JP3106501B2 - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents
Ｌ−リジンの製造法Info
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- JP3106501B2 JP3106501B2 JP09500307A JP50030797A JP3106501B2 JP 3106501 B2 JP3106501 B2 JP 3106501B2 JP 09500307 A JP09500307 A JP 09500307A JP 50030797 A JP50030797 A JP 50030797A JP 3106501 B2 JP3106501 B2 JP 3106501B2
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- lysine
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- coryneform bacterium
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
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- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、アミノ酸などの発酵生産に用いられている
コリネ型細菌に遺伝子操作の手法を用いて改変を加え、
該微生物を培養することによるＬ−リジンの製法に関す
る。
コリネ型細菌に遺伝子操作の手法を用いて改変を加え、
該微生物を培養することによるＬ−リジンの製法に関す
る。
背景技術 飼料添加物として用いられているＬ−リジンは通常、
コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使って発酵法に
より生産されている。現在知られている種々のＬ−リジ
ン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変異により作ら
れている。
コリネ型細菌のＬ−リジン生産変異株を使って発酵法に
より生産されている。現在知られている種々のＬ−リジ
ン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変異により作ら
れている。
一方、コリネ型細菌において、菌体内で自律増殖可能
でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラ
スミド（米国特許第4514502号参照）、遺伝子の菌体へ
の導入方法（特開平２−207791号等）が開示されてお
り、これらの技術を用いたＬ−スレオニンまたはＬ−イ
ソロイシン生産菌育成の可能性が開示されている（米国
特許第4452890号、及び米国特許第4442208号参照）。ま
た、Ｌ−リジン生産菌育成に関しても、ベクタープラス
ミドにＬ−リジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、
菌体内で増幅させる技術（特開昭56−160997号などがあ
る）が知られている。
でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベクタープラ
スミド（米国特許第4514502号参照）、遺伝子の菌体へ
の導入方法（特開平２−207791号等）が開示されてお
り、これらの技術を用いたＬ−スレオニンまたはＬ−イ
ソロイシン生産菌育成の可能性が開示されている（米国
特許第4452890号、及び米国特許第4442208号参照）。ま
た、Ｌ−リジン生産菌育成に関しても、ベクタープラス
ミドにＬ−リジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、
菌体内で増幅させる技術（特開昭56−160997号などがあ
る）が知られている。
Ｌ−リジン生合成遺伝子としては、例えば、ジヒドロ
ジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（特開平７−75578）
やジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ishin
o,S.et al.,Nucleic Acids Res.,15,3917（1987））の
ように、Ｌ−リジン生合成に関与する遺伝子をクローニ
ングした例や、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子（特開昭60−87788）、ジヒドロジピコリン
酸シンターゼ遺伝子（特公平６−55149）、ジアミノピ
メリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60−6299
4）のように、遺伝子の増幅がＬ−リジン生産性に影響
を与える例が知られている。
ジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（特開平７−75578）
やジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ishin
o,S.et al.,Nucleic Acids Res.,15,3917（1987））の
ように、Ｌ−リジン生合成に関与する遺伝子をクローニ
ングした例や、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子（特開昭60−87788）、ジヒドロジピコリン
酸シンターゼ遺伝子（特公平６−55149）、ジアミノピ
メリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60−6299
4）のように、遺伝子の増幅がＬ−リジン生産性に影響
を与える例が知られている。
また、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素のうち、野生
型ではフィードバック阻害を受ける酵素について、フィ
ードバック阻害が解除された変異を有する酵素遺伝子を
導入してＬ−リジン生産性を向上させた例も知られてい
る。このような遺伝子として具体的には、アスパルトキ
ナーゼ遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）等が
知られている。
型ではフィードバック阻害を受ける酵素について、フィ
ードバック阻害が解除された変異を有する酵素遺伝子を
導入してＬ−リジン生産性を向上させた例も知られてい
る。このような遺伝子として具体的には、アスパルトキ
ナーゼ遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）等が
知られている。
上記のように、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増幅、ある
いは変異遺伝子の導入によって、一定の成果が得られて
いる。例えば、リジン及びスレオニンによる協奏阻害が
解除された変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を保持する
コリネ型細菌は、Ｌ−リジンを著量（約25g/L）生産す
る。但し、該細菌は、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
を保持しない細菌と比較して生育速度が低下する。ま
た、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子に加え、さらにジ
ヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入することに
よってＬ−リジン生産性が向上するとの報告（Applied
and Environmental Microbiology 57（６）,1746−1752
（1991））もある。但し、概細菌は、生育速度が一層低
下する。
いは変異遺伝子の導入によって、一定の成果が得られて
いる。例えば、リジン及びスレオニンによる協奏阻害が
解除された変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を保持する
コリネ型細菌は、Ｌ−リジンを著量（約25g/L）生産す
る。但し、該細菌は、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
を保持しない細菌と比較して生育速度が低下する。ま
た、変異型アスパルトキナーゼ遺伝子に加え、さらにジ
ヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子を導入することに
よってＬ−リジン生産性が向上するとの報告（Applied
and Environmental Microbiology 57（６）,1746−1752
（1991））もある。但し、概細菌は、生育速度が一層低
下する。
一方、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子につ
いては、これを導入したコリネ型細菌のジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ活性が上昇したことは示されている
が、Ｌ−リジン生産性への影響については報告されてい
ない（特開平７−75578）。
いては、これを導入したコリネ型細菌のジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ活性が上昇したことは示されている
が、Ｌ−リジン生産性への影響については報告されてい
ない（特開平７−75578）。
また、コリネ型細菌においては、Ｌ−リジン生合成遺
伝子を複数個組み合わせ、生育を抑制せずにＬ−リジン
収率の大幅な改善に成功した例は知られていないのが現
状である。また、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増強により
生育の改善が図られた例も報告されていない。
伝子を複数個組み合わせ、生育を抑制せずにＬ−リジン
収率の大幅な改善に成功した例は知られていないのが現
状である。また、Ｌ−リジン生合成遺伝子の増強により
生育の改善が図られた例も報告されていない。
発明の開示 本発明の課題は、コリネ型細菌の細胞中のＬ−リジン
生合成の重要な酵素であるアスパルトキナーゼ（以下
「AK」ともいう。AK蛋白をコードする遺伝子を以下「ly
sC」ともいう。）、ジアミノピメリン酸レダクターゼ
（以下「DDPR」ともいう。DDPR蛋白をコードする遺伝子
を以下「dapB」ともいう。）、ジヒドロジピコリン酸シ
ンターゼ（「以下「DDPS」と略す。DDPS蛋白をコードす
る遺伝子を以下「dapA」ともいう。）、ジヒドロジピコ
リ酸デカルボキシラーゼ（以下「DDC」ともいう。DDC蛋
白をコードする遺伝子を以下「lysA」ともいう。）、及
びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「DD
H」ともいう。DDH蛋白をコードする遺伝子を以下「dd
h」ともいう。）の各々をコードするDNA配列を遺伝子材
料に用い、コリネ型細菌のＬ−リジン生産能及び生育速
度を改善しようというものである。
生合成の重要な酵素であるアスパルトキナーゼ（以下
「AK」ともいう。AK蛋白をコードする遺伝子を以下「ly
sC」ともいう。）、ジアミノピメリン酸レダクターゼ
（以下「DDPR」ともいう。DDPR蛋白をコードする遺伝子
を以下「dapB」ともいう。）、ジヒドロジピコリン酸シ
ンターゼ（「以下「DDPS」と略す。DDPS蛋白をコードす
る遺伝子を以下「dapA」ともいう。）、ジヒドロジピコ
リ酸デカルボキシラーゼ（以下「DDC」ともいう。DDC蛋
白をコードする遺伝子を以下「lysA」ともいう。）、及
びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「DD
H」ともいう。DDH蛋白をコードする遺伝子を以下「dd
h」ともいう。）の各々をコードするDNA配列を遺伝子材
料に用い、コリネ型細菌のＬ−リジン生産能及び生育速
度を改善しようというものである。
微生物を用いた物質の発酵生産を行なう場合、投入し
た原料に対する目的物質の収率と並んで、生産速度は極
めて重要な因子であり、設備当りの生産速度を上げるこ
とにより目的物質を大幅に安価に製造することが出来
る。そのため、発酵収率と生産速度を両立させることは
工業的に極めて重要である。本発明は、コリネ型細菌を
用いたＬ−リジンの発酵生産を行なうに当たり、以上の
様な問題点の解決方法を提示するものである。
た原料に対する目的物質の収率と並んで、生産速度は極
めて重要な因子であり、設備当りの生産速度を上げるこ
とにより目的物質を大幅に安価に製造することが出来
る。そのため、発酵収率と生産速度を両立させることは
工業的に極めて重要である。本発明は、コリネ型細菌を
用いたＬ−リジンの発酵生産を行なうに当たり、以上の
様な問題点の解決方法を提示するものである。
本発明の要旨は、コリネ型細菌において、リジン及び
スレオニンによる協演阻害が解除された変異型AK（以
下、単に「変異型AK」ともいう。）をコードする変異型
lysC（以下、単に「変異型lysC」ともいう。）にdapBを
組み合せて増強する事により、lysCを単独で増強した場
合と比べ、生育が改善され、Ｌ−リジン生産速度を向上
させることができること、更にdapA、lysA、ddhを順次
増強することにより、段階的にＬ−リジン生産速度を向
上できることにある。
スレオニンによる協演阻害が解除された変異型AK（以
下、単に「変異型AK」ともいう。）をコードする変異型
lysC（以下、単に「変異型lysC」ともいう。）にdapBを
組み合せて増強する事により、lysCを単独で増強した場
合と比べ、生育が改善され、Ｌ−リジン生産速度を向上
させることができること、更にdapA、lysA、ddhを順次
増強することにより、段階的にＬ−リジン生産速度を向
上できることにある。
すなわち本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンに
よるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパル
トキナーゼをコードするDNA配列、及びジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼをコードするDNA配列を含み、コリ
ネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAである。ま
た、上記各DNA配列に加えてジヒドロジピコリン酸シン
ターゼをコードするDNA配列をさらに含む組換えDNAを提
供する。さらに、上記３種のDNA配列に加えてジアミノ
ピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA配列を
さらに含む組換えDNAを提供する。また更に、上記４種
のDNA配列に加えてジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードするDNA配列をさらに含む組換えDNAを提供す
る。
よるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパル
トキナーゼをコードするDNA配列、及びジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼをコードするDNA配列を含み、コリ
ネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAである。ま
た、上記各DNA配列に加えてジヒドロジピコリン酸シン
ターゼをコードするDNA配列をさらに含む組換えDNAを提
供する。さらに、上記３種のDNA配列に加えてジアミノ
ピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA配列を
さらに含む組換えDNAを提供する。また更に、上記４種
のDNA配列に加えてジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼをコードするDNA配列をさらに含む組換えDNAを提供す
る。
また、本発明は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによ
るフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルト
キナーゼを保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼをコードするDNAが増強されたコリネ型細菌を提
供する。さらに、このコリネ型細菌において、さらにジ
ヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするDNAが増強
されたコリネ型細菌を提供する。さらにまた、このコリ
ネ型細菌において、前記の３種のDNAに加えてジアミノ
ピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするDNAが増強
されたコリネ型細菌を提供する。また、前記コリネ型細
菌において、前記の４種のDNAに加えて、ジアミノピメ
リン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAが増強された
コリネ型細菌を提供する。
るフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルト
キナーゼを保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼをコードするDNAが増強されたコリネ型細菌を提
供する。さらに、このコリネ型細菌において、さらにジ
ヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするDNAが増強
されたコリネ型細菌を提供する。さらにまた、このコリ
ネ型細菌において、前記の３種のDNAに加えてジアミノ
ピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするDNAが増強
されたコリネ型細菌を提供する。また、前記コリネ型細
菌において、前記の４種のDNAに加えて、ジアミノピメ
リン酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAが増強された
コリネ型細菌を提供する。
さらに本発明は、上記のいずれかのコリネ型細菌を好
適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積
せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴
とするＬ−リジンの製造法を提供するものである。
適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積
せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴
とするＬ−リジンの製造法を提供するものである。
尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バージーズ・
マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriolog
y）第８版599頁（1974）に定義されている一群の微生物
であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を
有しない桿菌であり。コリネバクテリウム属細菌、及び
従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリ
ネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリ
ウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に
近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriolog
y）第８版599頁（1974）に定義されている一群の微生物
であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を
有しない桿菌であり。コリネバクテリウム属細菌、及び
従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリ
ネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリ
ウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に
近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明に用いられるＬ−リジン生合成遺伝子の取
得 本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子は、DNA供与
体である細菌から染色体DNAを調製し、プラスミドベク
ター等を用いて染色体DNAライブラリーを作製し、この
ライブラリーから所望の遺伝子を保持する株を選択し、
選択された株からその遺伝子が挿入された組換えDNAを
回収することによって得られる。本発明に用いるＬ−リ
ジン生合成遺伝子のDNA供与体としては、所望のＬ−リ
ジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能する酵素
タンパク質を発現するものであれば、特に制限されない
が、コリネ型細菌が好ましい。
得 本発明に用いるＬ−リジン生合成遺伝子は、DNA供与
体である細菌から染色体DNAを調製し、プラスミドベク
ター等を用いて染色体DNAライブラリーを作製し、この
ライブラリーから所望の遺伝子を保持する株を選択し、
選択された株からその遺伝子が挿入された組換えDNAを
回収することによって得られる。本発明に用いるＬ−リ
ジン生合成遺伝子のDNA供与体としては、所望のＬ−リ
ジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能する酵素
タンパク質を発現するものであれば、特に制限されない
が、コリネ型細菌が好ましい。
コリネ型細菌由来のlysC、dapA及びdapB遺伝子は、い
ずれも配列が知られているので、ポリメラーゼチェイン
リアクション法（PCR polymerase chain reaction;Whi
te,T.J.et al;Trends Genet.5,185（1989）参照）によ
って増幅することにより取得することができる。
ずれも配列が知られているので、ポリメラーゼチェイン
リアクション法（PCR polymerase chain reaction;Whi
te,T.J.et al;Trends Genet.5,185（1989）参照）によ
って増幅することにより取得することができる。
以下に、本発明に用いる各Ｌ−リジン生合成遺伝子を
取得する方法を例示する。
取得する方法を例示する。
（１）変異型lysCの取得 変異型lysCを含むDNA断片は、AK活性に対するＬ−リ
ジン及びＬ−スレオニによる相乗的なフィードバック阻
害が実質的に解除された変異株から調製することができ
る（WO94/25605国際公開パンフレット）。このような変
異株は、例えば、コリネ型細菌野生株に、通常の変異処
理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）等の変異剤処理を施し、
変異処理した細胞郡の中から取得することができる。AK
活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal of Bioc
hemistry（1968）,63（２）,139−148に記載される方法
を用いることができる。このような変異株として、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacteri
um lactofermentum）野生株ATCC13869株（現在の名称
は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacter
ium glutamicum）に変更されている）より変異処理によ
り誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3445（FERM P−1944）
が最も好ましいものとして挙げられる。
ジン及びＬ−スレオニによる相乗的なフィードバック阻
害が実質的に解除された変異株から調製することができ
る（WO94/25605国際公開パンフレット）。このような変
異株は、例えば、コリネ型細菌野生株に、通常の変異処
理法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）等の変異剤処理を施し、
変異処理した細胞郡の中から取得することができる。AK
活性の測定は、Miyajima,R et al;The Journal of Bioc
hemistry（1968）,63（２）,139−148に記載される方法
を用いることができる。このような変異株として、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacteri
um lactofermentum）野生株ATCC13869株（現在の名称
は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacter
ium glutamicum）に変更されている）より変異処理によ
り誘導されたＬ−リジン生産菌AJ3445（FERM P−1944）
が最も好ましいものとして挙げられる。
また、変異型lysCは、野生型lysCを含むプラスミドDN
Aをインビトロ変異処理することによっても得られる。
さらに、AKのＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗
的なフィードバック阻害を解除する変異が具体的に知ら
れている（WO94/25605国際公開パンフレット）ので、こ
の情報に基づいて部位特異的変異法等により、野生型ly
sCから調製することもできる。
Aをインビトロ変異処理することによっても得られる。
さらに、AKのＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗
的なフィードバック阻害を解除する変異が具体的に知ら
れている（WO94/25605国際公開パンフレット）ので、こ
の情報に基づいて部位特異的変異法等により、野生型ly
sCから調製することもできる。
コリネ型細菌からlysCを単離するには、例えば、斎
藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophy
s.Acta,72,619,（1963））等により染色体DNAを調製
し、ポリメラーゼチェインリアクション法（PCR:polyme
rase chain reaction;White,T.J.et al;Trends Genet.
5,185（1989）参照）により、lysCを増幅することによ
って行うことができる。
藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miura Biochem.Biophy
s.Acta,72,619,（1963））等により染色体DNAを調製
し、ポリメラーゼチェインリアクション法（PCR:polyme
rase chain reaction;White,T.J.et al;Trends Genet.
5,185（1989）参照）により、lysCを増幅することによ
って行うことができる。
DNAプライマーとしては、例えば、コリネバクテリウ
ム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Mole
cular Microbiology（1991）,5（５）,1197−1204,Mol.
Gen.Genet.（1990）224,317−324参照）を基にして、ly
sCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列表配
列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する23mer
及び21merの一本鎖DNAが挙げられる。DNAの合成はAppli
ed Biosystems社製DNA合成機model 380Bを使用し、ホス
ホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters（198
1）,22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応
は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラーPJ2000型を
用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定さ
れた方法に従って行うことができる。
ム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Mole
cular Microbiology（1991）,5（５）,1197−1204,Mol.
Gen.Genet.（1990）224,317−324参照）を基にして、ly
sCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列表配
列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する23mer
及び21merの一本鎖DNAが挙げられる。DNAの合成はAppli
ed Biosystems社製DNA合成機model 380Bを使用し、ホス
ホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters（198
1）,22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反応
は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラーPJ2000型を
用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定さ
れた方法に従って行うことができる。
PCR法により増幅されたlysCは、E.coli及び／又はコ
リネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDN
Aに接続して組換えDNAを調製し、これをE.coli細胞に導
入しておくと、後の操作がしやすくなる。E.coli細胞内
において自律複製可能なベクターとしては、プラスミド
ベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なも
のが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
リネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDN
Aに接続して組換えDNAを調製し、これをE.coli細胞に導
入しておくと、後の操作がしやすくなる。E.coli細胞内
において自律複製可能なベクターとしては、プラスミド
ベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なも
のが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
また、これらのベクターにコリネ型細菌中でプラスミ
ドを自律複製可能にする能力をもつDNA断片を挿入する
と、E.coli及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ない
わゆるシャトルベクターとして使用することができる。
ドを自律複製可能にする能力をもつDNA断片を挿入する
と、E.coli及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ない
わゆるシャトルベクターとして使用することができる。
このようなシャトルベクトーとしては、以下のものが
挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物
及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。
挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物
及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。
pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617（FERM BP−353
2） pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882（FERM BP−136） コリネバクテリウム・グルタミカムSR8201（A
TCC39135） pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ1883（FERM BP−137） コリネバクテリウム・グルタミカムSR8202（A
TCC39136） pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884（FERM BP−138） pAJ3148 コリネバクテリウム・グルタミカムSR8203（A
TCC339137） pAJ440 バチルス・ズブチリスAJ11901（FERM BP−14
0） これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして
得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及
びSDSを用いて溶菌し、3000×ｇで遠心分離して溶解物
から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セ
シウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配
遠心分離により分別精製する。
2） pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882（FERM BP−136） コリネバクテリウム・グルタミカムSR8201（A
TCC39135） pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ1883（FERM BP−137） コリネバクテリウム・グルタミカムSR8202（A
TCC39136） pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884（FERM BP−138） pAJ3148 コリネバクテリウム・グルタミカムSR8203（A
TCC339137） pAJ440 バチルス・ズブチリスAJ11901（FERM BP−14
0） これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして
得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及
びSDSを用いて溶菌し、3000×ｇで遠心分離して溶解物
から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セ
シウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配
遠心分離により分別精製する。
E.coliにプラスミドを導入して形質転換するにはD.M.
Morrisonの方法（Methods in Enzymology,68,326,197
9）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNA
の透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Bi
ol.,53,159（1970））等により行うことができる。
Morrisonの方法（Methods in Enzymology,68,326,197
9）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNA
の透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Bi
ol.,53,159（1970））等により行うことができる。
上記のようにしてAK野生株からlysCを単離すれば野生
型lysCが得られ、AK変異株からlysCを単離すれば変異型
lysCが得られる。
型lysCが得られ、AK変異株からlysCを単離すれば変異型
lysCが得られる。
野生型lysCを含むDNA断片の塩基配列の一例を、配列
表配列番号３に示す。この塩基配列より推定される野生
型AKタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をDNA
配列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみ
を配列番号５に示す。また、DNA塩基配列より推定され
る野生型AKタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列
をDNAと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列の
みを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始
コドンにGTGが用いられており、対応するアミノ酸をメ
チオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリ
ン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
表配列番号３に示す。この塩基配列より推定される野生
型AKタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をDNA
配列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみ
を配列番号５に示す。また、DNA塩基配列より推定され
る野生型AKタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列
をDNAと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列の
みを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始
コドンにGTGが用いられており、対応するアミノ酸をメ
チオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリ
ン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
本発明に用いる変異型lysCとしては、Ｌ−リジン及び
Ｌ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解
除されたAKをコードするものであれば特に制限されない
が、野生型AKのアミノ酸配列において、αサブユニット
ではＮ末端から279番目のアラニン残基がアラニン以外
かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニッ
トでは30番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性ア
ミノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられ
る。ここで、野生型AKのアミノ酸配列としては、具体的
にはαサブユニットでは配列表配列番号５に示すアミノ
酸配列が、βサブユニットでは配列表配列番号７に示す
アミノ酸配列が挙げられる。
Ｌ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解
除されたAKをコードするものであれば特に制限されない
が、野生型AKのアミノ酸配列において、αサブユニット
ではＮ末端から279番目のアラニン残基がアラニン以外
かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニッ
トでは30番目のアラニン残基がアラニン以外かつ酸性ア
ミノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられ
る。ここで、野生型AKのアミノ酸配列としては、具体的
にはαサブユニットでは配列表配列番号５に示すアミノ
酸配列が、βサブユニットでは配列表配列番号７に示す
アミノ酸配列が挙げられる。
また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のア
ミノ酸残基として好ましいものは、スレオニン残基、ア
ルギニン残基、システイン残基、フェニルアラニン残
基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基及びバリ
ン残基が挙げられる。
ミノ酸残基として好ましいものは、スレオニン残基、ア
ルギニン残基、システイン残基、フェニルアラニン残
基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基及びバリ
ン残基が挙げられる。
尚、置換されるアミノ酸残基に対応するコドンは、そ
のアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問
わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型
AKのアミノ酸配列がわずかに相異するものがあると予想
される。このような酵素の活性に関与しない１又は２以
上の位置での１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失
あるいは挿入等による変異を有するAKも本発明に使用す
ることができる。さらに、AK活性、及びＬ−リジン及び
Ｌ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解
除に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミ
ノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するAK
も使用できる。
のアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問
わない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型
AKのアミノ酸配列がわずかに相異するものがあると予想
される。このような酵素の活性に関与しない１又は２以
上の位置での１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失
あるいは挿入等による変異を有するAKも本発明に使用す
ることができる。さらに、AK活性、及びＬ−リジン及び
Ｌ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解
除に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミ
ノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するAK
も使用できる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株
であるAJ12036株（FERM P−734）に変異型lysCプラスミ
ドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、1992年４月10日に
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番
号305日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託
番号FERM P−12918として寄託され、1995年２月10日に
ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP
−4999の受託番号で寄託されている。
であるAJ12036株（FERM P−734）に変異型lysCプラスミ
ドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、1992年４月10日に
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番
号305日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託
番号FERM P−12918として寄託され、1995年２月10日に
ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP
−4999の受託番号で寄託されている。
（２）dapBの取得 dapBを含むDNA断片は、コリネ型細菌染色体からPCRに
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
DDPRをコードするDNA配列は、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムにおいて既知であり（Journal of
Bacteriology 175（９）,2743−2749（1993））、これ
を基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができ
る。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列
表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有する各々23
merのDNAが挙げられる。DNAの合成、PCR反応、得られた
dapBを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と
同様にして行うことができる。
ラクトファーメンタムにおいて既知であり（Journal of
Bacteriology 175（９）,2743−2749（1993））、これ
を基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができ
る。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列
表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有する各々23
merのDNAが挙げられる。DNAの合成、PCR反応、得られた
dapBを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と
同様にして行うことができる。
dapBを含むDNA断片の塩基配列及びこの配列から予想
されるアミノ酸配列を配列番号10に示す。また、アミノ
酸配列のみを配列番号11に示す。本発明には、このアミ
ノ酸配列をコードするDNA断片の他、配列番号11に示す
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわち
DDPR活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のア
ミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有する
アミノ酸配列をコードするDNA断片も同様に使用でき
る。
されるアミノ酸配列を配列番号10に示す。また、アミノ
酸配列のみを配列番号11に示す。本発明には、このアミ
ノ酸配列をコードするDNA断片の他、配列番号11に示す
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわち
DDPR活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のア
ミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有する
アミノ酸配列をコードするDNA断片も同様に使用でき
る。
E.coliJM109株に後記実施例で得られたdapBを含むプ
ラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107
株は、1995年５月26日より通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号305日本国茨城県つくば市
東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−5114の受託番
号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
ラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107
株は、1995年５月26日より通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号305日本国茨城県つくば市
東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−5114の受託番
号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（３）dapAの取得 dapAを含むDNA断片は、コリネ型細菌染色体からPCRに
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトフォーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトフォーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
DDPSをコードするDNA配列は、コリネバクテリウム・
グルタミカムにおいて既知であり（Nucleic Acids Rese
arch 18（21）,6421（1990）、EMBL accession No.X539
93参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製す
ることができる。このようなDNAプライマーとして具体
的には、配列表の配列番号12及び13に記載の塩基配列を
有する各々23merのDNAが挙げられる。DNAの合成、PCR反
応、得られたdapAを含むプラスミドの調製等は、前記の
lysCの場合と同様にして行うことができる。
グルタミカムにおいて既知であり（Nucleic Acids Rese
arch 18（21）,6421（1990）、EMBL accession No.X539
93参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製す
ることができる。このようなDNAプライマーとして具体
的には、配列表の配列番号12及び13に記載の塩基配列を
有する各々23merのDNAが挙げられる。DNAの合成、PCR反
応、得られたdapAを含むプラスミドの調製等は、前記の
lysCの場合と同様にして行うことができる。
dapAを含むDNA断片の塩基配列及びこの配列から予想
されるアミノ酸配列の一例を配列番号14に示す。また、
アミノ酸配列のみを配列番号15に示す。本発明には、こ
のアミノ酸配列をコードするDNA断片の他、配列番号15
に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、す
なわちDDPS活性に実質的に影響がない限り、１又は２以
上のアミノ酸の置換、欠失、挿入等による変異を有する
アミノ酸配列をコードするDNA断片も同様に使用でき
る。
されるアミノ酸配列の一例を配列番号14に示す。また、
アミノ酸配列のみを配列番号15に示す。本発明には、こ
のアミノ酸配列をコードするDNA断片の他、配列番号15
に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、す
なわちDDPS活性に実質的に影響がない限り、１又は２以
上のアミノ酸の置換、欠失、挿入等による変異を有する
アミノ酸配列をコードするDNA断片も同様に使用でき
る。
E.coliJM109株に後記実施例で得られたdapAを含むプ
ラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106
株は、1995年５月26日より通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号305日本茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−5113の受託番号
で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
ラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106
株は、1995年５月26日より通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所（郵便番号305日本茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−5113の受託番号
で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（４）lysAの取得 lysAを含むDNA断片は、コリネ型細菌染色体からPCRに
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトフォーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトフォーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
コリネ型細菌においては、lysAはargS（アルギニル−
tRNAシンターゼ遺伝子）とともにオペロンを形成してお
り、argSの下流にlysAが存在している。lysAの発現は、
argSの上流にあるプロモーターによって調節を受ける
（Journal of Bacteriology Nov.,7356−7362（1993）
参照）。これらの遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムにおいて既知であり（Molecular Mi
crobiology 4（11）,1819−1830（1990）、Molecular a
nd General Genetics 212,112−119（1988）参照）、こ
れを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができ
る。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列
表の配列番号16（Molecular Microbiology 4（11）,181
9−1830（1990）に記載されている塩基配列において塩
基番号11〜33に相当する）及び配列番号17（Molecular
and General Genetics 212,122−119（1988）に記載の
塩基配列において塩基番号1370〜1392に相当する）に示
す塩基配列を有する各々23merのDNAが挙げられる。DNA
の合成、PCR反応、得られたlysAを含むプラスミドの調
製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができ
る。
tRNAシンターゼ遺伝子）とともにオペロンを形成してお
り、argSの下流にlysAが存在している。lysAの発現は、
argSの上流にあるプロモーターによって調節を受ける
（Journal of Bacteriology Nov.,7356−7362（1993）
参照）。これらの遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムにおいて既知であり（Molecular Mi
crobiology 4（11）,1819−1830（1990）、Molecular a
nd General Genetics 212,112−119（1988）参照）、こ
れを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができ
る。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列
表の配列番号16（Molecular Microbiology 4（11）,181
9−1830（1990）に記載されている塩基配列において塩
基番号11〜33に相当する）及び配列番号17（Molecular
and General Genetics 212,122−119（1988）に記載の
塩基配列において塩基番号1370〜1392に相当する）に示
す塩基配列を有する各々23merのDNAが挙げられる。DNA
の合成、PCR反応、得られたlysAを含むプラスミドの調
製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができ
る。
後記実施例では、lysAを増強するために、プロモータ
ー、argS及びlysAを含むDNA断片を用いたが、argSは本
発明に必須ではなく、lysAがプロモーターの直下に連結
されたDNA断片を用いてもよい。
ー、argS及びlysAを含むDNA断片を用いたが、argSは本
発明に必須ではなく、lysAがプロモーターの直下に連結
されたDNA断片を用いてもよい。
argS及びlysAを含むDNA断片の塩基配列及びこの配列
がコードすると予想されるアミノ酸配列の一例を配列番
号18に示す。また、argSがコードするアミノ酸配列の一
例を配列番号19に、lysAがコードするアミノ酸配列の一
例を配列番号20に示す。本発明には、このアミノ酸配列
をコードするDNA断片の他、配列番号20に示すアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちDDC活性
に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の
置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸
配列をコードするDNA断片も同様に使用できる。
がコードすると予想されるアミノ酸配列の一例を配列番
号18に示す。また、argSがコードするアミノ酸配列の一
例を配列番号19に、lysAがコードするアミノ酸配列の一
例を配列番号20に示す。本発明には、このアミノ酸配列
をコードするDNA断片の他、配列番号20に示すアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちDDC活性
に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の
置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸
配列をコードするDNA断片も同様に使用できる。
（５）ddhの取得 ddhを含むDNA断片は、コリネ型細菌染色体からPCRに
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
より調製することができる。DNA供与菌としては特に制
限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムATCC13869株が挙げられる。
DDH遺伝子は、コリネバクテリウム グルタミカムに
おいて既知であり（Ishino,S.et al.,Nucleic Acids Re
s.,15,3917（1987））、これを基にしてPCR用プライマ
ーを調製することができる。このようなDNAプライマー
として具体的には、配列表の配列番号21及び22に記載の
塩基配列を有する各々20merのDNAが挙げられる。DNAの
合成、PCR反応、得られたddhを含むプラスミドの調製等
は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
おいて既知であり（Ishino,S.et al.,Nucleic Acids Re
s.,15,3917（1987））、これを基にしてPCR用プライマ
ーを調製することができる。このようなDNAプライマー
として具体的には、配列表の配列番号21及び22に記載の
塩基配列を有する各々20merのDNAが挙げられる。DNAの
合成、PCR反応、得られたddhを含むプラスミドの調製等
は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
ddhを含むDNA断片の塩基配列及びこの配列から予想さ
れるアミノ酸配列を配列番号23に示す。また、アミノ酸
配列のみを配列番号24に示す。本発明には、このアミノ
酸配列をコードするDNA断片の他、配列番号24に示すア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちDD
H活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミ
ノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するア
ミノ酸配列をコードするDNA断片も同様に使用できる。
れるアミノ酸配列を配列番号23に示す。また、アミノ酸
配列のみを配列番号24に示す。本発明には、このアミノ
酸配列をコードするDNA断片の他、配列番号24に示すア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちDD
H活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミ
ノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するア
ミノ酸配列をコードするDNA断片も同様に使用できる。
＜２＞本発明の組換えDNA及びコリネ型細菌 本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオ
ニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたア
スパルトキナーゼ（変異型AK）を保持し、さらにジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼをコードするDNA（dapB）
が増強されたものである。本発明のコリネ型細菌として
好ましい態様は、さらに、ジヒドロジピコリン酸シンタ
ーゼをコードするDNA（dapA）が増強されたコリネ型細
菌である。本発明のコリネ型細菌としてさらに好ましい
態様は、さらに、ジアミノピメリン酸デカルボキシラー
ゼをコードするDNA（lysA）が増強されたコリネ型細菌
である。本発明のコリネ型細菌としてより好ましい態様
は、さらに、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするDNA（ddh）が増強されたコリネ型細菌である。
ニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたア
スパルトキナーゼ（変異型AK）を保持し、さらにジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼをコードするDNA（dapB）
が増強されたものである。本発明のコリネ型細菌として
好ましい態様は、さらに、ジヒドロジピコリン酸シンタ
ーゼをコードするDNA（dapA）が増強されたコリネ型細
菌である。本発明のコリネ型細菌としてさらに好ましい
態様は、さらに、ジアミノピメリン酸デカルボキシラー
ゼをコードするDNA（lysA）が増強されたコリネ型細菌
である。本発明のコリネ型細菌としてより好ましい態様
は、さらに、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするDNA（ddh）が増強されたコリネ型細菌である。
ここでDNAを「増強」とは、遺伝子のコピー数を高く
する、プロモーターを強力なものを使用する、比活性の
高い酵素をコードする遺伝子を使用する、あるいはこれ
らを組み合わせるなどして、そのDNAによりコードされ
る酵素の細胞中の活性を高くすることをいう。
する、プロモーターを強力なものを使用する、比活性の
高い酵素をコードする遺伝子を使用する、あるいはこれ
らを組み合わせるなどして、そのDNAによりコードされ
る酵素の細胞中の活性を高くすることをいう。
変異型AKを保持するコリネ型細菌としては、突然変異
によって変異型アスパルトキナーゼを産生するようにな
ったものでもよく、また、変異型lysCを導入することに
よって形質転換されたものでもよい。
によって変異型アスパルトキナーゼを産生するようにな
ったものでもよく、また、変異型lysCを導入することに
よって形質転換されたものでもよい。
上記DNAを導入するコリネ型細菌の例としては、例え
ば次のようなＬ−リジン生産性野生株が挙げられる。
ば次のようなＬ−リジン生産性野生株が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869 （コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340（FERM BP−1539） また、上記菌株以外にも、これらの菌株から誘導され
たＬ−リジン生産能を有する変異株等も、宿主として利
用できる。この様な人工変異株としては次の様なものが
ある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、
「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B−114
70）、特公昭56−1914号、特公昭56−1915号、特公昭57
−14157号、特公昭57−14158号、特公昭57−30474号、
特公昭58−10075号、特公昭59−4993号、特公昭61−358
40号、特公昭62−24074号、特公昭62−36673号、特公平
５−11958号、特公平７−12437号、特公平７−112438号
参照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要
とする変異株（特公昭48−28078号、特公昭56−6499
号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモ
セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異
株（米国特許第3708395号及び第3825472号）、DL−α−
アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラ
クタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノ
イド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン
生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラ
ーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン
生産変異株（特開昭50−53588号、特開昭50−31093号、
特開昭52−102498号、特開昭53−9394号、特開昭53−86
089号、特開昭55−9783号、特開昭55−9759号、特開昭5
6−32995号、特開昭56−39778号、特公昭53−43591号、
特公昭53−1833号）、イノシトールまたは酢酸を要求す
るＬ−リジン生産変異株（特開昭55−9784号、特開昭56
−8692号）、フルオロピルビン酸または34℃以上の温度
に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55
−9783号、特開昭53−86090号）、エチレングリコール
に耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウ
ム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特
許第4411997号）。
たＬ−リジン生産能を有する変異株等も、宿主として利
用できる。この様な人工変異株としては次の様なものが
ある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、
「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B−114
70）、特公昭56−1914号、特公昭56−1915号、特公昭57
−14157号、特公昭57−14158号、特公昭57−30474号、
特公昭58−10075号、特公昭59−4993号、特公昭61−358
40号、特公昭62−24074号、特公昭62−36673号、特公平
５−11958号、特公平７−12437号、特公平７−112438号
参照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要
とする変異株（特公昭48−28078号、特公昭56−6499
号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモ
セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異
株（米国特許第3708395号及び第3825472号）、DL−α−
アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラ
クタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノ
イド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン
生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラ
ーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン
生産変異株（特開昭50−53588号、特開昭50−31093号、
特開昭52−102498号、特開昭53−9394号、特開昭53−86
089号、特開昭55−9783号、特開昭55−9759号、特開昭5
6−32995号、特開昭56−39778号、特公昭53−43591号、
特公昭53−1833号）、イノシトールまたは酢酸を要求す
るＬ−リジン生産変異株（特開昭55−9784号、特開昭56
−8692号）、フルオロピルビン酸または34℃以上の温度
に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55
−9783号、特開昭53−86090号）、エチレングリコール
に耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウ
ム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特
許第4411997号）。
上記のような宿主においてＬ−リジン生合成遺伝子を
増強するには、具体的な例としては、これらの遺伝子を
プラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクタ
ー等を用いて宿主に導入する。その際、低コピー型のベ
クターを用いてもある程度の増強は期待できるが、マル
チコピー型のベクターを用いることが好ましい。そのよ
うなベクターとして、上記pAJ655、pAJ1844、pAJ611、p
AJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクターが挙げられ
る。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾンは、WO02
/0267国際公開パンフレット、WO93/18151国際公開パン
フレット、欧州特許公開0445385号、特開平６−46867
号、Vertes,A.A.et al.,Mol.Microbiol.,11,739−746
（1994）、Bonamy,C.,et al,Mol.Microbiol.,14,571−5
81（1994）、Vertes,A.A.et al.,Mol.Gen.Genet.,245,3
97−405（1994）、Jagar,W.et al.,FEMS Microbiology
Letters,126,1−６（1995）、特開平７−107976号、特
開平７−327680号等に記載されている。
増強するには、具体的な例としては、これらの遺伝子を
プラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクタ
ー等を用いて宿主に導入する。その際、低コピー型のベ
クターを用いてもある程度の増強は期待できるが、マル
チコピー型のベクターを用いることが好ましい。そのよ
うなベクターとして、上記pAJ655、pAJ1844、pAJ611、p
AJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクターが挙げられ
る。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾンは、WO02
/0267国際公開パンフレット、WO93/18151国際公開パン
フレット、欧州特許公開0445385号、特開平６−46867
号、Vertes,A.A.et al.,Mol.Microbiol.,11,739−746
（1994）、Bonamy,C.,et al,Mol.Microbiol.,14,571−5
81（1994）、Vertes,A.A.et al.,Mol.Gen.Genet.,245,3
97−405（1994）、Jagar,W.et al.,FEMS Microbiology
Letters,126,1−６（1995）、特開平７−107976号、特
開平７−327680号等に記載されている。
尚、本発明において、変異型lysCは必ずしも増強され
ている必要はなく、前記したように染色体DNA上のlysC
に変異を有するもの、あるいは変異型lysCが染色体DNA
に組み込まれたものでもよいが、プラスミドベクターを
用いて導入されても差し支えない。一方、dapA、dapB、
lysA及びddhは、効率よくＬ−リジンを生産させるため
には増強されていることが好ましい。
ている必要はなく、前記したように染色体DNA上のlysC
に変異を有するもの、あるいは変異型lysCが染色体DNA
に組み込まれたものでもよいが、プラスミドベクターを
用いて導入されても差し支えない。一方、dapA、dapB、
lysA及びddhは、効率よくＬ−リジンを生産させるため
には増強されていることが好ましい。
lysC、dapA、dapB、lysA及びddhの各遺伝子の導入
は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入し
てもよく、単一のベクターを用いて２種類、３種類４種
類、又は５種類の遺伝子を共に導入してもよい。別個の
ベクターを用いる場合には、遺伝子の導入の順序は問わ
ないが、宿主での安定な分配保持機構を有し、互いに共
存可能なベクターを用いることが好ましい。
は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入し
てもよく、単一のベクターを用いて２種類、３種類４種
類、又は５種類の遺伝子を共に導入してもよい。別個の
ベクターを用いる場合には、遺伝子の導入の順序は問わ
ないが、宿主での安定な分配保持機構を有し、互いに共
存可能なベクターを用いることが好ましい。
変異型AKを保持し、さらにdapBが増強されたコリネ型
細菌は、例えば、変異型lysC、及びdapBを含み、コリネ
型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAを宿主コリネ
型細菌に導入することによって、得られる。
細菌は、例えば、変異型lysC、及びdapBを含み、コリネ
型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAを宿主コリネ
型細菌に導入することによって、得られる。
また、変異型lysC及びdapBに加え、さらに、dapAが増
強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、dapB及
びdapAを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組
換えDNAを宿主コリネ型細菌に導入することによって、
得られる。
強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、dapB及
びdapAを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組
換えDNAを宿主コリネ型細菌に導入することによって、
得られる。
さらに、変異型lysC、dapB及びdapAに加え、さらに、
lysAが増強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lys
C、dapB、dapA及びlysAを含み、コリネ型殺菌細胞中で
自律増殖可能な組換えDNAを宿主コリネ型細菌に導入す
ることによって、得られる。
lysAが増強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lys
C、dapB、dapA及びlysAを含み、コリネ型殺菌細胞中で
自律増殖可能な組換えDNAを宿主コリネ型細菌に導入す
ることによって、得られる。
さらにもた、変異型lysC、dapB、dapA及びlysAに加
え、さらに、ddhが増強されたコリネ型細菌は、例え
ば、変異lysC、dapB、dapA、lysA及びddhを含み、コリ
ネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAを宿主コリ
ネ型細菌に導入することによって、得られる。
え、さらに、ddhが増強されたコリネ型細菌は、例え
ば、変異lysC、dapB、dapA、lysA及びddhを含み、コリ
ネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えDNAを宿主コリ
ネ型細菌に導入することによって、得られる。
上記のような組換えDNAは、例えば、プラスミドベク
ター、トランスポゾンン、ファージベクター等のベクタ
ーに、Ｌ−リジン生合成遺伝子の各々を挿入することに
よって得られる。
ター、トランスポゾンン、ファージベクター等のベクタ
ーに、Ｌ−リジン生合成遺伝子の各々を挿入することに
よって得られる。
宿主への組換えDNAの導入の方法は、プラスミドの場
合、電気パルス法（杉本ら、特開平２−207791号公報）
によって行うことができる。トランスポゾンを用いた遺
伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾンを搭載させ
て細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を誘導するこ
とにより行なうことができる。
合、電気パルス法（杉本ら、特開平２−207791号公報）
によって行うことができる。トランスポゾンを用いた遺
伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾンを搭載させ
て細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を誘導するこ
とにより行なうことができる。
＜３＞Ｌ−リジンの製造法 上記のようにしてＬ−リジン生合成遺伝子が増強され
たコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ
−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを
採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造するこ
とができる。
たコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ
−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを
採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造するこ
とができる。
使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン
及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地
が挙げられる。
及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地
が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュク
ロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマ
ール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いること
ができる。
ロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマ
ール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いること
ができる。
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆
加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニ
ア水等を用いることができる。
ム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆
加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニ
ア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンB1、Ｌ−ホモセリ
ンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させる
ことが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カ
リウム、硫酸マグネシムウ、鉄イオン、マンガンイオン
等が少量添加される。
ンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させる
ことが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カ
リウム、硫酸マグネシムウ、鉄イオン、マンガンイオン
等が少量添加される。
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、
培養温度は25℃〜37℃に、培養中pHは５〜８に制御する
ことが好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸
性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使
用することができる。培養物からのＬ−リジンの採取は
通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を
組み合わせることにより実施できる。
培養温度は25℃〜37℃に、培養中pHは５〜８に制御する
ことが好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸
性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使
用することができる。培養物からのＬ−リジンの採取は
通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を
組み合わせることにより実施できる。
図面の簡単な説明 図１は、変異型lysCを有するプラスミドp399AK9B及び
p399AKYB構築の過程を示す図である。
p399AKYB構築の過程を示す図である。
図２は、dapB及びBrevi.−oriを有するプラスミドpDP
RBの構築の過程を示す図である。
RBの構築の過程を示す図である。
図３は、dapA及びBrevi.−oriを有するプラスミドpDP
SBの構築の過程を示す図である。
SBの構築の過程を示す図である。
図４は、lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過
程を示す図である。
程を示す図である。
図５は、lysA及びBrevi.−oriを有するプラスミドpLY
SABの構築の過程を示す図である。
SABの構築の過程を示す図である。
図６は、ddh及びBrevi.ori−を有するプラスミドpPK4
Dの構築の過程を示す図である。
Dの構築の過程を示す図である。
図７は、lysC、dapB及びBrevi.−oriを有するプラス
ミドpCRCABの構築の過程を示す図である。
ミドpCRCABの構築の過程を示す図である。
図８は、変異型lysC、dapB及びBrevi.−oriを有する
プラスミドpCBの構築の過程を示す図である。
プラスミドpCBの構築の過程を示す図である。
図９は、dapA、dapB及びBrevi.−oriを有するプラス
ミドpABの構築の過程を示す図である。
ミドpABの構築の過程を示す図である。
図10は、ddh及びlysAを有するプラスミドp399DLの構
築の過程を示す図である。
築の過程を示す図である。
図11は、ddh、lysA及びBrevi.−oriを有するプラスミ
ドpDLの構築の過程を示す図である。
ドpDLの構築の過程を示す図である。
図12は、変異型lysC、dapA、dapB及びBrevi.−oriを
有するプラスミドpCABの構築の過程を示す図である。
有するプラスミドpCABの構築の過程を示す図である。
図13は、変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びBrevi.−
oriを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図であ
る。
oriを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図であ
る。
図14は、変異型lysC、dapA、dapB、ddh、lysA及びBre
vi.−oriを有するプラスミドpCABDLの構築の過程を示す
図である。
vi.−oriを有するプラスミドpCABDLの構築の過程を示す
図である。
好適な実施例の説明 以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野
生型lysC遺伝子及び変異型lysC遺伝子の取得 ＜１＞野生型及び変異型lysCの取得、及びそれらを含有
するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC1386
9株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−
リジン生産性変異株AJ3445（FERM P−1944）を染色体DN
Aの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりlysC
がリジン及びスレオニンによる協奏阻害が実質的に解除
されている（Journal of Biochemistry 68,701−710（1
970））。
生型lysC遺伝子及び変異型lysC遺伝子の取得 ＜１＞野生型及び変異型lysCの取得、及びそれらを含有
するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC1386
9株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−
リジン生産性変異株AJ3445（FERM P−1944）を染色体DN
Aの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりlysC
がリジン及びスレオニンによる協奏阻害が実質的に解除
されている（Journal of Biochemistry 68,701−710（1
970））。
染色体DNAよりPCR法（polymerase chain reaction;Wh
ite,T.J.et al;Trends Genet.5,185（1989）参照）によ
りlysCを含むDNA断片を増幅した。増幅に用いたDNAプラ
イマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既
知となっている配列（Molecular Microbiology（1991）
５（５）,1197−1204,Mol.Gen.Genet.（1990）224,317
−324参照）を基にしてlysCをコードする約1643bpの領
域を増幅すべく、配列番号１及び配列番号２に示す塩基
配列を有する23mer及び21merの一本鎖DNAを合成した。D
NAの合成はApplied Biosystems社製DNA合成機model 380
Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron
Letters（1981）,22,1859参照）常法に従って合成し
た。
ite,T.J.et al;Trends Genet.5,185（1989）参照）によ
りlysCを含むDNA断片を増幅した。増幅に用いたDNAプラ
イマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既
知となっている配列（Molecular Microbiology（1991）
５（５）,1197−1204,Mol.Gen.Genet.（1990）224,317
−324参照）を基にしてlysCをコードする約1643bpの領
域を増幅すべく、配列番号１及び配列番号２に示す塩基
配列を有する23mer及び21merの一本鎖DNAを合成した。D
NAの合成はApplied Biosystems社製DNA合成機model 380
Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron
Letters（1981）,22,1859参照）常法に従って合成し
た。
PCR反応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラーPJ
2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者によ
り指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅
された1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動に
より確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法によ
り精製し、制限酵素Nru I（宝酒造（株）製及びEcoR I
（宝酒造（株）製）にて切断した。
2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者によ
り指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅
された1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動に
より確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法によ
り精製し、制限酵素Nru I（宝酒造（株）製及びEcoR I
（宝酒造（株）製）にて切断した。
遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Tak
eshita,S et al;Gene（1987）,61,63−74参照）を用い
た。pHSG399を制限酵素Sma I（宝酒造（株）製）及び制
限酵素EcoR Iにて切断し、増幅されたlysC断片と接続し
た。DNAの接続はDNAライゲーションキット（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この
様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム染色体より増幅されたlysC断片が接続されたプ
ラスミドを作製した。野生株であるATCC13869株由来のl
ysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌で
あるAJ3463由来のlysCを有するプラスミドをp399AK9と
命名した。
eshita,S et al;Gene（1987）,61,63−74参照）を用い
た。pHSG399を制限酵素Sma I（宝酒造（株）製）及び制
限酵素EcoR Iにて切断し、増幅されたlysC断片と接続し
た。DNAの接続はDNAライゲーションキット（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この
様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム染色体より増幅されたlysC断片が接続されたプ
ラスミドを作製した。野生株であるATCC13869株由来のl
ysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌で
あるAJ3463由来のlysCを有するプラスミドをp399AK9と
命名した。
p399AKYおよびp399AK9に、それぞれコリネバクテリウ
ム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をも
つDNA断片（以下「Brevi.−ori」と記す）を導入し、コ
リネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なlysCを搭載
したプラスミドを作製した。Brevi.−oriは、これを含
み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテリウム属細菌
の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターpH
K4から調製した。pHK4は、pHC4をKpn I（宝酒造（株）
製）及びBamH I（宝酒造（株）製）で切断し、Brevi.−
ori断片を抽出し、同じくKpn I及びBamH Iにて切断した
pHSG298に接続することによって構築される（特開平５
−7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイシン耐性
を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB
101は、エシェリヒア・コリAJ13136と命名され、1995年
８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（郵便番号305日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に受託番号FERM BP−5186として寄託されてい
る。
ム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をも
つDNA断片（以下「Brevi.−ori」と記す）を導入し、コ
リネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なlysCを搭載
したプラスミドを作製した。Brevi.−oriは、これを含
み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテリウム属細菌
の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターpH
K4から調製した。pHK4は、pHC4をKpn I（宝酒造（株）
製）及びBamH I（宝酒造（株）製）で切断し、Brevi.−
ori断片を抽出し、同じくKpn I及びBamH Iにて切断した
pHSG298に接続することによって構築される（特開平５
−7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイシン耐性
を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB
101は、エシェリヒア・コリAJ13136と命名され、1995年
８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（郵便番号305日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に受託番号FERM BP−5186として寄託されてい
る。
pHK4を、制限酵素Kpn I及びBamH Iにて切断し、切断
面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit
（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なっ
た。平滑末端化後、リン酸化済みBamH Iリンカー（宝酒
造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.−ori部分のDNA
断片をBamH Iのみによる切断によって切り出される様改
変した。このプラスミドをBamH Iにより切断し、生じた
Brevi.−ori DNA断片を同じくBamH Iにて切断したp399A
KY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌中で
自律複製可能でかつlysC遺伝子を含むプラスミドを作製
した。
面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit
（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なっ
た。平滑末端化後、リン酸化済みBamH Iリンカー（宝酒
造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.−ori部分のDNA
断片をBamH Iのみによる切断によって切り出される様改
変した。このプラスミドをBamH Iにより切断し、生じた
Brevi.−ori DNA断片を同じくBamH Iにて切断したp399A
KY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌中で
自律複製可能でかつlysC遺伝子を含むプラスミドを作製
した。
p399AKY由来の野生型lysC遺伝子を含むプラスミドをp
399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lysC遺伝子を含
むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AK
YB構築の過程を図１に示す。ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム野生株であるAJ12036株（FERM P−73
4）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ126
91は、1992年４月10日に通常産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（郵便番号305日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−12918として寄託
され、1995年２月10日にブダペスト条約に基づく国際寄
託に移管され、FERM BP−4999の受託番号で寄託されて
いる。
399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lysC遺伝子を含
むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AK
YB構築の過程を図１に示す。ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム野生株であるAJ12036株（FERM P−73
4）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ126
91は、1992年４月10日に通常産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（郵便番号305日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−12918として寄託
され、1995年２月10日にブダペスト条約に基づく国際寄
託に移管され、FERM BP−4999の受託番号で寄託されて
いる。
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野
生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定 野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysC
を含むプラスミドp399AK9を各々の形質転換体から調製
し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なっ
た。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et
al:Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463（1977）などがある）
によった。
生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定 野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysC
を含むプラスミドp399AK9を各々の形質転換体から調製
し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なっ
た。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et
al:Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463（1977）などがある）
によった。
p399AKYにコードされている野生型lysCの塩基配列を
配列表の配列番号３に示す。一方、p399AK9にコードさ
れている変異型lysCの塩基配列は野生型lysCと比べ、配
列番号３において1051番目のＧがＡに変化しているとい
う１塩基の変異のみを有していた。コリネバクテリウム
・グルタミカムのlysCは、同一のDNA鎖にα、βの２本
のサブユニットが同一のリーディングフレームでコード
されていることが知られているが（Kalinowski,J et a
l;Molecular Microbiology（1991）５（５）,1197−120
4参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のDNA鎖に
α、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレ
ームでコードされていると考えられる。
配列表の配列番号３に示す。一方、p399AK9にコードさ
れている変異型lysCの塩基配列は野生型lysCと比べ、配
列番号３において1051番目のＧがＡに変化しているとい
う１塩基の変異のみを有していた。コリネバクテリウム
・グルタミカムのlysCは、同一のDNA鎖にα、βの２本
のサブユニットが同一のリーディングフレームでコード
されていることが知られているが（Kalinowski,J et a
l;Molecular Microbiology（1991）５（５）,1197−120
4参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のDNA鎖に
α、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレ
ームでコードされていると考えられる。
DNA塩基配列より推定される野生型AKタンパク質のα
サブユニットのアミノ酸配列をDNA配列と同時に配列表
の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示
す。また、DNA塩基配列より推定される野生型AKタンパ
ク質のβサブユニットのアミノ酸配列をDNAと同時に配
列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に
示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにGTGが用
いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記し
ているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォル
ミルメチオニンを表すものである。
サブユニットのアミノ酸配列をDNA配列と同時に配列表
の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示
す。また、DNA塩基配列より推定される野生型AKタンパ
ク質のβサブユニットのアミノ酸配列をDNAと同時に配
列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に
示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにGTGが用
いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記し
ているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォル
ミルメチオニンを表すものである。
一方、変異型lysC配列上の変異は、野生型AKタンパク
質のアミノ酸配列（配列番号５、７）において、αサブ
ユニットでは279番目のアラニン残基がスレオニン残基
に、βサブユニットでは30番目のアラニン残基がスレオ
ニン残基にというアミノ酸残基置換を起こしていること
を意味する。
質のアミノ酸配列（配列番号５、７）において、αサブ
ユニットでは279番目のアラニン残基がスレオニン残基
に、βサブユニットでは30番目のアラニン残基がスレオ
ニン残基にというアミノ酸残基置換を起こしていること
を意味する。
実施例２ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムda
pBの取得 ＜１＞dapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株AT
CC13869株を染色体DNAの供与体として用いた。ATCC1386
9株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapBを含むDNA断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムにおいて既知となっている配列（Journal of
Bacteriology 175（９）,2743−2749（1993）参照）を
基にしてDDPRをコードする約2.0kbの領域を増幅すべ
く、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有す
る各々23merのDNA断片を合成した。DNAの合成及びPCR反
応は、実施例１と同様にして行った。増幅された2001bp
の遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpCR−Scipt
（Invitrogen社製）を用い、増幅したdapB断片と接続し
た。この様にしてpCR−Scriptにブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapB断片20
01bpの接続されたプラスミドを作製した。この様にして
取得したATCC13869由来のdapBを有するプラスミドをpCR
DAPBと命名した。E.coliJM109株にpCRDAPBを導入して得
られた形質転換株AJ13107株は、1995年５月26日より通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号
305日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番
号FERM BP−5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づ
き国際寄託されている。
pBの取得 ＜１＞dapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株AT
CC13869株を染色体DNAの供与体として用いた。ATCC1386
9株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapBを含むDNA断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムにおいて既知となっている配列（Journal of
Bacteriology 175（９）,2743−2749（1993）参照）を
基にしてDDPRをコードする約2.0kbの領域を増幅すべ
く、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有す
る各々23merのDNA断片を合成した。DNAの合成及びPCR反
応は、実施例１と同様にして行った。増幅された2001bp
の遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpCR−Scipt
（Invitrogen社製）を用い、増幅したdapB断片と接続し
た。この様にしてpCR−Scriptにブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapB断片20
01bpの接続されたプラスミドを作製した。この様にして
取得したATCC13869由来のdapBを有するプラスミドをpCR
DAPBと命名した。E.coliJM109株にpCRDAPBを導入して得
られた形質転換株AJ13107株は、1995年５月26日より通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号
305日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番
号FERM BP−5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づ
き国際寄託されている。
更に、pCRDAPBをEcoR VとSph Iで切断する事により、
DDPRの構造遺伝子を含む1101bpの断片を抽出した。この
断片を、pHSG399をHinc IIおよびSph Iにて切断したも
のと連結したプラスミドを作成した。この作成したプラ
スミドをp399DPRと命名した。
DDPRの構造遺伝子を含む1101bpの断片を抽出した。この
断片を、pHSG399をHinc IIおよびSph Iにて切断したも
のと連結したプラスミドを作成した。この作成したプラ
スミドをp399DPRと命名した。
作製したp399DPRにBrevi.−oriを導入し、コリネ型細
菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラスミドを作製
した。pHK4を制限酵素Kpn I（宝酒造（株）製）にて切
断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blun
ting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法に
て行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamH Iリンカ
ー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.ori部
分のDNA断片をBamH Iのみによる切断によって切り出さ
れる様改変した。このプラスミドをBamH Iにより切断
し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくBamH Iにて切断
したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能
でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製したプラ
スミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図２に示
す。
菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラスミドを作製
した。pHK4を制限酵素Kpn I（宝酒造（株）製）にて切
断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blun
ting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法に
て行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamH Iリンカ
ー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.ori部
分のDNA断片をBamH Iのみによる切断によって切り出さ
れる様改変した。このプラスミドをBamH Iにより切断
し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくBamH Iにて切断
したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能
でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製したプラ
スミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図２に示
す。
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapB
の塩基配列の決定 p399DPRを保持するAJ13107株からプラスミドDNAを調
製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミ
ノ酸配列を配列番号10に示す。また、アミノ酸配列のみ
を配列番号11に示す。
の塩基配列の決定 p399DPRを保持するAJ13107株からプラスミドDNAを調
製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミ
ノ酸配列を配列番号10に示す。また、アミノ酸配列のみ
を配列番号11に示す。
実施例３ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムda
pAの取得 ＜１＞dapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株AT
CC13869株を染色体DNAの供与体として用いた。ATCC1386
9株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapAを含むDNA断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカ
ムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids Rese
arch 18（21）,6421（1990）、EMBL accession No.X539
93参照）を基にしてDDPSをコードする約1.5kbの領域を
増幅すべく、配列表の配列番号12及び13に記載の塩基配
列を有する各々23merのDNAを合成した。DNAの合成及びP
CR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された14
11bpの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpCR100
0（Invitrogen社製;Bio/Technology 9,657−663（199
1）参照）を用い、増幅したdapA断片と接続した。DNAの
接続はDNAライゲーションキット（宝酒造（株）製）を
用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpCR1
000にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色
体より増幅されたdapA断片1411bpの接続されたプラスミ
ドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のd
apAを有するプラスミドをpCRDAPAと命名した。
pAの取得 ＜１＞dapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株AT
CC13869株を染色体DNAの供与体として用いた。ATCC1386
9株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRによりdapAを含むDNA断片を増幅した。増幅に用
いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカ
ムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids Rese
arch 18（21）,6421（1990）、EMBL accession No.X539
93参照）を基にしてDDPSをコードする約1.5kbの領域を
増幅すべく、配列表の配列番号12及び13に記載の塩基配
列を有する各々23merのDNAを合成した。DNAの合成及びP
CR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された14
11bpの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpCR100
0（Invitrogen社製;Bio/Technology 9,657−663（199
1）参照）を用い、増幅したdapA断片と接続した。DNAの
接続はDNAライゲーションキット（宝酒造（株）製）を
用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpCR1
000にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色
体より増幅されたdapA断片1411bpの接続されたプラスミ
ドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のd
apAを有するプラスミドをpCRDAPAと命名した。
E.coliJM109株にpCRDAPAを導入した得られた形質転換
株AJ13106株は、1995年５月26日より通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305日本国茨城
県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−511
3の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託され
ている。
株AJ13106株は、1995年５月26日より通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305日本国茨城
県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP−511
3の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託され
ている。
作製したpCRDAPAにBrevi.−oriを導入し、コリネ型細
菌中で自律複製可能なdapAを搭載したプラスミドを作製
した。pHK4を制限酵素Kpn I及びBamH I（宝酒造（株）
製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化
はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定さ
れた方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みSm
a Iリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBre
vi.−ori部分のDNA断片をSma Iのみによる切断によって
切り出される様改変した。このプラスミドをSma Iによ
り切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくSma Iに
て切断したpCRDAPAに接続し、コリネ型細菌中で自律増
殖可能でかつdapAを含むプラスミドを作製した。このプ
ラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB（Kmr）の構築過程
を図３に示す。
菌中で自律複製可能なdapAを搭載したプラスミドを作製
した。pHK4を制限酵素Kpn I及びBamH I（宝酒造（株）
製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化
はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定さ
れた方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みSm
a Iリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBre
vi.−ori部分のDNA断片をSma Iのみによる切断によって
切り出される様改変した。このプラスミドをSma Iによ
り切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくSma Iに
て切断したpCRDAPAに接続し、コリネ型細菌中で自律増
殖可能でかつdapAを含むプラスミドを作製した。このプ
ラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB（Kmr）の構築過程
を図３に示す。
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapA
の塩基配列の決定 pCRDAPAを保持するAJ13106株からプラスミドDNAを調
製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミ
ノ酸配列を配列番号14に示す。また、アミノ酸配列のみ
を配列番号15に示す。
の塩基配列の決定 pCRDAPAを保持するAJ13106株からプラスミドDNAを調
製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なっ
た。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミ
ノ酸配列を配列番号14に示す。また、アミノ酸配列のみ
を配列番号15に示す。
実施例４ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムly
sAの取得 ＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株AT
CC13869株を染色体DNAの供与体として用いた。ATCC3186
9株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロン
のプロモーターを含むDNA断片を増幅した。増幅に用い
たDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グル
タミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Mi
crobiology4（11）,1819−1830（1990）、Molecular an
d General Genetics 212,112−119（1988）参照）を基
にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びDDCをコードす
る約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号16及
び17に記載の塩基配列を有する各々23merの合成DNAを用
いた。DNAの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして
行った。増幅された3579bpの遺伝子断片のクローン化用
のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素Sm
a I（宝酒造（株）製）にて切断し、増幅されたlysAを
含むDNA断片と接続した。この様にして取得したATCC138
69由来のlysAを有するプラスミドをp399LYSAと命名し
た。
sAの取得 ＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株AT
CC13869株を染色体DNAの供与体として用いた。ATCC3186
9株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNA
よりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロン
のプロモーターを含むDNA断片を増幅した。増幅に用い
たDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グル
タミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Mi
crobiology4（11）,1819−1830（1990）、Molecular an
d General Genetics 212,112−119（1988）参照）を基
にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びDDCをコードす
る約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号16及
び17に記載の塩基配列を有する各々23merの合成DNAを用
いた。DNAの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして
行った。増幅された3579bpの遺伝子断片のクローン化用
のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素Sm
a I（宝酒造（株）製）にて切断し、増幅されたlysAを
含むDNA断片と接続した。この様にして取得したATCC138
69由来のlysAを有するプラスミドをp399LYSAと命名し
た。
更に、p399LYSAをKpn I（宝酒造（株）製）とBamH I
（宝酒造（株）製）で切断することにより、lysAを含む
DNA断片を抽出した。このDNA断片を、pHSG299をKpn Iと
BamH Iで切断したものと連結した。得られたプラスミド
をp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を図４に示
す。
（宝酒造（株）製）で切断することにより、lysAを含む
DNA断片を抽出した。このDNA断片を、pHSG299をKpn Iと
BamH Iで切断したものと連結した。得られたプラスミド
をp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を図４に示
す。
得られたp299LYSAにBrevi.−oriを導入し、コリネ型
細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラスミドを作
製した。pHK4を制限酵素Kpn I及びBamH Iで切断し、切
断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit
（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なっ
た。平滑末端化後、リン酸化済みKpn Iリンカー（宝酒
造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.−ori部分のDNA
断片をKpn Iのみによる切断によって切り出される様改
変した。このプラスミドをKpn Iにより切断し、生じたB
revi.−oriDNA断片を同じくKpn Iにて切断したp299LYSA
に接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysAを
含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpLYS
ABと命名した。pLYSAB構築の過程を図５に示す。
細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラスミドを作
製した。pHK4を制限酵素Kpn I及びBamH Iで切断し、切
断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit
（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なっ
た。平滑末端化後、リン酸化済みKpn Iリンカー（宝酒
造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.−ori部分のDNA
断片をKpn Iのみによる切断によって切り出される様改
変した。このプラスミドをKpn Iにより切断し、生じたB
revi.−oriDNA断片を同じくKpn Iにて切断したp299LYSA
に接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysAを
含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpLYS
ABと命名した。pLYSAB構築の過程を図５に示す。
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysA
の塩基配列の決定 p299LYSAのプラスミドDANを調製し、実施例１と同様
にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及
びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配
列番号18に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコ
ードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配
列を、各々配列番号19及び20に示す。
の塩基配列の決定 p299LYSAのプラスミドDANを調製し、実施例１と同様
にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及
びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配
列番号18に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコ
ードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配
列を、各々配列番号19及び20に示す。
実施例５ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdd
hの取得 ddh遺伝子は、コリネバクテリウム グルタミカム（C
orynebacterium glutamicum）のddh遺伝子の既知のヌク
レオチド配列（Ishino,S.et al.,Nucleic Acids Res.,1
5,3917（1987））をもとに作成した２種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（配列番号21、22）を用いたPCR法に
より、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムATCC
13869の染色体DNAからddh遺伝子を増幅することによっ
て得た。得られた増幅DNA断片をEcoT22IとAva Iで切断
し、末端を平滑化した後、pMW119のSma I部位に挿入
し、プラスミドpDDHを得た。
hの取得 ddh遺伝子は、コリネバクテリウム グルタミカム（C
orynebacterium glutamicum）のddh遺伝子の既知のヌク
レオチド配列（Ishino,S.et al.,Nucleic Acids Res.,1
5,3917（1987））をもとに作成した２種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（配列番号21、22）を用いたPCR法に
より、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムATCC
13869の染色体DNAからddh遺伝子を増幅することによっ
て得た。得られた増幅DNA断片をEcoT22IとAva Iで切断
し、末端を平滑化した後、pMW119のSma I部位に挿入
し、プラスミドpDDHを得た。
次に、pDDHをSal IとEcoR Iにて切断し、平滑末端化
した後、得られた断片をSma Iで切断したpUC18と連結し
た。こうして得られたプラスミドをpUC18DDHと命名し
た。
した後、得られた断片をSma Iで切断したpUC18と連結し
た。こうして得られたプラスミドをpUC18DDHと命名し
た。
pUC18DDHにBrevi.−oriを導入し、コリネ型細菌中で
自律複製可能なddhを搭載したプラスミドを作製した。p
HK4を制限酵素Kpn I及びBamH Iで切断し、切断面を平滑
末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑
末端化後、リン酸化済みPst Iリンカー（宝酒造（株）
製）を接続し、pHSG299のPst I部位に挿入した。このよ
うにして作製したプラスミドをpPK4と命名した。次に、
pUC18DDHをXba IとKpn Iで切断し、生じたddh断片をKpn
IとXba Iで切断したpPK4に接続した。このようにし
て、コリネ型細菌中で自律複写可能で、かつ、ddhを含
むプラスミドを作製し、このプラスミドをpPK4Dと命名
した。pPK4D構築の過程を図６に示す。
自律複製可能なddhを搭載したプラスミドを作製した。p
HK4を制限酵素Kpn I及びBamH Iで切断し、切断面を平滑
末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造
（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑
末端化後、リン酸化済みPst Iリンカー（宝酒造（株）
製）を接続し、pHSG299のPst I部位に挿入した。このよ
うにして作製したプラスミドをpPK4と命名した。次に、
pUC18DDHをXba IとKpn Iで切断し、生じたddh断片をKpn
IとXba Iで切断したpPK4に接続した。このようにし
て、コリネ型細菌中で自律複写可能で、かつ、ddhを含
むプラスミドを作製し、このプラスミドをpPK4Dと命名
した。pPK4D構築の過程を図６に示す。
実施例６変異型lysC及びdapAを併せ持つプラスミドの作
製 dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBre
vi.−oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lys
C、dapAおよびコリネ型細菌の複写起点を有するプラス
ミドを作製した。p399AK9BをSal Iにて完全分解した
後、平滑末端化し、EcoR Iリンカーを接続する事により
Sal I部位をEcoR I部位に改変したプラスミドを作製し
た。得られたプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399
AK9BSEをEcoR Iにて部分分解することによって変異型ly
sCとBrevi.−oriを一つのフラグメントとして切り出し
た。このフラグメントをpCRDAPAをEcoR Iにて切断した
ものと連結した。得られたプラスミドをpCRCABと命名し
た。このプラスミドはE.coliとコリネ型細菌中で自律増
殖可能で、かつ宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異
型lysCとdapAを併せ保持しているプラスミドである。pC
RCABの作製過程を図７に示す。
製 dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBre
vi.−oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lys
C、dapAおよびコリネ型細菌の複写起点を有するプラス
ミドを作製した。p399AK9BをSal Iにて完全分解した
後、平滑末端化し、EcoR Iリンカーを接続する事により
Sal I部位をEcoR I部位に改変したプラスミドを作製し
た。得られたプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399
AK9BSEをEcoR Iにて部分分解することによって変異型ly
sCとBrevi.−oriを一つのフラグメントとして切り出し
た。このフラグメントをpCRDAPAをEcoR Iにて切断した
ものと連結した。得られたプラスミドをpCRCABと命名し
た。このプラスミドはE.coliとコリネ型細菌中で自律増
殖可能で、かつ宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異
型lysCとdapAを併せ保持しているプラスミドである。pC
RCABの作製過程を図７に示す。
実施例７変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミドの作
製 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有す
るプラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプ
ラスミドを作製した。p399DPRをEcoR VとSph Iで切断す
ることにより、DDPRの構造遺伝子を含む1101bpの断片を
抽出した。この断片を、p399AK9をSal Iで切断した後平
滑末端化し、更にSpH Iにて切断したものと結合し、変
異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。この
プラスミドをp399AKDDPRと命名した。
製 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有す
るプラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプ
ラスミドを作製した。p399DPRをEcoR VとSph Iで切断す
ることにより、DDPRの構造遺伝子を含む1101bpの断片を
抽出した。この断片を、p399AK9をSal Iで切断した後平
滑末端化し、更にSpH Iにて切断したものと結合し、変
異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。この
プラスミドをp399AKDDPRと命名した。
次に、得られたp399AKDPRにBrevi.−oriを導入した。
Brevi.−oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素Kpn I（宝
酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。
平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用
い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン
酸化済みBamH Iリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、
pHK4よりBrevi.−ori部分のDNA断片をBamH Iのみによる
切断によって切り出される様改変した。このプラスミド
をBamH Iにより切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同
じくBamH Iにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリネ型
細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapBを含
むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築の過
程を図８に示す。
Brevi.−oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素Kpn I（宝
酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。
平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用
い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン
酸化済みBamH Iリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、
pHK4よりBrevi.−ori部分のDNA断片をBamH Iのみによる
切断によって切り出される様改変した。このプラスミド
をBamH Iにより切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同
じくBamH Iにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリネ型
細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapBを含
むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築の過
程を図８に示す。
実施例8dapA及びdapBを併せ持つプラスミドの作製 dapAを有するプラスミドpCRDAPAをKpn IおよびEcoR I
にて切断し、dapAを含むDNA断片を抽出し、ベクタープ
ラスミドpHSG399をKpn IおよびEcoR Iにて切断したもの
と接続した。得られたプラスミドをp399DPSと命名し
た。
にて切断し、dapAを含むDNA断片を抽出し、ベクタープ
ラスミドpHSG399をKpn IおよびEcoR Iにて切断したもの
と接続した。得られたプラスミドをp399DPSと命名し
た。
一方、dapBを有するプラスミドpCRDAPBをSac IIおよ
びEcoR Iにて切断し、DDPRをコードする領域を含む2.0k
bのDNA断片を抽出し、Sac IIおよびEcoR Iにて切断した
p399DPSと接続し、dapAとdapBを併せ持つプラスミドを
作製した。得られたプラスミドをp399ABと命名した。
びEcoR Iにて切断し、DDPRをコードする領域を含む2.0k
bのDNA断片を抽出し、Sac IIおよびEcoR Iにて切断した
p399DPSと接続し、dapAとdapBを併せ持つプラスミドを
作製した。得られたプラスミドをp399ABと命名した。
次に、p399ABにBrevi.−oriを導入した。Brevi.−ori
を含むpHK4を制限酵素BamH I（宝酒造（株）製）にて切
断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blun
ting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法に
て行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpn Iリンカ
ー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.−ori
部分のDNA断片をKpn Iのみによる切断によって切り出さ
れる様改変した。このプラスミドをKpn Iにより切断
し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくKpn Iにて切断
したp399ABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能で
かつdapAおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pABと
命名した。pABの構築の過程を図９に示す。
を含むpHK4を制限酵素BamH I（宝酒造（株）製）にて切
断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blun
ting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法に
て行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpn Iリンカ
ー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.−ori
部分のDNA断片をKpn Iのみによる切断によって切り出さ
れる様改変した。このプラスミドをKpn Iにより切断
し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくKpn Iにて切断
したp399ABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能で
かつdapAおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pABと
命名した。pABの構築の過程を図９に示す。
実施例9ddh及びlysAを併せ持つプラスミドの作製 ddhを有するプラスミドpUC18DDHをEcoR IおよびXba I
にて切断し、ddhを含むDNA断片を抽出した。このddh断
片を、lysAを有するプラスミドp339LYSAをBamH Iおよび
Xba Iにて切断した後、切断面を平滑末端化したものと
連結した。得られたプラスミドをp399DLと命名した。p3
99DL構築の過程を図10に示す。
にて切断し、ddhを含むDNA断片を抽出した。このddh断
片を、lysAを有するプラスミドp339LYSAをBamH Iおよび
Xba Iにて切断した後、切断面を平滑末端化したものと
連結した。得られたプラスミドをp399DLと命名した。p3
99DL構築の過程を図10に示す。
次に、p399DLにBrevi.−oriを導入した。pHK4をXba I
およびBamH Iにて切断し、切断面を平滑末端化した。平
滑末端後、リン酸化済みXba Iリンカーを接続し、pHK4
よりBrevi.−ori部分のDNA断片をXba Iのみによる切断
によって切り出される様改変した。このプラスミドをXb
aIにて切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくXba
Iで切断した。p399DLに接続し、コリネ型細菌中で自律
増殖可能でかつddhおよびlysAを含むプラスミドを作製
し、pDLと命名した。pDLの構築の過程を図11に示す。
およびBamH Iにて切断し、切断面を平滑末端化した。平
滑末端後、リン酸化済みXba Iリンカーを接続し、pHK4
よりBrevi.−ori部分のDNA断片をXba Iのみによる切断
によって切り出される様改変した。このプラスミドをXb
aIにて切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくXba
Iで切断した。p399DLに接続し、コリネ型細菌中で自律
増殖可能でかつddhおよびlysAを含むプラスミドを作製
し、pDLと命名した。pDLの構築の過程を図11に示す。
実施例10変異型lysC、dapA及びdapBを併せ持つプラスミ
ドの作製 p399DPSをEcoR I、Sph Iにて分解し、平滑末端化した
後、dApA遺伝子を抽出した。この断片を、p399AK9をSal
Iにて切断し平滑末端化したものとライゲーションし、
変異型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築し
た。
ドの作製 p399DPSをEcoR I、Sph Iにて分解し、平滑末端化した
後、dApA遺伝子を抽出した。この断片を、p399AK9をSal
Iにて切断し平滑末端化したものとライゲーションし、
変異型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築し
た。
dapBを有するプラスミドpCRDAPBをEcoR Iにて切断、
平滑末端化した後、Sac Iにて切断し、dapBを含む2.0kb
のDNA断片を抽出した。dapA及び変異型lysCを有するプ
ラスミドp399CAをSpe Iにて切断、平滑末端化した後、S
ac Iにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、変異型ly
sC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。このプラス
ミドをp399CABと命名した。
平滑末端化した後、Sac Iにて切断し、dapBを含む2.0kb
のDNA断片を抽出した。dapA及び変異型lysCを有するプ
ラスミドp399CAをSpe Iにて切断、平滑末端化した後、S
ac Iにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、変異型ly
sC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。このプラス
ミドをp399CABと命名した。
次に、p399CABにBrevi.−oriを導入した。Brevi.−or
iを有するプラスミドpHK4を制限酵素BamH I（宝酒造
（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑
末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、
指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化
済みKpn Iリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4
よりBrevi.−ori部分のDNA断片をKpn Iのみによる切断
によって切り出される様改変した。このプラスミドをKp
n Iにより切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくK
pn Iにて切断したp399CABに接続し、コリネ型細菌中で
自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapAおよびdapBを併せ
持つプラスミドを作製し、pCABと命名した。pCABの構築
の過程を図12に示す。
iを有するプラスミドpHK4を制限酵素BamH I（宝酒造
（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑
末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、
指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化
済みKpn Iリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4
よりBrevi.−ori部分のDNA断片をKpn Iのみによる切断
によって切り出される様改変した。このプラスミドをKp
n Iにより切断し、生じたBrevi.−oriDNA断片を同じくK
pn Iにて切断したp399CABに接続し、コリネ型細菌中で
自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapAおよびdapBを併せ
持つプラスミドを作製し、pCABと命名した。pCABの構築
の過程を図12に示す。
実施例11変異型lysC、dapA、dapB及びlysAを併せ持つプ
ラスミドの作製 lysAを有するプラスミドp299LYSAをKpn I及びBamH I
にて切断し、平滑末端化した後、lysA遺伝子断片を抽出
した。この断片を、pCABをHpa I（宝酒造（株）製）に
て切断し平滑末端化したものとライゲーションし、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapA、da
pB、及びlysAを併せ持つプラスミドを作製し、pCABLと
命名した。pCABL構築の過程を図13に示す。尚、pCABL中
で、lysA遺伝子断片はdapB遺伝子を含むDNA断片内のHpa
I部位に挿入されているが、このHpa I部位は、dapB遺
伝子のプロモーターよりも上流（配列番号10中塩基番号
611〜616）に位置しており、dapB遺伝子は分断されてい
ない。
ラスミドの作製 lysAを有するプラスミドp299LYSAをKpn I及びBamH I
にて切断し、平滑末端化した後、lysA遺伝子断片を抽出
した。この断片を、pCABをHpa I（宝酒造（株）製）に
て切断し平滑末端化したものとライゲーションし、コリ
ネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapA、da
pB、及びlysAを併せ持つプラスミドを作製し、pCABLと
命名した。pCABL構築の過程を図13に示す。尚、pCABL中
で、lysA遺伝子断片はdapB遺伝子を含むDNA断片内のHpa
I部位に挿入されているが、このHpa I部位は、dapB遺
伝子のプロモーターよりも上流（配列番号10中塩基番号
611〜616）に位置しており、dapB遺伝子は分断されてい
ない。
実施例12変異型lysC、dapA、dapB、ddh及びlysAを併せ
持つプラスミドの作製 pHSG299をXba I及びKpn Iにて切断し、ddh及びlysAを
有するプラスミドp399DLをXba I及びKpn Iで切断したも
のと連結した。作製されたプラスミドをp299DLと命名し
た。このp299DLをXba I及びKpn Iで切断し、平滑末端化
した。平滑末端化後、ddh及びlysAを含むDNA断片を抽出
した。このDNA断片を、変異型lysC、dapAおよびdapBを
併せ持つプラスミドpCABをHpa Iにて切断し平滑末端化
したものと連結し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でか
つ変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びddhを併せ持つプ
ラスミドを作製し、pCABDLと命名した。pCABDL構築の過
程を図14に示す。
持つプラスミドの作製 pHSG299をXba I及びKpn Iにて切断し、ddh及びlysAを
有するプラスミドp399DLをXba I及びKpn Iで切断したも
のと連結した。作製されたプラスミドをp299DLと命名し
た。このp299DLをXba I及びKpn Iで切断し、平滑末端化
した。平滑末端化後、ddh及びlysAを含むDNA断片を抽出
した。このDNA断片を、変異型lysC、dapAおよびdapBを
併せ持つプラスミドpCABをHpa Iにて切断し平滑末端化
したものと連結し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でか
つ変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びddhを併せ持つプ
ラスミドを作製し、pCABDLと命名した。pCABDL構築の過
程を図14に示す。
実施例13L−リジン生合成遺伝子を含むプラスミドのブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生
産菌への導入 上記のようにして作製されたＬ−リジン生合成遺伝子
を有するプラスミドp399AK9B（Cmr）、pDPSB（Kmr）、p
DPRB（Cmr）、pLYSAB（Cmr）、pPK4D（Cmr）、pCRCAB
（Kmr）、pAB（Cmr）、pCB（Cmr）、pDL（Cmr）、pCAB
（Cmr）、pCABL（Cmr）、pCABDL（Cmr）をブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌である
AJ11082（NRRL Ｂ−11470）に導入した。AJ11082株
は、AEC耐性の性質を有する。プラスミドの導入の方法
は、電気パルス法（杉本ら、特開平２−207791号公報）
によった。形質転換体の選択は各々のプラスミドが持つ
薬剤耐性マーカーによった。クロラムフェニコール耐性
遺伝子を有するプラスミドを導入した場合は５μg/mlの
クロラムフェニコールを含む完全培地にて、また、カナ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合
には25μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転
換体の選択を行なった。
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生
産菌への導入 上記のようにして作製されたＬ−リジン生合成遺伝子
を有するプラスミドp399AK9B（Cmr）、pDPSB（Kmr）、p
DPRB（Cmr）、pLYSAB（Cmr）、pPK4D（Cmr）、pCRCAB
（Kmr）、pAB（Cmr）、pCB（Cmr）、pDL（Cmr）、pCAB
（Cmr）、pCABL（Cmr）、pCABDL（Cmr）をブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌である
AJ11082（NRRL Ｂ−11470）に導入した。AJ11082株
は、AEC耐性の性質を有する。プラスミドの導入の方法
は、電気パルス法（杉本ら、特開平２−207791号公報）
によった。形質転換体の選択は各々のプラスミドが持つ
薬剤耐性マーカーによった。クロラムフェニコール耐性
遺伝子を有するプラスミドを導入した場合は５μg/mlの
クロラムフェニコールを含む完全培地にて、また、カナ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合
には25μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転
換体の選択を行なった。
実施例14L−リジンの製造 実施例13で取得した各形質転換体をＬ−リジン生産培
地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−
リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。
地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−
リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。
炭酸カルシウム以外の下記成分（1L中）を溶解し、KO
HでpH8.0に調製し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱
滅菌した炭酸カルシウムを50g加える。
HでpH8.0に調製し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱
滅菌した炭酸カルシウムを50g加える。
グルコース 100g （NH4）2SO4 55g KH2PO4 1g MgSO4・7H2O 1g ビオチン 500μｇ チアミン 2000μｇ FeSO4・7H2O 0.01g MnSO4・7H2O 0.01g ニコチンアミド 5mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30ml 炭酸カルシウム 50g 上記組成の培地に各種形質転換体及び親株を植菌し、
31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養40時間、72時間
後のＬ−リジン生成量、及び72時間後の生育（OD562）
を表に示す。表中、lysC＊は変異型lysCを表す。生育は
101倍希釈した後、560nmにてODを測定することにより定
量した。
31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養40時間、72時間
後のＬ−リジン生成量、及び72時間後の生育（OD562）
を表に示す。表中、lysC＊は変異型lysCを表す。生育は
101倍希釈した後、560nmにてODを測定することにより定
量した。
以上に示すように、変異型lysC、dapA、又はdapBの単
独の増強では、培養72時間後にはＬ−リジン生産量は親
株よりも多いか同等であるが、40時間後では親株よりも
生産量が少なく、すなわち短期間培養におけるＬ−リジ
ン生産速度は低下した。同様に、変異型lysC及びdapA、
又はdapA及びdapBを組み合わせて増強した場合には、培
養72時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いが、
40時間後では親株よりも生産量が少なく、Ｌ−リジン生
産速度は低下した。
独の増強では、培養72時間後にはＬ−リジン生産量は親
株よりも多いか同等であるが、40時間後では親株よりも
生産量が少なく、すなわち短期間培養におけるＬ−リジ
ン生産速度は低下した。同様に、変異型lysC及びdapA、
又はdapA及びdapBを組み合わせて増強した場合には、培
養72時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いが、
40時間後では親株よりも生産量が少なく、Ｌ−リジン生
産速度は低下した。
同様に、lysAもしくはddhを単独で増強した場合に
は、培養40時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多
いが、生育が低下したために長期間培養では親株よりも
生産量が少い結果となった。
は、培養40時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多
いが、生育が低下したために長期間培養では親株よりも
生産量が少い結果となった。
これらに対し、変異型lysCとともにdapBを増強した株
では、生育が改善され、短期間培養におけるＬ−リジン
生産速度を回復させることができた上、長期間培養での
Ｌ−リジン蓄積量も向上した。さらに変異型lysC、dapA
及びdapBの３者が同時に増強された株では、Ｌ−リジン
生産性が一層向上された。また、さらにlysA、ddhを順
次増強することによって、段階的にＬ−リジンの生産速
度及び蓄積量はともに向上した。尚、lysA及びddhのみ
を組み合わせて増強した場合にも、親株に比べてＬ−リ
ジン生産速度が向上した。
では、生育が改善され、短期間培養におけるＬ−リジン
生産速度を回復させることができた上、長期間培養での
Ｌ−リジン蓄積量も向上した。さらに変異型lysC、dapA
及びdapBの３者が同時に増強された株では、Ｌ−リジン
生産性が一層向上された。また、さらにlysA、ddhを順
次増強することによって、段階的にＬ−リジンの生産速
度及び蓄積量はともに向上した。尚、lysA及びddhのみ
を組み合わせて増強した場合にも、親株に比べてＬ−リ
ジン生産速度が向上した。
産業上の利用分野 本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジン生産能を向
上させることができ、生育速度も改善される。
上させることができ、生育速度も改善される。
コリネ型Ｌ−リジン生産菌において、変異型lysCとと
もにdapBを増強することにより、Ｌ−リジン生産速度を
向上させることができ、生産性も向上させることができ
る。これらの遺伝子に加え、dapA、lysA、ddhを順次増
強することによって、Ｌ−リジン生産速度及び生産性を
一層向上させることができる。
もにdapBを増強することにより、Ｌ−リジン生産速度を
向上させることができ、生産性も向上させることができ
る。これらの遺伝子に加え、dapA、lysA、ddhを順次増
強することによって、Ｌ−リジン生産速度及び生産性を
一層向上させることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 早川 敦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 中野 英一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 小林 正樹 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 吉原 康彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (56)参考文献 特開 平７−75578（ＪＰ，Ａ) Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ ｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．57，Ｖｏｌ．６, （1991），ｐ．1746−1752 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．15，Ｎｏ．９, （1987），ｐ．3917 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．11, （1990），ｐ．1819−1830 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 13/00 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィ
ードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナー
ゼをコードするDNA配列、及びジヒドロジピコリン酸レ
ダクターゼをコードするDNA配列を含み、コリネ型細菌
細胞中で自律増殖可能な組換えDNA。 - 【請求項２】ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコード
するDNA配列をさらに含む請求項１記載の組換えDNA。 - 【請求項３】ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを
コードするDNA配列をさらに含む請求項２記載の組換えD
NA。 - 【請求項４】ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするDNA配列をさらに含む請求項３記載の組換えDN
A。 - 【請求項５】前記Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる
フィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキ
ナーゼが、コリネ型細菌由来のアスパルトキナーゼであ
り、αサブユニットではＮ末端から279番目のアラニン
残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残
基に、βサブユニットでは30番目のアラニン残基がアラ
ニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化し
た変異型アスパルトキナーゼである請求項１〜４のいず
れか一項に記載の組換えDNA。 - 【請求項６】ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコー
ドするDNA配列が、配列表配列番号15に示すアミノ酸配
列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えDNA。 - 【請求項７】ジヒドロピコリン酸シンターゼをコードす
るDNA配列が、配列表配列番号11に示すアミノ酸配列又
はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする請求
項２記載の組換えDNA。 - 【請求項８】ジアミノジピメリン酸デカルボキシラーゼ
をコードするDNA配列が、配列表配列番号19に示すアミ
ノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコー
ドする請求項３記載の組換えDNA。 - 【請求項９】ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコ
ードするDNA配列が、配列表配列番号24に示すアミノ酸
配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードす
る請求項４記載の組換えDNA。 - 【請求項１０】Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフ
ィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナ
ーゼを保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼをコードするDNA配列が増強されたコリネ型細菌。 - 【請求項１１】請求項１記載の組換えDNAが導入された
ことにより形質転換された請求項10記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項１２】さらに、ジヒドロジピコリン酸シンター
ゼをコードするDNA配列が増強された請求項10記載のコ
リネ型細菌。 - 【請求項１３】請求項２記載の組換えDNAが導入された
ことにより形質転換された請求項12記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項１４】さらに、ジアミノピメリン酸デカルボキ
シラーゼをコードするDNA配列が増強された請求項12記
載のコリネ型細菌。 - 【請求項１５】請求項３記載の組換えDNAが導入された
ことにより形質転換された請求項14記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項１６】さらに、ジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼをコードするDNA配列が増強された請求項14記載
のコリネ型細菌。 - 【請求項１７】請求項４記載の組換えDNAが導入された
ことにより形質転換された請求項16記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項１８】請求項10〜17のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リ
ジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取
することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14061495 | 1995-06-07 | ||
| JP7-140614 | 1995-06-07 | ||
| PCT/JP1996/001511 WO1996040934A1 (fr) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | Procede de production de l-lysine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3106501B2 true JP3106501B2 (ja) | 2000-11-06 |
Family
ID=15272810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09500307A Expired - Lifetime JP3106501B2 (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | Ｌ−リジンの製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0841395B1 (ja) |
| JP (1) | JP3106501B2 (ja) |
| KR (1) | KR100268324B1 (ja) |
| CN (1) | CN1165619C (ja) |
| AU (1) | AU705550B2 (ja) |
| BR (1) | BR9606379A (ja) |
| CA (1) | CA2224058C (ja) |
| CZ (1) | CZ293268B6 (ja) |
| DK (1) | DK0841395T3 (ja) |
| ES (1) | ES2373863T3 (ja) |
| HU (1) | HU222503B1 (ja) |
| MX (1) | MX9709923A (ja) |
| RU (1) | RU2197528C2 (ja) |
| SK (1) | SK285013B6 (ja) |
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| AU1619699A (en) | 1997-12-05 | 1999-06-28 | Human Genome Sciences, Inc. | Synferon, a synthetic type i interferon |
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