CZ390397A3 - Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby L-lyzinu kultivací mikroorganismu, získaného modifikací koryneformní bakterie, používané pro fermentativní výrobu aminokyseliny apod., použitím techniky založené na genetickém inženýrství.

Dosavadní stav techniky

L-lyzin, který se používá jako přídavná látka do krmiv, se obvykle vyrábí fermentativním způsobem použitím mutantního kmene náležejícího ke koryneformním bakteriím, produkujícího L-lyzin. V současnosti je známo mnoho bakterií produkujících L-lyzin, které byly vytvořeny umělou mutací standardního kmene, náležejícího ke 15 koryneformním bakteriím.

Co se týče koryneformních bakterií, jsou známy vektorové plazmidy, které se autonomně replikují v bakteriálních buňkách a mají markerový gen rezistence vůči léku (viz US patent No. 4,514,502), a způsob zavádění genu do bakteriálních buněk (například zveřejněná 2o japonská patentová přihláška No. 2-207791). Popisuje se také možnost šlechtění bakterií produkujících L-threonin nebo L-izoleucin použitím výše popsaných způsobů (viz US patenty No. 4,452,890 a 4,442,208). Co se týče šlechtění bakterie produkující L-lyzin, je znám způsob, při kterém se vloží gen účastnící se biosyntézy L-lyzinu 25 do plazmidového vektoru pro zesílení genu v bakteriálních buňkách (např. uveřejněná japonská patentová přihláška No. 56-160997).

- 2 Známými geny pro biosyntézu L-lyzinu jsou např. gen pro dihydrodipikolinát reduktázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 7-75578) a gen pro diaminopimelát dehydrogenázu (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res., 15. 3917 (1987), ve kterém je klonován 5 gen účastnící se biosyntézy L-lyzinu a gen pro fosfoenolpyruvát karboxylázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 60-87788), gen pro dihydrodipikolinát syntázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 6-55149) a gen pro diaminopimelát dekarboxylázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 60-62994), u kterých io amplifikace genu ovlivňuje míru produkce L-lyzinu.

Co se týče enzymů účastnících se biosyntézy L-lyzinu, je znám příklad enzymu, který podléhá zpětnovazební inhibici při použití ve formě standardního typu. V takovém případě je výtěžnost L-lyzinu zlepšena zavedením genu enzymu s takovou mutací, že 15 zpětnovazebně inhibice se vyřadí. Takovými známými geny jsou zvláště například gen aspartokinázy (zveřejněná mezinárodní přihláška WO 94/25605).

Jak se popisuje výše, určité pozitivní výsledky byly získány pomocí amplifikace genů biosyntetického systému L-lyzinu nebo 20 zavedením mutantních genů. Značné množství L-lyzinu (přibližně 25 g/l) např. produkuje koryneformní bakterie, která nese mutantní gen pro aspartokinázu s vyřazenou spřaženou inhibici lyzinem a threoninem. Nevýhodou této bakterie je však pokles růstové rychlosti při porovnání s bakterií, která mutantní gen aspartokinázy 25 nemá. Popisuje se také, že výtěžnost L-lyzinu se zlepší dalším zavedením genu dihydrodipikolinát syntázy navíc k mutantnímu genu pro aspartokinázu (Applied and Environmental Microbiology, 57(6), 1746 - 1752 (1991). Rovněž tato bakterie však trpí dalším snížením růstové rychlosti.

3o Co se týče genu pro dihydrodipikolinát reduktázu, bylo ukázáno, že aktivita dihydrodipikolinát reduktázy se v koryneformní bakterii se • · «4 · 4 44 4 ··· · · · ····4 • 4 · · · ·♦ • 4 44 4444 4444 zavedeným genem zvýší, avšak chybí údaje o vlivu na produktivitu Llyzinu (zveřejněná japonská patentová přihláška No. 7-75578).

V současnosti tedy není znám žádný případ koryneformní bakterie, u které by se někomu podařilo významně zlepšit výtěžek L5 lyzinu kombinací většího počtu genů biosyntézy L-lyzinu bez omezení růstu. Stejně tak není znám případ, který by se zabýval zvýšením růstu zesílením genu pro biosyntézu L-lyzinu.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je zlepšení schopnosti produkovat L-lyzin a růstové rychlosti koryneformní bakterie použitím genetických materiálů sekvencí DNA kódujících aspartokinázu (dále označovanou jako „AK“, s tím, že gen kódující protein AK se dále v případě potřeby označuje jako JysC“), dihydrodipikolinát reduktázu (dále označovanou jako „DDPR“, s tím, že gen kódující protein DDPR se dále v případě potřeby označuje jako „dapB“). dihydrodipikolinát syntázu (zde zkracovanou jako „DDPS“, s tím, že gen kódující protein DDPS se dále v případě potřeby označuje jako „dapA“), diaminopimelát dekarboxylázu, (dále označovanou jako „DDC“, s tím,

2o že gen kódující protein DDC se dále v případě potřeby označuje jako „lysA“) a diaminopimelát dehydrogenázu (dále označovanou jako „DDH“, s tím, že gen kódující protein DDH se dále v případě potřeby označuje jako „ddh“), které jsou v buňkách koryneformních bakterií důležitými enzymy pro biosyntézu L-lyzinu. Pokud se fermentačním způsobem s použitím mikroorganismu produkuje určitá látka, rychlost produkce, stejně jako výtěžek této látky vzhledem ke vloženému materiálu je extrémně důležitý faktor. Náklady na produkci určité látky mohou být značně sníženy zvýšením produkční rychlosti na jednotku objemu fermentačního zařízení. Je tedy pro průmyslové využití

3o extrémně důležité, aby výtěžek fermentace a rychlost produkce byly • ·· . · · · · ·· • · ··· · · · ···· · • · · · · · · · · ····· ······ ·· ··

- 4 vzájemně kompatibilní. Předkládaný vynález navrhuje řešení tohoto problému, aby bylo možno dosáhnout zlepšení fermentativního způsobu výroby L-lyzinu s použitím koryneformních bakterií.

Podstatou předkládaného vynálezu je skutečnost, že růst koryneformní bakterie je možno zlepšit a tím zvýšit rychlost produkce L-lyzinu dosažením zesílení kombinací dapB s mutantním lysC (dále v případě potřeby jednoduše označovaným jako „mutantní lysC), kódující mutantní AK (dále v případě potřeby jednoduše označovanou jako „AK mutantního typu“), přičemž touto kombinací se vyřadí z činnosti spřažená inhibice lyzinem a threoninem ve srovnání s případem, kdy se zesílí lysC samotný, a že rychlost produkce Llyzinu může být dále zvýšována po krocích postupným zesilováním dapA, lysA a ddh.

Předkládaný vynález spočívá jmenovitě v rekombinantní DNA autonomně replikovatelné v buňkách koryneformní bakterie, obsahující sekvenci DNA kódující aspartokinázu, ve které je zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem v podstatě vyřazena z činnosti a sekvenci DNA, kódující dihydrodipikolinát reduktázu.

Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která dále navíc k výše popsaným sekvencím DNA obsahuje sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu. Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která navíc ke třem výše popsaným sekvencím DNA dále obsahuje sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu. Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která dále navíc k výše popsaným čtyřem sekvencím DNA obsahuje sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.

V dalším hledisku poskytuje předkládaný vynález koryneformní bakterii nesoucí aspartokinázu, ve které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a obsahující zesílenou DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále

- 5 • ·· · · · ····

9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 99 99 9 9 9 9 obsahuje zesílenou DNA kódující ve výše uvedené koryneformní bakterii dihydrodipikolinát syntézu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA, kódující ve výše uvedené koryneformní bakterii navíc ke třem výše popsaným DNA diaminopimelát dekarboxylázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA, která ve výše uvedené koryneformní bakterii navíc ke čtyřem DNA popisovaným výše kóduje diaminopimelát dehydrogenázu.

V ještě dalším hledisku poskytuje vynález způsob výroby Llyzinu, který zahrnuje kroky kultivace jakékoliv výše popsané koryneformní bakterie ve vhodném médiu, produkce a akumulace Llyzinu v bakteriální kultuře a izolace L-lyzinu z kultury.

Koryneformní bakterie v předkládaném vynálezu jsou skupinou mikroorganismů, jak je definována v publikaci: Berqey's Manual of Determinative Bacterioloqy, 8. vyd., str. 599 (1974), tedy aerobní grampozitivní tyčinky, které nejsou odolné vůči kyselinám a nemají schopnost tvořit spory. Mezi koryneformní bakterie spadají bakterie náležející k rodu Corvnebacterium, bakterie náležející k rodu Brevibacterium, které byly dosud zatříděny do rodu Brevibacterium, ale nyní náležejí k rodu Corvnebacterium, a bakterie náležející k rodu Brevibacterium blízce příbuzné k bakteriím náležejícím k rodu Corvnebacterium.

Dále následuje podrobný popis vynálezu:

(1) Příprava genů biosyntézy L-lyzinu používaných v předkládaném vynálezu

Geny biosyntézy L-lyzinu používané v předkládaném vynálezu se získávají izolací chromozomální DNA z bakterie (donor DNA), vytvořením knihovny chromozomální DNA použitím plazmidového vektoru nebo jiným způsobem, selekcí kmene nesoucího požadovaný gen, a izolací rekombinantní DNA z vybraného kmene, do které je gen

- 6 ~vložen. Volba donoru DNA pro gen biosyntézy L-lyzinu používaný v předkládaném vynálezu není nějak specificky limitována pod podmínkou, že požadovaný gen biosyntézy L-lyzinu exprimuje protein enzymu, který v buňkách koryneformní bakterie funguje. S výhodou je 5 však donorem DNA koryneformní bakterie.

Všechny geny lysC, dapA a dapB, pocházející z koryneformních bakterií, mají známé sekvence. Mohou být tedy získány provedením amplifikace- metodou polymerázové řetězové reakce (PCR; viz White, T. J. a další, Trends Genet., 5, 185 (1989).

io Každý z genů pro biosyntézu L-lyzinu používaný v předkládaném vynálezu je možno získat podle některé metody, jejich příklady se uvádějí níže.

1. Příprava mutantního lysC

Fragment DNA obsahující mutantní gen lysC je možno připravit z mutantního kmene, ve kterém byla v podstatě vyřazena z činnosti synergická zpětnovazební inhibice aktivity AK L-lyzinem a Lthreoninem (mezinárodní publikovaná přihláška WO 94/25605). Takový mutantní kmen může být například získán ze skupiny buněk, které pocházejí ze standardního kmene koryneformní bakterie, vystaveného působení mutace použitím obvyklých metod mutace, jako je ozáření UV a působení mutačních činidel, jako je N-methyl-N'-nitroN-nitrosoguanidin. Aktivita AK může být měřena pomocí metody popsané v: Miyajima, R. a další, v The Journal of Biochemistry (1968),

63(2), 139 - 148. Jako takový mutantní kmen je nejvýhodnější kmen, představovaný bakterií produkující L-lyzin AJ3445 (FERM P-1944), odvozený pomocí mutačního působení z kmene Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 standardního typu (dnes označované novým názvem Corynebacterium qlutamicum).

- 7 • · · · · · ··· 4 · © · · * · · · · · ·· ··

Alternativně je možno mutantní lysC získat mutací plazmidové DNA, obsahující gen lysC standardního typu in vitro. V dalším hledisku je známa specifická informace o mutaci, vedoucí k vyřazení synergické zpětnovazební inhibice AK L-lyzinem a L-threoninem z činnosti (mezinárodní zveřejněná patentová přihláška WO 94/25605). Mutantní gen lysC může být tedy také připraven na základě informace například metodou místně specifické mutageneze.

Fragment obsahující lysC může být izolován z koryneformní bakterie přípravou chromozomální DNA například metodou Saito H. a Miura K., Biochem. Biophys. Acta, 72. 619 (1963), a amplifikací lysC metodou polymerázové řetězové reakce (PCR; viz White, T. J. a další, Trends Genet., 5, 185 (1989).

Jako příklad primerů DNA je možno uvést jednořetězcové DNA 23-meru a 21-meru s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No.: 1 a 2 ve výpisu sekvencí pro amplifikací například oblasti o velikosti přibližně 1643 bp, kódující lysC, založené na sekvenci známé pro Corynebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy (1991), 5(5), 1197 - 1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317 - 324).DNA je možno syntetizovat obvyklými způsoby použitím syntezátoru DNA model 380B firmy Applied Biosystems a použitím fosfoamiditové metody (viz Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). PCR je možno provádět s použitím přístroje DNA Thermal Cycler Model PJ2000 firmy Takara Shuzo, a Taq DNA polymerázy metodou doporučenou výrobcem. Je výhodné, když je pro přípravu rekombinantní DNA gen lysC, amplifikovaný PCR, ligován s vektorem DNA, který se autonomně replikuje v buňkách E. coli a/nebo koryneformní bakterie, a rekombinantní DNA se předem zavede do buněk E. coli. Dodržení této podmínky usnadní následující postup. Vektorem autonomně se replikujícím v buňkách E. coli íe s výhodou plazmidový vektor, který se s výhodou autonomně replikuje v buňkách hostitele, včetně například

9 9

9 9 9

plazmidů pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 a RSF1010.

Pokud se do těchto vektorů vloží fragment DNA, který má schopnost umožnit plazmidů autonomní replikaci v koryneformní bakterii, může být vektor použit jako tzv. kyvadlový vektor, který se autonomně replikuje jak v E. coli, tak i koryneformní bakterii. Takový kyvadlový vektor zahrnuje následující vektory. Mikroorganismus nesoucí každý takový vektor a depozitní čísla uložení v mezinárodních institucích pro ukládání mikroorganismů jsou uvedena v závorkách.

pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) PAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)

Corynebacterium qlutamicum SR8201 (ATCC 39135) PAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)

Corynebacterium qlutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corynebacterium qlutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)

Tyto vektory je možno získat z mikroorganismů uložených ve sbírce následujícím způsobem. Buňky oddělené v logaritmické fázi růstu byly lyžovány použitím lysozymu a SDS a poté centrifugací lyzátu při 30 000 x g pro získání supernatantu, ke kterému byl přidán polyethylengiykol. Potom byla provedena frakcionace a purifikace centrifugací v rovnovážném hustotním gradientu chloridu česného ethidiumbromidu.

Buňky E. coli mohou být transformovány například zavedením plazmidů metodou D. M. Morrison, Methods in Enzymoloqy, 68, 326 (1979) nebo metodou, kdy se pro zvýšení permeability pro DNA působí na buňky příjemce chloridem vápenatým (Mandel, M. a Higa, A., J, Mol. Biol., 53, 159 (1970).

- 9 • φ φ ·· · · · · · φ φ ··· φ · · φφφφ · φφφ φφφ φφφ • ΦΦ ·· φφ φφφφ φφ ··

Gen lysC standardního typu se získá izolací genu lysC z AK kmene standardního typu, zatímco mutantní lysC se získá při izolaci lysC z AK mutantního kmene některou z výše popsaných metod.

Příklad sekvence nukleotidů fragmentu DNA obsahujícího 5 standardní typ lysC je uveden ve výpisu sekvencí v SEQ ID No.: 3.

Sekvence aminokyselin α-subjednotky proteinu AK standardního typu se odvozuje ze sekvence nukleotidů, ukázané ve výpisu sekvencí v SEQ ID No.: 4 spolu se sekvencí DNA. V SEQ ID No.: 5 je uvedena pouze sekvence aminokyselin. Aminokyselinová sekvence βίο podjednotky proteinu AK standardního typu se odvozuje ze sekvence nukleotidů DNA, která je uvedena v SEQ ID No.: 6 výpisu sekvencí spolu s DNA. SEQ ID No.: 7 uvádí pouze sekvenci aminokyselin. V každé podjednotce je jako iniciační kodon použit GTG a odpovídající aminokyselina je methionin. Totéž platí pro methionin, valin nebo 15 formylmethionin.

Výběr mutantního genu lysC použitého v předkládaném vynálezu není zvlášť omezován za předpokladu, že kóduje AK, u které je vyřazena synergická zpětnovazební inhibice L-lyzinem a Lthreoninem. Jako příklad mutantního genu lysC je uveden gen s 20 mutací, ve které je 279. zbytek alaninu počítáno od N-konce zaměněn za zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina v α-podjednotce a 30. zbytek alaninu je zaměněn za zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina v β-podjednotce aminokyselinové sekvence AK standardního typu. 25 Sekvence aminokyselin AK standardního typu specificky zahrnuje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID No.: 5 ve výpisu sekvencí jako α-podjednotka a sekvenci aminokyselin, ukázanou v SEQ ID No.: 7 ve výpisu sekvencí jako β-podjednotka. Aminokyseliny, které s výhodou představují zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než 3o kyselá aminokyselina, jsou zbytky aminokyselin threonin, arginin, cystein, fenylalanin, prolin, serin, tyrozin a valin.

- 10 • · · · · · · · · · • · · · · · ♦ · · · · · « • · · · · · ··· ··· ·· ♦· ···· ·· ··

Kodon odpovídající zbytku aminokyseliny, která má být substituována není u tohoto typu specificky omezen kromě podmínky, že kóduje zbytek aminokyseliny. Předpokládá se, že sekvence aminokyselin u standardního typu AK se může mírně lišit v závislosti na rozdílu v bakteriálních druzích a bakteriálních kmenech. AK, které mají mutaci založenou např. na substituci, deleci nebo inzerci jednoho nebo více zbytků aminokyselin v jedné nebo více polohách, které nemají vztah k aktivitě enzymu jak je popsáno výše, mohou být v předkládaném vynálezu použity také. Jiné AK, které mají mutaci založenou například na substituci, deleci nebo inzerci jiných jedné nebo více zbytků aminokyselin mohou být použity také za předpokladu, že změny podstatně neovlivní aktivitu AK a vyřazení synergické zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem.

Kmen AJ12691, získaný zavedením plazmidu p399AK9B nesoucího mutantní gen lysC do kmene AJ12036 (FERM BP-734) standardního typu Brevibacterium lactofermentum, byl uložen

10. 4. 1992 pod depozitním číslem FERM P-12918 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko), a převeden 10. 2. 1995 na mezinárodní uložení založené na Budapěšťské smlouvě pod depozitním číslem FERM BP-4999.

2. Příprava dapB

Fragment DNA obsahující gen dapB je možno připravit z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Výběr donoru DNA není specificky omezen, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Sekvence DNA kódující DDPR je pro Brevibacterium lactofermentum známa (Journal of Bacteriology, 175(9), 2743 - 2749 (1993), a na jejím základě je možno připravit primery DNA pro PCR.

- 11 Příklady takových primerů DNA jsou 23-mery DNA, které mají sekvence nukleotidů uvedené ve výpisu sekvencí pod SEQ ID No. 8 a

9. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný dapB může být provedena stejným způsobem, jak bylo popsáno výše pro ⁵ IvsC.

Nukleotidová sekvence fragmentu DNA obsahujícího dapB a z ní odvozená aminokyselinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 10. Pouze aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 11. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto aminokyselinovou sekvenci může io předkládaný vynález ekvivalentně používat fragmenty DNA kódující sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je aminokyselinová sekvence ukázaná v SEQ ID No: 11, totiž sekvenci aminokyselin s mutací, založenou například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že změny nemají podstatný 15 vliv na aktivitu DDPR.

Transformovaný kmen AJ13107, získaný zavedením plazmidu pCRDAPB obsahujícího dapB získaný v dále popisovaných příkladech do E. coli JM109, je od 26. 5. 1995 uložen u mezinárodně uznané instituce pod depozitním číslem FERM BP-5114 v National Institute of 20 Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

3. Příprava dapA

Fragment DNA obsahující dapA je možno připravit z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Donor DNA nemusí být zvláště vybírán, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Sekvence DNA kódující DDPS je známa pro Corynebacterium qlutamicum (viz Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL No. X53993), a na jejím základě je možno připravit primery pro PCR. Takové DNA primery se jako příklady uvádějí prostřednictvím DNA 235 merú s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No: 12 a 13 ve výpisu sekvencí. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný dapA může být provedena stejným způsobem jako v případě lysC popsaném výše.

Příklad nukleotidové sekvence fragmentu DNA obsahujícího io dapA a z nich odvozené sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 14. Pouze aminokyselinový sekvence je uvedena v SEQ ID No: 15. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto sekvenci aminokyselin může předkládaný vynález ekvivalentně využívat fragmenty DNA kódující v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako je sekvence 15 uvedená v SEQ ID No: 15, totiž sekvence aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že nemají podstatný vliv na aktivitu DDPS.

Transformovaný kmen AJ13106, získaný zavedením plazmidu 20 pCRDAPA, obsahujícího dapA, který byl získán podle dále uvedeného příkladu, do kmene E. coli JM109, byl uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5113 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 25 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.

4. Příprava lysA

Fragment DNA obsahující lysA může být připraven z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Výběr donoru DNA

- 13 • 9 « · · · · · ···· · φ « · ··· ··· «·> ·· ·· ···· ·· ·· není zvláště omezen, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

V koryneformní bakterii tvoří gen lysA operon spolu s arqS (gen pro arginyl-tRNA syntázu), přičemž lysA je po směru translace vzhledem k arqS. Exprese lysA je řízena promotorem, který se vyskytuje proti směru translace vzhledem k arqS (viz Journal of Bacteriology, Nov,, 7356 - 7362 (1993). Sekvence DNA těchto genů jsou známy pro Corynebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy, 4(11), 1819 - 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212. 112 - 119 (1988), a na základě těchto sekvencí je možno připravit primery pro PCR. Takové primery DNA jsou v příkladech specificky uváděny jako DNA 23-merů, které mají nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 16 ve výpisu sekvencí (odpovídající číslům nukleotidů 11 až 33 v nukleotidové sekvenci popsané v Molecular Microbioloqy, 4(11), 1819 - 1830 (1990) a SEQ ID No: 17 (odpovídající číslům nukleotidů 1370 až 1392 v nukleotidové sekvenci popsané v Molecular and Generál Genetics, 212, 112 - 119 (1988). Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný gen lysA může být provedena stejným způsobem jako u výše popsaného IvsC.

Pro zesílení lysA byl v dále uvedených příkladech použit fragment DNA, obsahující promotor, arqS a lysA. Pro předkládaný vynález však arqS není nezbytný. Je možné použít fragmentu DNA ve kterém je lysA ligován právě po směru translace vzhledem k promotoru.

Příklad nukleotidové sekvence fragmentu DNA obsahujícího arqS a lysA a aminokyselinové sekvence odvozené ze sekvence nukleotidů, jsou uvedeny v SEQ ID No: 18. Příklad sekvence aminokyselin kódovaný arqS je uveden v SEQ ID No: 19 a příklad aminokyselinové sekvence kódované lysA ie uveden v SEQ ID No: 20. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tyto aminokyselinové sekvence • ·

mohou být v předkládaném vynálezu ekvivalentně použity fragmenty DNA kódující v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako sekvence aminokyselin uvedená v SEQ ID No: 20, totiž sekvence aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že tyto změny nemají podstatný vliv na aktivitu DDC.

5. Příprava ddh

Fragment DNA obsahující ddh ie možno připravit z chromozomu koryneformní bakterií pomocí PCR. Výběr donoru DNA není zvláště omezen, avšak v příkladech se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Gen DDH je znám pro Corvnebacterium olutamicum (Ishino, S. a další, Nucleíc Acids Res., 15, 3917 (1987) a na jeho základě je možno připravit primery pro PCR. Příklady těchto primerů DNA jsou uvedeny jako DNA 20-merů s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No: 21 a 22 ve výpisu sekvencí. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidů obsahujícího získaný ddh může být provedena stejným způsobem jako pro výše popsaný lysC.

Sekvence nukleotidů fragmentu DNA kódujícího ddh a sekvence aminokyselin odvozená z této nukleotidové sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 23. Pouze aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID No: 24. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto sekvenci aminokyselin může předkládaný vynález ekvivalentně použít fragmenty DNA kódující v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako je sekvence aminokyselin ukázaná v SEQ ID No: 24, totiž sekvenci aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že nemají podstatný vliv na aktivitu DDH.

- 15 ·· ·· · ···· • ··· ·'. ♦ · ···· · ····· · · · ·· · · ···· 9 9 9 9 (2} Rekombinantní DNA a koryneformní bakterie podle předkládaného vynálezu

Koryneformní bakterie podle předkládaného vynálezu nese aspartokinázu (mutantní AK), ve které je v podstatě vyřazena 5 zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, zatímco DNA (dapB), kódující dihydrodipikolinát reduktázu je zesílena. V předkládaném vynálezu je koryneformní bakterií ve výhodném provedení koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (dapA), kódující dihydrodipikolinát syntázu. V ještě výhodnějším io provedení je koryneformní bakterií podle předkládaného vynálezu koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (lysA), kódující diaminopimelát dekarboxylázu. V ještě výhodnějším provedení je koryneformní bakterií podle předkládaného vynálezu koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (ddh), kódující diaminopimelát 15 dehydrogenázu.

Termín „zesílení“ DNA zde označuje skutečnost, že intracelulární aktivita enzymu, kódovaného DNA, je zvýšena například zvýšením počtu kopií v genu, použitím silného promotoru, použitím genu kódujícího enzym s vysokou specifickou aktivitou nebo použitím 20 kombinace těchto prostředků.

Koryneformní bakterií nesoucí mutantní AK může být bakterie, která produkuje mutantní aspartokinázu v důsledku mutace nebo bakterie, které jsou transformovány zavedením mutantního lysC.

Příklady koryneformní bakterie použité pro zavedení výše 25 uvedené DNA například zahrnují následující kmeny produkující lyzin standardního typu.:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;

Corynebacterium acetoqlutamicum ATCC 15806;

Corynebacterium callunae ATCC 15991;

- 16 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;

(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;

(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;

(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;

(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17965;

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;

Brevibacterium roseum ATCC 13825;

Brevibacterium thioqenitalis ATCC 19240;

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).

Kromě výše uvedených bakteriálních kmenů zahrnují kmeny použitelné jako hostitelské například mutantní kmeny se schopností produkovat L-lyzin, odvozené z výše uvedených kmenů. Takové umělé mutantní kmeny zahrnují následující: mutantní kmeny rezistentní k S(2-aminoethyl)-cysteinu (zde zkracované jako „AEC“) (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), japonská zveřejněná přihláška No. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 5810075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 a 7-112438); mutantní kmeny, které jsou rezistentní k AEC a vyžadují aminokyseliny jako je L-leucin, L-homoserin, L-prolin, L-serin, Larginin, L-alanin a L-valin (US patenty No. 3,708,395 a 3,825,472); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou rezistentní na DL-aamino-s-kaprolaktam, α-amino-lauryllaktam, aspartátový analog, sulfoléčiva, chinoid a N-lauroylleucin; mutantní kmeny produkující Llyzin, které jsou rezistentní na inhibitory oxyaloacetát dekarboxylázy nebo enzymů respiračního systému Qaponská zveřejněná patentová

- 17 • ·· · · · · · ·· • · · · · · » · ··· · · ··· ··· ··· • ·· ·· ·· ···· ·· ·· přihláška No. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 a 56-39778 a japonská zveřejněná přihláška No. 53-43591 a 53-1833); mutantní kmeny produkující Llyzin, které vyžadují inozitol nebo kyselinu octovou (japonské zveřejněné patentové přihlášky No. 55-9784 a 56-8692); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou citlivé na fluoropyruvát nebo teploty, které nejsou menší než 34 °C (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 55-9783 a 53-86090); a produkční mutantní kmeny náležející do rodu Brevibacterium nebo Corynebacterium, které jsou rezistentní k ethylenglykolu a produkují L-lyzin (US patent No. 4,411,997).

Ve specifickém provedení se pro zesílení genů biosyntézy Llyzinu u hostitele jak je popsáno výše zavádějí geny do hostitele použitím plazmidového vektoru, transpozonu nebo fágového vektoru apod. Po zavedení se očekává, že dojde k zesílení do určité míry i v případě použití vektoru s nízkým počtem kopií. Je však výhodné použít vektoru s větším počtem kopií. Takové vektory zahrnují například plazmidové vektory pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 a pAJ440 popsané výše. Mimoto se v mezinárodních zveřejněných přihláškách WO 02/02627 a WO 93/18151, evropské zveřejněné přihlášce No. 445385, japonské patentové zveřejněné přihlášce No. 646867, Vertes, A. A. a další, Mol. Microbiol., 11, 739 - 746 (1994, Bonamy, C., a další, Mol. Microbiol., 14, 571 - 581 (1994), Vertes, A. A. a další, Mol. Gen. Genet., 245, 397 - 405 (1994), Jagar, W. a další, FEMS Microbiology Letters, 126, 1 - 6 (1995), japonská zveřejněná patentová přihláška No. 7-107976, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 7-327680 apod. popisují transpozony odvozené z koryneformní bakterie.

V předkládaném vynálezu není nezbytné, aby byl mutantní IvsC nutně zesílen. Je možné použít kmeny, které mají mutaci na lysC nebo chromozomální DNA, nebo ve kterých je mutantní lysC včleněn do

- 18• · · · · · · ·· ··«· ·· · to.

chromozomální DNA. Alternativně může být mutantní lysC zaveden použitím plazmidového vektoru. Na druhé straně pro produkci L-lyzinu s vysokou účinností je výhodné zesílení dapA, dapB. lysA a ddh.

Každý z genů lysC, dapA. dapB, lysA a ddh může být do hostitele úspěšně zaveden s použitím různých vektorů. Alternativně mohou být dva, tři, čtyři nebo pět z těchto genů zavedeny společně použitím jediného vektoru. Jestliže se použije různých vektorů, geny mohou být~zaváděny v jakémkoliv pořadí, je však výhodné použít vektory, které jsou v hostiteli stabilní a které jsou schopny vzájemné koexistence.

Koryneformní bakterie nesoucí mutantní AK a dále obsahující zesílený dapB se například získává zavedením rekombinantní DNA obsahující mutantní lysC a dapB, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený dapA navíc k mutantnímu lysC a dapB se například získá zavedením rekombinantní DNA obsahující mutantní lysC, dapB a dapA, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený lysA navíc k mutantnímu lysC, dapB a dapA se například získá zavedením rekombinanční DNA, obsahující mutantní lysC, dapB, dapA a lysA, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený ddh navíc k mutantnímu lysC, dapB, dapA a lysA se například získá zavedením rekombinanční DNA, obsahující mutantní lysC, dapB, dapA, lysA a ddh, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.

- 19 « «« ·· *· ·· ·· ,, · · ···· ···· ,,···· ·· ··» · · * · · ··· ··· ··· ·· ·· ···· ·· ··

Výše uvedené rekombinantní DNA mohou být získány například vložením každého z genů, který se účastní biosyntézy L-lyzinu, do vektoru jako je plazmidový vektor, transpozon nebo fágový vektor, jak bylo popsáno výše.

V případě, že se jako vektoru použije plazmidu, rekombinantní DNA může být do hostitele zavedena pomocí elektropulzní metody (Sugimoto a další, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 2207791). Zesílení genu s použitím transpozonu je možno provést zavedením plazmidu, nesoucího transpozon, do hostitelské buňky a indukcí transpozice transpozonu.

(3) Způsob výroby L-lyzinu

L-lyzin může být účinně vyráběn kultivací koryneformní bakterie, obsahující zesílené geny biosyntézy L-lyzinu jak bylo popsáno výše ve vhodném médiu, produkcí a akumulací L-lyzinu v kultuře bakterií a izolací L-lyzinu z kultury.

Příkladem použitelného média je obvyklé médium obsahující zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické ionty a popřípadě další organické složky.

Jako zdroj uhlíku je možné použít cukry jako je glukóza, fruktóza, sacharóza, melasa a hydrolyzovaný škrob; a organické kyseliny jako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantarová.

Jako zdroj dusíku je možné použít anorganické amonné soli jako je síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný; a organické zdroje dusíku jako sojový hydrolyzát; dále plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.

- 20 • ··

9« 99 99 99 • · 9 · 9 9 · 9 ·

9 9 9 9 99

9999 99 99V 9 9

9 9 9 9 9 ·

9999 99 99

Jako zdroje stopových živin je vhodné použít látek, které obsahují například vitamin Bi a L-homoserin nebo kvasničný extrakt apod. ve vhodném množství. Pokud je nutné, mohou být z jiných stopových látek v malých množstvích použity fosforečnan draselný, síran hořečnatý, iont železa, manganu apod.

Kultivace se s výhodou provádí za aerobních podmínek po dobu přibližně 30 až 90 hod. Kultivační teplota se v průběhu kultivace s výhodou řídí při 25 až 37 °C a pH při 5 až 8. Pro nastavení pH je možno použít organických, kyselých nebo alkalických látek nebo plynného amoniaku apod. L-lyzin je možno z kultury izolovat kombinací běžného způsobu založeného na iontoměničové pryskyřici, srážecí metody a jiných známých způsobů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ilustruje způsob konstrukce plazmidů p399AKYB a p399AK9B, obsahujících mutantní lysC.

Obr. 2 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pDPRB, obsahující dapB a Brevi.-ori.

Obr. 3 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pDPSB, obsahující dapA a Brevi.-ori.

Obr. 4 ilustruje způsob konstrukce plazmidů p299LYSA, obsahující lysA.

Obr. 5 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pLYSAB, obsahující lysA a Brevi.-ori.

Obr. 6 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pPK4D, obsahující ddh a Brevi.-ori.

Obr. 7 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pCRCAB, obsahující lysC, dapB a Brevi.-ori.

• ·

-21 Obr. 8 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCB, obsahující mutantní lysC, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 9 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pAB, obsahující dapA, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 10 ilustruje způsob konstrukce plazmidu p399DL, obsahující ddh, a lysA.

Obr. 11 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pDL, obsahující ddh, lysA a Brevi.-ori.

Obr. 12 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCAB, obsahující io mutantní lysC, dapA, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 13 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCABL, obsahující lysC, dapA, dapB, lysA a Brevi.-ori.

Obr. 14 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCABDL, obsahující lysC, dapA, dapB, ddh, lysA a Brevi.-ori.

Předkládaný vynález bude podrobněji vysvětlen níže na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava genu lysC standardního typu a mutantního genu lysC z bakterie Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava genů lysC standardního a mutantního typu a příprava plazmidů, které je obsahují

Kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a L-lyzin produkující mutantní kmen AJ3445 (FERM P-1944), získaný z kmene ATCC 13869 mutací byly použity jako dárci chromozomální DNA.

-22• · · · · ·· • · · · ···· · • · · · · · ·· 9 9·· ·· · *

Mutace kmene AJ3445 byla provedena tak, aby byl gen lysC změněn pro dosažení v podstatě úplného vyřazení spřažené inhibice lyzinem a threoninem (Journal of Biochemistrv, 68, 701 - 710 (1970).

Pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce; viz White, T. J. a další, Trends Genet,, 5, 185 (1989) byl z chromozomální DNA amplifikován fragment DNA obsahující lysC. Jako primery byly pro amplifikaci syntetizovány jednořetězcový 23-mer a 21-mer DNA s nukleotidovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No: 1 a 2, aby došlo k amplifikaci oblasti o velikosti přibližně 1644 BP kódující lysC, založený na sekvenci známé pro Corvnebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy (1991), 5(5), 1197 - 1204; a Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317 - 324). DNA byla syntetizována obvyklým způsobem s použitím DNA syntezátoru model 380B firmy Applied Biosystems použitím fosfoamiditové metody (viz Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).

Gen byl amplifikován pomocí PCR použitím přístroje DNA Thermal Cycler Model PJ2000 firmy Takara Shuzo a Taq DNA polymerázy v souladu s doporučením dodavatele. Vznik zesíleného genového fragmentu o velikosti 1643 kb byl potvrzen elektroforézou na agarózovém gelu. Potom byl obvyklým způsobem fragment vyříznutý z gelu vyčištěn a štěpen restrikčními enzymy Nrul (firmy Takara Shuzo) a EcoRI (firmy Takara Shuzo).

Jako klonovacího vektoru pro genový fragment bylo použito plazmidu pHSG399 (viz Takeshita, S. a další, Gene (1987), 61, 63 64). pHSG399 byl štěpen restrikčními enzymy Smál (firmy Takara Shuzo) a EcoRI a byl ligován s amplifikovaným fragmentem lysC. DNA byla ligována s použitím ligačního kitu DNA (firma Takara Shuzo) podle doporučené metody. Byly tedy připraveny plazmidy, ve kterých byly fragmenty lysC, amplifikované z chromozomů Brevibacterium lactofermentum ligovány s pHSG399. Plazmid obsahující gen lysC z ATCC 13869 (kmen standardního typu) byl označen jako p399AKY • · a plazmid obsahující lysC z AJ3463 (bakterie produkující L-lyzin) byl označen jako p399AK9.

Fragment DNA (zde označovaný jako „Brevi.-ori“) se schopností vytvářet plazmid autonomně se replikující v bakterii rodu 5 Corynebacterium byl zaveden do p399AKY a p399AK9 s cílem připravit plazmidy nesoucí lysC, které se autonomně replikují v bakterii rodu Corynebacterium. Brevi.-ori byl připraven z plazmidového vektoru pHK4 obsahujícího Brevi.-ori a autonomně se replikujícího v buňkách jak Escherichia coli tak i v bakteriích rodu 10 Corynebacterium. pHK4 byl zkonstruován štěpením pHC4 Kpnl (firmy Takara Shuzo) a BamHI (firmy Takara Shuzo), extrakcí fragmentu Brevi.-ori a jeho ligací s pHSG298, který byl rovněž štěpen Kpnl a BamHI (viz japonská zveřejněná přihláška No. 5-7491). pHK4 hostiteli poskytuje rezistenci na kanamycin. Escherichia coli nesoucí pHK4 15 byla označena jako Escherichia coli AJ13136 a uložena 1. 8. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5186 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

2o pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI a štěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno s použitím soupravy DNA Blunting kit (firmy Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření rovných konců byl ligován fosforylovaný BamHI linker (firmy Takara Shuzo) pro dosažení takové 25 úpravy, že DNA fragment odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen z pHK4 štěpením samotným BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený DNA fragment Brevi.-ori byl ligován s p399AKY a p399AK9, které byly rovněž štěpeny BamHI za vytvoření plazmidů, které vždy obsahovaly gen lysC autonomně se replikující 3o v bakterii rodu Corynebacterium.

• · *«♦·········· • · · ··· ··· ··· ·· ·· ♦··· ·♦ ··

- 24 Plazmid obsahující gen IvsC standardního typu pocházející z p399AKY byl označen jako p399AKYB a plazmid obsahující mutantní gen IvsC pocházející z p399AK9 byl označen jako p399AK9B. Způsob konstrukce p399AK9B a p399AKYB je ukázán na obr. 1. Kmen 5 AJ12691 získaný zavedením mutantního plazmidu IvsC p399AK9B do kmene Brevibacterium lactofermentum standardního typu (kmen AJ12036, FERM BP-374) byl uložen 10. 4. 1993 pod depozitním číslem FERM P-12918 u National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of io Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) a převeden na mezinárodní uložení podle Budapešťské dohody 10. 2. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-4999.

(2) Stanovení nukleotidových sekvencí IvsC standardního typu a mutantního typu z Brevibacterium lactofermentum

Plazmid p399AKY obsahující IvsC standardního typu a plazmid p399AK9 obsahující mutantní IvsC byly připraveny z příslušných transformantů s cílem určit nukleotidové sekvence mutantního 2o a standardního IvsC. Stanovení nukleotidové sekvence bylo provedeno Sangerovou metodou (například F. Sanger a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 5463 (1977).

Nukleotidové sekvence lysC standardního typu kódovaného p399AKY je ukázána v SEQ ID No: 3 ve výpisu sekvencí.

Nukleotidové sekvence mutantního IvsC kódovaného p399AK9 měla jedinou mutaci na jednom nukleotidu, kde G v poloze 1051 byl změněn v SEQ ID No: 3 na A ve srovnání s IvsC standardního typu. Je známo, že lysC Corynebacterium qlutamicum má dvě podjednotky (α, β), kódované v identickém čtecím rámci na identickém řetězci DNA (viz 3o Kalinowski, J. a další, Molecular Microbioloqy (1991) 5(5), 1197 1204). Pokud se usuzuje z homologie, předpokládá se, že zde • · sekvenovaný gen má také dvě podjednotky (a, b) kódované ve stejném čtecím rámci na identickém řetězci DNA.

Sekvence aminokyselin podjednotky a proteinu AK standardního typu, odvozená se sekvence nukleotidů DNA, je ukázána v SEQ ID No: 4 spolu se sekvencí DNA. Pouze sekvence aminokyselin je uvedena v SEQ ID No: 5. Sekvence aminokyselin β-podjednotky proteinu AK standardního typu, odvozená z nukleotidové sekvence dna, je uvedena v SEQ ID No: 6 spolu s DNA. Pouze aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID No: 7. V každé z podjednotek se jako iniciační kodon používá GTG a odpovídající aminokyselina je methionin. Toto přiřazení však označuje methionin, valin nebo formylmethionin.

Na druhé straně mutace sekvence mutantního genu lysC výskytem substituce aminokyselinového zbytku spočívá v tom, že zbytek alaninu v poloze 279 α-podjednotky je zaměněn za zbytek threoninu a zbytek alaninu v poloze 30 β-podjednotky je zaměněn za zbytek threoninu v sekvenci aminokyselin standardního typu proteinu AK (SEQ ID No: 5 a 7).

Příklad 2: Příprava dapB z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava dapB a konstrukce plazmidu obsahujícího dapB

Jako donor chromozomální DNA byl použit kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 standardního typu. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 standardní metodou. Fragment DNA obsahující dapB byl amplifikován z chromozomální DNA metodou PCR. Pro amplifikaci byly použity DNA primery založené na 23-merech DNA s nukleotidovými sekvencemi uvedenými ve výpisu sekvencí jako SEQ ID No: 8 a 9, které byly syntetizovány pro zesílení oblasti o velikosti přibližně 2,0 kb, kódující DDPR podle sekvence známé pro

- 26 Brevibacterium lactofermentum (viz Journal of Bacteriology, 157(9), 2743 - 2749 (1993). Syntéza DNA a PCR byly prováděny stejným způsobem jak se popisuje v příkladu 1, Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 2001 bp, který byl ligován 5 s amplifikovaným fragmentem dapB, byl použit plazmid pCR-Script (firma Invitrogen).

Byl tedy zkonstruován plazmid, ve kterém byl fragment dapB o velikosti 2001 bp, amplifikovaný z chromozomu Brevibacterium lactofermentum. ligován s plazmidem pCR-Script. Plazmid získaný io výše popsaným způsobem, jehož dapB ppchází z ATCC13869, byl označen jako pCRDAPB. Transformantní kmen AJ13107, získaný zavedením pCRDAPB do E. coli JM109 byl mezinárodně uložen

26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5114 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science 15 and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.

Štěpením pCRDAPB enzymem EcoRV a Sphl byl extrahován fragment o velikosti 1101 bp obsahující strukturní gen DDPR. Tento 2o fragment byl ligován s pHSG399, který byl štěpen Hincll a Sphl pro přípravu plazmidu. Připravený plazmid byl označen jako p399DPR.

Do připraveného p399DPR byl zaveden Brevi.-ori za vytvoření plazmidu nesoucího dapB, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčním enzymem Kpnl (firma Takara 25 Shuzo) a štěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo vytvořeno použitím sady DNA Blunting Kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření tupého konce byl ligován fosforylovaný linker BamHI (firmy Takara Shuzo) pro vytvoření takové modifikace, aby fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori mohl být z 30 pHK4 vyříznut pouze enzymem BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399DPR, • · · ·

který byl také štěpen BamHI za vytvoření plazmidu, obsahujícího dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Připravený plazmid byl označen jako pDPRB. Postup konstrukce pDPRB je ukázán na obr. 2.

(2) Stanovení nukleotidové sekvence dapB z Brevibacterium lactofermentum

Plazmidová DNA byla připravena z kmene AH13107 nesoucího p399DPR a nukleotidová sekvence byla určena stejným způsobem, jak io bylo popsáno v příkladu 1. Zjištěná nukleotidová sekvence a z ní odvozená aminokyselinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 10. Samotná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 11.

Příklad 3: Příprava dapA z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava dapA a konstrukce plazmidu obsahujícího dapA

Jako donoru chromozomální DNA bylo použito kmene

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 obvyklou metodou. Fragment 20 DNA obsahující gen dapA byl pomocí PCR amplifikován z chromozomální DNA. Jako primery DNA použité pro amplifikaci byly syntetizovány 20-mery DNA s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No: 12 a 13 ve výpisu sekvencí, aby bylo dosaženo amplifikace oblasti o velikosti přibližně 1,5 kb kódující DDPS, 25 založené na sekvenci známé pro Corynebacterium qlutamicum (viz

Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL No. X53993).

Syntéza DNA a PCR byly provedeny stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 1411 bp, který byl ligován s amplifikovaným fragmentem dapA, byl použit pCR1000 (firma Invitrogen, viz • · • · · · ; ·· · · · · · ·· • φ φ « · I · ♦ · ···· · ··· · · · ·♦· - 28 - ....... ···· ·* “

Bio/Technology, 9, 657 - 663 (1991). Ligace DNA byla provedena s použitím sady DNA ligation kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Byl tedy zkonstruován plazmid, ve kterém byl fragment dapA o velikosti 1411 bp amplifikovaný z chromozomu Brevibacterium lactofermentum ligován s pCR1000. Plazmid získaný uvedeným postupem, který obsahoval gen dapA pocházející z ATCC 13869, byl označen jako pCRDAPA.

Transformovaný kmen AJ13106, získaný zavedením pCRDAPA do E. coli JM109 byl podle mezinárodních předpisů uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5113 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.

Do připraveného pCRDAPA byl vložen Brevi.-ori pro vytvoření plazmidu, nesoucího dapA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Smál (firma Takara Shuzo) pro vytvoření modifikace, aby mohl být fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori vyříznut z pHK4 štěpením pouze Smál. Tento plazmid byl štěpen Smál a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s pCRDAPA, který byl rovněž štěpen Smál, za vytvoření plazmidu obsahujícího dapA. autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Tento plazmid byl označen jako pDPSB. Způsob konstrukce pDPSB(Km^r) je ukázán na obr. 3.

• · · · · • · · ♦ · · • · ·

9Λ·9 ·♦ ··

- 29 (2} Stanovení nukleotidové sekvence dapA z Brevibacterium lactofermentum

Byla připravena plazmidová DNA z kmene AJ13106, nesoucího pCRDAPA a stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1 byla určena její nukleotidová sekvence. Zjištěná nukleotidová sekvence a z ní odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 14. Samotná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 15.

Příklad 4: Příprava lysA z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava lysA a konstrukce plazmidu obsahujícího lysA

Jako dárce chromozomální DNA byl použit kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 standardního typu. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 obvyklým způsobem. Potom byl pomocí PCR z chromozomální DNA amplifikován fragment DNA, obsahující arqS, lysA a promotor operonu, který je obsahuje. Jako DNA primery použité pro amplifikaci byly syntetizovány 23-mery DNA s nukleotidovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID No: 16 a 17 ve výpisu sekvencí, aby bylo dosaženo amplifikace oblasti o velikosti přibližně

3,6 kb kódující arginyl-tRNA syntézu a DDC, založené na sekvenci známé pro Corynebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy, 4(11), 1819 - 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212, 112 - 119 (1988). Syntéza DNA a PCR byly provedeny stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 3579 bp byl použit pHSG399. pHSG399 byl štěpen restrikčním enzymem Smál (firma Takara Shuzo), a byl ligován s fragmentem DNA obsahujícím amplifikovaný lysA. Plazmid získaný postupem, který byl popsán výše, který obsahoval lysA pocházející z ATCC 13869, byl označen jako p399LYSA.

• ·

Fragment DNA obsahující lysA byl extrahován štěpením p399LYSA Koni (firma Takara Shuzo) a BamHI (firma Takara Shuzo). Tento fragment DNA byl ligován s pHSG, který byl rovněž štěpen Kpnl a BamHI. Získaný plazmid byl označen jako p299LYSA. Způsob konstrukce p299LYSA je ukázán na obr. 4.

Do získaného p299LYSA byl zaveden Brevi.-ori pro vytvoření plazmidu, nesoucího lysA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Kpnl (firma Takara Shuzo) pro získání takové modifikace, aby mohl být fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori vyříznut z pHK4 štěpením samotným Kpnl. Tento plazmid byl štěpen Kpnl a získaný fragment Brevi.-ori DNA byl ligován s p299LYSA, který byl rovněž štěpen Kpnl, za vytvoření plazmidu obsahujícího lysA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Připravený plazmid byl označen jako pLYSAB. Způsob konstrukce pLYSAB je uveden v obr. 5.

(2) Stanovení nukleotidové sekvence lysA z Brevibacterium lactofermentum

Byla připravena plazmidová DNA p299LYSA a stejným způsobem jako v příkladu 1 byla určena její nukleotidové sekvence. Zjištěná nukleotidové sekvence a z ní odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 18. Co se týče nukleotidové sekvence, sekvence aminokyselin kódovaná arqS a sekvence aminokyselin kódovaná lysA jsou uvedeny v SEQ ID No: 19 a 20.

• · · · · • · · · • · · · · • » · ·

- 31 - .......

Příklad 5: Příprava ddh z Brevibacterium lactofermentum

Gen ddh byl získán amplifikací ddh genu z chromozomální DNA bakterie Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 metodou PCR použitím dvou oligonukleotidových primerů (SEQ ID No: 21 a 22), připravených podle známé nukleotidové sekvence genu ddh Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987). Získaný amplifikovaný fragment DNA byl štěpen EcoT22l a -Aval a rozštěpené konce byly zarovnány. Potom byl fragment vložen do místa Smál plazmidu pMW119 za získání plazmidu pDDH.

Potom byl pDDH štěpen Sall a EcoRI, a vytvořené konce byly zarovnány. Získaný fragment byl pak ligován s pUC18, štěpeným enzymem Smál. Takto získaný plazmid byl označen jako pUC18DDH.

Do pUC18DDH byl zaveden Brevi.-ori za vytvoření plazmidu nesoucího ddh, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaného konce byl ligován fosforylovaný linker Pstl (firma Takara Shuzo) tak, že byl vložen do místa Pstl pHSG299. Takto zkonstruovaný plazmid byl označen jako pPK4. Potom byl pUC18DDH štěpen Xbal a Kpnl a vytvořený fragment byl ligován s pPK4, který byl štěpen rovněž Kpnl a Xbal. Takto byl získán plazmid obsahující gen ddh, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Tento plazmid byl označen jako pPK4D. Způsob konstrukce pPK4D je uveden na obr. 6.

• ·

·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ·· • · · · · ··· · • · · · · • β ♦··· · ♦ ··

Příklad 6: Konstrukce plazmidů obsahující kombinaci mutantního IvsC a dapA

Plazmid obsahující mutantní IvsC, dapA a počátek replikace koryneformní bakterie byl zkonstruován z plazmidů pCRDAPA, obsahujícího dapA a plazmidů p399AK9B, obsahujícího mutantní IvsC a Brevi.-ori. p399AK9B byl úplně degradován Sall a potom byly vytvořeny zarovnané konce, ke kterým byl ligován linker EcoRI pro vytvoření ptazmidu, ve kterém bylo místo Sall modifikováno na štěpící místo EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako p399AK9BSE. Mutantní lysC a Brevi.-ori byly vyříznuty jako jeden fragment částečným štěpením p399AK9BSE enzymem EcoRI. Tento fragment byl ligován s pCRDAPA, štěpeným rovněž EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako pCRCAB. Tento plazmid je schopný autonomní replikace v E, coli a koryneformní bakterie a poskytuje hostiteli kanamycinovou rezistenci, přičemž obsahuje kombinaci mutantního IvsC a dapA. Způsob vytvoření pCRCAB je uveden v obr. 7.

Příklad 7: Konstrukce plazmidů obsahujícího mutantní IvsC a dapB

Plazmid obsahující mutantní IvsC a dapB byl zkonstruován z plazmidů p399AK9 s mutantním lysC a plazmidů p399DPR s dapB. Fragment o velikosti 1101 bp nesoucí strukturní gen DDPR byl extrahován štěpením p399DPR EcoRV a Sphl. Tento fragment byl ligován s p399AK9, který byl štěpen Sall a rozštěpené konce byly potom zarovnány a dále byl štěpen Sphl pro vytvoření plazmidů, obsahujícího kombinaci mutantního IvsC a dapB. Tento plazmid byl označen jako p399AKDDPR.

Do získaného p399AKDDPR byl zaveden Brevi.-ori. Plazmid pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem Kpnl (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím soupravy DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření

zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker BamHI (firma Takara Shuzo) pro vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyříznut z pHK4 štěpením samotnou BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený 5 fragment Brevi.-ori DNA byl ligován s p399AKDDPR, který byl rovněž štěpen BamHI, za vytvoření plazmidu obsahujícího mutantní lysC a dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCB. Způsob konstrukce pCB ukazuje obr. 8.

Příklad 8: Konstrukce plazmidu, obsahujícího kombinaci dapA a dapB

Plazmid pCRDAPA obsahující dapA byl štěpen Kpnl a EcoRI pro vyříznutí fragmentu DNA obsahujícího dapA, který byl ligován s vektorovým plazmidem pHSG399, který byl předtím rovněž rozštěpen Kpnl a EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako p399DPS.

Na druhé straně byl plazmid pCRDAPB, obsahující dapB, štěpen

Sacll a EcoRI pro vyštěpení fragmentu DNA o velikosti 2,0 kb, obsahující oblast kódující DDPR, která byla ligována s p399DPS, který byl předtím také štěpen Sacll a EcoRI pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci dapA a dapB. Získaný plazmid byl označen jako p399AB.

Potom byl do p399AB zaveden Brevi.-ori. pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno použitím soupravy DNA Blunting kit (firma 25 Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaného konce byl ligován fosforylovaný linker Kpnl (firma Takara Shuzo) za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen z pHK4 štěpením pouze Kpnl. Tento plazmid byl štěpen Kpnl a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl 30 ligován s p399AB, který byl předtím rovněž rozštěpen enzymem Koni, za vytvoření plazmidu obsahujícího dapA a dapB, autonomně se • ·

replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pAB. Způsob konstrukce pAB ukazuje obr. 9.

Příklad 9: Konstrukce plazmidu obsahujícího kombinaci ddh a lysA

Plazmid pUC18DDH obsahující ddh byl štěpen EcoRI a Xbal pro vyštěpení fragmentu DNA obsahujícího ddh. Tento fragment ddh byl ligován s plazmidem p399LYSA obsahujícím lysA, předem štěpeným BamHI a Xbal, přičemž po štěpení byly vzniklé konce zarovnány. Získaný plazmid byl označen jako p399DL. Způsob io konstrukce p399DL je uveden v obr. 10.

Potom byl do p399DL zaveden Brevi.-ori. pHK4 byl štěpen Xbal a BamHI a štěpené konce byly zarovnány. Po vytvoření rovných konců byl ligován fosforylovaný linker Xbal za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen z 15 pHK4 štěpením samotným Xbal. Tento plazmid byl štěpen Xbal a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399DL, který byl předtím rovněž štěpen Xbal za vytvoření plazmidu, obsahujícího ddh a lysA, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pDL. Postup konstrukce pDL je ukázán na 2o obr. 11.

Příklad 10: Konstrukce plazmidu obsahujícího mutantní IvsC, dapA a dapB p399DPS byl štěpen EcoRI a Sphl za vytvoření zarovnaných 25 konců a poté bylo provedeno vyštěpení genu dapA. Tento fragment byl ligován s p399AK9, který byl štěpen Sall a vytvořené konce byly zarovnány, za vytvoření plazmidu p399CA, ve kterém koexistují mutantní IvsC a dapA.

Plazmid pCRDAPB obsahující dapB byl štěpen EcoRI a konce 3o byly zarovnány a potom následovalo štěpení Sací pro získání

• · fragmentu DNA o velikosti 2,0 kb, obsahujícího dapB. Plazmid p399CA obsahující dapA a mutantní lysC byl štěpen Spěl a byly vytvořeny zarovnané konce, a získaný produkt byl štěpen Sací a ligován s vyštěpeným fragmentem dapB za získání plazmidu obsahujícího 5 mutantní lysC, dapA a dapB. Tento plazmid byl označen jako P399CAB.

Potom byl do p399CAB zaveden Brevi.-ori. Plazmid pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření 10 zarovnaných konců bylo provedeno soupravou DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Kpnl (firma Takara Shuzo) za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyříznut z pHK4 štěpením samotným Kpnl. Tento 15 plazmid byl štěpen Kpnl a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399CAB, který byl rovněž štěpen Kpnl za vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA a dapB, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen pCAB. Způsob konstrukce pCAB je ukázán na 2o obr. 12.

Příklad 11: Konstrukce plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB a lysA

Plazmid p299LYSA obsahující lysA byl štěpen Kpnl a BamHI a byly zarovnány rozštěpené konce a potom byl vyštěpen fragment genu lysA. Tento fragment byl ligován s pCAB, štěpeným Hpal (produkt Takara Shuzo) a byly zarovnány jeho konce pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA. dapB a lysA. autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený x plazmid byl označen jako pCABL. Způsob vytvoření pCABL je uveden v obr. 13. Je nutno uvést, že gen lysA je vložen do místa Hpal ve

- 36 fragmentu DNA obsahujícím dapB v pCABL, avšak místo Hpal je umístěno proti směru translace vůči promotoru pro gen dapB (polohy nukleotidů 611 až 616 v SEQ ID No: 10).

Příklad 12: Vytvoření plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB, ddh a lysA pHSG299 byl štěpen Xbal a Kpnl a byl ligován s p399DL, obsahujícím ddh a lysA, který byl rovněž štěpen Xbal a Kpnl. Vytvořený plazmid byl označen p299DL. p299DL byl štěpen Xbal a Kpnl a rozštěpené konce byly zarovnány. Po vytvoření zarovnaných konců byl vyříznut fragment DNA obsahující ddh a lysA. Tento fragment DNA byl ligován s plazmidem pCAB, obsahujícím kombinaci mutantního lysC, dapA a dapB, který byl také štěpen Hpal a jeho konce byly zarovnány, za vytvoření plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB, lysA a ddh, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCABDL. Způsob konstrukce pCABDL je uveden v obr. 14.

Příklad 13: Zavedení plazmidú obsahujících geny pro biosyntézu Llyzinu do bakterie produkující L-Ivzin Brevibacterium lactofermentum

Plazmidy obsahující geny pro biosyntézu L-lyzinu vytvořené podle výše uvedeného popisu, totiž p399AK9B(Cm^r), pDPSB(Km^r), pDPRB(Cm^r), pLYSAB(Cm^r), pPK4D(Cm^r), pCRCAB(Km^r), pAB(Cm^r), pCB(Cm^r), pDL(Cm^r), pCAB(Cm^r), pCABL(Cm^r), pCABDL(Cm^r) byly zavedeny do bakterie produkující L-lyzin AJ11082 (NRRL B-11470) Brevibacterium lactofermentum. Kmen AJ11082 se vyznačuje rezistencí na AEC. Plazmidy byly zaváděny elektropulzní metodou (Sugimoto a další, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 2207791). Byly zvoleny transformanty s příslušnou rezistencí na markéry, dodanou jednotlivými plazmidy. Selekce transformantů ·· ·· ·· • · · · « • · · · · • · ··· · • · · ’ ··· ·· ··

- 37 probíhala na úplném médiu obsahujícím 5 pg/ml chloramfenikolu pokud byl prováděn výběr bakterií obsahujících plazmid s rezistencí na chloramfenikol nebo byla selekce prováděna na úplném médiu obsahujícím 25pg/ml kanamycinu, jestliže byl v bakterii přítomen plazmid obsahující gen na rezistenci vůči kanamycinu.

Příklad 14: Produkce L-lyzinu

Každý z transformantú získaných v příkladu 13 byl kultivován v produkčním médiu pro L-lyzin pro zhodnocení schopnosti produkovat L-lyzin. Složení produkčního média pro L-lyzin bylo následující:

Produkční médium pro L-lyzin

Složky podle následujícího seznamu kromě uhličitanu vápenatého byly rozpuštěny a pH bylo hydroxidem draselným upraveno na 8,0 (všechny údaje se vztahují na 1 I). Médium bylo sterilizováno 15 min při 115 °C a potom byl přidán uhličitan vápenatý (50 g), který byl odděleně sterilizován v suchém stavu horkým vzduchem.

Glukóza	100 g
(NH4)2SO4	55 g
kh2po4	1 g
MgSO4.7H2O	1 g
Biotin	500 pg
Thiamin	2000 pg
FeSO4.7H2O	0,01 g
MnSO4.7H2O	0,01 g
Nikotinamid	5 mg

·· ·· **. ··.

···· ···· ; ; . · · ··

........ :

- 38 Proteinový hydrolyzát (Mámenou) 30 ml

Uhličitan vápenatý 50 g

Každý z různých typů transformantů a rodičovský kmen byl zaočkován do média s výše uvedeným složením a na třepačce byla 5 provedena kultivace při 31,5 °C. Množství vyprodukovaného lyzinu po 40 nebo 72 hodinách kultivace a růst po 72 hodinách (OD₅₆2) jsou uvedeny v tabulce 1. V tabulce IvsC* představuje mutantní IvsC. Růst byl kvantitativně určován měřením OD při 560 nm po 101 násobném zředění.

Tabulka 1

Akumulace L-lyzinu po kultivaci 40 nebo 72 hod

Bakteriální kmen/plazmid	Zavedený qen	Vytvořený L- lyzin (g/i)	Růst (OD562/101)
		po 40 hod	po 72 hod
AJ11082		22,0	29,8	0,450
AJ11082/ p399AK9B	IvsC*	16,8	34,5	0,398
AJ11082/ pDPSB	dapA	18,7	33,8	0,410
AJ11082/ pDPRB	dapB	19,9	29,9	0,445
AJ11082/ pLYSAB	lysA	19,8	32,5	0,356
AJ11082/ pPK4D	ddh	19,0	33,4	0,330
AJ11082/ pCRCAB	IvsC*, dapA	19,7	36,5	0,360
AJ11082/ pAB	dapA,dapB	19,0	34,8	0,390
AJ11082/pCB	IvsC*, dapB	23,3	35,0	0,440
AJ11082/pDL	ddh, IvsA	23,3	31,6	0,440
AJ11082/ pCAB	IvsC*, dapA, dapB	23,0	45,0	0,425

• · · « · · ··· <· *· ····

AJ11082/ pCABL	IvsC*, dapA, dapB, lysA	26,2	46,5	0,379
AJ11082/ pCABDL	IvsC*, dapA,	26,5	47,0	0,409
	dapB, lysA, ddh

Jak je uvedeno v tabulce 1, pokud se samostatně zesílí mutantní lysC, dapA, nebo dapB, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo větší nebo rovno množství vyprodukovanému rodičovským genem po 72 hodinách 5 kultivace, avšak množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo menší, než bylo vytvořeno rodičovským kmenem po 40 hod kultivace. Při krátkodobé kultivaci byla totiž rychlost produkce L-lyzinu snížena. Podobně když byly společně zesíleny mutantní lysC a dapA nebo dapA a dapB, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo po 72 hod io kultivace větší než u rodičovského kmene, avšak po 40 hodinách kultivace bylo množství vytvořeného L-lyzinu menší než u rodičovského kmene. Rychlost produkce L-lyzinu byla tedy snížena.

Na druhé straně, pokud byly lysA nebo ddh zesíleny samostatně, nebo při kombinaci zesílení lysA a ddh, množství 15 vyprodukovaného L-lyzinu bylo po 40 hod kultivace větší než množství vytvořené rodičovským kmenem, avšak množství vytvořeného lyzinu bylo menší než množství vyprodukované rodičovským genem v případě dlouhodobé kultivace, protože došlo ke snížení růstu.

Naopak v případě, když byl dapB zesílen spolu s mutantním 2o lysC, došlo ke zlepšení růstu, rychlost produkce L-lyzinu byla při krátkodobé kultivaci úspěšně zachována a množství nahromaděného L-lyzinu bylo rovněž zvýšeno v případě dlouhodobé kultivace. V případě kmenu, u kterého byly současně zesíleny geny mutantní lysC, dapA a dapB, došlo k dalšímu zlepšení produkce. Jak rychlost 25 produkce L-lyzinu, tak i množství nahromaděného L-lyzinu se postupně zvyšovalo postupným zesilováním lysA a ddh.

• · · · · · · : · ·· • · · · · · ··· · · ·· · · · · · ·

-40 Průmyslová využitelnost

Podle předkládaného vynálezu je možno zvýšit produkční schopnost L-lyzinu koryneformní bakterie a její růstovou rychlost.

Rychlost produkce L-lyzinu a produktivita může být u koryneformní bakterie produkující L-lyzin rovněž zvýšena zesílením dapB spolu s mutantním lysC. Rychlost produkce L-lyzinu a produktivita může být dále zvýšena postupným zvýšením dapA, lysA a ddh navíc k uvedeným genům.

« ·

-41 VÝPIS SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: Ajinomoto Co., lne.

(ii) Název vynálezu: Způsob výroby L-lysinu (iii) Počet sekvencí: 24 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Jméno:

(B) Ulice:

(C) Město:

(E) Země:

(F) PSČ:

(v) Počítačová forma:

(A) Typ media: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, verze # 1.30 (vi) Údaje o předkládané přihlášce (A) Číslo přihlášky (B) Datum podání:

(C) Zařazení do třídění:

(vii) Údaje o předchozí přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: JP 7-140614 (B) Datum podání: 7. července 1995 (viii) Informace o zástupci (A) Jméno:

(B) Registrační číslo:

(ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon (B) Telefax:

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:1:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná .. syntetická DNA (A) POPIS: /desc = synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:2:

ACGGAA1TCA ATCTTACGGC C (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1643 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

• · • · · · · · · · ···· · • · · ··· ··· ··· ·· ·♦ ·♦·· ·· ·· (A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CITTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGCTGG CCCTGGTCGT ACAGftAATAT240

GGCGGTTCCT CGCCTGftGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300

ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360

GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420

CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480

GGCGCAGAAG CTCAATCTIT CACTGGCTCT CAGGCTGCTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540

GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTCTGC CTGAAGCACT CGATGAGGGC600

AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GITAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660

ITGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720

GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780

AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC840

TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900

GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960

CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGCTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC1020

GTTCTGGCTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG ITITCCGTGC GTTGGCTGAT1080

GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC1140

GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG1200

CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC1260

CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG1320

CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG1380

ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAG1T CCAGCTGGGC1440

GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT1500

TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA1560

CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTITGCT TCCCCGCGTT1620

CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC1643 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1643 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) • · • ·· · · · · · ·· ···»········· • · · ··· · · · ··· ·· ·· ···· ·♦ ·· (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 s (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 217..1482 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATAŤCA ATATACGGTC60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGITGAGCGG180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG234

Met Ala Leu Val Val Gin

AAA

TAT

GGC

GGT

TCC

TCG

CTT

GAG

AGT

GCG

GAA

CGC

ATT

AGA

AAC

GTC

282

Lys

Tyr

Gly Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Glu

Arg

Ile

Arg Asn

Val

10

15

20

GCT

GAA

CGG

ATC

GTT

GCC

ACC

AAG

AAG

GCT

GGA

AAT

GAT

GTC

GTG

GTT

j30

Ala

Glu

Arg

ile

Val

Ala

Thr

Lys

Lys

Ala

Gly

Asn

Asp

Val

Val

Val

25

30

35

GTC

TGC

TCC

GCA

ATG

GGA

GAC

ACC

ACG

GAT

GAA

CTT

CTA

GAA

CTT

GCA

378

Val

Cys

Ser

Ala

Met

Gly

Asp

Thr

Thr

Asp

Glu

Leu

Leu

Glu

Leu

Ala

40

45

50

GCG

GCA

GTG

AAT

CCC

GTT

CCG

CCA

GCT

CGT

GAA

ATG

GAT

ATG

CTC

CTG

42é

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Val

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Met

Asp

Met

Leu

Leu

55

60

65

70

ACT

GCT

GGT

GAG

CGT

ATT

TCT

AAC

GCT

CTC

GTC

GCC

ATG

GCT

ATT

GAG

474

Thr

Ala

Gly

Glu

Arg

Ile

Ser

Asn

Ala

Leu

Val

Ala

Met

Ala

Ile

Glu

75

80

85

TCC

CTT

GGC

GCA

GAA

GCT

CAA

TCT

TTC

ACT

GGC

TCT

CAG

GCT

GGT

GTG

522

Ser

Leu

Gly

Ala

Glu

Ala

Gin

Ser

Phe

Thr

Gly

Ser

Gin

Ala

Gly

Val

90

95

100

CTC

ACC

ACC

GAG

CGC

CAC

GGA

AAC

GCA

CGC

ATT

GTT

GAC

GTC

ACA

CCG

570

Leu

Thr

Thr

Glu

Arg

His

Gly

Asn

Ala

Arg

Ile

Val

Asp

Val

Thr

Pro

105

110

115

GGT

CGT

GTG

CGT

GAA

GCA

CTC

GAT

GAG

GGC

AAG

ATC

TGC

ATT

GTT

GCT

513

Gly Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Glu

Gly Lys

Ile

Cys

Ile

Val

Ala

120

125

130

GGT

TTT

CAG

GGT

GTT

AAT

AAA

GAA

ACC

CGC GAT

GTC

ACC

ACG

TTG

GGT

566

Gly

Phe

Gin

Gly

Val

Asn

Lys

Glu

Thr

Arg Asp

Val

Thr

Thr

Leu

Gly

135

140

145

150

CGT

GGT

GGT

TCT

GAC

ACC

ACT

GCA

GTT

GCG TTG

GCA

GCT

GCT

TTG

AAC

714

Arg

Gly Gly

Ser

Asp

Thr

Thr

Ala

Val

Ala

Leu Ala

Ala

Ala

Leu

Asn

155

160

165

GCT

GAT

GTG

TCT

GAG

ATT

TAC

TCG

GAC GTT

GAC

GCT

CTG

TAT

ACC

GCT

762

Ala

Asp

Val

Cys

Glu

Ile

Tyr

Ser

Asp Val

Asp

Gly

Val

Tyr Thr

Ala

170

175

180

GAC

CCG

CGC

ATC

GTT

CCT

AAT

GCA

CAG

AAG

CTG

GAA

AAG

CTC

AGC

TTC

810

Asp

Pro

Arg

Ile

Val

Pro

Asn

Ala

Gin

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

185

190

195

GAA

GAA

ATG

CTG

GAA

CTT

GCT

GCT

CTT

GGC

TCC

AAG

ATT

TTG

GTG

CTG

353

Glu

Glu

Met

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala

Val

Gly

Ser

Lys

Ile

Leu

Val

Leu

200

205

210

CGC

ACT

GIT

GAA

TAC

GCT

CCT

GCA

TTC

AAT

GTG

CCA

CTT

CGC

CTA

CGC

'30'6

Arg

Ser

Val

Glu

Tyr

Ala

Arg

Ala

Phe

Asn

Val

Pro

Leu

Arg

Val

Arg

215

220

225

230

TCG

TCT

TAT

ACT

AAT

GAT

CCC

GGC

ACT

TTG

ATT

GCC

GGC

TCT

ATG

GAG

954

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn

Asp

Pro

Gly

Thr

Leu

Ile

Ala

Gly

Ser

Met

Glu

235

240

245

GAT

ATT

CCT

GTG

GAA

GAA

GCA

CTC

CTT

ACC

GCT

CTC

GCA

ACC

GAC

AAG

1002

Asp

Ile

Pro

Val

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

Thr

Asp

Lys

250

255

260

TCC

GAA

GCC

AAA

CTA

ACC

GTT

CTG

GCT

ATT

TCC

GAT

AAG

CCA

GGC

GAG

1050

Ser

Glu

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

265

270

275

GCT

GCC

AAG

GTT

TTC

CCT

GCG

TTG

GCT

GAT

GCA

GAA

ATC

AAC

ATT

GAC

1098

Ala

Ala

Lys

Val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

280

285

290

ATG

GTT

CTG

CAG

AAC

GTC

TCC

TCT

GTG

GAA

GAC

GGC

ACC

ACC

GAC

ATC

1146

Met

Val

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

Ile

295

300

305

310

ACG

TTC

ACC

TGC

CCT

CGC

GCT

GAC

GGA

CGC

CCT

GCG

ATG

GAG

ATC

TTG

1194

Thr

Phe

Thr

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp Gly

Arg Arg

Ala

Met

Glu

Ile

Leu

315

320

325

AAG

AAG

CTT

CAG

GIT

CAG

GGC

AAC

TGG

ACC

AAT

GTG

CTT

TAC

GAC

GAC

1242

Lys

Lys

Leu

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

330

335

340

CAG

GTC

GGC

AAA

GTC

TCC

CTC

CTG

GGT

GCT

GGC

ATG

AAG

TCT

CAC

CCA

1290

Gin

Val

Gly

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

345

350

355

GCT

GTT

ACC

GCA

GAG

TTC

ATG

GAA GCT

CTG

CGC

GAT

CTC

AAC

GTG

AAC

1338

Gly

Val

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

Glu Ala

Leu

Arg Asp

Val

Asn

Val

Asn

360

365

370

·· ·· ·· ··

ATC

GAA

TTG

ATT

TCC

ACC

TCT

GAG

ATC

CGC

ATT

TCC

GIG

CTG

ATC

CGT

1386

Ile

Glu

Leu

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

Ile

Ser

Val

Leu

Ile

Arg

375

380

385

390

GAA

GAT

GAT

CTG

GAT

GCT

GCT

GCA

CGT

GCA

TTG

CAT

GAG

CAG

TTC

CAG

1434

Glu

Asp

Asp

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

His

Glu

Gin

Phe

Gin

395

400

405

CTG

GGC

GGC

GAA

GAC

GAA

GCC

GTC

GIT

TAT

GCA

GGC

ACC

GGA

CGC

TAA

1482

Leu

Gly Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr Ala

Gly

Thr

Gly Arg

410

415

420

1542

1602

1643

(2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 421 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

15		(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0;5:
Met	Ala	Leu	Val	Val	Gin	Lys Tyr Gly Gly Ser	Ser	Leu	Glu	Ser	Ala
1				5		10				15
Glu	Arg	Ile	Arg	Asn	Val	Ala Glu Arg Ile Val	Ala	Thr	Lys	Lys	Ala
			20			25			30
Gly	Asn	Asp	Val	Val	Val	Val Cys Ser Ala Met	Gly Asp	Thr	Thr	Asp
		35				40		45
Glu	Leu	Leu	Glu	Leu	Ala	Ala Ala Val Asn Pro	Val	Pro	Pro	Ala	Arg
	50					55	60
Glu	Met	Asp	Met	Leu	Leu	Thr Ala Gly Glu Arg	Ile	Ser	Asn	Ala	Leu
65					70	75				80
Val	Ala	Met	Ala	Ile	Glu	Ser Leu Gly Ala Glu	Ala	Gin	Ser	Phe	Thr
				85		90				95
Gly	Ser	Gin	Ala	Gly	Val	Leu Thr Thr Glu Arg	His	Gly	Asn	Ala	Arg
			100			105			110
Ile	Val	Asp	Val	Thr	Pro	Gly Arg Val Arg Glu	Ala	Leu	Asp	Glu	Gly
		115				120		125
Lys	Ile	Cys	Ile	Val	Ala	Gly Phe Gin Gly Val	Asn	Lys	Glu	Thr	Arg
	130					135	140
Asp	Val	Thr	Thr	Leu	Gly Arg Gly Gly Ser Asp	Thr	Thr	Ala	Val	Ala
145					150	155				160
Leu	Ala	Ala	Ala	Leu	Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr	Ser	Asp	Val
				165		170				175
Asp	Gly	Val	Tyr	Thr	Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn	Ala	Gin Lys
			180			185			190

Leu

Glu

Lys

Leu Ser

Phe

Glu

Glu

Met

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala

Val

Gly

195

200

205

Ser

Lys

Ile

Leu Val

Leu

Arg

Ser

Val

Glu

Tyr Ala Arg

Ala

Phe

Asn

210

215

220

Val

Pro

Leu

Arg Val

Arg

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn Asp

Pro

Gly

Thr

Leu

225

230

235

240

Ile

Ala

Gly

Ser Met

Glu

Asp

Ile

Pro

Val

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

245

250

255

Gly

Val

Ala

Thr Asp

Lys

Ser

Glu

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

260

265

270

Ser

Asp

Lys

Pro Gly

Glu

Ala

Ala

Lys

Val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

275

280

285

Ala

Glu

Ile

Asn Ile

Asp

Met

Val

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

290

295

300

Asp

Gly

Thr

Thr Asp

Ile

Thr

Phe

Thr

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly Arg

305

310

315

320

Arg

Ala

Met

Glu Ile

Leu

Lys

Lys

Leu

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Trp Thr

325

330

335

Asn

Val

Leu

Tyr Asp

Asp

Gin

Val

Gly Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

340

345

350

Gly

Met

Lys

Ser His

Pro

Gly

Val

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

Ala

Leu

355

360

365

Arg

Asp

Val

Asn Val

Asn

Ile

Glu

Leu

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

370

375

380

Ile

Ser

Val

Leu Ile

Arg

Glu

Asp Asp

Leu

Asp

Ala Ala

Ala

Arg

Ala

385

390

395

400

Leu

His

Glu

Gin Phe

Gin

Leu

Gly Gly

Glu

Asp Glu Ala

Val

Val

Tyr

405

410

415

Ala

Gly

Thr

Gly Arg

420 (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1643 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ;

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 964..1482 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΑΑΤΑΊΤΑΑΑ TCGAATATCA ATATACGGTC60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240

GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300

ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360

GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420

CTCCTGACTG C7TGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480

GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CA2TGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540

GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600

AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660

TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTIT GAACGCTGAT720

GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG C^TCGTTCCT780

AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTCGC840

TCCAAGAITT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900

GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960

CCT GTG GAA GAA GCA GTC CIT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA1008

Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu

5 1015

GCC

AAA

GTA

ACC

GTT

CTG

GGT

ATT

TCC

GAT

AAG

CCA

GGC

GAG

GCT

GCC

1056

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

Ser

Asp Lys

Pro

Gly

Glu

Ala

Ala

20

25

30

AAG

GTT

TTC

CGT

GCG

TTG

GCT

GAT

GCA

GAA

ATC

AAC

ATT

GAC

ATG

GTT

1104

Lys

Val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Val

35

40

45

CTG

CAG

AAC

GTC

TCC

TCT

GTG

GAA

GAC

GGC

ACC

ACC

GAC

ATC

ACG

TTC

1152

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp Gly

Thr

Thr

Asp

Ile

Thr

Phe

50

55

60

ACC

TGC

CCT

CGC

GCT

GAC

GGA

CGC

CGT

GCG

ATG

GAG

ATC

ITG

AAG

AAG

1200

Thr

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly Arg Arg

Ala

Met

Glu

Ile

Leu

Lys

Lys

65

70

75

CTT

CAG

GTT

CAG

GGC

AAC

TGG

ACC

AAT

GTG

CTT

TAC GAC

GAC

CAG

GTC

1248

Leu

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Tip

Thr

Asn

Val

Leu

Tyr Asp Asp

Gin

Val

80

85

90

95

GGC

AAA

GTC

TCC

CTC

GTG

GGT

GCT

GGC

ATG

AAG

TCT

CAC

CCA

GGT

GTT

1296

Gly

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

Gly

Val

100

105

110

ACC

GCA

GAG

TTC

ATG

GAA

GCT

CTG

CGC

GAT

GTC

AAC

GTG

AAC

ATC

GAA

1344

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

Ala

Leu

Arg

Asp Val

Asn

Val

Asn

Ile

Glu

- 49 • · · • · · • · · · · ·

115

120

125

TTG

ATT

TCC

ACC

TCT

GAG

ATC

CGC ATT

TCC

GTG

CTG

ATC

CGT

GAA

GAT

1392

Leu

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg Ile

Ser

Val

Leu

Ile Arg

Glu

Asp

130

135

140

GAT

CTG

GAT

GCT

GCT

GCA

CGT

GCA

TTG

CAT

GAG

CAG

TTC

CAG

CTG

GGC

1440

Asp

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

His

Glu

Gin

Phe

Gin

Leu

Gly

145

150

155

GGC

GAA

GAC

GAA

GCC

GTC

GTT

TAT

GCA

GGC

ACC

GGA

CGC

TAAAGTTTTAA

1490

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val Tyr

Ala

Gly

Thr

Gly Arg

160

165

170

1550

1610

--TTACAATGAC

CCCTTTTGGA

CCGCAGGCOG

GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TTC

CACCATCGCA

AGAGCGCAAT

TAAGATTGAA

AGGAGTAGTT GTTATGCGCA TCCCCGCGTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

io (A) DÉLKA: 172 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7;

Met

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

Thr

Asp

Lys

Ser

Glu

Ala

1

5

10

1

5

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

Ala

Ala

Lys

20

25

30

Val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Val

Leu

35

40

4!

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

Ile

Thr

Phe

Thr

50

55

60

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly

Arg

Arg

Ala

Met

Glu

Ile

Leu

Lys

Lys

Leu

65

70

75

80

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

Gin

Val

Gly

85

90

9

5

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

Gly

Val

Thr

100

105

lil

3

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

Ala

Leu

Arg

Asp

Val

Asn

Val

Asn

Ile

Glu

Leu

115

120

12!

5

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

Ile

Ser

Val

Leu

Ile

Arg

Glu

Asp

Asp

130

135

140

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

His

Glu

Gin

Phe

Gin

Leu

Gly

Gly

145

150

155

160

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

Ala

Gly

Thr

Gly

Arg

165 170 • · · · · · · • · ··· · · · · · • · · · · · ··· ·· ·· · · · · ··

- 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ io (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8: GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

2o (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9: CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2001 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý • · · * (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

- (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 730..1473 io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT50

GACGITGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG120

ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC180

TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC240

AACTTGAGCC TGCTGCITCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG300

GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC360

ATCTGAAGGC GTGCGAGITG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGITTCTG TCACAACTGG420

AGCAGGACTA GCAGAGGITG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA480

AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT540

AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT600

GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT660

TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA720

AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GIT CTC GGA GCC AAA GGC CGT768

Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg 1510

GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG816

Val Gly Gin Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp LeuGlu

2025

CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC864

Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu ValAsp

35 4045 • ·

AAC

GGC

GCT

GAA

GTT

GTC

GTT

GAC

TTC

ACC ACT

CCT

AAC

GCT

GTG

ATG

Asn

Gly

Ala

Glu

Val

Val

Val

Asp

Phe

Thr

Thr

Pro

Asn

Ala

Val

Met

50

55

60

GGC

AAC

CTG

GAG

TTC

TGC

ATC

AAC

AAC

GGC

ATT

TCT

GCG

GIT

GTT

GGA

Gly

Asn

Leu

Glu

Phe

Cys

Ile

Asn

Asn

Gly

Ile

Ser

Ala

Val

Val

Gly

65

70

75

ACC

ACG

GGC

ITC

GAT

GAT

GCT

CGT

TTG

GAG

CAG

GTT

CGC

GCC

TGG

CTT

Thr

Thr

Gly

Phe

Asp

Asp

Ala

Arg

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Ala

Trp

Leu

80

85

90

GAA

GGA

AAA

GAC

AAT

GTC

GGT

GTT

CTG

ATC

GCA

CCT

AAC

TTT

GCT

ATC

Glu

Gly

Lys

Asp

Asn

Val

Gly

Val

Leu

Ile

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

Ile

95

100

105

TCT

GCG

GTG

TTG

ACC

ATG

GTC

ΤΊΤ

TCC

AAG

CAG

GCT

GCC

CGC

TTC

TTC

Ser

Ala

Val

Leu

Thr

Met

Val

Phe

Ser

Lys

Gin

Ala

Ala

Arg

Phe

Phe

110

115

120

125

GAA

TCA

GCT

GAA

GTT

ATT

GAG

CTG

CAC

CAC

ccc

AAC

AAG

CTG

GAT

GCA

Glu

Ser

Ala

Glu

Val

Ile

Glu

Leu

His

His

Pro

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

130

135

140

CCT

TCA

GGC

ACC

GCG

ATC

CAC

ACT

GCT

CAG

GGC

ATT

GCT

GCG

GCA

CGC

Pro

Ser

Gly

Thr

Ala

Ile

His

Thr

Ala

Gin

Gly

Ile

Ala

Ala

Ala

Arg

145

150

155

AAA

GAA

GCA

GGC

ATG

GAC

GCA

CAG

CCA

GAT

GCG

ACC

GAG

CAG

GCA

CTT

Lys

Glu

Ala

Gly

Met

Asp

Ala

Gin

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

Gin

Ala

Leu

160

165

170

GAG

GGT

TCC

CGT

GGC

GCA

AGC

GTA

GAT

GGA

ATC

CCA

GTT

CAC

GCA

GTC

Glu

Gly

Ser

Arg

Gly

Ala

Ser

Val

Asp

Gly

Ile

Pro

Val

His

Ala

Val

175

180

185

CGC

ATG

TCC

GGC

ATG

GTT

GCT

CAC

GAG

CAA

GTT

ATC

ΤΊΤ

GGC

ACC

CAG

Arg

Met

Ser

Gly

Met

Val

Ala

His

Glu

Gin Val

Ile

Phe

Gly

Thr

Gin

190

195

200

205

GGT

CAG

ACC

TTG

ACC

ATC

AAG

CAG

GAC

TCC

TAT

GAT

CGC

AAC

TCA

TTT

Gly

Gin

Thr

Leu

Thr

Ile

Lys

Gin

Asp

Ser Tyr Asp Arg

Asn

Ser

Phe

210

215

220

GCA

CCA

GGT

GTC

TTG

GTG

GGT

GTG

CGC

AAC

ΑΊΤ

GCA CAG

CAC

CCA

GGC

Ala

Pro

Gly

Val

Leu

Val

Gly

Val

Arg

Asn

Ile

Ala

Gin

His

Pro Gly

225

230

235

CTA

GTC

GTA

GGA

CTT

GAG

CAT

TAC

CTA

GGC

CTG

TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC

Leu

Val

Val

Gly

Leu

Glu

His

Tyr

Leu Gly

Leu

240

245

912

960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392

1440

1493

- 53 1553

1613

1673

1733

1793

1853

1913

1973

2001

GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT ITCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG TGAACITITC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 248 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

Met 1	Gly Ile Lys Val 5	Gly Val	Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gin
10	15
Thr	Ile Val Ala Ala	Val Asn	Glu Ser Asp Asp Leu	Glu Leu Val Ala
	20		25	30
Glu	Ile Gly Val Asp Asp Asp	Leu Ser Leu Leu Val	Asp Asn Gly Ala
	35		40	45
Glu	Val Val Val Asp	Phe Thr	Thr Pro Asn Ala Val	Met Gly Asn Leu
	50	55	60
Glu	Phe Cys Ile Asn	Asn Gly	Ile Ser Ala Val Val	Gly Thr Thr Gly
65		70	75	80
Phe	Asp Asp Ala Arg	Leu Glu	Gin Val Arg Ala Trp	Leu Glu Gly Lys
	85		90	95
Asp	Asn Val Gly Val	Leu Ile	Ala Pro Asn Phe Ala	Ile Ser Ala Val
	100		105	110
Leu	Thr Met Val Phe	Ser Lys	Gin Ala Ala Arg Phe	Phe Glu Ser Ala
	115		120	125
Glu	Val Ile Glu Leu	His His	Pro Asn Lys Leu Asp	Ala Pro Ser Gly
	130	135	140
Thr	Ala Ile His Thr	Ala Gin	Gly Ile Ala Ala Ala	Arg Lys Glu Ala
145		150	155	160
Gly	Met Asp Ala Gin	Pro Asp	Ala Thr Glu Gin Ala	Leu Glu Gly Ser
	165		170	175
Arg	Gly Ala Ser Val	Asp Gly	Ile Pro Val His Ala	Val Arg Met Ser
	180		185	190

• ·· ·· 0 0 · · · • •••0 0 00 ··· · · • •0 · 0 · ··· ··* ·· ·· * · · · ·· ··

- 54 Gly Met Val Ala His Glu Gin Val Ile Phe Gly Thr Gin Gly Gin Thr

195 200205

Leu Thr Ile Lys Gin Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly

210 215220

Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gin His Pro Gly Leu Val Val

225 230 235240

Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu

245 (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina io (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:12:

GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

2o (A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:13:

GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1411 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina s (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

io (A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 311..1213 is (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT60

TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACMGCC CCTATCTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC120

ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTCTA AAAGACAGCC180

CTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT CTGGCTTGGG CGATTGTTAT240

GCAAAACTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGCTAAC 300 CTTGAACTCT ATG AGC ACA GCT TTA AGA GCT AAG ACC GGA OTA GAG CAC349

Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His

1510

TTC

GGC

ACC

GTT

GGA

CTA

GCA ATG

CTT

ACT

CCA

TTC

ACG

GAA

TCC

GGA

397

Phe

Gly

Thr

Val

Gly

Val

Ala Met

Val

Thr

Pro

Phe

Thr

Glu

Ser

Gly

15

20

25

GAC

ATC

GAT

ATC

GCT

GCT

GGC

CGC

GAA

GTC

GCG

GCT

TAT

TTG

CTT

GAT

44,5

Asp

Ile

Asp

Ile

Ala

Ala

Gly Arg

Glu

Val

Ala

Ala

Tyr

Leu

Val

Asp

30

35

40

45

AAG

GGC

TTG

GAT

TCT

TTG

GTT

CTC

GCG

GGC

ACC

ACT

GCT

GAA

TCC

CCA

493

Lys

Gly

Leu

Asp

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Pro

50

55

60

ACG

ACA

ACC

GCC

GCT

GAA

AAA

CTA

GAA

CTG

CTC

AAG

GCC

GTT

CCT

GAG

541

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Glu

Lys

Leu

Glu

Leu

Leu

Lys

Ala

Val

Arg

Glu

65

70

75

GAA

CTT

GGG

GAT

CGG

GCG

AAC

CTC

ATC

GCC

GCT

GTC

GGA

ACC

AAC

AAC

589

Glu

Val

Gly

Asp

Arg

Ala

Asn

Val

Ile

Ala

Gly

Val

Gly

Thr

Asn

Asn

80

85

90

ACG

CGG

ACA

TCT

GTG

GAA

CTT

GCG GAA

GCT

GCT

GCT

TCT

GCT

GGC

GCA

637

Thr

Arg

Thr

Ser

Val

Glu

Leu

Ala Glu

Ala

Ala

Ala

Ser Ala

Gly

Ala

95

100

105

GAC

GGC

CTT

TTA

GIT

GTA

ACT

CCT

TAT

TAC

TCC

AAG

CCG

AGC

CAA

GAG

665

Asp

Gly

Leu

Leu

Val

Val

Thr

Pro

Tyr Tyr

Ser Lys

Pro

Ser

Gin

Glu

110

115

120

125

GGA

TTG

CTG

GCG

CAC

TTC

GGT

GCA

ATT

GCT

GCA

GCA

ACA

GAG

GTT

CCA

763

Gly

Leu

Leu

Ala

His

Phe

Gly

Ala

Ile

Ala

Ala

Ala

Thr

Glu

Val

Pro

130

135

140

ATT

TGT

CTC

TAT

GAC

ATT

CCT

GGT

CGG

TCA

GCT

ATT

CCA

ATT

GAG

TCT

7S1

Ile

Cys

Leu

Tyr . Asp

Ile

Pro

Gly Arg

Ser

Gly

Ile

Pro

Ile

Glu

Ser

145

150

155

GAT

ACC

ATG

AGA

CGC

CTG

AGT

GAA

TTA

CCT

ACG

ATT

TTG

GCG

GTC

AAG

Asp

Thr

Met

Arg Arg

Leu

Ser

Glu

Leu

Pro

Thr

Ile

Leu

Ala

Val

Lys

160

165

170

GAC

GCC

AAG

GGT

GAC

CTC

GTT

GCA

GCC

ACG

TCA

TTG

ATC

AAA

GAA

ACG

877

Asp

Ala

Lys

Gly Asp

Leu

Val

Ala

Ala

Thr

Ser

Leu

Ile

Lys

Glu

Thr

175

180

185

GGA

CTT

GCC

TGG

TAT

TCA

GGC

GAT

GAC

CCA

CTA

AAC

CTT

GTT

TGG

CTT

925

Gly

Leu

Ala

Trp

Tyr

Ser

Gly Asp

Asp

Pro

Leu

Asn

Leu

Val

Trp

Leu

190

195

200

205

GCT

TTG

GGC

GGA

TCA

GGT

TTC

ATT

TCC

GTA

ATT

GGA

CAT

GCA

GCC

CCC

973

Ala

Leu

Gly

Gly

Ser

Gly

Phe

Ile

Ser

Val

Ile

Gly

His

Ala

Ala

Pro

210

215

220

ACA

GCA

TTA

CGT

GAG

TTG

TAC

ACA

AGC

TTC

GAG

GAA

GGC

GAC

CTC

GTC

1021

Thr

Ala

Leu

Arg

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ser

Phe

Glu

Glu

Gly Asp

Leu

Val

225

230

235

CGT

GCG

CGG

GAA

ATC

AAC

GCC

AAA

CTA

TCA

CCG

CTG

GTA GCT

GCC

CAA

1069

Arg

Ala

Arg

Glu

Ile

Asn

Ala

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Gin

240

245

250

GGT

CGC

TTG

GGT

GGA

GTC

AGC

TTG

GCA

AAA

GCT

GCT

CTG

CGT

CTG

CAG

1117

Gly Arg

Leu

Gly Gly

Val

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

255

260

265

GGC

ATC

AAC

GTA

GGA

GAT

CCT

CGA

CTT

CCA

ATT

ATG

GCT

CCA

AAT

GAG

1165

Gly

Ile

Asn

Val

Gly

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Met

Ala

Pro

Asn

Glu

270

275

280

285

CAG

GAA

CTT

GAG

GCT

CTC

CGA

GAA

GAC

ATG

AAA

AAA

GCT

GGA

GTT

CTA

1213

Gin

Glu

Leu

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu

Asp

Met

Lys

Lys

Ala

Gly

Val

Leu

290 295 300

TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA1273

AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA1333

CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC1393

TCAAGGATCC CAACATTC1411 • ·

- 57 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 301 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

Met Ser Thr Gly'Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val	Glu His Phe Gly Thr 15
1	5	10
Val Gly Val Ala	Met	Val Thr Pro Phe Thr Glu	Ser Gly Asp Ile Asp
20		25	30
Ile Ala Ala Gly Arg	Glu Val Ala Ala Tyr Leu	Val Asp Lys Gly Leu
35		40	45
Asp Ser Leu Val	Leu	Ala Gly Thr Thr Gly Glu	Ser Pro Thr Thr Thr
50		55	60
Ala Ala Glu Lys	Leu	Glu Leu Leu Lys Ala Val	Arg Glu Glu Val Gly
65		70 75	i 80
Asp Arg Ala Asn	Val	Ile Ala Gly Val Gly Thr	Asn Asn Thr Arg Thr
	85	90	95
Ser Val Glu Leu	Ala	Glu Ala Ala Ala Ser Ala	Gly Ala Asp Gly Leu
100		105	110
Leu Val Val Thr	Pro	Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser	Gin Glu Gly Leu Leu
115		120	125
Ala His Phe Gly	Ala	Ile Ala Ala Ala Thr Glu	Val Pro Ile Cys Leu
130		135	140
Tyr Asp Ile Pro	Gly	Arg Ser Gly Ile Pro Ile	Glu Ser Asp Thr Met
145		150 155	i 160
Arg Arg Leu Ser	Glu	Leu Pro Thr Ile Leu Ala	Val Lys Asp Ala Lys
	165	170	175
Gly Asp Leu Val	Ala	Ala Thr Ser Leu Ile Lys	Glu Thr Gly Leu Ala
180		185	190
Trp Tyr Ser Gly	Asp	Asp Pro Leu Asn Leu Val	Trp Leu Ala Leu Gly
195		200	205
Gly Ser Gly Phe	Ile	Ser Val Ile Gly His Ala	Ala Pro Thr Ala Leu
210		215	220
Arg Glu Leu Tyr	Thr	Ser Phe Glu Glu Gly Asp	Leu Val Arg Ala Arg
225		230 235 240
Glu Ile Asn Ala	Lys	Leu Ser Pro Leu Val Ala	Ala Gin Gly Arg Leu
	245	250	255
Gly Gly Val Ser	Leu	Ala Lys Ala Ala Leu Arg	Leu Gin Gly Ile Asn
260		265	270
Val Gly Asp Pro	Arg	Leu Pro Ile Met Ala Pro	Asn Glu Gin Glu Leu
275		280	285
Glu Ala Leu Arg	Glu	Asp Met Lys Lys Ala Gly	Val Leu
290		295	300

• · • · · · · * • ·· · · · · ······ ♦ · • · · · · · ··» ·· ·· ····

- 58 • · (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý '(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16; GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

ccaaaaccgc cctccacggc gaa (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3579 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · · (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ; ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS o (B) UMÍSTĚNÍ: 533..2182 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 2188..3522 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT60

TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA120

GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT180

GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC240

GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC300

AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC360

CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA420

CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA480

AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG535

Met

ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT583

Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val GluVal

1015

TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT631

Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin ValVal

2530

GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT679

Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile

35

40

45

GCA

TTG

CAG

GTG

GCT

AAA

AAG

GTC

GGT

CAG

AAC CCT

CGG

GAT

TTG

GCT

727

Ala

Leu

Gin

Val

Ala

Lys

Lys

Val

Gly

Gin

Asn

Pro

Arg Asp

Leu

Ala

50

55

60

65

ACC

TGG

CTG

GCA

GAG

GCA

TTG

GCT

GCA

GAT

GAC

GCC

ATT

GAT

TCT

GCT

775

Thr

Trp

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Ala

Asp

Asp

Ala

Ile

Asp

Ser

Ala

70

75

80

GAA

ATT

GCT

GGC

CCA

GGC

TTT

TTG

AAC

ATT

CGC

CTT

GCT

GCA

GCA

GCA

823

Glu

Ile

Ala

Gly

Pro

Gly

Phe

Leu

Asn

Ile

Arg

Leu

Ala

Ala

Ala

Ala

85

90

95

CAG

GGT

GAA

ATT

GTG

GCC

AAG

ATT

CTG

GCA

CAG

GGC

GAG

ACT

TTC

GGA

871

Gin

Gly

Glu

Ile

Val

Ala

Lys

Ile

Leu

Ala

Gin

Gly

Glu

Thr

Phe

Gly

100

105

110

AAC

TCC

GAT

CAC

CTT

TCC

CAC

TTG

GAC

GTG

AAC

CTC

GAG

TTC

GTT

TCT

919

Asn

Ser

Asp

His

Leu

Ser

His

Leu

Asp

Val

Asn

Leu

Glu

Phe

Val

Ser

115

120

125

GCA

AAC

CCA

ACC

GGA

CCT

ATT

CAC

CTT

GGC

GGA

ACC

CGC

TGG

GCT

GCC

967

Ala

Asn

Pro

Thr

Gly

Pro

Ile

His

Leu

Gly Gly

Thr

Arg

Trp

Ala

Ala

130

135

140

145

GTG

GGT

GAC

TCT

TTG

GGT

CCT

GTG

CTG

GAG

GCT

TCC

GGC

GCG

AAA

GTG

1015

Val

Gly Asp

Ser

Leu

Gly Arg

Val

Leu

Glu Ala

Ser

Gly

Ala

Lys

Val

150

155

160

ACC

CGC

GAA

TAC

TAC

TTC

AAC

GAT

CAC

GGT

CGC

CAG

ATC

GAT

CCT

TTC

1063

Thr

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

His

Gly Arg

Gin

Ile

Asp

Arg

Phe

165

170

175

GCT

TTG

TCC

CTT

CTT

GCA

GCG

GCG

AAG

GGC

GAG

CCA

ACG

CCA

GAA

GAC

1111

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu

Ala

Ala

Ala

Lys Gly

Glu

Pro

Thr

Pro

Glu

Asp

180

185

190

GGT

TAT

GGC

GGC

GAA

TAC

ATT

AAG

GAA

ATT

GCG

GAG

GCA

ATC

GTC

GAA

1159

Gly Tyr Gly Gly

Glu

Tyr

Ile

Lys

Glu

Ile

Ala

Glu

Ala

Ile

Val

Glu

195

200

205

AAG

CAT

CCT

GAA

GCG

TTG

GCT

TTG

GAG

CCT

GCC

GCA

ACC

CAG

GAG

CTT

1207

Lys

His

Pro

Glu

Ala

Leu

Ala

Leu

Glu

Pro

Ala

Ala

Thr

Gin

Glu

Leu

210

215

220

225

TTC

CGC

GCT

GAA

GGC

GTG

GAG

ATG

ATG

TTC

GAG

CAC

ATC

AAA

TCT

TCC

1255

Phe

Arg

Ala

Glu

Gly

Val

Glu

Met

Met

Phe

Glu

His

Ile

Lys

Ser

Ser

230

235

240

CTG

CAT

GAG

TTC

GGC

ACC

GAT

TTC

GAT

GTC

TAC

TAC

CAC

GAG

AAC

TCC

1303

Leu

His

Glu

Phe

Gly

Thr

Asp

Phe

Asp

Val

Tyr Tyr

His

Glu

Asn

Ser

245

250

255

CTG

TTC

GAG

TCC

GGT

GCG

GTG

GAC

AAG

GCC

GTG

CAG

GTG

CTG

AAG

GAC

1351

Leu

Phe

Glu

Ser

Gly

Ala

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Gin

Val

Leu

Lys

Asp

260

265

270

AAC

GGC

AAC

CTG

TAC

GAA

. AAC

GAG

GGC

. GCT

TGG

TGG

CTG CCT

TCC

: acc

1399

• · • ·

Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr

275

280

285

GAA

TTC

GGC

GAT

GAC

AAA

GAC

CGC

GTG

GTG

ATC

AAG

TCT

GAC

GGC

GAC

1447

Glu

Phe

Gly Asp Asp

Lys Asp Arg

Val

Val

Ile Lys

Ser

Asp

Gly Asp

290

295

300

305

GCA

GCC

TAC

ATC

GCT

GGC

GAT

ATC

GCG

TAC

GTG

GCT

GAT

AAG

TTC

TCC

1495

Ala

Ala

Tyr

Ile

Ala

Gly Asp

Ile

Ala

Tyr

Val

Ala

Asp

Lys

Phe

Ser

310

315

320

CGC

GGA

CAC

AAC

CTA

AAC

ATC

TAC

ATG

TTG

GGT

GCT

GAC

CAC

CAT

GGT

1543

Arg

Gly

His

Asn-

Leu

Asn

Ile

Tyr

Met

Leu

Gly

Ala

Asp

His

His

Gly

325

330

335

TAC

ATC

GCG

CGC

CTG

AAG

GCA

GCG

GCG

GCG

GCA

CTT

GGC

TAC

AAG

CCA

1591

Tyr

Ile

Ala

Arg

Leu

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Leu

Gly Tyr

Lys

Pro

340

345

350

GAA

GGC

GTT

GAA

CTC

CTG

ATT

GGC

CAG

ATG

GTG

AAC

CTG

CTT

CGC

GAC

1639

Glu

Gly

Val

Glu

Val

Leu

Ile

Gly

Gin

Met

Val

Asn

Leu

Leu

Arg

Asp

355

360

365

GGC

AAG

GCA

GTG

CGT

ATG

TCC

AAG

CGT

GCA

GGC

ACC

GTG

GTC

ACC

CTA

1687

Gly

Lys

Ala

Val

Arg

Met

Ser

Lys

Arg

Ala

Gly

Thr

Val

Val

Thr

Leu

370

375

380

385

GAT

GAC

CTC

GTT

GAA

GCA

ATC

GGC

ATC

GAT

GCG

GCG

CGT

TAC

TCC

CTG

1735

Asp

Asp

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Gly

Ile

Asp

Ala

Ala

Arg

Tyr

Ser

Leu

390

395

400

ATC

CGT

TCC

TCC

GTG

GAT

TCT

TCC

CTG

GAT

ATC

GAT

CTC

GGC

CTG

TGG

1783

Ile

Arg

Ser

Ser

Val

Asp

Ser

Ser

Leu

Asp

Ile

Asp

Leu

Gly

Leu

Trp

405

410

415

GAA

TCC

CAG

TCC

TCC

GAC

AAC

CCT

GTG

TAC

TAC

GTG

CAG

TAC

GGA

CAC

1831

Glu

Ser

Gin

Ser

Ser

Asp

Asn

Pro

Val

Tyr

Tyr

Val

Gin

Tyr Gly

His

420

425

430

GCT

CGT

CTG

TGC

TCC

ATC

GCG

CGC

AAG

GCA

GAG

ACC

TTG

GGT

GTC

ACC

1879

Ala

Arg

Leu

Cys

Ser

Ile

Ala

Arg

Lys

Ala

Glu

Thr

Leu

Gly

Val

Thr

435

440

445

GAG

GAA

GGC

GCA

GAC

CTA

TCT

CTA

CTG

ACC

CAC

GAC

CGC

GAA

GGC

GAT

1927

Glu

Glu

Gly

Ala

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Thr

His

Asp

Arg

Glu

Gly Asp

450

455

460

465

CTC

ATC

CGC

ACA

CTC

GGA

GAG

TTC

CCA

GCA

GTG

GTG

AAG

GCT

GCC

GCT

1975

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala

Val

Val

Lys

Ala

Ala

Ala

470

475

480

GAC

CTA

CGT

GAA

CCA

CAC

CGC

ATT

GCC

CGC

TAT

GCT

GAG

GAA

TTA

GCT

2023

Asp

Leu

Arg

Glu

Pro

His

Arg

Ile

Ala

Arg

Tyr

Ala

Glu

Glu

Leu

Ala

485

490

495

GGA

ACT

TTC

CAC

CGC

TTC

TAC

GAT

TCC

TGC

CAC

ATC

CTT

CCA

AAG

GTT

2071

Gly

Thr

Phe

His

Arg

Phe

Tyr Asp

Ser

Cys

His

Ile

Leu

Pro

Lys

Val

500

505

510

GAT

GAG

GAT

ACG

GCA

CCA

ATC

CAC ACA

GCA

CGT

CTG

GCA CTT

GCA

GCA

2119

·

Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala

515

520

525

GCA

ACC

CGC

CAG

ACC

CTC

GCT

AAC

GCC

CTG

CAC

CTG

GTT

GGC

GTT

TCC

2167

Ala

Thr

Arg

Gin

Thr

Leu

Ala Asn

Ala

Leu

His

Leu

Val

Gly

Val

Ser

530

535

540

545

GCA

CCG

GAG

AAG

ATG

TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA

2214

Ala

Pro

Glu

Lys

Met

Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu

-

550

1

5

CTT

CCC

GCA

CAC

GTA

TGG

CCA

CGC

AAT

GCC

GTG

CGC

CAA

GAA

GAC

GGC

2262

Leu

Pro

Ala

His

Val

Trp

Pro

Arg

Asn

Ala

Val Arg

Gin

G1U

Asp

Gly

10

15

20

25

GTT

GTC

ACC

GTC

GCT

GCT

GTG

CCT

CTG

CCT

GAC

CTC

GCT

GAA

GAA

TAC

2310

Val

Val

Thr

Val

Ala

Gly

Val

Pro

Leu

Pro

Asp

Leu

Ala

Glu

Glu

Tyr

30

35

40

GGA

ACC

CCA

CTG

TTC

GTA

GTC

GAC

GAG

GAC

GAT

TTC

CGT

TCC

CGC

TGT

2358

Gly

Thr

Pro

Leu

Phe

Val

Val

Asp

Glu

Asp

Asp

Phe

Arg

Ser

Arg

Cys

45

50

55

CGC

GAC

ATG

GCT

ACC

GCA

TTC

GGT

GGA

CCA

GGC

AAT

CTG

CAC

TAC

GCA

2406

Arg

Asp

Met

Ala

Thr

Ala

Phe

Gly Gly

Pro

Gly

Asn

Val

His

Tyr

Ala

60

65

70

TCT

AAA

GCG

TTC

CTG

ACC

AAG

ACC

ATT

GCA

CGT

TGG

GTT

GAT

GAA

GAG

2454

Ser

Lys

Ala

Phe

Leu

Thr

Lys

Thr

Ile

Ala

Arg

Trp

Val

Asp

Glu

Glu

75

80

85

GGG

CTG

GCA

CTG

GAC

ATT

GCA

TCC

ATC

AAC

GAA

CTG

GGC

ATT

GCC

CTG

2502

Gly

Leu

Ala

Leu

Asp

Ile

Ala

Ser

Ile

Asn

Glu

Leu

Gly

Ile

Ala

Leu

90

95

100

105

GCC

GCT

GCT

ITC

CCC

GCC

AGC

CGT

ATC

ACC

GCG

CAC

GGC

AAC

AAC

AAA

2550

Ala

Ala

Gly

Phe

Pro

Ala

Ser

Arg

Ile

Thr

Ala

His

Gly

Asn

Asn

Lys

110

115

120

GGC

GTA

GAG

TTC

CTG

CGC

GCG

TTG

GTT

CAA

AAC

GGT

CTG

GGA

CAC

GTG

2598

Gly

Val

Glu

Phe

Leu

Arg

Ala

Leu

Val

Gin

Asn

Gly

Val

Gly

His

Val

125

130

135

GTG

CTG

GAC

TCC

GCA

CAG

GAA

CTA

GAA

CTG

TTG

GAT

TAC

GTT

GCC

GCT

26<í6

Val

Leu

Asp

Ser

Ala

Gin

Glu

Leu

Glu

Leu

Leu

Asp

Tyr

Val

Ala

Ala

140

145

150

GCT

GAA

GGC

AAG

ATT

CAG

GAC

GTG

TTG

ATC

CGC

GTA

AAG

CCA

GGC

ATC

2694

Gly

Glu

Gly

Lys

Ile

Gin

Asp

Val

Leu

Ile

Arg

Val

Lys

Pro

Gly

Ile

155

160

165

GAA

GCA

CAC

ACC

CAC

GAG

ITC

ATC

GCC

ACT

AGC

CAC

GAA

GAC

CAG

AAG

2742

Glu

Ala

His

Thr

His

Glu

Phe

Ile

Ala

Thr

Ser

His

Glu

Asp

Gin

Lys

170

175

180

185

ITC

GGA

TTC

TCC

CTG

GCA

TCC

GGT

TCC

GCA

TTC

GAA

GCA

GCA

AAA

GCC

2790

Phe

Gly

Phe

Ser

Leu

Ala

Ser

Gly

Ser

Ala

Phe

Glu

Ala

Ala

Lys

Ala

190

195

200

GCC

AAC

AAC

GCA

GAA

AAC

CTG

AAC

CTG

GTT

GGC

CTG

CAC

TGC

CAC

CTT

2838

• ·

Ala Asn Asn Ala

Glu

Asn

Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val

205

210

215

GGT

TCC

CAG

GTG

TTC

GAC

GCC

GAA

GGC

TTC

AAG

CTG

GCA

GCA

GAA

CGC

2886

Gly

Ser

Gin

Val

Phe

Asp

Ala

Glu

Gly

Phe

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Arg

220

225

230

GTG

TTG

GGC

CTG

TAC

TCA

CAG

ATC

CAC

AGC

GAA

CTG

GGC

GTT

GCC

CTT

2934

Val

Leu

Gly

Leu

Tyr

Ser

Gin

Ile

His

Ser

Glu

Leu

Gly

Val

Ala

Leu

235

240

245

CCT

GAA

CTG

GAT

CTC

GGT

GGC

GGA

TAC

GGC

ATT

GCC

TAT

ACC

GCA

GCT

2982

Pro

Glu

Leu

Asp

Leu

Gly

Gly Gly

Tyr

Gly

Ile

Ala

Tyr

Thr

Ala

Ala

250

255

260

265

GAA

GAA

CCA

CTC

AAC

GTC

GCA

GAA

GTT

GCC

TCC

GAC

CTG

CTC

ACC

GCA

3030

Glu

Glu

Pro

Leu

Asn

Val

Ala

Glu

Val

Ala

Ser

Asp

Leu

Leu

Thr

Ala

270

275

280

GTC

GGA

AAA

ATG

GCA

GCG

GAA

CTA

GGC

ATC

GAC

GCA

CCA

ACC

GTG

CTT

3078

Val

Gly

Lys

Met

Ala

Ala

Glu

Leu

Gly

Ile

Asp

Ala

Pro

Thr

Val

Leu

285

290

295

GTT

GAG

CCC

GGC

CGC

GCT

ATC

GCA

GGC

CCC

TCC

ACC

GTG

ACC

ATC

TAC

3126

Val

Glu

Pro

Gly Arg

Ala

Ile

Ala

Gly

Pro

Ser

Thr

Val

Thr

Ile

Tyr

300

305

310

GAA

GTC

GGC

ACC

ACC

AAA

GAC

GTC

CAC

GTA

GAC

GAC

GAC

AAA

ACC

CGC

3174

Glu

Val

Gly

Thr

Thr

Lys

Asp

Val

His

Val

Asp

Asp

Asp

Lys

Thr

Arg

315

320

325

CGT

TAC

ATC

GCC

GTG

GAC

GGA

GGC

ATG

TCC

GAC

AAC

ATC

CGC

CCA

GCA

3222

Arg

Tyr

Ile

Ala

Val

Asp

Gly Gly

Met

Ser

Asp

Asn

Ile

Arg

Pro

Ala

330

335

340

345

CTC

TAC

GGC

TCC

GAA

TAC

GAC

GCC

CGC

GTA

GTA

TCC

CGC

TTC

GCC

GAA

3270

Leu

Tyr Gly

Ser

Glu

Tyr Asp

Ala

Arg

Val

Val

Ser

Arg

Phe

Ala

Glu

350

355

360

GGA

GAC

CCA

GTA

AGC

ACC

CGC

ATC

GTG

GGC

TCC

CAC

TGC

GAA

TCC

GGC

3318

Gly Asp

Pro

Val

Ser

Thr

Arg

Ile

Val

Gly

Ser

His

Cys

Glu

Ser

Gly

365

370

375

GAT

ATC

CTG

ATC

AAC

GAT

GAA

ATC

TAC

CCA

TCT

GAC

ATC

ACC

AGC

GGC

3366

Asp

Ile

Leu

Ile

Asn

Asp

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Gly

380

385

390

GAC

TTC

CTT

GCA

CTC

GCA

GCC

ACC

GGC

GCA

TAC

TGC

TAC

GCC

ATG

AGC

3414

Asp

Phe

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Thr

Gly

Ala

Tyr Cys

Tyr

Ala

Met

Ser

395

400

405

TCC

CGC

TAC

AAC

GCC

TTC

ACA

CGG

CCC

GCC

GTC

GTG

TCC

GTC

CGC

GCT

3462

Ser

Arg

Tyr

Asn

Ala

Phe

Thr

Arg

Pro

Ala

Val

Val

Ser

Val

Arg

Ala

410

415

420

425

GCC

AGC

TCC

CGC

CTC

ATG

CTG

CGC

CGC

GAA

ACG CTC

GAC

GAC

ATC

CTC

3510

Gly

Ser

Ser

Arg

Leu

Met

Leu

Arg Arg

Glu

Thr

Leu

Asp Asp

Ile

Leu

430 435 440

TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562

Ser Leu Glu Ala

445

GTGGAGGGCG GTTTTGG

3579 • · • · (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 550 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

Met Thr Pro Ala Asp

Leu Ala

Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu

1

5

10

15

Val

Leu

Thr

Ser

Arg

Glu

Leu

Asp

Thr

Ser

Val Leu

Pro

Glu

Gin

Val

20

25

30

Val

Val

Glu

Arg

Pro

Arg

Asn

Pro

Glu

His

Gly Asp

Tyr

Ala

Thr

Asn

35

40

45

Ile

Ala

Leu

Gin

Val

Ala

Lys

Lys

Val

Gly

Gin Asn

Pro

Arg

Asp

Leu

50

55

60

Ala

Thr

Trp

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Ala

Asp Asp

Ala

Ile

Asp

Ser

65

70

75

80

Ala

Glu

Ile

Ala

Gly

Pro

Gly

Phe

Leu

Asn

Ile Arg

Leu

Ala

Ala

Ala

85

90

95

Ala

Gin

Gly

Glu

Ile

Val

Ala

Lys

Ile

Leu

Ala Gin

Gly

Glu

Thr

Phe

100

105

110

Gly

Asn

Ser

Asp

His

Leu

Ser

His

Leu

Asp

Val Asn

Leu

Glu

Phe

Val

115

120

125

Ser

Ala

Asn

Pro

Thr

Gly

Pro

Ile

His

Leu

Gly Gly

Thr

Arg

Trp

Ala

130

135

140

Ala

Val

Gly Asp

Ser

Leu

Gly Arg

Val

Leu

Glu Ala

Ser

Gly

Ala

Lys

145

150

155

160

Val

Thr

Arg

Glu

Tyr Tyr

Phe

Asn

Asp

His

Gly Arg

Gin

Ile

Asp

Arg

165

170

175

Phe

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu

Ala

Ala

Ala

Lys

Gly Glu

Pro

Thr

Pro

Glu

180

185

190

Asp

Gly

Tyr

Gly Gly

Glu

Tyr

Ile

Lys

Glu

Ile Ala

Glu

Ala

Ile

Val

195

200

205

Glu

Lys

His

Pro

Glu

Ala

Leu

Ala

Leu

Glu

Pro Ala

Ala

Thr

Gin

Glu

210

215

220

Leu

Phe

Arg

Ala

Glu

Gly Val Glu

Met

Met

Phe Glu His

Ile

Lys

Ser

225

230

235

240

Ser

Leu

His

Glu

Phe

Gly Thr Asp

Phe

Asp

Val Tyr Tyr

His

Glu

Asn

245

250

255

Ser

Leu

Phe

Glu

Ser

Gly Ala Val

Asp

Lys Ala Val

Gin

Val

Leu Lys

260 265 270

Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser

275

280

285

Thr

Glu

Phe

Gly Asp

Asp

Lys Asp Arg

Val

Val

Ile

Lys

Ser

Asp

Gly

290

295

300

Asp

Ala

Ala

Tyr

Ile

Ala

Gly Asp

Ile

Ala

Tyr

Val

Ala

Asp

Lys

Phe

305

310

315

320

Ser

Arg

Gly

His

Asn

Leu

Asn

Ile

Tyr

Met

Leu

Gly

Ala

Asp

His

His

325

330

335

Gly

Tyr

Ile

Ala

Arg

Leu

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Leu

Gly Tyr

Lys

340

345

350

Pro

Glu

Gly

Val

Glu

Val

Leu

Ile

Gly

Gin

Met

Val

Asn

Leu

Leu

Arg

355

360

365

Asp

Gly

Lys

Ala

Val

Arg

Met

Ser

Lys

Arg

Ala

Gly

Thr

Val

Val

Thr

370

375

380

Leu

Asp

Asp

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Gly

Ile

Asp

Ala

Ala

Arg

Tyr

Ser

385

390

395

400

Leu

Ile

Arg

Ser

Ser

Val

Asp

Ser

Ser

Leu

Asp

Ile

Asp

Leu

Gly

Leu

405

410

415

Trp

Glu

Ser

Gin

Ser

Ser

Asp

Asn

Pro

Val

Tyr

Tyr

Val

Gin

Tyr

Gly

420

425

430

His

Ala

Arg

Leu

Cys

Ser

Ile

Ala

Arg

Lys

Ala

Glu

Thr

Leu

Gly

Val

435

440

445

Thr

Glu

Glu

Gly

Ala

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Thr

His

Asp

Arg

Glu

Gly

450

455

460

Asp

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala

Val

Val

Lys

Ala

Ala

465

470

475

480

Ala

Asp

Leu

Arg

Glu

Pro

His

Arg

Ile

Ala

Arg

Tyr

Ala

Glu

Glu

Leu

485

490

495

Ala

Gly

Thr

Phe

His

Arg

Phe

Tyr Asp

Ser

Cys

His

Ile

Leu

Pro

Lys

500

505

510

Val

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Pro

Ile

His

Thr

Ala

Arg

Leu

Ala

Leu

Ala

515

520

525

Ala

Ala

Thr

Arg

Gin

Thr

Leu

Ala

Asn Ala

Leu

His

Leu Val Gly

Val

530

535

540

Ser

Ala

Pro

Glu

Lys

Met

545 550 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 445 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein • · • ·

- 66 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO;20:

Met	Ala	Thr Val	Glu	Asn Phe Asn Glu Leu Pro	Ala	His	Val Trp Pro
1			5	10			15
Arg	Asn	Ala Val	Arg	Gin Glu Asp Gly Val Val	Thr	Val Ala Gly Val
		20		25			30
Pro	Leu	Pro Asp	Leu	Ala Glu Glu Tyr Gly Thr	Pro	Leu	Phe Val Val
		35		40		45
Asp	Glu	Asp Asp	Phe	Arg Ser Arg Cys Arg Asp	Met	Ala	Thr Ala Phe
	50			55	60
Gly Gly	Pro Gly Asn	Val His Tyr Ala Ser Lys	Ala	Phe	Leu Thr Lys
65				70 75		80
Thr	Ile	Ala Arg	Trp	Val Asp Glu Glu Gly Leu	Ala	Leu	Asp Ile Ala
			85	90			95
Ser	Ile	Asn Glu	Leu	Gly Ile Ala Leu Ala Ala	Gly	Phe	Pro Ala Ser
		100		105			110
Arg	Ile	Thr Ala	His	Gly Asn Asn Lys Gly Val	Glu	Phe	Leu Arg Ala
		115		120		125
Leu	Val	Gin Asn	Gly	Val Gly His Val Val Leu	Asp	Ser	Ala Gin Glu
	130			135	140
Leu	Glu	Leu Leu	Asp	Tyr Val Ala Ala Gly Glu	Gly	Lys	Ile Gin Asp
145				150 155		160
Val	Leu	Ile Arg	Val	Lys Pro Gly Ile Glu Ala	His	Thr	His Glu Phe
			165	170			175
Ile	Ala	Thr Ser	His	Glu Asp Gin Lys Phe Gly	Phe	Ser	Leu Ala Ser
		180		185			190
Gly	Ser	Ala Phe	Glu	Ala Ala Lys Ala Ala Asn	Asn	Ala	Glu Asn Leu
		195		200		205
Asn	Leu	Val Gly	Leu	His Cys His Val Gly Ser	Gin	Val	Phe Asp Ala
	210			215	220
Glu	Gly	Phe Lys	Leu	Ala Ala Glu Arg Val Leu	Gly	Leu	Tyr Ser Gin
225				230 235		240
Ile	His	Ser Glu	Leu	Gly Val Ala Leu Pro Glu	Leu	Asp	Leu Gly Gly
			245	250			255
Gly	Tyr	Gly Ile	Ala	Tyr Thr Ala Ala Glu Glu	Pro	Leu	Asn Val Ala
		260		265			270
Glu	Val	Ala Ser	Asp	Leu Leu Thr Ala Val Gly	Lys	Met	Ala Ala Glu
		275		280		285
Leu	Gly	Ile Asp	Ala	Pro Thr Val Leu Val Glu	Pro	Gly	Arg Ala Ile
	290			295	300
Ala	Gly	Pro Ser	Thr	Val Thr Ile Tyr Glu Val	Gly	Thr	Thr Lys Asp
305				310 315		320
Val	His	Val Asp	Asp	Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile	Ala	Val Asp Gly
			325 330			335
Gly	Met	Ser Asp	Asn	Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly	Ser	Glu Tyr Asp
		340	345			350
Ala	Arg	Val Val	Ser	Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro	Val	Ser Thr Arg
		355		360		365

Ile Val 370

Gly Ser

His

Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu

375

380

Ile

Tyr

Pro

Ser Asp

Ile

Thr

Ser

Gly Asp

Phe

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

385

390

395

400

Thr

Gly

Ala

Tyr Cys

Tyr

Ala

Met

Ser Ser

Arg

Tyr

Asn

Ala

Phe

Thr

405

410

415

Arg

Pro

Ala

Val

Val

Ser

Val

Arg Ala Gly Ser

Ser

Arg

Leu

Met

Leu

420

425

430

Arg

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Asp

Ile

Leu Ser

Leu

Glu

Ala

435

440

445

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ is (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

TGCCCCTCGA GCTAAATTAG • ·

- 68 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1034 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

io (A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 61..1020 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60

ATG

ACC

AAC

ATC

CGC

GTA

GCT

ATC

GTG

GGC

TAC

GGA

AAC

CTG

GGA

CGC

108

Met

Thr

Asn

Ile

Arg

Val

Ala

Ile

Val

Gly Tyr Gly

Asn

Leu

Gly Arg

1

5

10

15

AGC

GTC

GAA

AAG

CTT

ATT

GCC

AAG

CAG

CCC

GAC

ATG

GAC

CTT

GTA

GGA

156

Ser

Val

Glu

Lys

Leu

Ile

Ala

Lys

Gin

Pro

Asp

Met

Asp

Leu

Val

Gly

20

25

30

ATC

TTC

TCG

CGC

CGG

GCC

ACC

CTC

GAC

ACA

AAG

ACG

CCA

GTC

ΤΓΓ

GAT

204

Ile

Phe

Ser

Arg Arg

Ala

Thr

Leu

Asp

Thr

Lys

Thr

Pro

Val

Phe

Asp

35

40

45

GTC

GCC

GAC

GTG

GAC

AAG

CAC

GCC

GAC

GAC

GTG

GAC

GTG

CTG

TTC

CTG

252

Val

Ala

Asp

Val

Asp

Lys

His

Ala

Asp

Asp

Val

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

50

55

60

TGC

ATG

GGC

TCC

GCC

ACC

GAC

ATC

CCT

GAG

CAG

GCA

CCA

AAG

TTC

GCG

300

Cys

Met

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

Ile

Pro

Glu

Gin

Ala

Pro

Lys

Phe

Ala

65

70

75

80

CAG

TTC

GCC

TGC

ACC

GTA

GAC

ACC

TAC

GAC

AAC

CAC

CGC

GAC

ATC

CCA

348

Gin

Phe

Ala

Cys

Thr

Val

Asp

Thr

Tyr Asp

Asn

His

Arg Asp

Ile

Pro

85

90

95

CGC

CAC

CGC

CAG

GTC

ATG

AAC

GAA

GCC

GCC

ACC

GCA

GCC

GGC

AAC

GTT

396

Arg

His

Arg

Gin

Val

Met

Asn

Glu

Ala

Ala

Thr

Ala

Ala

Gly

Asn

Val

100

105

110

GCA

CTG

GTC

TCT

ACC

GGC

TGG

GAT

CCA

GGA

ATG

TTC

TCC

ATC

AAC

CGC

444

Ala

Leu

Val

Ser

Thr

Gly Trp

Asp

Pro

Gly

Met

Phe

Ser

Ile

Asn

Arg

115

120

125

GTC

TAC

GCA

GCG

GCA

GTC

TTA

GCC

GAG

CAC

CAG

CAG

CAC

ACC

TTC

TGG

492

Val

Tyr

Ala

Ala

Ala

Val

Leu

Ala Glu

His

Gin

Gin

His

Thr

Phe

Trp

130

135

140

GGC

CCA

GGT

TTG

TCA

CAG

GGC

CAC

TCC

GAT

GCT

TTG

CGA

CGC ATC

CCT

540

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser

Gin

Gly

His

Ser

Asp

Ala

Leu

Arg

Arg Ile

Pro

145

150

155

160

GGC

GTT

CAA

AAG

GCA

GTC

CAG

TAC

ACC

CTC

CCA

TCC

GAA

GAC GCC

CTG

588

Gly

Val

Gin

Lys

Ala

Val

Gin

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Glu

Asp Ala

Leu

165

170

175

GAA

AAG

GCC

CGC

CGC

GGC

GAA

GCC

GGC

GAC

CTT

ACC

GGA

AAG CAA

ACC

636

Glu

Lys

Ala

Arg

Arg Gly

Glu

Ala

Gly Asp

Leu

Thr

Gly

Lys Gin

Thr

180

185

190

CAC

AAG

CGC

CAA-TGC

TTC

GTG

GTT

GCC

GAC

GCG

GCC

GAT

CAC GAG

CGC

684

His

Lys

Arg

Gin Cys

Phe

Val

Val

Ala Asp

Ala

Ala

Asp

His Glu

Arg

195

200

205

ATC

GAA

AAC

GAC

ATC

CGC

ACC

ATG

CCT

GAT

TAC

TTC

GTT

GGC TAC

GAA

732

Ile

Glu

Asn

Asp

Ile

Arg

Thr Met

Pro

Asp

Tyr

Phe Val

Gly Tyr

Glu

210

215

220

GTC

GAA

GTC

AAC

TTC

ATC

GAC

GAA

GCA

ACC

TTC

GAC

TCC

GAG CAC

ACC

780

Val

Glu

Val

Asn

Phe

Ile

Asp

Glu

Ala

Thr

Phe

Asp

Ser

Glu His

Thr

225

230

235

240

GGC

ATG

CCA

CAC

GGT

GGC

CAC

GTG

ATT

ACC

ACC

GGC

GAC

ACC GGT

GGC

828

Gly

Met

Pro

His

Gly

Gly

His

Val

Ile

Thr

Thr

Gly

Asp

Thr Gly Gly

245

250

255

TTC

AAC

CAC

ACC

GTG

GAA

TAC

ATC

CTC

AAG

CTC

GAC

CGA

AAC CCA

GAT

876

Phe

Asn

His

Thr

Val

Glu

Tyr

Ile

Leu

Lys

Leu

Asp Arg

Asn Pro

Asp

260

265

270

TTC

ACC

GCT

TCC

TCA

CAG

ATC

GCT

TTC

GCT

CGC

GCA

GCT

CAC CGC

ATG

924

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Gin

Ile

Ala

Phe

Gly Axg

Ala

Ala

His Arg

Met

275

280

285

AAG

CAG

CAG

GGC

CAA

AGC

GGA

GCT

TTC

ACC

GTC

CTC

GAA

GTT GCT

CCA

972

Lys

Gin

Gin

Gly

Gin

Ser

Gly

Ala

Phe

Thr

Val

Leu

Glu

Val Ala

Pro

290

295

300

TAC

CTG

CTC

TCC

CCA

GAG

AAC

TTG

GAC

GAT

CTG

ATC

GCA

CGC GAC

GTC

1020

Tyr

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Asn

Leu

Asp

Asp

Leu

Ile

Ala

Arg Asp

Val

305

310

315

320

TAATTTAGCT CGAG 1034 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 320 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

- 70 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

Met	Thr	Asn	Ile	Arg Val	Ala Ile	Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1				5		10	15
Ser	Val	Glu	Lys	Leu Ile	Ala Lys	Gin Pro	Asp	Met Asp Leu Val Gly
			20			25		30
Ile	Phe	Ser	Arg	Arg Ala	Thr Leu	Asp Thr	Lys	Thr Pro Val Phe Asp
		35			40			45
Val	Ala	Asp	Val	Asp Lys	His Ala	Asp Asp	Val	Asp Val Leu Phe Leu
	50				55			60
Cys	Met	Gly	Ser	Ala Thr	Asp Ile	Pro Glu	Gin	Ala Pro Lys Phe Ala
65				70			75	i 80
Gin	Phe	Ala	Cys	Thr Val	Asp Thr	Tyr Asp	Asn	His Arg Asp Ile Pro
				85		90	95
Arg	His	Arg	Gin	Val Met	Asn Glu	Ala Ala	Thr	Ala Ala Gly Asn Val
			100			105		110
Ala	Leu	Val	Ser	Thr Gly	Trp Asp	Pro Gly	Met	Phe Ser Ile Asn Arg
		115			120		125
Val	Tyr	Ala	Ala	Ala Val	Leu Ala	Glu His	Gin	Gin His Thr Phe Trp
	130				135			140
Gly	Pro	Gly	Leu	Ser Gin	Gly His	Ser Asp	Ala	Leu Arg Arg Ile Pro
145				150			155 160
Gly	Val	Gin	Lys	Ala Val	Gin Tyr	Thr Leu	Pro	Ser Glu Asp Ala Leu
				165		170	175
Glu	Lys	Ala	Arg Arg Gly	Glu Ala	Gly Asp	Leu	Thr Gly Lys Gin Thr
			180			185		190
His	Lys	Arg	Gin	Cys Phe	Val Val	Ala Asp	Ala	Ala Asp His Glu Arg
		195			200		205
Ile	Glu	Asn	Asp	Ile Arg	Thr Met	Pro Asp	Tyr	Phe Val Gly Tyr Glu
	210				215			220
Val	Glu	Val	Asn	Phe Ile	Asp Glu	Ala Thr	Phe	Asp Ser Glu His Thr
225				230			235 240
Gly	Met	Pro	His	Gly Gly	His Val	Ile Thr	Thr	Gly Asp Thr Gly Gly
				245		250	255
Phe	Asn	His	Thr	Val Glu	Tyr Ile	Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
			260			265		270
Phe	Thr	Ala	Ser	Ser Gin	Ile Ala	Phe Gly Arg	Ala Ala His Arg Met
		275			280		285
Lys	Gin	Gin	Gly	Gin Ser	Gly Ala	Phe Thr Val	Leu Glu Val Ala Pro
	290				295			300
Tyr	Leu	Leu	Ser	Pro Glu	Asn Leu Asp Asp Leu	Ile Ala Arg Asp Val
305				310		315 320

Claims (5)

1. Rekombinantní DNA schopná autonomní replikace v buňkách koryneformní bakterie, obsahující sekvenci DNA kódující aspartokinázu, u které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu.

2. Rekombinantní DNA podle nároku 1, dále obsahující sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu.

3. Rekombinantní DNA podle nároku 2, dále obsahující sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu.

4. Rekombinantní DNA podle nároku 3, dále obsahující sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.

5. Rekombinantní DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde uvedenou aspartokinázou, ve které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, je aspartokináza pocházející z koryneformní bakterie, a kde uvedená aspartokináza je mutantní aspartokináza, ve které je v α-podjednotce zaměněn zbytek alaninu v poloze 279, počítáno od N-konce, za zbytek aminokyseliny jiné než alanin a jiné než kyselá aminokyselina, a v β-podjednotce je zaměněn zbytek alaninu v poloze 30 za zbytek aminokyseliny jiné než alanin a jiné než kyselá aminokyselina.

6. Rekombinantní DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde sekvence DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 15 ve výpisu sekvenci nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 15.

7. Rekombinantní DNA podle nároku 2, kde uvedená sekvence kódující dihydrodipikolinát syntázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 11 ve výpisu sekvencí nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 11.

8. Rekombinantní DNA podle nároku 3, kde uvedená sekvence kódující diaminopimelát dekarboxylázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 19 ve výpisu sekvencí nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 19.

9. Rekombinantní DNA podle nároku 4, kde uvedená sekvence kódující diaminopimelát dehydrogenázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 24 ve výpisu sekvencí nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 24.

10. Koryneformní bakterie, vyznačující se tím, ž e nese aspartokinázu, u které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazebně inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a • · • 4 · · · ·· • 4 · ·44 • 4 4 ··· ·· • e 4 · ··

44 ···* ·«·· která obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu.

11. Koryneformní bakterie podle nároku 10, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní

DNA podle nároku 1.

12. Koryneformní bakterie podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu.

13. Koryneformní bakterie podle nároku 12, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní

DNA podle nároku 2.

14. Koryneformní bakterie podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu.

15. Koryneformní bakterie podle nároku 14, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní

DNA podle nároku 3.

16. Koryneformní bakterie podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.

• · • · · · · ·· ♦ · · · * ..........

·«···· ·· ··· · · a · · · · · · · · ······· ···· ·· ·*

17. Koryneformní bakterie podle nároku 16, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní DNA podle nároku 4.

5 18. Způsob výroby L-lyzinu, vyznačující se tím, ž e zahrnuje kroky kultivace uvedené koryneformní bakterie podle některého z nároků 10 až 17 ve vhodném médiu, produkce a akumulace L-lyzinu v kultuře bakterií a izolace Llyzinu z kultury.