Arg

Ile

Val

Gly

Ser

His

Cys

G1U

Ser

Gly

365

370

375

GAT

ATC

CTG

ATC

AAC GAT

GAA

ATC

TAC

CCA

TCT

GAC

ATC

ACC

AGC

GGC

3366

Asp

Ile

Leu

ile

Asn Asp

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Gly

380

385

390

GAC

TTC

CTT

GCA

CTC GCA

GCC

ACC

GGC

GCA

TAC

TGC

TAC

GCC

ATG

AGC

3414

Asp

Phe

Leu

Ala

Leu Ala

Ala

Thr

Gly

Ala

Tyr Cys

Tyr

Ala

Met

Ser

395

400

405

TCC

CGC

TAC

AAC

GCC TTC

ACA

CGG

CCC

GCC

GTC GTG

TCC

GTC

CGC

GCT

3462

Ser

Arg Tyr

Asn

Ala Phe

Thr

Arg

Pro

Ala

Val Val

Ser

Val

Arg

Ala

410

415

420

425

GGC

AGC

TCC

CGC

CTC ATC CTG

CGC

CGC

GAA

ACG CTC

GAC

GAC

ATC

CTC

3510

Gly

Ser

Ser

Arg

Leu Met

Leu

Arg Arg

Glu

Thr

Leu

Asp Asp

Ile

Leu

430 435 440

TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCOCTT CACCTTCGCC 3562

Ser Leu Glu Ala

445

GTGGAGGGCG GTTTTGG

3579

-44CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 550 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

Met	Thr	Pro	Ala Asp	Leu	Ala	Thr	Leu Ile Lys Glu	Thr	Ala Val	Glu
1				5				10		15
Val	Leu	Thr	Ser	Arg	Glu	Leu	Asp	Thr Ser Val Leu	Pro	Glu Gin	Val
			20					25		30
Val	Val	Glu	Arg	Pro	Arg	Asn	Pro	Glu His Gly Asp Tyr	Ala Thr	Asn
		35					40		45
Ile	Ala	Leu	Gin	Val	Ala	Lys	Lys	Val Gly Gin Asn Pro	Arg Asp	Leu
	50					55		60
Ala	Thr	Trp	Leu	Ala	Glu	Ala	Leu	Ala Ala Asp Asp	Ala	Ile Asp	Ser
65					70			75			80
Ala	Glu	Ile	Ala	Gly	Pro	Gly	Phe	Leu Asn Ile Arg	Leu	Ala Ala	Ala
				85				90		95
Ala	Gin	Gly	Glu	Ile	Val	Ala	Lys	Ile Leu Ala Gin	Gly	Glu Thr	Phe
			100					105		110
Gly	Asn	Ser	Asp	His	Leu	Ser	His	Leu Asp Val Asn	Leu	Glu Phe	Val
		115					120	125
Ser	Ala	Asn	Pro	Thr	Gly	Pro	Ile	His Leu Gly Gly	Thr	Arg Trp	Ala
	130					135		140
Ala	Val	Gly Asp	Ser	Leu	Gly Arg	Val Leu Glu Ala	Ser	Gly Ala Lys
145					150			155			160
Val	Thr	Arg Glu Tyr Tyr	Phe	Asn	Asp His Gly Arg	Gin	Ile Asp Arg
				165			170		175
Phe	Ala	Leu Ser	Leu	Leu	Ala	Ala	Ala Lys Gly Glu	Pro	Thr Pro	Glu
			180					185		190
Asp Gly Tyr Gly Gly	Glu	Tyr	Ile	Lys Glu Ile Ala	Glu	Ala Ile	Val
		195					200	205
Glu	Lys	His	Pro	Glu	Ala	Leu	Ala	Leu Glu Pro Ala	Ala	Thr Gin	Glu

210 215220

Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser

225 230 235240

Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn 245 250255

Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gin Val Leu Lys 260 265270

-45CZ 293268 B6

Asp	Asn	Gly	Asn Leu Tyr Glu Asn Glu	Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser
		275	280		285
Thr	Glu	Phe	Gly Asp Asp Lys Asp Arg	Val Val Ile Lys Ser Asp Gly
	290		295	300
Asp	Ala	Ala	Tyr Ile Ala Gly Asp Ile	Ala Tyr Val	Ala Asp Lys Phe
305			310	315	320
Ser	Arg Gly	His Asn Leu Asn Ile Tyr	Met Leu Gly	Ala Asp His His
			325	330	335
Gly	Tyr	Ile	Ala Arg Leu Lys Ala Ala	Ala Ala Ala	leu Gly Tyr Lys
			340 345	350
Pro	Glu	Gly	Val Glu Val Leu Ile Gly	Gin Met Val	Asn Leu Leu Arg
		355	360		365
Asp Gly	Lys	Ala Val Arg Met Ser Lys	Arg Ala Gly	Thr Val Val Thr
	370		375	380
Leu	Asp Asp	Leu Val Glu Ala Ile Gly	Ile Asp Ala	Ala Arg Tyr Ser
385			390	395	400
Leu	Ile	Arg	Ser Ser Val Asp Ser Ser	Leu Asp Ile	Asp Leu Gly Leu
			405	410	415
Trp	Glu	Ser	Gin Ser Ser Asp Asn Pro	Val Tyr Tyr	Val Gin Tyr Gly
			420 425	430
His	Ala	Arg	Leu Cys Ser Ile Ala Arg	Lys Ala Glu	Thr Leu Gly Val
		435	440		445
Thr	Glu	Glu	Gly Ala Asp Leu Ser Leu	Leu Thr His	Asp Arg Glu Gly
	450		455	460
Asp	Leu	Ile	Arg Thr Leu Gly Glu Phe	Pro Ala Val	Val Lys Ala Ala
465			470	475	480
Ala	Asp	Leu	Arg Glu Pro His Arg Ile	Ala Arg Tyr	Ala Glu Glu Leu
			485	490	495
Ala	Gly	Thr	Phe His Arg Phe Tyr Asp	Ser Cys His	Ile Leu Pro Lys
			500 505	510
Val	Asp	Glu	Asp Thr Ala Pro Ile His	Thr Ala Arg	Leu Ala Leu Ala
		515	520		525
Ala	Ala	Thr	Arg Gin Thr Leu Ala Asn	Ala Leu His	Leu Val Gly Val
	530		535	540
Ser	Ala	Pro	Glu Lys Met
545			550

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 445 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-46CZ 293268 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

Met	Ala	Thr	Val	Glu Asn Phe Asn Glu	Leu Pro	Ala His	Val Trp Pro
1				5		10				15
Arg	Asn	Ala	Val	Arg Gin Glu Asp Gly Val Val	Thr	Val	Ala Gly Val
			20		25				30
Pro	Leu	Pro	Asp	Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr	Pro	Leu	Phe	Val Val
		35		40				45
Asp	Glu	ASp	Asp	Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp	Met	Ala	Thr	Ala Phe
	50			55			60
Gly Gly	Pro	Gly	Asn Val His Tyr	Ala	Ser Lys	Ala	Phe	Leu	Thr Lys
65				70		75			80
Thr	Ile	Ala	Arg	Trp Val Asp Glu	Glu	Gly Leu	Ala	Leu	Asp	Ile Ala
				85		90				95
Ser	Ile	Asn	Glu	Leu Gly Ile Ala	Leu	Ala Ala	Gly	Phe	Pro	Ala Ser
			100		105				110
Arg	Ile	Thr	Ala	His Gly Asn Asn	Lys Gly Val	Glu	Phe	Leu	Arg Ala
		115		120				125
Leu	Val	Gin	Asn	Gly Val Gly His	Val	Val Leu	Asp	Ser	Ala	Gin Glu
	130			135			140
Leu	Glu	Leu	Leu	Asp Tyr Val Ala	Ala	Gly Glu	Gly Lys	Ile	Gin Asp
145				150		155			160
Val	Leu	Ile	Arg	Val Lys Pro Gly	Ile	Glu Ala	His	Thr	His	Glu Phe
				165		170				175
Ile	Ala	Thr	Ser	His Glu Asp Gin	Lys	Phe Gly	Phe	Ser	Leu	Ala Ser
			180		185			190
Gly	Ser	Ala	Phe	Glu Ala Ala Lys	Ala	Ala Asn	Asn	Ala	Glu	Asn Leu
		195		200			205
Asn	Leu	Val	Gly	Leu His Cys His	Val	Gly Ser	Gin	Val	Phe	Asp Ala
	210			215			220
Glu	Gly	Phe	Lys	Leu Ala Ala Glu	Arg	Val Leu	Gly	Leu	Tyr	Ser Gin
225				230		235			240
Ile	His	Ser	Glu	Leu Gly Val Ala	Leu	Pro Glu	Leu	Asp	Leu	Gly Gly
				245		250				255
Gly Tyr Gly	Ile	Ala Tyr Thr Ala	Ala	Glu Glu	Pro	Leu	Asn	Val Ala
			260	265			270
Glu	Val	Ala	Ser	Asp Leu Leu Thr	Ala	Val Gly	Lys	Met	Ala	Ala Glu
		275		280			285
Leu	Gly	Ile	Asp	Ala Pro Thr Val	Leu	Val Glu	Pro	Gly Arg	Ala Ile
	290			295			300
Ala	Gly	Pro	Ser	Thr Val Thr Ile	Tyr	Glu Val	Gly	Thr	Thr	Lys Asp

305 310 315 320

Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330335

Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345350

Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg 355 360365

-47CZ 293268 B6

Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu

370 375 380

Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala

385 390 395 400

Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410415

Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425430

Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala

435 440445 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:21:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:22:

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG

-48CZ 293268 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1034 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 61..1020 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:23:

ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60

ATG

ACC

AAC

ATC

CGC

GTA

GCT

ATC

GTG

GGC TAC GGA

AAC CTG

GGA CGC

108

Met

Thr

Asn

Ile

Arg

Val

Ala

Ile

Val

Gly Tyr Gly

Asn Leu

Gly Arg

1

5

10

15

AGC

GTC

GAA

AAG

CTT

ATT

GCC

AAG

CAG

CCC GAC ATG

GAC CTT

GTA

GGA

156

Ser

Val

Glu

Lys

Leu

Ile

Ala

Lys

Gin

Pro Asp Met

Asp Leu

Val

Gly

20

25

30

ATC

TTC

TCG

CGC

CGG

GCC

ACC

CTC

GAC

ACA AAG ACG

CCA GTC

TTT

GAT

204

Ile

Phe

Ser

Arg

Arg

Ala

Thr

Leu

Asp

Thr Lys Thr

Pro Val

Phe

Asp

35

40

45

GTC

GCC

GAC

GTG

GAC

AAG

CAC

GOC

GAC

GAC GTG GAC

GTG CTG

TTC

CTG

252

Val

Ala

Asp

Val

Asp

Lys

His

Ala

Asp

Asp Val Asp

Val Leu

Phe

Leu

50

55

60

TGC

ATG

GGC

TCC

GCC

ACC

GAC

ATC

CCT

GAG CAG GCA

CCA AAG

TTC

GCG

300

Cys

Met

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

Ile

Pro

Glu Gin Ala

Pro Lys

Phe

Ala

65

70

75

80

CAG

TTC

GCC

TGC

ACC

GTA

GAC

ACC

TAC

GAC AAC CAC

CGC GAC

ATC

CCA

348

Gin

Phe

Ala

Cys

Thr

Val

Asp

Thr

Tyr

Asp Asn His

Arg Asp

Ile

Pro

85

90

95

CGC

CAC

CGC

CAG

GTC

ATG

AAC

GAA

GOC

GOC ACC GCA

GCC GGC

AAC

GTT

396

Arg

His

Arg

Gin Val

Met

Asn

Glu

Ala

Ala Thr Ala

Ala Gly

Asn

val

100

105

110

GCA

CTG

GTC

TCT

ACC

GGC

TGG GAT

CCA GGA ATG TTC

TCC ATC

AAC

CGC

444

Ala

Leu

Val

Ser

Thr

Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe

Ser Ile

Asn

Arg

115

120

125

GTC

TAC

GCA

GCG

GCA

GTC TTA GCC

GAG CAC CAG CAG

CAC ACC

TTC

TGG

492

Val

Tyr

Ala

Ala

Ala

Val

Leu Ala

Glu His Gin Gin

His Thr

Phe

Trp

130

135

140

-49CZ 293268 B6

GGC

CCA

GGT

TTG

TCA

CAG

GGC CAC

TCC

GAT GCT TTC

CGA

CGC ATC

CCT

540

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser

Gin

Gly His

Ser

Asp Ala Leu

Arg

Arg Ile

Pro

145

150

155

160

GGC

GTT

CAA

AAG

GCA

GTC

CAG

TAC

ACC

CTC CCA TCC

GAA

GAC GCC

CTG

588

Gly

Val

Gin

Lys

Ala

Val

Gin

Tyr

Thr

Leu Pro Ser

Glu

Asp Ala

Leu

165

170

175

GAA

AAG

GCC

CGC

CGC

GGC

GAA

GCC

GGC

GAC CTT ACC

GGA

AAG CAA

ACC

636

Glu

Lys

Ala

Arg Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Asp leu Thr

Gly

Lys Gin

Thr

180

185

190

CAC

AAG

CGC

CAA_TGC

TTC

GTG

GTT

GCC

GAC GCG GCC

GAT

CAC GAG

CGC

684

His

Lys

Arg

Gin Cys

Phe

Val

Val

Ala

Asp Ala Ala

Asp

His Glu

Arg

195

200

205

ATC

GAA

AAC

GAC

ATC

CGC

ACC ATG

CCT

GAT TAC TTC GIT

GGC TAC

GAA

732

Ile

Glu

Asn

Asp

Ile

Arg

Thr

Met

Pro

Asp Tyr Phe Val

Gly Tyr

Glu

210

215

220

GTC

GAA

GTC

AAC

TTC

ATC

GAC

GAA

GCA

ACC TTC GAC

TCC

GAG CAC

ACC

780

Val

Glu

Val

Asn

Phe

Ile

Asp

Glu

Ala

Thr Phe Asp

Ser

Glu His

Thr

225

230

235

240

GGC

ATG

CCA

CAC

GGT

GGC

CAC

GTG

ATT

ACC ACC GGC

GAC

ACC GCT

GGC

828

Gly

Met

Pro

His

Gly

Gly

His

Val

Ile

Thr Thr Gly

Asp

Thr Gly Gly

245

250

255

TTC

AAC

CAC

ACC

GTG

GAA

TAC

ATC

CTC

AAG CTC GAC

CGA

AAC CCA

GAT

876

Phe

Asn

His

Thr

Val

Glu

Tyr

Ile

Leu

Lys Leu Asp

Arg

Asn Pro

Asp

260

265

270

TTC

ACC

GCT

TCC

TCA

CAG

ATC

GCT

TTC

GGT CGC GCA

GCT

CAC CGC

ATC

924

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Gin

Ile

Ala

Phe

Gly Arg Ala

Ala

His Arg

Met

275

280

285

AAG

CAG

CAG

GGC

CAA

AGC

GGA

GCT

TTC

ACC GTC CTC

GAA

GTT GCT

CCA

972

Lys

Gin

Gin

Gly

Gin

Ser

Gly Ala

Phe

Thr Val Leu

Glu

Val Ala

Pro

290

295

300

TAC

CTG

CTC

TCC

CCA

GAG

AAC TTC

GAC

GAT CTC ATC GCA

CGC GAC

GTC

1020

Tyr

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Asn Leu

Asp

Asp Leu Ile Ala

Arg Asp

Val

305

310

315

320

TAAT1TAGCT CGAG 1034 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 320 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-50CZ 293268 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:24:

Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1	5	10	15
Ser	Val	Glu	Lys	Leu	Ile .	Ala	Lys Gin Pro Asp 1	Met Asp Leu Val Gly
			20				25	30
Ile	Phe	Ser	Arg Arg	Ala	Thr	Leu Asp Thr Lys 1	Thr Pro Val Phe Asp
		35					40	45
Val	Ala	Asp	Val	Asp Lys	His	Ala Asp Asp Val	Asp Val Leu Phe Leu
	50					55		60
Cys	Met	Gly	Ser	Ala	Thr	Asp	Ile Pro Glu Gin	Ala Pro Lys Phe Ala
65					70		75	80
Gin	Phe	Ala	Cys	Thr	Val	Asp	Thr Tyr Asp Asn	His Arg Asp Ile Pro
				85			90	95
Arg	His	Arg	Gin	Val	Mat	Asn	Glu Ala Ala Thr	Ala Ala Gly Asn Val
			100				105	110
Ala	Leu	Val	Ser	Thr	Gly Trp Asp Pro Gly Met	Phe Ser Ile Asn Arg
		115					120	125
Val	Tyr	Ala	Ala	Ala	Val	Leu	Ala Glu His Gin	Gin His Thr Phe Trp
	130					135	140
Gly	Pro	Gly	Leu	Ser	Gin Gly	His Ser Asp Ala	Leu Arg Arg Ile Pro
145					150		155 160
Gly	val	Gin	Lys	Ala	Val	Gin	Tyr Thr Leu Pro	Ser Glu Asp Ala Leu
				165			170	175
Glu	Lys	Ala	Arg Arg Gly	Glu	Ala Gly Asp Leu	Thr Gly Lys Gin Thr
			180				185	190
His	Lys Arg	Gin	Cys	Phe	Val	Val Ala Asp Ala	Ala Asp His Glu Arg
		195					200	205
Ile	Glu	Asn	Asp	Ile	Arg	Thr	Met Pro Asp Tyr	Phe Val Gly Tyr Glu
	210					215	220
Val	Glu	Val	Asn	Phe	Ile	Asp	Glu Ala Thr Phe	Asp Ser Glu His Thr
225					230	235 240
Gly	Met	Pro	His	Gly Gly	His	Val Ile Thr Thr	Gly Asp Thr Gly Gly
				245		250	255
Phe	Asn	His	Thr	Val	Glu	Tyr	Ile Leu Lys Leu	Asp Arg Asn Pro Asp
			260			265	270
Phe	Thr	Ala	Ser	Ser	Gin	Ile	Ala Phe Gly Arg	Ala Ala His Arg Met
		275					280	285
Lys	Gin	Gin	Gly	Gin	Ser	Gly Ala Phe Thr Val	Leu Glu Val Ala Pro
	290				295	300
Tyr	Leu	Leu	Ser	Pro	Glu	Asn Leu Asp Asp Leu	Ile Ala Arg Asp Val

305 310 315 320

-51 CZ 293268 B6

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní DNA schopná autonomní replikace v buňkách koryneformní bakterie, obsahující sekvenci DNA kódující aspartokinázu, u které je vyřazena z činnosti zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a sekvencí DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu.
2. 2. Rekombinantní DNA podle nároku 1, dále obsahující sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu.
3. 3. Rekombinantní DNA podle nároku 2, dále obsahující sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu.
4. 4. Rekombinantní DNA podle nároku 3, dále obsahující sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.
5. 5. Rekombinantní DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde uvedenou aspartokinázou je mutantní aspartokináza, ve které je v α-podjednotce s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 5 zaměněn zbytek alaninu v poloze 279, počítáno od N-konce, za zbytek aminokyseliny jiné než alanin a jiné než je kyselá aminokyselina, a v β-podjednotce s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 7 je zaměněn zbytek alaninu v poloze 30 za zbytek aminokyseliny jiné než je alanin a jiné než je kyselá aminokyselina.
6. 6. Rekombinantní DNA podle nároku 1, kde sekvence DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 11 ve výpisu sekvencí, nebo mutantu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ ID No: 11 se zachovanou enzymatickou aktivitou.
7. 7. Rekombinantní DNA podle nároku 2, kde sekvence DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 15 ve výpisu sekvencí, nebo mutantu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ ID No: 15 se zachovanou enzymatickou aktivitou.
8. 8. Rekombinantní DNA podle nároku 3, kde uvedená sekvence kódující diaminopimelát dekarboxylázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 20 ve výpisu sekvencí nebo, mutantu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ ID No: 20 se zachovanou enzymatickou aktivitou.
9. 9. Rekombinantní DNA podle nároku 4, kde uvedená sekvence kódující diaminopimelát dehydrogenázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 24 ve výpisu sekvencí, nebo mutantu sekvence aminokyselin uvedené v SEQ ID No: 24 se zachovanou enzymatickou aktivitou.
10. 10. Koryneformní bakterie, která nese aspartokinázu, u které je vyřazena z činnosti zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a která má zvýšenou intracelulámí aktivitu dihydrodipikolinát reduktázy.
11. 11. Koryneformní bakterie podle nároku 10, která je transformována zavedením rekombinantní DNA podle nároku 1.
12. 12. Koryneformní bakterie podle nároku 10, která má dále zvýšenou intracelulámí aktivitu dihydrodipikolinát syntázy.
13. 13. Koryneformní bakterie podle nároku 12, která je transformována zavedením rekombinantní DNA podle nároku 2.

    -52CZ 293268 B6
14. 14. Koryneformní bakterie podle nároku 12, která má dále zvýšenou intracelulámí aktivitu diaminopimelát dekarboxylázy.
15. 15. Koryneformní bakterie podle nároku 14, která je transformována zavedením rekombinantní DNA podle nároku 3.
16. 16. Koryneformní bakterie podle nároku 14, která má dále zvýšenou intracelulámí aktivitu diaminopimelát dehydrogenázy.
17. 17. Koryneformní bakterie podle nároku 16, která je transformována zavedením rekombinantní DNA podle nároku 4.
18. 18. Způsob výroby L-lyzinu, vyznačující se tím, že se kultivuje koryneformní bakterie podle některého z nároků 10 až 17 ve vhodném médiu, v kultuře bakterií se produkuje a akumuluje L-lyzin a L-lyzin se izoluje z kultury.