KR20090023513A - 염기성 물질의 제조법 - Google Patents
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Abstract
본원에서는, 염기성 물질을 함유하는 능력을 갖는 미생물을 액체 배지를 함유하는 발효조 중에서 배양하여 당해 배지 중에 염기성 물질을 생성 및 축적시키는 발효법에 의한 염기성 물질의 제조법으로서, 전체 배양공정 내의 적어도 일부의 기간 동안에 배지 중의 총 암모니아 농도를 일정한 농도 범위로 조정함으로써 염기성 물질의 카운터 이온으로서 사용되는 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용량을 감소시킴을 특징으로 하는 제조법이 기술된다.
염기성 물질, 카운터 이온, 총 암모니아 농도, 황산암모늄, 염화암모늄, 라이신 데카복실라제
Description
본 발명은 미생물 공업에 관련된 것이며, 상세하게는 발효법에 의한 염기성 물질의 제조방법에 관한 것이다. 발효법에 따라 제조할 수 있는 염기성 물질, 예를 들면, L-라이신은 동물사료용 첨가물로서, L-아르기닌 및 L-히스티딘은 수액 등의 의약품으로서 유용하다.
발효법에 의한 염기성 물질의 제조방법에서는 염기성 물질 생산능을 갖는 미생물을 배양하여, 배양액 중에 염기성 물질을 생성, 축적시켜 배양액으로부터 염기성 아미노산을 채취한다. 이때, 배양방법은 회분방식, 유가(流加)방식 또는 연속방식으로 실시된다.
이러한 염기성 물질의 발효 생산에 있어, 종래에는 배지의 pH를 중성으로 유지하기 위해 배양액 중에서 해리되어 양이온이 되는 목적 물질에 대한 카운터 음이온으로서, 황산 이온 또는 염화물 이온이 배지에 첨가된다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-30985호, 제(평)5-24969호].
배양액에서의 염기성 물질의 채취는 정제를 필요로 하는 경우에는 이온교환에 의해 실시되는 경우가 많다. 예를 들면, L-라이신의 경우에, 발효액을 약산성으로 조정하여, L-라이신을 이온교환 수지에 흡착시킨 다음, 암모늄 이온을 이용하여 수지로부터 용출시키고, 이를 라이신 기재로서 그대로 사용하거나 염산을 사용하여 L-라이신 염산염으로서 결정화시킨다.
상기한 L-라이신의 정제에서 배양액 중의 카운터 음이온으로서 염화물 이온을 사용하는 경우, 배양액을 농축하면 직접 L-라이신 염산염이 수득되지만, 현실적으로는 염화물 이온은 금속제의 발효조 등을 부식시키기 때문에, 배지 중에 고농도로 존재시키는 것은 바람직하지 않다.
한편, 정제하지 않은 경우에는 발효액을 그대로 농축시키거나 발효액을 염산 또는 황산을 이용하여 약산성으로 조정한 후, 분무 과립화한다. 이 경우에, 배양중에 첨가한 카운터 음이온도 잔류 성분이 되며, 수득되는 발효 생산물 중의 염기성 물질의 함유율이 저하된다.
한편, 일본 공개특허공보 2002-65287호(미국 특허 출원공개 제2002025564호)에는, 염기성 아미노산의 발효에서 탄산 이온 또는 중탄산 이온을 염기성 아미노산의 카운터 음이온으로서 이용하여 황산 이온 또는 염화물 이온의 일부를 대체하는 방법이 기재되어 있다. 배양액 중의 탄산 이온 또는 중탄산 이온은, pH를 산성으로 만들거나 배지를 농축시키거나 또는 이 둘을 병용하여 비교적 용이하게 제거할 수 있다. 당해 문헌에는 탄산 이온 또는 중탄산 이온을 배양액 중에 첨가하는 방법으로서, 발효 동안 발효조 내의 압력을 플러스가 되도록 제어하거나 탄산가스 또 는 탄산가스를 함유하는 혼합가스를 배지에 공급하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 탄산가스는 통상적인 배지 조건인 중성 부근의 pH에서는 거의 배양액에 용해되지 않는다. 따라서, 황산 이온 또는 염화물 이온의 감소효과를 높이기 위해 적당한 중탄산 이온이나 탄산 이온을 배양액 중에 존재시키기 위해서는, 알칼리성 pH에서 배양하는 것이 필요하다. 그러나, pH가 높아지면 일반적으로 세균의 생육속도 및 목적 물질의 생산능력이 저하된다.
발명의 개시
본 발명은 목적하는 염기성 물질 생산능을 갖는 미생물을 사용하고 탄산 이온 또는 중탄산 이온을 염기성 물질의 카운터 음이온으로서 이용하는 염기성 물질의 발효적 생산에서, 미생물 생육속도의 저하와 목적 물질의 생산능력의 저하를 회피하여 황산 이온 또는 염화물 이온의 감소와 효율적인 목적 물질의 생산을 양립할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
통상적으로 코리네형 세균 또는 에세리키아(Escherichia)속 세균을 사용하는 발효법에 의한 염기성 물질의 제조에서는 pH가 높아지면 생육속도나 목적 물질의 생산능력이 저하된다. 본 발명자는, 이의 주된 요인이 염기성 물질의 생성 또는 생육을 위한 질소원으로서 또는 염기성 물질의 카운터 이온원으로서 배지에 첨가되는 암모니아에 있으며, 총 암모니아 농도를 적절한 농도 범위로 조정하면서 발효함으로써 높은 pH 조건에서 미생물의 생육속도의 저하와 목적 물질의 생산능력의 저하를 대폭적으로 억제할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명은 상기 발견에 기초하여 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
(1) 염기성 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 액체 배지를 함유하는 발효조 중에서 배양하여 당해 배지 중에서 염기성 물질을 생성 및 축적시킴을 포함하고, 전체 배양공정 내의 적어도 일부의 기간 동안, 배지중 총 암모니아 농도를 일정한 농도 범위로 조정함으로써, 염기성 물질의 카운터 이온으로서 사용되는 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용양을 감소시킴을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
(2) 총 암모니아 농도의 일정 범위가 다음 조건을 만족시키는 범위인 (1)의 방법:
(A) 배지 중의 암모늄 이온 농도는, 배지 중에 용존된 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온 및 다른 음이온의 이온 당량의 합계가 배지 중에 축적된 염기성 물질중의 이온화된 염기성 물질의 이온 당량보다 커지도록 하는 농도이다;
(B) 배지 중의 총 암모니아 농도는, 미생물을 배지의 pH 및 총 암모니아 농도를 변경하여 배양하고, 염기성 물질의 생산성을 측정하고, 최적 조건에서의 염기성 물질의 생산성의 50% 이상의 생산성을 나타내는 총 암모니아 농도를 각각의 pH에서 측정함으로써 미리 결정된 상기 미생물의 염기성 물질의 생산을 억제하지 않는 농도이다.
(3) 총 암모니아 농도의 일정 범위가 다음과 같이 미리 측정되는 (1)의 방법:
(A') 목적하는 염기성 물질의 카운터 이온원으로서 pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하고 pH가 암모니아 가스, 암모니아수 및 요소중 하나 이상을 첨가함으로써 pH 6.5 내지 pH 7.2의 범위로 유지되는 배지 중에서 배양하고, 염기성 물질의 생산성을 측정하고,
(B') 상기 단계(A')에서 사용되는 배지 성분에서 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 저하시킨 배지를 사용하여 배양을 실시하고, 목적하는 염기성 물질의 축적에 의해 카운터 이온인 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 부족됨으로 인해 배지의 pH를 7.2 이하로 유지할 수 없는 기간 동안에는 총 암모니아 농도를 변화시켜 배양을 실시하여, (A')에서 측정된 생산성의 50% 이상의 생산성을 제공하는 총 암모니아 농도의 범위를 측정한다.
(4) 적어도 일부의 기간이 목적하는 염기성 물질의 축적에 의해 카운터 이온이 부족됨으로써 배지의 pH가 상승하는 기간 및 배지에 양이온을 첨가함으로써 pH가 상승하는 기간 중 하나 이상을 포함하는 (1)의 방법.
(5) 배지 중의 총 암모니아 농도가, 배지 중의 용존 산소 농도, 배지 중의 탄소원의 소비속도, 배지의 탁도, 염기성 물질의 생산성 및 배지의 pH 변화를 지표로 하여 측정되는 바에 따라 미생물의 활성이 저하되거나 정지할 때에 배지에 암모니아 또는 요소를 첨가함으로써 조정됨을 특징으로 하는 (1)의 방법.
(6) 배지로서, pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하는 배지의 조성으로부터 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 감소시킨 배지를 사용하며,
적어도 일부의 기간이 배지에 축적되는 염기성 물질로 인해서 카운터 이온이 부족됨으로써 pH를 7.2이하로 유지할 수 없는 기간임을 특징으로 하는 (1)의 방법.
(7) 다른 음이온이 황산 이온, 염화물 이온, 인산 이온 및 이온화된 유기산으로부터 선택되는 (2)의 방법.
(8) 다른 음이온의 합계가 900meq/l 이하임을 특징으로 하는 (2) 또는 (7)의 방법.
(9) 배양액 중의 총 암모니아 농도가 200mM 이하로 조정됨을 특징으로 하는 (1)의 방법.
(10) 미생물을 증식시키는 공정을 포함하는 (1)의 방법.
(11) 미생물을 증식시키는 공정 동안에는 총 암모니아 농도를 조정하지 않음을 특징으로 하는 (10)의 방법.
(12) 염기성 물질이 L-라이신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로부터 선택되는 (1)의 방법.
(13) 염기성 물질이 L-라이신인 (12)의 방법.
(14) 염기성 물질이 L-아르기닌인 (12)의 방법.
(15) 발효 후에 배지 또는 이의 처리물을 가열하여, 중탄산 이온 및 탄산 이온을 제거함을 특징으로 하는 (1)의 방법.
(16) 미생물이 코리네형 세균 또는 에세리키아속 세균인 (1)의 방법.
(17) (15)의 방법에 따라 수득되는 염기성 물질을 함유하는 발효액 또는 발효 생산물.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법은, 염기성 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 액체 배지를 함유하는 발효조 중에서 배양하여 당해 배지 중에 염기성 물질을 생성 및 축적시키는 발효에 의한 염기성 물질의 제조법이다. 본 발명의 방법은 전체 배양공정 내에 적어도 일부의 기간 동안, 배지 중의 총 암모니아 농도를 일정한 농도 범위로 조정함으로써 염기성 물질의 카운터 이온으로서 사용되는 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용량을 감소시킴을 특징으로 한다. 즉, 본 발명은 질소원으로서 미생물의 생육 또는 목적 물질의 생산에 필요한 양의 총 암모니아를 확보하면서, 총 암모니아 농도가 미생물의 생육 또는 목적 물질의 생산을 억제하지 않는 농도가 되도록 함으로써 황산 이온 및 염화물 이온이 감소된 배지에서 염기성 물질을 생산하는 방법이다.
총 암모니아 농도의 일정 범위로는 다음 조건을 만족시키는 범위를 들 수 있다:
(A) 배지 중의 암모늄 이온 농도는, 배지 중에 용존된 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온 및 다른 음이온의 이온 당량의 합계가 배지 중에 축적된 염기성 물질 중의 이온화된 염기성 물질의 이온 당량보다 커지도록 하는 농도이다;
(B) 배지 중의 총 암모니아 농도는 하기 방법에 따라 미리 결정된 미생물의 염기성 물질의 생산을 억제하지 않는 농도이다:
상기 미생물을 배지의 pH 및 총 암모니아 농도를 변경하여 배양하고, 염기성 물질의 생산성을 측정하고, 각각의 pH에서, 최적인 조건에서의 염기성 물질의 생산성의 50% 이상의 생산성을 나타내는 총 암모니아 농도를 측정한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에서, 총 암모니아 농도의 일정 범위는 하기의 방법에 따라 미리 결정된다:
(A')(순서 1: 중성 조건에서 발효 성적의 평가)
목적하는 염기성 물질의 카운터 이온원으로서 pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하는 배지로서, pH가 암모니아 가스, 암모니아수 및 요소 중 하나 이상을 첨가함으로써 pH 6.5 내지 pH 7.2의 범위로 유지되는 배지 중에서 배양하고, 염기성 물질의 생산성을 측정한다.
(B')(순서 2: 황산암모늄 또는 염화암모늄의 사용량을 감소시키면서, 제어하는 암모늄 이온의 농도를 변화시켜 발효 성적을 평가)
상기 순서 1(A')에서는, 사용하는 배지 성분에서 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 감소시킨 배지를 사용하여 배양을 실시하고, 목적하는 염기성 물질이 축적됨에 따라 카운터 이온인 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 부족됨으로써 배지의 pH를 7.2 이하로 유지할 수 없는 기간 동안에는 총 암모니아 농도를 변화시켜 배양을 실시하며, (A')에서 측정된 생산성의 50% 이상의 생산성이 수득되는 총 암모니아 농도의 범위를 결정한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에서는, 총 암모니아 농도의 일정 범위를 미리 결정하지 않아도, 총 암모니아 농도를 소정의 범위로 조정할 수 있다. 구체적으로, 배지 중의 총 암모니아 농도를, 배지 중의 용존 산소 농도, 배지 중의 탄소원의 소 비속도, 배지의 탁도, 염기성 물질의 생산성 및 배지의 pH 변화를 지표로 하여 측정되는 바에 따라 미생물의 활성이 저하되거나 정지할 때에 배지에 암모니아 또는 요소를 첨가함으로써 조정한다. 배지로서, 염기성 물질의 카운터 이온원으로서 pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하는 배지의 조성으로부터 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 감소시킨 배지가 사용된다. 또한, 적어도 일부의 기간으로는, 배지에 축적되는 염기성 물질에 대한 카운터 이온이 부족됨으로써 pH를 7.2이하로 유지할 수 없는 기간을 들 수 있다.
다른 음이온으로는 염화물 이온, 황산 이온, 인산 이온 및 유기산(아세트산, 락트산, 석신산) 등을 들 수 있다. 또한, 배지 중에 용존된 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온은 염기성 물질의 카운터 음이온으로서 작용한다.
본 발명에서, 이온 당량이란 각 이온의 몰농도에 각각의 가수를 곱한 값이며, eq/l의 단위로 나타낸다. 즉, 1가의 이온 1mM은 1meq/l이며, 2가의 이온 1mM은 2meq/l이다.
총 암모니아 농도의 조정은 배지에서 미생물의 생육 또는 염기성 물질의 생성에 필요한 양이며, 또한 미생물의 염기성 물질의 생산을 억제하지 않는 농도의 총 암모니아를 존재시키기 위한 것이며, 이에 따라 자동적으로 배지는 염기성 물질의 카운터 음이온으로서 필요한 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 용해시키는데 적합한 pH로 조정된다.
본 발명에서 「총 암모니아」란 해리되어 있지 않은 암모니아(NH3) 및 암모 늄 이온(NH4 +)의 합계를 말한다. 또한, 총 암모니아 농도를 조정하는 경우에, 측정하는 것은 해리되어 있지 않은 암모니아일 수 있으며 암모늄 이온이라도 양호하며, 또한 이들 둘다일 수 있다.
종래에는, 일반적으로 염기성 물질의 카운터 음이온의 공급원 및 질소원으로서, 황산암모늄이나 염화암모늄이 배지에 첨가된다. 또한, 통상적으로 배지의 pH의 조정에는 암모니아 또는 요소가 사용되므로 배지 중에는 고농도의 암모니아 및 암모늄 이온이 존재한다. 배지에 첨가되는 황산 이온 또는 염화물 이온의 양을 감소시키기 위해 황산암모늄 또는 염화암모늄의 양을 감소시키는 경우, 감소되는 분량에 상당하는 질소원을, 예를 들면, 암모니아 등으로서 공급하는 것이 필요하다. 이때, 목적하는 염기성 물질 등과 같이 세균에 의해 생성되며 배양이 진행됨에 따라 증가되는 양이온, 첨가한 암모니아 중의 이온화되어 있는 양이온 및 나트륨 이온이나 칼륨 이온 등과 같이 배지에 첨가된 양이온을 포함하는 양이온과 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온과 같이 세균의 호흡에 의해 발생하거나 배지에 첨가됨으로써 배지 중에서 증가되는 음이온과의 균형이 고려된 암모니아의 공급 방법을 개발하는 것이 필요하다. 이러한 균형이 유지되지 않으면, 암모니아가 너무 고농도가 되거나, pH가 과잉으로 높아지거나, 반대로 암모니아가 고갈됨으로써 발효가 성립되지 않는다. 본 발명에서는, 총 암모니아의 농도를 일정한 범위로 조정하는 암모니아의 첨가 방법을 개발함으로써 상기와 같은 양이온과 음이온의 균형을 양호하게 유지할 수 있도록 하고, 배지에 함유되는 황산 이온 또는 염화물 이온의 양이 감소되 는 조건하에서도 양호한 미생물의 생육 및 염기성 물질의 생성을 실현할 수 있다.
배지 중의 총 암모니아 농도의 조정은 배지에 암모니아 가스, 암모니아 용액 또는 요소 중 하나 이상을 첨가함으로써 배지 중의 총 암모니아 농도가 허용량이 되도록 함으로써 실시된다. 또한, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한, 염화암모늄 또는 황산암모늄 등의 암모늄염을 가할 수 있다. 또한, 배양 종료후에 기체로서 용이하게 제거할 수 있는 중탄산 이온 또는 또는 탄산 이온을 카운터 이온으로서 함유하는 암모늄염을 사용할 수 있다. 총 암모니아 농도는 배지 중 또는 배기 가스 중의 암모늄 이온 또는 암모니아의 농도를 측정하고, 이 측정치를 지표로서 사용하여 조절할 수 있다. 또한, 암모니아로 pH를 조정할 때에 총 암모니아 농도가 허용치가 되도록 하는 pH를 미리 설정하여, 이러한 pH가 되도록 암모니아를 첨가함으로써 총 암모니아 농도를 조정할 수 있다. 이 경우, 필요에 따라, 배양 동안에 상기한 바와 같이 설정된 pH를 변화시킬 수 있다.
또한, 배지 중의 총 암모니아 농도의 조정은 배지 중의 용존 산소 농도, 배지 중의 탄소원의 소비속도, 배지의 탁도, 염기성 물질의 생산성 및 배지의 pH 변화를 지표로 하여 측정되는 바에 따라 미생물의 활동이 저하되거나 정지할 때에 배지에 암모니아 또는 요소를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 즉, 배지 중의 질소원이 부족하거나 고갈되면, 미생물의 증식 또는 목적 물질의 생산과 같은 미생물의 활동은 저하되거나 정지된다. 통상적으로 미생물의 활동은 배지 중의 용존 산소 및 탄소원의 소비, 배지의 탁도의 상승, 목적 물질의 생산, 암모니아의 소비 또는 호흡에 의한 이산화탄소의 방출에 기인하는 배지의 pH의 저하로서 나타난다. 따라 서 미생물의 활동이 저하되거나 정지한 경우에, 단위 시간당 통기량 또는 교반속도가 일정하다면 배지 중의 용존 산소 농도가 상승하며, 또한 암모니아의 소비와 탄산가스의 배출이 저하됨으로써 배지의 pH는 상승한다. 또한, 탄소원의 소비속도, 배지의 탁도의 증가속도 및 목적 물질의 생산속도가 저하된다. 따라서, 질소원 이외의 배지 성분이 충족되어 있는 상태에서 이들을 지표로 하여 미생물의 활동의 정체가 관찰될 때에는 질소원이 부족하거나 고갈되어 있을 때이다. 이때에 미생물의 생육 또는 목적 물질의 생산에 필요한 양의 암모니아 또는 요소를 배지에 첨가한다. 이 과정을 반복함으로써 결과적으로 배지 중의 총 암모니아 농도가 일정 범위로 유지된다. 배지에 요소를 첨가하여 배양하면, 미생물에 의해 요소가 자화(資化)되며, 암모니아가 배지로 방출된다. 상기와 동일하게 하여 암모니아 또는 요소의 첨가를 반복하면 배지의 pH는 서서히 상승한다. 암모니아 또는 요소의 첨가량은 배지 중의 총 암모니아의 종결 농도로서 1회에 300mM, 바람직하게는 200mM, 보다 바람직하게는 100mM을 들 수 있다. 또는, 암모니아 또는 요소를 첨가한 후의 pH의 상승이 0.3, 바람직하게는 0.15, 보다 바람직하게는 0.1 이내가 되도록 암모니아 또는 요소를 첨가할 수 있다.
또한, 배지 중의 용존 산소 농도는 예를 들면, 용존 산소전극에 의해 측정할 수 있다.
배지 중에 용존된 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온, 및 다른 음이온의 이온 당량의 합계가 배지 중에 축적된 염기성 물질의 이온 당량보다 높은 것은 중탄산 이온, 탄산 이온 및 다른 음이온의 농도 및 염기성 물질의 농도를 측정함으로써 확 인할 수 있다. 또한, 예비실험을 실시하여, 상기 조건을 만족시키는 pH 및/또는 암모니아의 첨가량을 설정하고, 이러한 pH 및/또는 암모니아의 첨가량으로 배양을 실시함으로써 상기 조건을 만족시킬 수 있다.
본 발명에서 배양 pH는 일정할 수 있거나 일정하지 않을 수 있다. 또한, 배지의 pH를 제어하는 경우, pH의 제어는 pH 자체를 지표로 하여 실시할 수 있으며, 직접적으로 pH 자체를 제어하지 않으며 총 암모니아 농도를 제어함으로써 간접적으로 제어할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 미생물의 활동을 지표로 하면서 암모니아 또는 요소를 첨가하면, 배지 중의 총 암모니아 농도가 적정한 농도 범위로 조절되고, 염기성 물질이 축적됨에 따라 pH가 서서히 증가한다. 또한, 총 암모니아 농도를 일정한 범위내로 제어하여 배양하면, 배지 중의 각종 양이온과 음이온의 축적 균형이 변화되어 결과적으로 pH가 변화된다. 어떠한 수단을 선택하더라도, 결과적으로 배지 중의 총 암모니아 농도가 일정한 농도 범위로 조정되며, 염기성 물질의 카운터 이온으로서 사용되는 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용량을 감소시킬 수 있다.
본 발명에서, 「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는다」란 본 발명에서 사용하는 미생물이 양호하게 생육되며, 또한 염기성 물질이 양호하게 생산되는 것을 의미한다. 미생물의 생육이 불충분한 경우 또는 미생물이 양호하게 생육되더라도 염기성 물질이 효율적으로 생산되지 않는 경우에는, 염기성 물질의 생산은 억제된다고 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 사용하는 미생물을 배지의 pH 및 총 암모니아 농도 를 변경하여 배양하고, 배지에 축적되는 염기성 물질의 생산성을 측정하고, 최적인 조건, 예를 들면, 종래의 중성에서 일반적인 조건에서의 염기성 물질의 생산성의 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 성적이 각각의 pH에서 수득되도록 하는 총 암모니아 농도는 「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는」 농도이다. 또한, 본 발명에서, 「생산성」이란 수율, 생산속도 또는 총생산량을 말한다. 「수율」이란 배지 중의 자화할 수 있는 탄소원을 기준으로 한 염기성 물질의 생산량을 말하며, 「생산속도」란 단위 시간당 생산량을 말한다. 또한, 단순히 「생산량」이란 용어가 사용되는 경우, 이는 탄소원을 완전하게 소비할 때의 배지 중의 염기성 물질의 축적량을 말한다.
또한, 본 발명에서 사용하는 미생물을 최적인 조건, 예를 들면, 종래의 중성에서 일반적인 조건하에 배양한 경우에 배지에 축적되는 염기성 물질의 생산성을 측정한 다음, 동일한 조성의 배지로부터 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 감소시킨 배지를 사용하여 배양을 실시하고, 생산성을 측정한다. 이 경우, 목적하는 염기성 물질의 축적에 따라 카운터 이온인 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 부족됨으로써 배지 중의 pH가 상승하는 기간이 존재한다. 이 기간 동안에 총 암모니아 농도를 일정한 농도 범위로 제어하여 배양한다. 제어하는 농도 범위로서, 1mM 내지 500mM의 범위 내의 각종 농도 범위로 설정하여 배양을 실시하고, 염기성 물질의 생산성이 최적인 조건의 경우와 비교하여 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 성적을 얻도록 하는 농도 범위를 「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는」 농도로 한다. 상기 「종래 의 중성에서 일반적인 조건」에 사용되는 배지로는 pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하는 배지를 들 수 있다.
또한, 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 목적하는 양만큼의 감소는 염기성 물질의 목적하는 생산성이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다.
「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는」 총 암모니아의 농도는 예를 들면, 하기와 같이 결정할 수도 있다. 본 발명에서 사용하는 미생물을 배지의 pH 및 총 암모니아 농도를 변경하여 배양하고, 배지에 축적된 염기성 물질의 양을 측정한다. 각각의 조건에서의 염기성 물질의 축적량을 최적 조건에서의 축적량과 비교한다. 이와 동일하게 하여, 염기성 물질의 생산을 억제하지 않는 총 암모니아 농도를 결정할 수 있다. 최적 조건이란, 예를 들면, 종래의 중성에서 일반적인 조건과 같이 중성으로 배양하는데 충분한 카운터 이온을 사용하여 배양하는 조건을 말한다.
또한, 「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는」 총 암모니아의 농도는 예를 들면, 하기와 같이 결정할 수도 있다. 본 발명에서 사용하는 미생물을 최적 조건, 예를 들면, 종래의 중성에서 일반적인 조건으로 배양한 경우에 배지에 축적되는 염기성 물질의 생산성을 측정한 다음, 동일한 조성의 배지로부터 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 목적하는 양만큼 감소된 배지를 사용하여 배양을 실시하고, 생산성을 조사한다. 이 경우, 목적하는 염기성 물질의 축적에 따라 카운터 이온인 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 부족됨으로써 배지 중의 pH가 상승하는 기간이 존재한다. 이 기간 동안, 총 암모니아 농도를 일정한 농도 범위로 제어하여 배양한다. 제어하는 농도 범위로서, 1mM 내지 500mM의 범위 내의 각종 농도 범위로 설정하여 배양을 실시하고, 이의 생산성이 최적인 조건의 경우와 비교한다.
「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는다」에는 예를 들면, 최적인 조건에서 염기성 물질을 생산하는 경우의 생산성이 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 생산성이 얻어지는 조건이 포함된다. 구체적으로, 배지 중의 총 암모니아 농도로는 바람직하게는 300mM 이하, 보다 바람직하게는 200mM, 특히 바람직하게는 100mM 이하의 농도를 들 수 있다. 암모니아의 해리도는 pH가 높아지면 저하된다. 해리되지 않은 암모니아는 암모늄 이온보다 균에 대하여 독성이 강하다. 따라서, 총 암모니아 농도의 상한은 배양액의 pH에도 의존한다. 즉, 배양액의 pH가 높을수록 허용되는 총 암모니아 농도는 낮아진다. 따라서, 「염기성 물질의 생산을 억제하지 않는」 총 암모니아 농도와 관련하여, 배양 동안의 가장 높은 pH에서 허용되는 총 암모니아 농도 범위를 배양 기간을 통한 총 암모니아 농도의 범위로 간주할 수 있다.
한편, 미생물의 생육 및 염기성 물질의 생산에 필요한 질소원으로서의 총 암모니아 농도는, 배양 동안에 질소원이 부족됨으로 인해 미생물에 의한 목적 물질의 생산성이 저하되지 않는 한, 특별히 제한되지 않으며 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 배양 동안에 암모니아 농도를 경시적으로 측정하여, 배지 중의 암모니아가 고갈되면 소량의 암모니아를 배지에 첨가할 수 있다. 암모니아를 첨가할 때의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 총 암모니아 농도로서 바람직하게는 1mM 이상, 보다 바람직하게는 5mM 이상, 특히 바람직하게는 10mM 이상의 농도를 들 수 있다.
본 발명의 방법은 주로 염기성 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 증식시키는 배양공정 및 주로 미생물에 염기성 물질을 생산하는 배양공정을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 미생물의 증식과 염기성 물질의 생성을 병행하여 실시할 수 있다. 또한, 주 발효 또는 본 배양 등으로 호칭되는 상기와 같은 배양과 별도로, 전배양을 실시할 수 있다.
본 발명에서, 상기한 바와 같이 배지 중의 총 암모니아 농도를 조정하는 것에 추가하여, 배지 중에 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 용존되기 용이해지도록 하는 조작을 실시할 수 있다. 이러한 조작으로는 발효 동안 발효조 내의 압력이 플러스로 되도록 제어하거나, 탄산가스 또는 탄산가스를 함유하는 혼합가스를 배지에 공급하거나 배지 중에 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 용존되도록 발효조 내의 통기를 제한하거나 암모늄 이온 이외의 양이온, 예를 들면, 나트륨 이온 또는 칼륨 이온 등을 배지에 첨가함으로써 pH를 상승시키는 것 등을 들 수 있다.
발효조 내의 압력이 플러스로 되도록 하기 위해서는, 예를 들면, 발효조로의 공급 기압을 배출 기압보다 높게 하면 양호하다. 발효조 내의 압력을 높게 함으로써 발효에 의해 생성되는 탄산가스가 배양액에 용해되고, 중탄산 이온 또는 탄산 이온을 발생시킨다. 발효조 내의 압력으로는 구체적으로 0.13 내지 0.3MPa, 바람직하게는 0.15 내지 0.25MPa를 들 수 있다.
또한, 배양액에 탄산가스 또는 탄산가스를 함유하는 혼합가스를 공급함으로써 배양액에 탄산가스를 용해시킬 수 있다. 또는 발효조로의 통기를 제한함으로써 발효에 의해 생성되는 탄산가스를 배양액에 용해시킬 수 있다. 적합한 통기량은, 예를 들면, 배지 중의 중탄산 이온 또는 탄산 이온을 측정하거나 pH 또는 암모니아 농도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 배양액에 탄산가스를 공급하는 경우에는 예를 들면, 순수 탄산가스 또는 탄산가스를 5용적% 이상 함유하는 혼합가스를 버블링시킬 수 있다. 또한, 배지에 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 용해시키는 상기한 방법은 단독으로서 또는 복수를 조합하여 사용할 수 있다.
배지 중의 총 암모니아 농도를 조정하는 조작 및 필요에 따라 배지 중에 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 용존하기 용이해지도록 하는 조작은 전체 배양공정 내의 적어도 일부의 기간 동안 실시하면 양호하다.
상기 「적어도 일부의 기간」이란 목적하는 생산성이 얻어지는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로 예를 들면, 본 배양에서 전체 배양공정의 1/10 이상, 바람직하게는 1/5 이상을 올릴 수 있다. 보다 구체적으로, 목적하는 염기성 물질의 축적에 따라 배지에 사용되는 황산 이온 및/또는 염화물 이온 등의 카운터 이온이 부족됨으로 인해 배지의 pH가 상승하는 기간, 배지에 양이온이 첨가됨으로 인해 pH가 상승하는 기간 및 이들 두 기간 모두가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 배지는 적어도 총 암모니아 농도를 조정하는 조작을 실시할 때에 총 암모니아 농도가 상기한 범위 내에 있는 한, 특별히 제한되지 않으며 탄소원, 질소원 등의 유기, 무기 영양원 및 기타 미량 영양소를 함유하는 배지를 사용하는 미생물에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
탄소원은 미생물이 자화할 수 있는 탄소원이면 어떠한 것이라도 양호하며, 예를 들면, 사카로스, 글루코스, 프럭토스, 당밀, 전분 가수분해물 등의 당, 아세 트산 등의 유기산, 에탄올 등의 알코올, 메탄 등의 탄화수소를 들 수 있다.
질소원으로는 암모니아 등의 무기물, 단백질 가수분해물 또는 효모 추출물 등을 들 수 있다. 미량 영양소로는 아미노산, 비타민 또는 미량 금속원소를 들 수 있다.
배지에 함유되는 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온 이외의 다른 음이온에는 염화물 이온, 황산 이온, 인산 이온, 이온화된 유기산 및 수산화물 이온 등을 들 수 있다. 이들 다른 이온의 이온 당량의 합계는 통상적으로는 900meq/l 이하, 바람직하게는 700meq/l 이하, 보다 바람직하게는 500meq/l 이하, 더욱 바람직하게는 300meq/l 이하, 특히 바람직하게는 200meq/l 이하이다.
본 발명에서는 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용량을 감소시키는 것이 목적의 하나이며, 배지에 함유되는 황산 이온 또는 염화물 이온 또는 이들의 이온 당량의 합계는 통상적으로 700meq/l 이하, 바람직하게는 500meq/l 이하, 보다 바람직하게는 300meq/l 이하, 더욱 바람직하게는 200meq/l 이하, 특히 바람직하게는 100meq/l 이하이다.
발효 형태에 관해서는 특별한 제한은 없으며, 배지를 유가하지 않는 회분배양, 투입된 당이 소비되는 시점에서, 다시 배지를 유가하는 유가배양, 배지가 발효조의 허용량을 초과하는 시점에서 배지를 추출하는 연속배양, 균체를 재회수하는 세포 재순환(cell recycle) 방법 등의 어떠한 것이라도 될 수 있다. 배양온도는 사용하는 미생물에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 통상적으로는 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 또한, 발효 동안에 충분한 교반과 산소를 공급하 는 것이 바람직하다.
목적하는 염기성 물질을 생산하기 위한 배양은 구체적으로 예를 들면, 하기와 같이 실시한다. 통상적인 일반적으로 사용되는 배지 성분에서 황산암모늄 또는 염화암모늄 등의 암모늄염을 일부 또는 모두 제거한 배지를 제조한다. 이러한 배지에 별도 배양한 미생물을 접종하고, 상기한 바와 같이 결정된, 사용되는 미생물에 적합한 총 암모니아 농도 범위로 제어하여 배양한다. 발효조 중의 배양액 또는 샘플링한 배양액 중의 암모니아 농도는 예를 들면, 시판되는 이온 측정기 등을 사용하여 측정할 수 있다. 이의 측정치를 지표로 하여 총 암모니아 농도를 제어할 수 있다. 총 암모니아 농도가 소정의 농도 범위가 되도록 암모니아 가스 또는 암모니아수 또는 요소를 배양액에 첨가할 수 있다. 발효조로부터 배기 가스중의 암모니아 농도를 일반적인 암모니아 전극에 의해 측정함으로써 배지 중의 총 암모니아 농도를 간접적으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에서, 배지 중의 총 암모니아 농도의 조정은 상기한 바와 같이 배지의 pH를 지표로 사용하여 하기에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
목적하는 염기성 물질의 카운터 이온원으로서 pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하는 배지의 조성으로부터 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 목적하는 양만큼 감소된 배지에서, 암모니아 가스, 암모니아수 및 요소 중 하나 이상을 첨가하여 당해 배지의 pH를 변화시키면서 배양하고, 배지에 축적될 목적하는 염기성 물질에 대한 카운터 이온이 부족됨으로써 pH를 7.2이하로 유지할 수 없는 기간 동안에는 배지 중의 용존 산소 농도의 경시적 변 화, 배지 중의 탄소원의 소비속도의 경시적 변화, 배지의 탁도의 경시적 변화 또는 배지의 pH 변화 등을 지표로 하여, 암모니아 가스, 암모니아수 및 요소 중 하나 이상을 첨가함으로써 간접적으로 배지 중의 총 암모니아 농도를 적합한 농도 범위로 유지하여 배양한다.
본 발명에 따라 제조되는 염기성 물질로는 염기성 아미노산, 구체적으로는 L-라이신, L-아르기닌 및 L-히스티딘을 들 수 있다. 이들 중에서는 L-라이신이 바람직하다.
염기성 물질 생산능을 갖는 미생물에는 특별한 제한은 없으며, 발효법에 따라 염기성 물질을 생산할 수 있는 한, 어떠한 미생물이라도 사용할 수 있다. 특히, 배지의 pH가 높더라도, 배지 중의 총 암모니아 농도가 낮은 경우에 염기성 물질을 양호하게 생산하는 미생물이 적합하게 사용된다. 이러한 미생물로는 코리네형 세균, 에세리키아속, 세라티아(Serratia)속, 바실루스(Bacillus)속에 속하는 세균을 들 수 있다.
하기에 코리네형 세균 및 에세리키아속 세균에 관해 설명하지만, 본 발명의 방법에 사용되는 미생물은 이들 세균으로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 코리네형 세균에는 코리네박테리움속 세균 및 종래에는 브레비박테리움 속으로 분류되었지만 현재는 코리네박테리움 속에 통합된 세균이 포함되며[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)], 또한 코리네박테리움 세균과 매우 밀접하게 관련된 브레비박테리움 속 세균이 포함된다. 이러한 코리네형 세균의 예로는 다음이 포함된다:
코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티컴(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리엄(Corynebacterium lilium)(코리네박테리움 글루타미컴)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes)
코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)(코리네박테리움 글루타미컴)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(코리네박테리움 글루타미컴)
브레비박테리움 이마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)(코리네박테리움 글루타미컴)
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오제니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리넘(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum).
코리네형 세균의 구체적 예는 다음과 같다.
코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC13870
코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC15806
코리네박테리움 알카놀리티컴 ATCC21511
코리네박테리움 칼루내 ATCC15991
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
코리네박테리움 릴리엄(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC15990
코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965
코리네박테리움 서모아미노제네스 AJ12340(FERM BP-1539)
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868
브레비박테리움 디바리카텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC14020
브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC13826, ATCC14067
브레비박테리움 이마리오필럼 ATCC14068
브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC13869
브레비박테리움 로세움 ATCC13825
브레비박테리움 사카롤리티컴 ATCC14066
브레비박테리움 티오제니탈리스 ATCC19240
브레비박테리움 암모니아제네스(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC6871
브레비박테리움 알붐 ATCC 15111
브레비박테리움 세리넘 ATCC 15112
마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC 15354.
또한, 에세리키아속에 속하는 세균의 예에는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)가 포함된다. 에세리키아 콜라이를 유전공학적 기법으로 육종하는 경우에 이. 콜라이 K12주 및 이의 유도체인 에세리키아 콜라이 MG1655주(ATCC 제47076호) 및 W3110주(ATCC 제27325호)를 사용할 수 있다. 에세리키아 콜라이 K12주는 1922년에 스탠포드 대학에서 분리된 것이며, λ 파아지의 용원균인 동시에 F 인자를 가지며 접합 등에 의해 유전적 재조합체가 생성될 수 있는 범용성이 높은 균주이다. 또한, 에세리키아 콜라이 K12주의 게놈 서열은 이미 결정되어 있으며 유전자 정보도 자유롭게 이용할 수 있다. 에세리키아 콜라이 K12주 및 이의 유도주를 입수하기 위해, 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에서 분양을 받을 수 있다(ATCC 주소: P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, United States of America).
L-라이신 생산능을 갖는 코리네형 세균으로는 S-(2-아미노에틸)-시스테인(이하, AEC라고 약칭한다) 내성 변이주, 이의 성장을 위해 L-호모세린 등의 아미노산을 필요로 하는 변이주[참조: 일본 특허공보 제(소)48-28078호, 제(소)56-6499호], AEC에 내성을 나타내며 또한 L-로이신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린 등의 아미노산을 요구하는 변이주[참조: 미국 특허 제 3,708,395호 및 제3,825,472호], DL-α-아미노-ε-카프롤락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파르트산-유사체, 설파제, 퀴노이드, N-라우로일로이신에 내성을 나타내는 L-라이신 생산 변이주, 옥살로아세트산 탈탄산 효소(데카복실라제)또는 호흡계 효소 억제제에 내성을 나타내는 L-라이신 생산 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)50-53588호, 제(소)50-31093호, 제(소)52-102498호, 제(소)53-9394호, 제(소)53-86089호, 제(소)55-9783호, 제(소)55-9759호, 제(소)56-32995호, 제(소)56-39778호, 특허공보 제(소)53-43591호, 제(소)53-1833호], 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 L-라이신 생산 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)55-9784호, 제(소)56-8692호], 플루오로피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 대하여 감수성을 나타내는 L-라이신 생산 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)55-9783호, 제(소)53-86090호], 에틸렌글리콜에 내성을 나타내며 L-라이신을 생산하는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속의 생산 변이주[참조: 미국 특허출원 제333455호]를 들 수 있다.
구체적으로 예를 들면, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 31269, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 21475, 코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC 21491을 들 수 있다.
또한, 실시예에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869/pVK-C*, plysE도 또한 바람직한 L-라이신 생산 코리네형 세균이다. 상기 균주는 L-라이신 및 L-트레오닌에 의한 피드백 억제가 해제된 탈감작형 아스파르토키나제를 암호화하는 유전자(lysC*)를 함유하는 플라스미드 pVK-C*와, 코리네박테리움속 세균으로 공지되어 있는 L-라이신의 배출을 촉진하는 유전자(국제공개 팜플렛 제9723597 A2호)의 상동 유전자인 lysE 유전자를 함유하는 플라스미드 plysE[참조: 미국 특허 출원공개 제2003113899호]를 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 야생주인 ATCC 13869주에 도입시킨 균주이다.
lysC* 유전자는 예를 들면, ATCC 13869를 돌연변이 처리하여 유도한 L-라이신 생산성 변이주 AJ3463(FERM P-1987)[참조: 일본 특허공보 제(소)51-34477호]로부터 단리할 수 있다. AJ3463주는 1973년 3월22일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(구 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)(주소 우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6)에 FERM P-1987의 수탁번호로 기탁되어 있다. 또한, lysC* 유전자 단편은 당해 유전자를 함유하는 플라스미드 p399AK9B를 유지하는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12691주로부터 단리할 수 있다. AJ12691주는 1992년 4월 10일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁번호 FERM P-12918로서 기탁되었고, 1995년 2월 10일자로 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁으로 이관되고, FERM BP-4999의 수탁번호로 기탁되어 있다. 플라스미드 p399AK9B는 AJ3463주 유래의 lysC를 클로닝 벡터 pHSG399[참조: Takeshita, S et al; Gene(1987), 61, 63-74]에 삽입하여 수득한 플라스미드 p399AK9 내로 코리네박테리움속 세균내에서 플라스미드를 자율 복제할 수 있게 하는 능력을 갖는 DNA 단편을 삽입함으로써 수득한 것이다[참조: 미국 특허 제5,766,925호].
탈감작형 아스파르토키나제는 야생형 아스파르토키나제의 α-서브유닛의 279 위치의 알라닌 잔기 및 β-서브유닛의 30위치의 알라닌 잔기가 각각 트레오닌 잔기에 치환되어 있다. α-서브유닛 및 β-서브유닛은 함께 lysC 유전자의 동일한 프레임(frame)내에 암호화되어 있다. lysC* 유전자의 염기 서열과 탈감작형 아스파르토키나제의 α-서브유닛의 아미노산 서열을 각각 서열번호 5 및 6에 기재하며, 동일 유전자의 염기 서열과 탈감작형 아스파르토키나제의 β-서브유닛의 아미노산 서열을 각각 서열번호 7 및 8에 기재한다.
코리네형 세균의 lysE 유전자는 보고되어 있는 이의 염기 서열(GenBank 승인번호 X96471)에 기초하여 작제한 프라이머, 예를 들면, 서열번호 3 및 4에 기재된 프라이머를 사용하여, 코리네형 세균의 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법(PCR: 폴리머라제 연쇄 반응; 참조: White, T.J. et al., Trends Genet.5, 185(1989))에 의해 취득할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미컴 lysG 및 lysE 유전자를 함유하는 DNA 단편의 염기 서열(GenBank 승인번호 X96471)를 서열번호 9에 기재하며, 당해 유전자에 의해 암호화되는 LysE 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 10에 기재한다. 또한, LysG은 서열번호 8의 염기번호 1723 내지 2352에 상당하는 위치의 상보적 서열에 의해 암호화된다.
아스파르토키나제의 α-서브유닛, β-서브유닛 및 LysE 단백질을 암호화하는 DNA에는, 이들 단백질의 활성이 상실되지 않는 한, 각각의 단백질의 1개 또는 수개의 위치에서 1개 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함할 가능성이 있는 단백질을 암호화하는 DNA가 포함된다. 「수개」의 아미노산의 수는 단백질의 3차원 구조 중의 아미노산 잔기의 위치 또는 종류에 따라 상이하지만, 각 각의 단백질에 대하여 바람직하게는 2 내지 30, 보다 바람직하게는 2 내지 20, 특히 바람직하게는 2 내지 10이다. 이것은 하기의 이유에 기인한다. 즉, 몇몇 아미노산은 서로 높은 상동성을 가지며 이러한 아미노산들 간의 차이는 단백질의 3차원 구조 및 이의 활성에 크게 영향받지 않기 때문이다. 따라서, 각각의 단백질은 서열번호 6, 8 또는 10에 기재된 아미노산 잔기에 대하여 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지며 또한 아스파르토키나제 또는 LysE 단백질의 활성을 갖는 단백질일 수 있다.
상기와 같은 단백질의 변형은 각각의 단백질의 활성이 유지되도록 하는 보존적 돌연변이이다. 치환은 아미노산 서열중 적어도 1개의 잔기가 제거되어, 여기에 다른 잔기가 삽입되는 변화이다. 각각의 단백질의 원래의 아미노산을 치환하며 또한, 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 치환으로는 ala에서 ser 또는 thr로의 치환, arg에서 gln, his 또는 lys로의 치환, asn에서 glu, gln, lys, his 또는 asp로의 치환, asp에서 asn, glu 또는 gln로의 치환, cys에서 ser 또는 ala로의 치환, gln에서 asn, glu, lys, his, asp 또는 arg로의 치환, glu에서 asn, gln, lys 또는 asp로의 치환, gly에서 pro로의 치환, his에서 asn, lys, gln, arg 또는 tyr로의 치환, ile에서 leu, met, val 또는 phe로의 치환, leu에서 ile, met, val 또는 phe로의 치환, lys에서 asn, glu, gln, his 또는 arg로의 치환, met에서 ile, leu, val 또는 phe로의 치환, phe에서 trp, tyr, met, ile 또는 leu로의 치환, ser에서 thr 또는 ala로의 치환, thr에서 ser 또는 ala로의 치환, trp에서 phe 또는 tyr로의 치환, tyr에서 his, phe 또는 trp로의 치환 및 val에서 met, ile 또는 leu로의 치환을 들 수 있다.
서열번호 6, 8 또는 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들면, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되도록 부위 특이적 돌연변이도입법을 사용하여, 서열번호 6, 8 또는 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜 수득할 수 있다. 이러한 변형된 DNA는 돌연변이를 발생시키는 시약 및 조건에서의 처리를 사용하는 종래 방법에 따라 수득될 수 있다. 이러한 처리로서, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 하이드록실아민으로의 처리 또는 DNA를 유지하는 세균의 UV 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 아질산 등의 시약으로의 처리를 들 수 있다.
상기와 같은 변형된 단백질을 암호화하는 DNA는 엄중한 조건(stringent condition)하에 lycC 유전자 또는 lysE 유전자 또는 이들 유전자의 일부분과 하이브리드화하며 또한 아스파르토키나제 활성 또는 lysE 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 단리함으로써 수득될 수 있다. 용어 「엄중한 조건」에는 소위 특이적 하이브리드가 형성되며 또한비특이적 하이브리드가 형성되지 않도록 하는 조건을 포함한다. 예를 들면, 엄중한 조건에는 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들면, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화하는 조건이 포함된다. 또한, 엄중한 조건에는 서던 하이브리드화에서 통상적인 세정 조건, 예를 들면, 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1% SDS가 포함된다.
또한, 에세리키아속에 속하는 L-라이신 생산균으로는 L-라이신 유사체에 내성을 갖는 변이주를 예시할 수 있다. 이러한 L-라이신 유사체는 에세리키아속 세균의 증식을 억제하지만, 이의 억제는 L-라이신이 배지 중에 공존하면, 전체적 또는 부분적으로 해제된다. 예를 들면, 옥살리딘, 라이신하이드록사메이트, (S)-2-아미노에틸-L-시스테인(AEC), γ-메틸리딘, α-클로로카프롤락탐 등이 있다. 이들 라이신 유사체에 내성을 갖는 변이주는 통상적인 인공 돌연변이 조작을 에세리키아속의 미생물에 실시함으로써 얻어진다. L-라이신 제조에 사용하는 균주로서, 구체적으로는 에세리키아 콜라이 AJ11442(FERM BP-1543, NRRL B-12185; 일본 공개특허공보 제(소)56-18596호 및 미국 특허 제4,346,170호 참조) 및 에세리키아 콜라이 VL611을 들 수 있다. AJ11442주는 1981년 5월 1일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(구 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)(주소 우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6)에 수탁번호 FERM P-5084로서 기탁되었으며, 1987년 10월 29일자로 이러한 원기탁으로부터 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고, FERM BP-1543으로서 기탁되어 있다. 이상의 미생물의 아스파르토키나제는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제되어 있다.
또한, 예를 들면, 탈감작형 아스파르토키나제 이외에 L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강된 세균도 또한 적합한 L-라이신 생산균으로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 디하이드로디피콜린산 합성효소, 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 디아미노피멜산 탈탄산 효소, 디아미노피멜산 데하이 드로게나제[이상, 참조: 국제공개 96/40934호 팜플렛], 포스포에놀피루브산 카복실라제(일본 공개특허공보 제(소)60-87788호], 아스파르테이트 아미노트랜스페라제[일본 특허공보 제(평)6-102028호], 디아미노피멜산 에피머라제 유전자[일본 공개특허공보 2003-135066호], 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제[국제공개 00/61723호 팜플렛] 등의 디아미노피멜산 경로의 효소 또는 호모아코니트산 하이드라타제[일본 공개특허공보 2000-157276호] 등의 아미노아디프산 경로의 효소 등을 들 수 있다.
L-라이신 생산능을 갖는 에세리키아 콜라이로서, 구체적으로 예를 들면, 에세리키아 콜라이 W3110(tyrA)/pCABD2(국제공개 제WO 95/16042호에 기재) 등을 들 수 있다. 에세리키아 콜라이 W3110(tyrA)/pCABD2는 에세리키아 콜라이의 tyrA 결손주 W3110(tyrA)[이는 AJ12604라고 명명되어, 평성 3년 1월 28일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(구 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)(주소 우편번호 305-8566 일본 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6)에 FERM P-11975의 수탁번호로 기탁되어 있으며, 1991년 9월 26일자로 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되어, FERM BP-3579의 수탁번호로 기탁되어 있다]에 L-라이신 생합성계 효소 유전자를 유지하는 플라스미드 pCABD2를 도입한 주이다.
pCABD2는 118위치의 히스티딘 잔기가 티로신 잔기로 돌연변이되어 있으며 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이형 디하이드로디피콜린산 합성효소를 암호화하는 유전자, 352위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 돌연변이되어 있으며 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이형 아스파르토키나제 III을 암호화하는 유전자 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 유지하고 있다.
또한, 이. 콜라이 W3110(tyrA)주는 하기와 같이 수득할 수 있다. 한편, 유럽 공개특허공보 제488424/1992호에는 W3110(tyrA)주에 플라스미드를 도입하여 수득되는 많은 균주가 기재되어 있다. 예를 들면, 플라스미드 pHATerm을 도입하여 수득된 균주는 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm주라고 명명되고, 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있으며 등록번호 FERM BP-3653이 부여되어 있다. 이러한 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm주로부터 플라스미드 pHATerm을 제거함으로써 W3110(tyrA)주를 취득할 수 있다. 플라스미드의 제거는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.
또한, 에세리키아 콜라이의 L-라이신 생산균으로는 WC196주(제WO 96/17930호 국제공개 팜플렛 참조)를 사용할 수 있다. WC196주는 에세리키아 콜라이 K-12 유래의 W3110주에 AEC(S-(2-아미노에틸)-시스테인) 내성을 부여함으로써 육종된 것이다. 당해 균준는 에세리키아 콜라이 AJ13069주라고 명명되어, 1994년 12월 6일자로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현재는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6)에 수탁번호 FERM P-14690으로서 기탁되어 있으며, 1995년 9월 29일자로 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고, 수탁번호 FERM BP-5252가 부여되어 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 미생물은 L-라이신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-라이신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성 또는 L-라이신 생산을 하향 조절하는 기능을 하는 효소의 활성이 저하되거나 결손될 수 있다. L-라이신 생산에서, 이러한 효소로는 호모세린 데하이드로게나제, 라이신 데카복실라제(cadA, ldcC), 말산 효소가 있으며, 당해 효소의 활성이 저하되거나 결손된 균주는 국제공개 제WO 95/23864호, 제WO 96/17930호 팜플렛, 제WO 2005/010175호 팜플렛 등에 기재되어 있다.
이들 효소의 활성을 저하시키거나 결손시키는 방법으로서, 통상적인 돌연변이유발법에 따라 염색체 위의 상기 효소의 유전자내로 세포중의 당해 효소의 활성이 저하되거나 결손하도록 하는 돌연변이를 도입할 수 있다. 예를 들면, 유전자 재조합에 의해 염색체 위의 효소를 암호화하는 유전자를 결손시키거나, 프로모터 또는 샤인-달갈노(Shine-Dalgarno, SD) 서열 등의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 달성된다. 또한, 염색체 위의 효소를 암호화하는 영역에 아미노산 치환)를 도입하거나(미스센스 돌연변이, 개시 종료 코돈을 도입하거나(넌센스 돌연변이), 1 내지 2개의 염기를 부가 또는 결실시키는 프레임 이동 돌연변이를 도입하거나, 유전자의 일부분을 결실시킴으로써 달성할 수 있다[참조: Journal of biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)]. 또한, 암호화 영역이 결실되도록 하는 돌연변이 효소를 암호화하는 유전자를 작제하고, 염색체 위의 정상 유전자를 상동 재조합 등에 의해 당해 유전자로 치환하고, 트랜스포존 또는 IS 인자를 당해 유전자에 도입함으로써 효소 활성을 저하시키거나 결손시킬 수 있다.
예를 들면, 효소의 활성이 저하되거나 결손되도록 하는 돌연변이를 유전자 재조합에 의해 도입하기 위해서 하기와 같은 방법이 사용된다. 목적 유전자의 부분 서열을 변형시켜, 정상으로 기능하는 효소를 생성하지 않도록 하는 돌연변이형 유전자를 작제하고, 당해 유전자를 함유하는 DNA로 코리네형 세균을 형질전환시켜, 돌연변이형 유전자와 염색체 위의 유전자 간에 재조합을 일으킴으로써 염색체 위의 목적 유전자를 돌연변이형으로 치환시킬 수 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 부위 특이적 돌연변이 도입은 이미 확립되어 있으며 직쇄 위의 DNA를 사용하는 방법 또는 온도 감수성 복제 기점을 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법 등이 있다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645, 미국 특허 제6303383호 또는 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호]. 또한, 상기와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 부위 특이적 돌연변이 도입은 숙주에서 복제할 수 없는 플라스미드를 사용하여 실시할 수도 있다.
또한, L-라이신, L-아르기닌 배출 유전자인 ybjE의 발현량이 증강되도록 변형된 미생물도 본 발명에서 사용할 수 있다(국제공개 WO2005/073390호 팜플렛).
세라티아속에 속하는 L-라이신 생산균으로는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제되는 돌연변이를 갖는 디하이드로디피콜린산 합성효소를 암호화하는 DNA가 세포내에 도입되어 형질전환된 세라티아속 세균 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 유지하는 세라티아속 세균을 들 수 있다(국제공개 제WO 96/41871호).
L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네형 세균으로는 코리네형 세균 야생주; 설파 제, 2-티아졸알라닌 또는 α-아미노-β-하이드록시발레르산 등의 약제에 내성을 갖는 코리네형 세균; 2-티아졸알라닌 내성에 추가하여, L-히스티딘, L-프롤린, L-트레오닌, L-이소로이신, L-메티오닌 또는 L-트립토판 요구성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)54-44096호); 케토말론산, 플루오로말론산 또는 모노플루오로아세트산에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)57-18989호); 아르기니놀에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)62-24075호); X-구아니딘(X는 지방산 또는 지방쇄의 유도체)에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(평)2-186995호) 등을 들 수 있다. 또한, L-아르기닌 리프레서(repressor)가 결손된 코리네형 세균(미국 특허 출원공개 2002-0045233호 명세서) 및 글루탐산 데하이드로게나제 활성이 상승된 코리네형 세균(유럽 특허 출원공개 1057893호 명세서)도 L-아르기닌 생산에 적합한 균주이다.
구체적으로, 브레비박테리움 플라붐 AJ11169(FERM BP-6892), 코리네박테리움 글루타미컴 AJ12092(FERM BP-6906), 브레비박테리움 플라붐 AJ11336(FERM BP-6893), 브레비박테리움 플라붐 AJ11345(FERM BP-6894), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12430(FERM BP-2228)을 들 수 있다. AJ11169주 및 AJ12092주는 일본 공개특허공보 제(소)54-44096호에 기재된 2-티아졸알라닌 내성주, AJ11336주는 일본 특허공보 제(소)62-24075호에 기재된 아르기닌 내성 및 설파다이아진 내성을 갖는 주, AJ11345주는 일본 특허공보 제(소)62-24075호에 기재된 아르기닌올 내성, 2-티아졸알라닌 내성, 설파 구아니딘 내성 및 히스티딘 요구성을 갖는 주 및 AJ 12430주는 일본 공개특허공보 제(평)2-186995호에 기재된 옥틸구아니딘 내성 및 2-티아졸알라 닌 내성을 갖는 주이다.
코리네박테리움 글루타미컴 AJ12092(FERM BP-6906)는 코리네박테리움 글루타미컴 AJ12092주라고 명명되어, 평성 6년 12월 6일자로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6)에 수탁번호 FERM P-12092로서 기탁되어 있으며, 1999년 10월 1일자로 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고, 수탁번호 FERM BP-6906이 부여되어 있다.
L-아르기닌 생산능을 갖는 에세리키아속 세균으로는 argA 유전자가 도입된 에세리키아 콜라이[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-5693호], 아세트산 자화성 변이주의 L-아르기닌 생산성 유도체인 에세리키아 콜라이 237주(러시아 특허출원 제2000117677호)를 들 수 있다. 237주는 2000년 4월 10일자로 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오가니즘스(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika, 주소: Russia, 117545, Moscow, 1 Dorozhnyproezd, 1)에 VKPM B-7925의 번호로 기탁되어 있으며, 2001년 5월 18일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되었다. 237주의 유도체인 L-아르기닌에 의한 피드백 억제에 내성인 돌연변이를 갖는 주인 382주(일본 공개특허공보 2002-017342호)를 사용할 수 있다. 에세리키아 콜라이 382주는 2000년 4월 10일자로 러시안 내셔널 컬렉션오브 인더스트리얼 마이크로오가니즘스에 VKPM B-7926의 번호로 기탁되어 있으며, 2001년 5월 18일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되었다.
L-아르기닌 생산능을 갖는 세라티아속 세균으로는 L-아르기닌 분해능이 결손되고 아르기닌 길항제 및 카나바닌에 내성을 가지며 라이신을 요구하는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)52-8729호]를 들 수 있다.
L-히스티딘 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는 브레비박테리움속에 속하며, 티아민 길항제에 내성을 갖는 미생물, 구체적으로는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 FERM P-2170, FERM P-2316, FERM P-6478, FERM P-6479, FERM P-6480 및 FERM P-6481을 들 수 있다(일본 공개특허공보 제(소)59-63194호). 또한, 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하여, 폴리케타이드류에 내성을 가지며 L-히스티딘 생산능을 갖는 변이주, 구체적으로는 FERM P-4161, FERM P-7273, FERM P-8371, FERM P-8372, ATCC 14067을 들 수 있다.
L-히스티딘 생산능을 갖는 에세리키아속 세균으로는 에세리키아속에 속하여 히스티딘 유사체에 내성을 갖는 변이주, 예를 들면, 에세리키아 콜라이 R-344주 및 당해 R-344주로부터 추출한 L-히스티딘 합성계 효소 유전자가 도입된 에세리키아속 세균을 들 수 있다. 구체적으로, 에세리키아 콜라이 NRRL-12116, NRRL-12118, NRRL-12119, NRRL-12120 및 NRRL-12121을 들 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-5099호].
또한, L-히스티딘 생산능을 갖는 바실루스속 세균으로는 바실루스속에 속하고 히스티딘 유사체에 내성을 갖는 변이주 및 당해 변이주에서 수득한 히스티딘 길항제 내성에 관여하는 유전자가 도입된 바실루스속 세균을 들 수 있다. 구체적으 로는 FERM BP-218, FERM BP-224, FERM BP-219(일본 공개특허공보 제(소)58-107192호)를 들 수 있다.
본 발명에 따라 수득되는 염기성 물질을 함유하는 발효액 또는 이의 처리물은 해리된 염기성 물질에 대한 카운터 음이온으로서 탄산 이온 또는 중탄산 이온을 함유한다. 이러한 탄산 이온 또는 중탄산 이온은 배양액을 가열하거나 배양액을 농축시키거나, 염산 등의 강산을 첨가하여 pH를 저하시킴으로써 탄산가스로서 방출된다. 따라서, 발효액 또는 발효 생산물 중의 고형 성분 중의 염기성 물질의 함량이 높아진다.
본 발명에 따라서, 염화물 이온 또는 황산 이온을 중탄산 이온 또는 탄산 이온 등으로 치환함으로써 염화물 이온의 사용량을 설비의 부식을 일으키지 않는 수준까지 감소시키거나 황산 이온을 감소시킬 수 있다. 또한, 발효후, 배양액에 염산을 가할 뿐으로 중탄산 이온이나 탄산 이온을 염화물 이온으로 치환할 수 있으며 다시 농축할 뿐으로, 이온교환을 실시하지 않아도 라이신 염산염을 수득할 수 있으며 또한 직접 라이신 염산염의 결정을 분취(分取)할 수 있다.
본 발명에서 「발효 생산물」이란 상기 발효액으로부터 수득되는 농축액, 건조물 및 발효액 또는 이의 건조물을 가공한 제품을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 따라 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 코리네형 L-라이신 생산균의 구축
야생형 코리네형 세균에 탈감작형 아스파르토키나제를 암호화하는 유전자 및 라이신 배출 인자를 암호화하는 유전자를 도입하여, L-라이신 생산균을 생성시킨다.
(1) 탈감작형 아스파르토키나제를 암호화하는 유전자의 취득
L-라이신 및 L-트레오닌에 의한 피드백 억제가 해제된 탈감작형 아스파르토키나제(Ask*)를 암호화하는 유전자(lysC*)는 코리네박테리움 글루타미컴(브레비박테리움 락토퍼멘텀) ATCC 13869주로부터 돌연변이유발에 의해 유도된 L-라이신 생산성 변이주 AJ3463(FERM P-1987)[참조: 일본 특허공보 제(소)51-34477호]로부터 PCR법에 따라 단리한다.
AJ3463주를 CM-Dex 배지에서 배양하여, 수득된 균체에서 염색체 DNA를 통상적인 방법[참조: Biochem. Biophys. Acta., 72, 619-629(1963)]에 의해 추출한다. 이러한 염색체 DNA를 주형으로 하여, 제한효소 BamHI 부위를 목적 DNA 단편의 5'말단에 갖도록 도입하기 위한 올리고 뉴클레오타이드 ASK-F(서열번호 1), 제한효소 KpnI 부위를 목적 DNA 단편의 3'말단에 갖도록 도입하기 위한 올리고뉴클레오타이드 ASK-R(서열번호 2)를 PCR의 프라이머로서 사용하여 목적 유전자인 lysC*를 함유하는 유전자 DNA 단편을 증폭시킨다. 증폭의 조건은 변성 공정 98℃:10초, 어닐링 공정 55℃:30초, 신장 공정 72℃:2분으로 이루어진 사이클을 25회 실시한다. 사용되는 효소는 Pyrobest DNA 폴리머라제(제조원: 다카라슈조)로서 제조업자의 지시서에 따라서 사용한다.
증폭된 DNA 단편을 페놀/클로로포름 처리와 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 제한효소 BamHI와 KpnI로 분해시킨다. 수득된 반응액을 아가로스 겔 전기영동으로 전개하고, lysC* 유전자를 함유하는 밴드를 절단해내고, 통상의 방법에 따라 유전자 단편을 정제한다.
한편, 에세리키아 콜라이와 코리네박테리움 글루타미컴의 셔틀 벡터인 pVK7(미국 특허 제6,004,773호 참조)를 동일한 방식으로 제한효소 BamHI와 KpnI로 처리한 다음, 상기한 lysC* 단편과 연결시킨다. 이러한 연결 반응액을 사용하여, 이. 콜라이 JM109주의 적격성 세포(제조원: 다카라슈조)를 제조원의 프로토콜에 따라 형질전환시키고, 카나마이신 내성인 수개의 콜로니를 선별한다.
상기한 pVK7은 하기와 같이 에세리키아 콜라이용 벡터인 pHSG299(Kmr; 참조 Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74,(1987)]에 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 잠적 플라스미드(cryptic plasmid)인 pAM330을 연결시켜 작제한다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)11-266881호, WO 99/07853호 국제공개 팜플렛]. pAM330은 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC13869주로부터 제조한다. pHSG299를 AvaII(제조원: 다카라슈조(주))로 분해시키고, 이를 T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화한 후, HindIII(제조원: 다카라슈조(주))로 분해시켜, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화한 pAM330과 연결시킨다. 이와 같이 해서 pVK7을 취득한다. pVK7은 이. 콜라이 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 세포속에서 자율 복제할 수 있으며, 또한 pHSG299 유래의 다중 클로닝 부위, lacZ' 및 마커로서 카나마이신 내성 유전자를 함유한다.
상기한 바와 같이 수득된 카나마이신 내성의 콜로니에서, 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출하고, 목적하는 lysC* 유전자를 함유하는 플라스미드를 pVK-C*라고 명명한다.
(2) 라이신 배출인자 lysE를 암호화한 유전자의 취득
브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 코리네박테리움속 세균에서 기능하는 것으로 공지되어 있는 L-라이신 배출을 촉진하는 유전자[참조: 국제공개 팜플렛 제9723597 A2호]인 lysE 유전자를 PCR법에 따라 단리한다[참조: 미국 특허 출원공개 제2003113899호]. 상기 균주의 염색체 DNA는 상기와 같이 동일한 방식으로 제조한다.
DNA 프라이머로서 LysE-F(서열번호 3) 및 LysE-R(서열번호 4)를 사용한다. 또한, PCR 반응은 Pyrobest(제조원: 다카라슈조(주))를 사용하여, 94℃, 90초의 열처리 후, 변성 94℃, 20초, 어닐링 55℃, 30초, 신장 반응 72℃, 60초의 사이클을 30회 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 항온처리하여 실시한다. 이러한 반응에 따라 목적하는 크기의 DNA 단편을 취득한다. 이러한 DNA 단편을 정제한 후, 클로닝 벡터 pCR2.1(제조원: Invitrogene)에 제조원의 프로토콜에 따라 클로닝한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여, 이. 콜라이 JM109주의 적격성 세포(제조원: 다카라슈조)를 제조원의 프로토콜에 따라 형질전환시키고, 암피실린 내성인 수개의 콜로니를 선별한다.
이들 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하여, 목적하는 구조를 갖는 플라스미드를 pCRlysE라고 명명한다.
다음에, pCRlysE를 제한효소 BamHI와 XbaI에 의해 분해시켜, 아가로스 겔 전기영동을 실시하고, lysE 유전자를 함유하는 단편을 취득한다. 한편, 에세리키아 콜라이와 코리네박테리움 글루타미컴의 셔틀 벡터인 pKC[참조: 미국 특허 출원공개 제2003113899호]를 동일하게 제한효소 BamHI와 XbaI로 처리한 다음, 아가로스 겔 전기영동을 실시하여, 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 유전자 단편을 취득하고, 정제한 후, 상기한 lysE 단편과 연결시킨다. 이러한 연결 반응액을 사용하여, 이. 콜라이 JM109주의 적격성 세포(제조원: 다카라슈조)를 제조원의 프로토콜에 따라 형질전환시키고, 클로람페니콜 내성인 수개의 콜로니를 선별한다. 이와 같이 수득된 콜로니로부터 플라스미드를 제조하여 LysE 발현 플라스미드 plysE를 취득한다.
또한, pKC4는 다음과 같이 제조한다. 코리네형 세균에서 자율 복제할 수 있는 이미 취득된 플라스미드 pHM1519[참조: Agric. Bio1. Chem., 48, 2901-2903(1984)] 유래의 복제 기점을 갖는 플라스미드 pHK4[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-7491호]를 제한효소 BamHI 및 KpnI로 분해시켜, 복제 기점을 함유하는 유전자 단편을 취득하고, 수득된 단편을 DNA 평활 말단화 키트(다카라슈조)를 사용하여 평활 말단화한 후, KpnI 링커(다카라슈조)를 사용하여, pHSG399(다카라슈조)의 KpnI 부위에 연결에 의해 삽입시킨다. 이러한 연결 반응액을 사용하여, 이. 콜라이 JM109주의 적격성 세포(제조원: 다카라슈조)를 제조원의 프로토콜에 따라 형질전환하여, 클로람페니콜 내성인 수개의 콜로니를 선별한다. 이와 같이 수득된 콜로니로부터 플라스미드를 제조하여 pKC4를 취득한다.
(3) L-라이신 생산성 코리네형 세균의 작제
상기한 2개의 플라스미드, pVK-C* 및 plysE를 전기천공법에 따라 브레비박테 리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869주내로 도입시킨다. 전기천공은 Gene Pulser(제조원; BIO-RAD)을 사용하고, 큐베트의 전극 간격이 0.1cm이고, 펄스 조건이 25μF, 200Ω, 1.8kV인 조건으로 실시한다. 또한, 수득된 플라스미드 도입주는 클로람페니콜 5㎍/l와 카나마이신 25㎍/l를 함유하는 CM-Dex 한천 플레이트(배지 조성은 하기 참조)에서 선별한다. 수득된 플라스미드 도입주를 클로람페니콜 5㎍/l와 카나마이신 25㎍/l를 함유하는 CM-Dex 액체 배지에서 31.5℃에서 밤새 진탕 배양한다. 또한, 진탕 배양은 시험관을 사용하여 3ml의 배양액 중에서 실시한다.
CM-Dex 배지는 하기와 같이 제조한다. 표 1의 성분을 모두 혼합하고 KOH로 pH 7.5로 조정한 다음, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균한다. 또한, 한천 배지의 경우에는 한천을 최종 농도가 20g/L가 되도록 첨가한다.
| CM-Dex 배지의 조성(1L당) | |
| 글루코스 | 5 g |
| 폴리펩톤 | 10 g |
| 효모 추출물 | 10 g |
| KH2PO4 | 1 g |
| MgSO4·7H2O | 0.4 g |
| FeSO4·7H2O | 0.01 g |
| MnSO4·4H2O 또는 5H2O | 0.01 g |
| 요소 | 3 g |
| Mameno (대두 단백질 가수분해물, 질소 중량 환산) | 1.2 g |
| 바이오틴 | 10㎍ |
| 부가하여 1L가 되도록 하는 멸균수 | |
상기한 바와 같이 하여, L-라이신 생산성 코리네형 세균 ATCC 13869/pVK-C*, plysE를 수득한다.
실시예 2: 알칼리성의 배지에서 L-라이신 생산균의 생육 및 L-라이신 생산에 대한 총 암모니아 농도의 영향
실시예 1에서 작제한 L-라이신 생산균을 사용하여, 알칼리성 배지에서 L-라이신의 생산성이 억제되지 않는 총 암모니아 농도를 조사한다.
우선, 종래의 일반적인 배양방법, 즉 A 배지(조성은 표 2에 기재한다)에 글루코스를 기준으로 하여 55%(w/w)의 황산암모늄을 첨가한 배지(B 배지)를 사용하여, 배양 동안 암모니아 가스에 의해 배양액의 pH를 일정하게 유지시켜 L-라이신 발효를 실시한다. 상기 pH는 7.0 또는 8.0으로 제어한다.
| 배지의 조성(lL당) | |
| 글루코스 | 100 g |
| 효모 추출물 | 10 g |
| KH2PO4 | 1 g |
| MgSO4·7H2O | 1 g |
| 비타민 B1 염산염 | 2 mg |
| 바이오틴 | 0.5 mg |
| 니코틴아미드 | 5 mg |
| FeSO4·7H2O | 10 mg |
| MnSO4·4H2O 또는 5H2O | 10 mg |
| 10% GD-113 (소포제) | 0.05 mL |
구체적으로 하기와 같이 배양을 실시한다. 상기 균주를 3ml의 CM-Dex 액체 배지에 접종하고, 31.5℃에서 밤새 진탕 배양한 후, 이의 배양액 200㎕를 CM-Dex 한천 배지에 균일하게 도포하고, 31.5℃에서 밤새 정치 배양한다. 다음에, 당해 한천 배지에서 생육된 L-라이신 생산균을 1개 플레이트의 1/3에 상당하는 분량을, 300ml의 B 배지가 투입된 자 발효기(jar fermenter)에 접종시키고 배양을 실시한다. 배양 동안, 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 300ml으로 통기하고, 교반속도는 700rpm로 유지하고, 배양액의 온도는 31.5℃로 유지한다. 결과를 도 1에 기재한다.
그 결과, pH 7.0에서는, 17.4g/L의 L-라이신이 축적되고, 생산속도는 0.725g/L/시간이다. 한편, pH 8.0에서는, 거의 증식이 확인되지 않으며 발효는 성립되지 않는다(도 1).
다음에, 상기 L-라이신 생산균을 사용하여, 황산암모늄을 함유하지 않는 배지에서 발효를 실시한다.
상기 L-라이신 생산균을 3ml의 CM-Dex 액체 배지에 접종시키고 31.5℃에서 밤새 진탕 배양한다. 이의 배양액 200㎕를 CM-Dex 한천 배지에 균일하게 도포하고, 31.5℃에서 밤새 방치하여, A 배지(황산암모늄 무첨가) 300ml를 자 발효기에 투입하고, 암모니아 가스를 버블링하여 pH 7.8, pH 8.2, pH 8.9의 각 pH 조건으로 조정한다. 이러한 배지에 상기한 한천 배지에서 생육된 라이신 생산균을 1개 배지의 1/3에 상당하는 분량으로 접종시켜 배양을 실시한다. 배양 동안, 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 300ml으로 통기하고, 교반속도는 700rpm로 유지하고, 배양액의 온도는 31.5℃에서 일정하게 유지한다. 배양 도중에 암모니아 가스를 배양액에 버블링함으로써 pH를 일정하게 조정한다. 그 결과, pH 8.9의 조건에서는 배양액 중의 총 암모니아 농도가 100mM을 초과한 다음, 특히 생육이나 L-라이신 생산이 강하게 억제되는 것이 확인된다.
상기한 배양방법에서는, 배양시간이 경과함에 따라 L-라이신 생산균에 의해 발생되는 탄산가스가 탄산 이온 또는 중탄산 이온으로서 배양액 중에 용해해 들어가고 pH를 낮추므로 pH를 설정치로 조정하기 위해 첨가되는 암모니아의 양이 많아진다. 또한, 제어되는 pH가 높을수록 탄산 이온이나 중탄산 이온의 용해해 들어가는 농도가 높아지므로 pH를 설정치로 조정하기 위해 첨가되는 암모니아의 농도 역시 높아진다.
해리되지 않는 암모니아는 세포에 용이하게 침투되며, 균체를 손상시킨다. pH가 높을수록 암모니아의 해리도가 낮아지기 때문에, 총 암모니아 농도가 동일하더라도, pH가 높을수록 세균의 생육 억제는 보다 커지게 된다. 따라서, pH 8.9 이하에서, 총 암모니아 농도를 저농도, 예를 들면, 100mM 이하로 제어하면, 세균의 생육 또는 L-라이신 축적의 악화는 적은 것으로 판단된다.
다음에, 배지 중의 총 암모니아 농도를 100mM 이하로 제어하여, pH 7.8, pH 8.2, pH 8.9의 각 pH 조건에서 L-라이신 생산 배양을 실시한다.
상기 균주를 3ml의 CM-Dex 액체 배지에 접종하고, 31.5℃에서 밤새 진탕 배양한다. 이의 배양액 200㎕를 CM-Dex 한천 배지에 균일하게 도포하고, 31.5℃에서 밤새 정치 배양한다. A 배지(황산암모늄 무첨가) 300ml를 자 발효기에 투입하고, 당해 배지에 암모니아 가스를 버블링하여 pH 7.5, pH 7.8, pH 8.2 또는 pH 8.9의 각 pH 조건으로 조정한다. 이러한 배지에 상기한 한천 배지에서 생육된 L-라이신 생산균을 1장의 플레이트의 1/3에 상당하는 분량으로 접종시켜 배양을 실시한다. 배양 동안에 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 300ml으로 통기하고, 교반속도는 700rpm으로 유지하고, 배양액의 온도는 31.5℃로 유지한다. 배양 동안의 pH는 암모니아 대신에 6N 농도의 수산화칼륨을 사용하여 각 설정치로 유지한다.
배양액 중의 총 암모니아 농도는 배양액을 경시적으로 샘플링하여, 암모니아 전극과 이온 측정기(제조원: Orion)를 사용하여 측정하며, 필요에 따라 10% 암모니아 수용액을 첨가하여, 0 내지 100mM 사이가 되도록 제어한다. 또한, 배양액 중의 용존 산소 농도를 관찰함으로써 암모니아가 고갈할 때에 용존 산소 농도가 급격하게 상승하는 것을 검출하고, 이때에는 10% 암모니아 수용액을 첨가하여 배양액 중의 암모니아가 계속하여 고갈되지 않도록 한다. 결과를 도 2에 도시한다.
그 결과, pH 7.8 내지 pH 8.9의 pH 조건에서도, 양호한 생육 및 L-라이신 생산이 관찰되었다. 또한, 종래의 일반적인 배양방법에서 pH 7.0으로 발효를 실시한 경우와 비교하여, 생산속도에서 115% 이상의 성적이 수득되었다.
실시예 3: L-라이신의 생산
본 실시예에서는, 총 암모니아 농도만을 제어하고, pH의 제어는 실시하지 않고 L-라이신 발효를 실시한다. 총 암모니아 농도를 제어하는 범위는 실시예 2의 결과보다 100mM 이하의 범위를 선택한다.
상기 L-라이신 생산균을 3ml의 CM-Dex 액체 배지에 접종하고, 31.5℃에서 밤새 진탕 배양한다. 이의 배양액 200㎕를 CM-Dex 한천 배지에 균일하게 도포하고, 31.5℃에서 밤새 정치 배양한다. A 배지(황산암모늄 무첨가) 300ml를 자 발효기에 투입하고, 당해 배지에 암모니아 가스를 버블링하여, 총 암모니아 농도를 23.8mM로 조정한다. 이러한 배지에 상기한 한천 배지에서 생육된 L-라이신 생산균을 1장의 플레이트의 1/3에 상당하는 분량으로 접종시키고 배양을 실시한다. 배양 동안에 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 300ml으로 통기하고, 교반속도는 700rpm으로 유지하고, 배양액의 온도는 31.5℃로 유지한다. 배양액을 경시적으로 샘플링하여 총 암모니아 농도를 측정하고, 필요에 따라 10% 암모니아수 적량을 배지에 첨가하여 총 암모니아 농도가 0 내지 100mM 사이가 되도록 한다. 그 결과, 15.9g/L의 라이신이 축적되었으며, L-라이신 발효가 성립되었다(도 3).
실시예 4: 에세리키아 콜라이 L-라이신 생산균의 작제
<1> 라이신 데카복실라제를 암호화하는 cadA 및 ldcC 유전자 파괴주의 작제
우선, 라이신 데카복실라제 결손주의 작제를 실시한다. 라이신 데카복실라제는 cadA 유전자(Genbank 승인번호 NP-418555, 서열번호 15), ldcC 유전자(Genbank 승인번호 NP-414728, 서열번호 17)에 의해 암호화된다[참조: 국제공개 WO 96/17930호 팜플렛]. 당해 실시예에서, 친주로서 WC196주를 사용한다.
라이신 데카복실라제를 암호화하는 cadA 및 ldcC 유전자의 결실은 Datsenko와 Wanner에 의해 최초로 개발된 「Red-driven integration」이라고 호칭되는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645]과 λ 파아지 유래의 절단 시스템[참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nuc1eoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.]에 의해 실시한다. 「Red-driven integration」방법에 따르면, 목적하는 유전자의 일부를 합성 올리고 뉴클레오타이드의 5'측에 설계하고 항생물질 내성 유전자의 일부를 3'측에 설계한 합성 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 수득된 PCR 산물을 사용하여, 한 단계로 유전자 파괴주를 작제할 수 있다. 또한, λ 파아지 유래의 절단 시스템을 조합함으로써 유전자 파괴주에 도입된 항생물질 내성 유전자를 제거할 수 있다(일본 공개특허공보 2005-058227).
(1) cadA 유전자의 파괴
PCR에서 주형으로서 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR(일본 공개특허공보 2005-058827)을 사용한다. pMW118-attL-Cm-attR은 pMW118(제조원: 다카라바이오사)에 λ 파아지의 부착 부위인 attL 및 attR 유전자와 항생물질 내성 유전자인 cat 유전자를 삽입시킨 플라스미드이며, attL-cat-attR의 순으로 삽입되어 있다.
이러한 attL과 attR의 양쪽 말단에 대응하는 서열을 프라이머의 3'말단에 갖고 목적 유전자인 cadA 유전자의 일부에 대응하는 서열을 프라이머의 5'말단에 갖는 서열번호 11 및 12에 제시한 합성 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 PCR을 실시한다.
증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔로 정제하고, 온도 감수성의 복제능을 갖는 플라스미드 pKD46을 함유하는 에세리키아 콜라이 WC196주내로 전기천공에 의해 도입시킨다. 플라스미드 pKD46[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No.12, p6640-6645]는 아라비노스 유도성 ParaB 프로모터로 제어되는 λ Red 상동 재조합 시스템의 Red 레콤비나제를 암호화하는 유전자(γ, β, exo 유전자)를 함유하는 λ 파아지의 합계 2154개 염기의 DNA 단편(GenBank/EMBL 승인번호 J02459, 제31088번 내지 33241번)를 포함한다. 플라스미드 pKD46은 PCR 산물을 WC196주의 염색체에 도입하기 위해 필요하다.
전기천공용의 적격성 세포는 다음과 같이 제조한다. 즉, 100mg/L의 암피실린을 함유하는 LB 배지속에서 30℃에서 밤새 배양한 에세리키아 콜라이 WC196주를 암피실린(20mg/L)와 L-아라비노스(1mM)를 함유하는 5mL의 SOB 배지[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에서 100배 희석한다. 수득된 희석물을 30℃에서 통기하면서 OD600이 약 0.6이 될 때까지 생육시킨 다음, 100배로 농축하고, 10% 글리세롤로 3회 세정하여 전기천공에 사용할 수 있도록 한다. 전기천공은 70㎕의 적격성 세포와 약 100ng의 PCR 산물을 사용하여 실시한다. 전기천공 후의 세포를 1mL의 SOC 배지[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 가하고 37℃에서 2.5시간 동안 배양한 후, 37℃에서 Cm(클로람페니콜)(25mg/L)를 함유하는 L-한천 배지 위에서 평판 배양하고, Cm 내성 재조합체를 선별한다. 다음에, pKD46 플라스미드를 제거하기 위해 Cm을 함유하는 L-한천 배지 위에서 42℃에서 2회 계대(繼代)하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성을 시험하고, pKD46이 제거되어진 암피실린 감수성 균주를 취득한다.
클로람페니콜 내성 유전자에 의해서 식별할 수 있는 변이체의 cadA 유전자의 결실을 PCR에 의해 확인한다. 수득된 cadA 결손주를 WC196△cadA::att-cat주라고 명명한다.
다음에, cadA 유전자 내에 도입된 att-cat 유전자를 제거하기 위해, 헬퍼 플라스미드(helper plasmid) pMW-intxis-ts[참조: 일본 공개특허공보 제2005-058827호]를 사용한다. pMW-intxis-ts는 λ 파아지의 인테그라제(Int)를 암호화하는 유전자 및 엑시죠나제(excisionase)(Xis)를 암호화하는 유전자를 보유하며, 온도 감수성의 복제능을 갖는 플라스미드이다.
상기에서 수득된 WC196△cadA::att-cat주의 적격성 세포를 통상적인 방법에 따라 작제하고, 헬퍼 플라스미드 pMW-intxis-ts로 형질전환시키고, 30℃에서 50mg/L의 암피실린을 함유하는 L-한천 배지 위에서 평판 배양하고, 암피실린 내성주를 선별한다.
다음에, pMW-intxis-ts 플라스미드를 제거하기 위해, 선별된 균주를 L-한천 배지 위에서 42℃에서 2회 계대하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성 및 클로람페니콜 내성을 시험하고, att-cat 및 pMW-intxis-ts를 함유하지 않는 cadA 파괴주인 클로람페니콜- 및 암피실린-감수성 균주를 취득한다. 이러한 균주를 WC196△cadA라고 명명한다.
(2) WC196△cadA주의 ldcC 유전자의 결실
WC196△cadA주에서의 ldcC 유전자의 결실은 상기 방법에 따라 ldcC 파괴용 프라이머로서 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 실시한다. 이에 따라 cadA ldcC 파괴주인 WC196△cadA△ldcC를 수득된다.
<2> WC196△cadA△ldcC주 내로의 Lys 생산용 플라스미드 도입
WC196△cadA△ldcC주를 dapA, dapB 및 LysC 유전자를 보유한 Lys 생산용 플라스미드 pCABD2[참조: 국제공개 제WO 01/53459호 팜플렛]으로 통상적인 방법에 따라 형질전환시켜, WC196△cadA△ldcC/pCABD2주(WC196LC/pCABD2)를 수득한다.
실시예 5: 에세리키아 콜라이를 사용하는 L-라이신 생산
본 실시예에서는 에세리키아 콜라이에 의한 L-라이신의 생산에 응용한 예를 기재한다. 본 실시예에서는 일반적으로, L-라이신을 발효 생산하는 경우에 질소와 L-라이신에 대한 카운터 이온의 공급을 위해 배지에 첨가되는 황산암모늄(유안)이나 염화암모늄(염안)을 첨가하지 않고 L-라이신을 발효 생산한다. 구체적으로는, pH의 제어는 실시하지 않으며 배지 중의 암모니아 농도를 제어하여 배양을 실시한다. 사전에 배지 중의 암모니아 농도의 제어 범위를 검토한 결과, 총 암모니아 농도로서 50mM 내지 100mM의 범위가 바람직한 것으로 확인된다. 따라서, 실제의 본 배양에서는 총 암모니아 농도가 100mM을 초과하지 않도록 암모니아 가스를 버블링함으로써 제어한다. 또한, 총 암모니아 농도가 50mM까지 저하된 후에는 이의 농도를 유지하도록 암모니아 가스에 의해 제어한다.
L-라이신 생산주로서 WC196△cadA△ldcC/pCABD2를 사용하며, 배양에는 표 3에 기재된 이. 콜라이용 L-라이신 생산 배지 300ml가 투입된 자 발효기에 암모니아 가스를 버블링하여 총 암모니아 농도를 95mM로 조정한 것을 사용한다. 이러한 배지에, 20㎍/L의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 한천 배지의 전체면에 L-라이신 생산주를 도포하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 수득된 세포를 접종시킨다. 접종되는 세포의 양은 한천 배지 3장 분량에서 생육한 세포의 양이다. 배양은, 온도를 37℃로 유지하고 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 50mL로 통기하고 교반속도를 700rpm으로 하여 실시한다. 또한, 통기량은 배양액 중의 용존 산소 농도가 20% 포화율까지 저하된 시점에서, 1분당 100mL로 변경한다. 배지 중의 글루코스가 고갈되지 않도록 하고 또한 30g/L 이상이 되지 않도록, 표 4에 기재된 이. 콜라이용 공급액(feed solution)을 적절하게 배지에 적가한다. 최종적으로, 36g의 글루코스를 소비한 시점에서 배양을 정지한다. 그 결과, 배양은 순조롭게 실시되며 33시간 후에 첨가된 글루코스는 모두 소비되고, L-라이신이 13.4g 축적되고, L-라이신의 생산속도는 1.2g/L/시간이었다. 이때의 수율은 37%였다.
대조군으로서, 일반적인 염기성 아미노산의 제조방법과 동일하게 황산암모늄을 첨가하여, 총 암모니아 농도는 제어하지 않으며 pH의 제어를 실시하여 동일한 생산주를 사용하여 L-라이신의 생산을 한 경우의 결과를 나타낸다. 표 3에 기재된 이. 콜라이용 L-라이신 생산 배지에 황산암모늄을 1리터당 13g 첨가한 배지를 사용하여 동일한 세균을 동일하게 접종하여 암모니아 가스를 적절하게 버블링하는 것으로 pH 6.7로 일정하게 제어하여 배양한다. 배양온도, 통기량의 설정 및 교반속도는 상기와 동일하게 실시한다. 이 경우에는 표 4에 기재된 이. 콜라이용 공급액 대신에, 황산암모늄을 1리터당 112.5g 첨가한 이. 콜라이용 공급액(황산암모늄을 포함함, 표 5)을 첨가하여, 배지 중의 글루코스가 고갈되지 않도록 하고 또한 30g/L 이상이 되지 않도록 조절하면서 최종적으로 36g의 글루코스를 소비시킨다. 그 결과, 33시간 후에, 첨가된 모든 글루코스가 소비되었고, L-라이신이 14.7g 축적되었고, L-라이신의 생산속도는 1.3g/L/시간이었다. 이때의 수율은 40%였다.
또한, 상기에 나타낸 라이신의 농도는 모두 라이신 염산염으로 환산한 농도이다. 또한, 상기한 배양에서 총 암모니아 농도 및 pH의 경시적 변화를 도 4에 도시한다. 이들 결과의 비교로부터, 본 발명의 방법을 사용하면, L-라이신의 발효 생산에서 황산암모늄 또는 염화암모늄을 첨가하지 않더라도, 황산암모늄을 첨가한 일반적인 발효생산과 비교하여 약 92%의 생산속도 및 약 93%의 수율로 약 91%의 L-라이신의 생산량이 수득될 수 있는 것으로 확인되었다.
| 이. 콜라이용 L-라이신 생산 배지의 조성(1L당) | |
| 글루코스 | 30 g |
| KH2PO4 | 1 g |
| MgSO4·7H2O | 1.2 g |
| Mameno (대두 단백질 가수분해물, 질소 중량 환산) | 0.77 g |
| FeSO4·7H2O | 30 mg |
| MnSO4·4H2O 또는 5H2O | 30 mg |
| p-아미노벤조산 | 2 mg |
| L-트레오닌 | 300 mg |
| DL-메티오닌 | 200 mg |
| 시스테인 | 150 mg |
| 베타인 | 3.5 g |
| GD-113 (소포제) | 0.01 mL |
글루코스 및 MgSO4·7H2O를 부분 A로서 칭량하고, 다른 성분들을 부분 B로서 칭량하고, 부분 A는 그 자체로, 부분 B는 pH 5.0으로 조정하여, 115℃에서 10분 동안 개별적으로 오토클레이브하여 멸균한 다음, 혼합한다. 20㎍/L의 스트렙토마이신을 사용 전에 배지에 첨가한다.
| 이. 콜라이용 공급액의 조성(1L당) | |
| 글루코스 | 561 g |
| GD-113 | 7㎕ |
| KH2PO4 | 1.48 g |
| L-thr | 0.44 g |
성분들을 120℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균한다. 20㎍/L의 스트렙토마이신을 사용 전에 배지에 첨가한다.
| 이. 콜라이용 공급액(황산암모늄 함유)의 조성(1L당) | |
| 글루코스 | 561 g |
| GD-113 | 7㎕ |
| KH2PO4 | 1.48 g |
| L-thr | 0.44 g |
| (NH4)2SO4 | 112.5 g/L |
성분들을 120℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균한다. 20㎍/L의 스트렙토마이신을 사용 전에 배지에 첨가한다.
실시예 6: L-아르기닌의 생산
본 실시예에서는 코리네형 세균에 의한 L-아르기닌의 생산에 응용한 예를 기재한다. L-아르기닌 생산주로서 코리네박테리움 글루타미컴 AJ12092(FERM BP-6906)를 사용한다.
우선 대조군으로서, 일반적인 염기성 아미노산의 제조방법과 동일하게 황산암모늄을 첨가하고, 총 암모니아 농도는 제어하지 않으며 pH의 제어를 실시하여 동일한 생산주를 사용하여 L-아르기닌의 생산을 실시한 경우의 결과를 나타낸다. 표 6의 L-아르기닌 생산 배지 조성에 65g/L의 황산암모늄을 추가한 다음, 글루코스 농도를 40g/L로 변경한 조성의 배지 300ml가 투입된 자 발효기에 암모니아 가스를 버블링하고, pH를 7.0으로 조정한다. 코리네박테리움 글루타미컴 AJ12092주를 CM-Dex 한천 배지의 전체면에 도포하고, 31.5℃에서 24시간 동안 배양한 후, 자 발효기에 한천 배지 2장 분량의 생육한 세포를 접종시킨다. 배양은, 온도를 31.5℃로 유지하고, 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 150mL로 통기하며 교반속도를 700rpm으로 하여 실시한다. 또한 배양 동안의 pH는 별도로 멸균한 6N의 KOH 용액을 첨가여 6.9로 제어한다. 배양의 진행과 동시에 저하되는 배지 중의 글루코스 농도를 30 내지 40g/L로 유지하도록, 별도로 멸균한 692g/L의 글루코스 용액을 적절하게 첨가한다. 배양은 54시간 동안 실시한다. 그 결과, L-아르기닌이 23.4g/L 축적되었으며, L-아르기닌의 생성 수율은 소비한 글루코스의 26.7%였으며, 생산속도는 0.43g/L/시간이었다. 또한, 당해 배양 동안에 소비된 글루코스량은 뱃치(batch)당 29.1g이었다.
다음에, 황산암모늄을 첨가하지 않고 총 암모니아 농도만을 제어하여, pH의 제어를 실시하지 않은 L-아르기닌의 생산의 결과를 나타낸다. 표 6에 기재된 황산암모늄을 함유하지 않은 L-아르기닌 생산 배지 300ml가 투입된 자 발효기에 암모니아 가스를 버블링하여 총 암모니아 농도를 12.6mM로 조정한다. 상기 배지에, 대조군과 동일한 방식으로 배양한 L-아르기닌 생산균을 한천 배지 2장 분량의 생육한 세포를 접종시킨다. 배양은, 대조군과 동일하게 온도를 31.5℃로 유지하고, 필터에 의해 멸균된 공기를 1분당 150mL로 통기하고 교반속도를 700rpm으로 하여 실시한다. 배양액을 경시적으로 샘플링하여 총 암모니아 농도를 측정하거나 암모니아 농도 제어장치를 사용하여, 배양액 중의 총 암모니아를 다양한 농도가 되도록 제어하여 배양한 결과, 배양액 중의 총 암모니아 농도가 약 20 mM가 되도록 필요에 따라 암모니아 가스를 첨가하여 제어하는 것이 양호한 결과를 제공하는 것으로 확인되었다. 상기 결과에 기초하여, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 약 20mM로 제어한 배양은 순조롭게 진행되고, 51시간 후에 24.2g/L의 L-아르기닌이 축적되고 이에 따라 L-아르기닌 발효가 성립되었다(도 4). 또한, 당해 배양 동안에 소비된 글루코스는 뱃치당 35.1g이었으며, L-아르기닌의 생성 수율은 소비된 글루코스의 20.6%이었으며, 생산속도는 0.47g/L/시간이었다. 또한, 배양액의 pH는 배양 개시시의 7.92로부터 배양 종료시의 8.02까지 상승한다.
당해 결과는 대조군 실험과 비교하여, L-아르기닌의 발효 생산에서 황산암모늄 또는 염화암모늄을 첨가하지 않더라도, 황산암모늄을 첨가한 일반적인 발효생산과 비교하여 약 77%의 수율 및 약 9% 높은 생산속도로 생산할 수 있음을 나타낸다.
| L-아르기닌 생산 배지의 조성(1L당) | |
| 글루코스 | 150 g |
| KH2PO4 | 1 g |
| MgSO4·7H2O | 0.4 g |
| Mameno (대두 단백질 가수분해물, 질소 중량 환산) | 0.23 g |
| 비타민 B1 염산염 | 0.5 mg |
| 바이오틴 | 0.5 mg |
| FeSO4·7H2O | 10 mg |
| MnSO4·4H2O 또는 5H2O | 10 mg |
| GD-113 (소포제) | 0.05 mL |
배지를 수산화칼륨 수용액을 사용하여 pH 7.0으로 조정한 후, 1L가 되도록 하고 115℃에서 10분 동안 오토클레이브로 멸균한다.
[서열목록 설명]
서열번호 1: lysC 유전자 클로닝용의 프라이머 서열
서열번호 2: lysC 유전자 클로닝용의 프라이머 서열
서열번호 3: lysE 유전자 클로닝용의 프라이머 서열
서열번호 4: lysE 유전자 클로닝용의 프라이머 서열
서열번호 5: lycC* 유전자의 염기 서열과 억제 해제형 아스파르토키나제의 α-서브유닛의 아미노산 서열
서열번호 6:억제 해제형 아스파르토키나제의 α-서브유닛의 아미노산 서열
서열번호 7: lycC* 유전자의 염기 서열과 억제 해제형 아스파르토키나제의 β-서브유닛의 아미노산 서열
서열번호 8: 억제 해제형 아스파르토키나제의 β-서브유닛의 아미노산 서열
서열번호 9: lysE 유전자의 염기 서열 및 LysE 단백질의 아미노산 서열
서열번호 10: LysE 단백질의 아미노산 서열
서열번호 11: cadA 유전자 파괴용 프라이머
서열번호 12: cadA 유전자 파괴용 프라이머
서열번호 13: ldc 유전자 파괴용 프라이머
서열번호 14: ldc 유전자 파괴용 프라이머
서열번호 15: cadA 유전자의 염기 서열 및 라이신 데카복실라제의 아미노산 서열
서열번호 16: 라이신 데카복실라제(cadA)의 아미노산 서열
서열번호 17: ldc 유전자의 염기 서열 및 라이신 데카복실라제의 아미노산 서열
서열번호 18: 라이신 데카복실라제(ldc)의 아미노산 서열
본 발명에 따르면, 종래의 일반적인 배양법에서 수득된 생산성 등의 본래의 성능을 크게 손상하지 않고 황산암모늄 등의 공업 원료의 사용량을 감소시킬 수 있도록 하는 높은 pH에서도 염기성 물질을 발효 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득되는 발효액은 탄산 이온 및 중탄산 이온을 함유하지만 이들은 가열에 의해 용이하게 대기중으로 방출되므로 고형 성분중의 염기성 물질 함량이 높은 발효액 또는 발효 생산물을 수득할 수 있다. 또한, 정제를 필요로 하는 경우, 종래의 제조방법에서 통상적으로 실시되는 이온교환을 실시하지 않더라도, 발효액에 탄산보다 강한 산을 가하는 경우 탄산은 이 강산으로 용이하게 치환될 수 있다. 또한, 발효액을 농축함으로써 라이신 염산염의 결정을 직접 수득할 수 있다.
도 1은 일반적 배지 및 배양법에서의 L-라이신 생산 배양의 결과를 도시하는 도면이다.
도 2는 암모늄 농도를 제한한 배지에서의 L-라이신 생산 배양의 결과를 도시하는 도면이다.
도 3은 총 암모니아 농도만을 제어하고 pH의 제어는 실시하지 않는 경우의 L-라이신 생산 배양의 결과를 도시하는 도면이다.
도 4는 일반적 배지 및 황산암모늄 및 염화암모늄을 첨가하지 않은 배지에서 총 암모니아 농도와 pH의 경시적 변화를 도시하는 도면이다.
도 5는 암모늄 농도를 제한한 배지에서의 L-아르기닌 발효에서 생육, 총 암모니아 농도, pH, 잔류 당의 경시 변화를 도시하는 도면이다.
도 6은 암모늄 농도를 제한한 배지에서의 L-아르기닌 생산 배양의 결과를 도시하는 도면이다.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Process for producing basic substance
<130> C459-C5173
<150> JP 2004-295123
<151> 2004-10-07
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer ASK-F
<400> 1
cgcggatcct cgcgaagtag cacct gtcac tt 32
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer ASK-R
<400> 2
ctcgggtacc gtgccacgga attcaatctt acggcc 36
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer LysE-F
<400> 3
tggttaacgg gatttcagca agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer LysE-R
<400> 4
gagcagctgg acaacagcct tga 23
<210> 5
<211> 1643
<212> DNA
<213> Brevibacterium lactofermentum
<220>
<221> CDS
<222> (217)..(1482)
<400> 5
tcgcgaagta gcacctgtca cttttgtctc aaatattaaa tcgaatatca atatacggtc 60
tgtttattgg aacgcatccc agtggctgag acgcatccgc taaagcccca ggaaccctgt 120
gcagaaagaa aacactcctc tggctaggta gacacagttt ataaaggtag agttgagcgg 180
gtaactgtca gcacgtagat cgaaaggtgc acaaag gtg gcc ctg gtc gta cag 234
Val Ala Leu Val Val Gln
1 5
aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg gaa cgc att aga aac gtc 282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val
10 15 20
gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct gga aat gat gtc gtg gtt 330
Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val
25 30 35
gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat gaa ctt cta gaa ctt gca 378
Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
40 45 50
gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt gaa atg gat atg ctc ctg 426
Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
55 60 65 70
act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc gtc gcc atg gct att gag 474
Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu
75 80 85
tcc ctt ggc gca gaa gct caa tct ttc act ggc tct cag gct ggt gtg 522
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val
90 95 100
ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc att gtt gac gtc aca ccg 570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc aag atc tgc att gtt gct 618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala
120 125 130
ggt ttt cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc gat gtc acc acg ttg ggt 666
Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg ttg gca gct gct ttg aac 714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt gac ggt gtg tat acc gct 762
Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180
gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag ctg gaa aag ctc agc ttc 810
Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc tcc aag att ttg gtg ctg 858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu
200 205 210
cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat gtg cca ctt cgc gta cgc 906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215 220 225 230
tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg att gcc ggc tct atg gag 954
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc ggt gtc gca acc gac aag 1002
Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
250 255 260
tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att tcc gat aag cca ggc gag 1050
Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu
265 270 275
act gcc aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat gca gaa atc aac att gac 1098
Thr Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp
280 285 290
atg gtt ctg cag aac gtc tcc tct gtg gaa gac ggc acc acc gac atc 1146
Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile
295 300 305 310
acg ttc acc tgc cct cgc gct gac gga cgc cgt gcg atg gag atc ttg 1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu
315 320 325
aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc aat gtg ctt tac gac gac 1242
Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
330 335 340
cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct ggc atg aag tct cac cca 1290
Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg cgc gat gtc aac gtg aac 1338
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365 370
atc gaa ttg att tcc acc tct gag atc cgc att tcc gtg ctg atc cgt 1386
Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg
375 380 385 390
gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca ttg cat gag cag ttc cag 1434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln
395 400 405
ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat gca ggc acc gga cgc taa 1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
410 415 420
agttttaaag gagtagtttt acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg 1542
tcggccaggt tatgcgcacc cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt 1602
tctttgcttc cccgcgttcc gcaggccgta agattgaatt c 1643
<210> 6
<211> 421
<212> PRT
<213> Brevibacterium lactofermentum
<400> 6
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 7
<211> 1643
<212> DNA
<213> Brevibacterium lactofermentum
<220>
<221> CDS
<222> (964)..(1482)
<400> 7
tcgcgaagta gcacctgtca cttttgtctc aaatattaaa tcgaatatca atatacggtc 60
tgtttattgg aacgcatccc agtggctgag acgcatccgc taaagcccca ggaaccctgt 120
gcagaaagaa aacactcctc tggctaggta gacacagttt ataaaggtag agttgagcgg 180
gtaactgtca gcacgtagat cgaaaggtgc acaaaggtgg ccctggtcgt acagaaatat 240
ggcggttcct cgcttgagag tgcggaacgc attagaaacg tcgctgaacg gatcgttgcc 300
accaagaagg ctggaaatga tgtcgtggtt gtctgctccg caatgggaga caccacggat 360
gaacttctag aacttgcagc ggcagtgaat cccgttccgc cagctcgtga aatggatatg 420
ctcctgactg ctggtgagcg tatttctaac gctctcgtcg ccatggctat tgagtccctt 480
ggcgcagaag ctcaatcttt cactggctct caggctggtg tgctcaccac cgagcgccac 540
ggaaacgcac gcattgttga cgtcacaccg ggtcgtgtgc gtgaagcact cgatgagggc 600
aagatctgca ttgttgctgg ttttcagggt gttaataaag aaacccgcga tgtcaccacg 660
ttgggtcgtg gtggttctga caccactgca gttgcgttgg cagctgcttt gaacgctgat 720
gtgtgtgaga tttactcgga cgttgacggt gtgtataccg ctgacccgcg catcgttcct 780
aatgcacaga agctggaaaa gctcagcttc gaagaaatgc tggaacttgc tgctgttggc 840
tccaagattt tggtgctgcg cagtgttgaa tacgctcgtg cattcaatgt gccacttcgc 900
gtacgctcgt cttatagtaa tgatcccggc actttgattg ccggctctat ggaggatatt 960
cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa 1008
Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
1 5 10 15
gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att tcc gat aag cca ggc gag act gcc 1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala
20 25 30
aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat gca gaa atc aac att gac atg gtt 1104
Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val
35 40 45
ctg cag aac gtc tcc tct gtg gaa gac ggc acc acc gac atc acg ttc 1152
Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe
50 55 60
acc tgc cct cgc gct gac gga cgc cgt gcg atg gag atc ttg aag aag 1200
Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys
65 70 75
ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc aat gtg ctt tac gac gac cag gtc 1248
Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val
80 85 90 95
ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct ggc atg aag tct cac cca ggt gtt 1296
Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
100 105 110
acc gca gag ttc atg gaa gct ctg cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa 1344
Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu
115 120 125
ttg att tcc acc tct gag atc cgc att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat 1392
Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp
130 135 140
gat ctg gat gct gct gca cgt gca ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc 1440
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly
145 150 155
ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat gca ggc acc gga cgc taa 1482
Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170
agttttaaag gagtagtttt acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg 1542
tcggccaggt tatgcgcacc cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt 1602
tctttgcttc cccgcgttcc gcaggccgta agattgaatt c 1643
<210> 8
<211> 172
<212> PRT
<213> Brevibacterium lactofermentum
<400> 8
Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Thr Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu
35 40 45
Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu
65 70 75 80
Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly
85 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu
115 120 125
Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly
145 150 155 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170
<210> 9
<211> 2374
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1025)..(1723)
<400> 9
ccatttgctg aaggtgttac tctgcctggc ccaattcctg cgggcgaaga agtgaaaaac 60
cctgaacctt ttcagaagta actaaggccg caatccctcg attgctgcat caacgacggc 120
gtctgtgagt ctagctagag atctagattc caggcgccat cgttgccaat acatcggtgt 180
gtcaatgggt atctcatcga ggaggatcac ttctcctgct tttagcatgg gagcagcttg 240
ggtttcggga agaagtcccc aaccaaggcc tcggcgaatt gcctcaccaa aaccttccgc 300
cgacgggaca atggatacgc gcctgcgccc cacaggacca tcgacgcgcc cgtccaggtc 360
acggtcttga agcacatctt tgggaccgaa gcgtaagacg ggcatcgcag cccaatctag 420
tttcccatca accatgtagg catcccgcaa tgagggggtt gcaatggcca agtggcgcat 480
ggttccaagt tctactactt cacatcccgc cacgggatta gcttcacggg ttaccgctcc 540
taaaacatct ccacgccgca gcaaggataa tgtgtgcgct tcatcttcca agcgcagcgt 600
gagcgttgct ccaccccaag aagctacctc gttgaacacg ggaggaaacc atgtggatag 660
cgaatctgcg ttgatggcga tggttaacgg gatttcagca aggcgtccag atagttgcgc 720
tttagtttct gcttgcagca acaccatttt ccgcgctgct tgcacaagga cttcacccgc 780
ttcggttgct ttggccggtt gggtgcgcga taccaacact cgacccacgt gatgctcgag 840
agctttaacg cgctgactca ccgccgaggg ggaaatggaa agggctaagg aggcgccttc 900
gaagctgcct tcatcaatga ttgagagcaa agtgtccagt tgaatggggt tcatgaagct 960
atattaaacc atgttaagaa ccaatcattt tacttaagta cttccatagg tcacgatggt 1020
gatc atg gaa atc ttc att aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt ctt tta 1069
Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu
1 5 10 15
ctg tcc atc gga ccg cag aat gta ctg gtg att aaa caa gga att aag 1117
Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys
20 25 30
cgc gaa gga ctc att gcg gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct gac gtc 1165
Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val
35 40 45
ttt ttg ttc atc gcc ggc acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc aat gcc 1213
Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala
50 55 60
gcg ccg atc gtg ctc gat att atg cgc tgg ggt ggc atc gct tac ctg 1261
Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu
65 70 75
tta tgg ttt gcc gtc atg gca gcg aaa gac gcc atg aca aac aag gtg 1309
Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val
80 85 90 95
gaa gcg cca cag atc att gaa gaa aca gaa cca acc gtg ccc gat gac 1357
Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp
100 105 110
acg cct ttg ggc ggt tcg gcg gtg gcc act gac acg cgc aac cgg gtg 1405
Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val
115 120 125
cgg gtg gag gtg agc gtc gat aag cag cgg gtt tgg gta aag ccc atg 1453
Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met
130 135 140
ttg atg gca atc gtg ctg acc tgg ttg aac ccg aat gcg tat ttg gac 1501
Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp
145 150 155
gcg ttt gtg ttt atc ggc ggc gtc ggc gcg caa tac ggc gac acc gga 1549
Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly
160 165 170 175
cgg tgg att ttc gcc gct ggc gcg ttc gcg gca agc ctg atc tgg ttc 1597
Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe
180 185 190
ccg ctg gtg ggt ttc ggc gca gca gca ttg tca cgc ccg ctg tcc agc 1645
Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser
195 200 205
ccc aag gtg tgg cgc tgg atc aac gtc gtc gtg gca gtt gtg atg acc 1693
Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr
210 215 220
gca ttg gcc atc aaa ctg atg ttg atg ggt tagttttcgc gggttttgga 1743
Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly
225 230
atcggtggcc ttcgcccaaa tgttgatgcc ggcgtcgtgg gaaatctcat cgatcgcctc 1803
caactcggcg tcagaaaact ccaagttgtt gagtgaatca aggctgttgt ccagctgctc 1863
aactgacgaa gcaccaatca atgcactggt cacggtatcc gcgccgtact ctccttgctc 1923
gcgcagcacc catgcaagcg ccatctgcgc aagtgactgc ccgcgttcct gggcgatgtc 1983
attgagcttg cggaccatat caatattgtt cacgttcaac atgccctcag acagggactt 2043
accctggctg gcgcgggaac cctctggaat tccatcgaga tatttgtccg tgagcaggcc 2103
ctgcgcaagt ggtgagaaag caatgacgcc aagaccattg ttggcagctg actgcaacaa 2163
gttctcaccg tcatcgcccg gttcctccac ccaacgatta atgatggaat agcttggctg 2223
atgaatcaga agcgggcagc cctcctccgc catgaactca gccgcctccg ctgtgagctc 2283
tggaccgtag gaagaaatac ccacgtaaag agcctttcca gacgcaacaa tgtcacgcaa 2343
tgcgtacatg gtttcttcca aaggagtatc t 2374
<210> 10
<211> 233
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg
20 25 30
Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe
35 40 45
Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala
50 55 60
Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu
65 70 75 80
Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu
85 90 95
Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr
100 105 110
Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg
115 120 125
Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu
130 135 140
Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala
145 150 155 160
Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg
165 170 175
Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro
180 185 190
Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala
210 215 220
Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly
225 230
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: cadA-attL
<400> 11
tttgctttct tctttcaata ccttaacggt atagcgtgaa gcctgctttt ttat 54
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: cadA-attR
<400> 12
agatatgact atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacgct caagttagta taaa 54
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: ldc-attL
<400> 13
ggaggaacac atgaacatca ttgccattat gggacctgaa gcctgctttt ttat 54
<210> 14
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: ldcC-attR
<400> 14
cgccattttt aggactcgta cgcggtaaac gccgtccgtc aagttagtat aaa 53
<210> 15
<211> 2148
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2148)
<400> 15
atg aac gtt att gca ata ttg aat cac atg ggg gtt tat ttt aaa gaa 48
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
gaa ccc atc cgt gaa ctt cat cgc gcg ctt gaa cgt ctg aac ttc cag 96
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
att gtt tac ccg aac gac cgt gac gac tta tta aaa ctg atc gaa aac 144
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
aat gcg cgt ctg tgc ggc gtt att ttt gac tgg gat aaa tat aat ctc 192
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
gag ctg tgc gaa gaa att agc aaa atg aac gag aac ctg ccg ttg tac 240
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
gcg ttc gct aat acg tat tcc act ctc gat gta agc ctg aat gac ctg 288
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
cgt tta cag att agc ttc ttt gaa tat gcg ctg ggt gct gct gaa gat 336
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
att gct aat aag atc aag cag acc act gac gaa tat atc aac act att 384
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
ctg cct ccg ctg act aaa gca ctg ttt aaa tat gtt cgt gaa ggt aaa 432
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
tat act ttc tgt act cct ggt cac atg ggc ggt act gca ttc cag aaa 480
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
agc ccg gta ggt agc ctg ttc tat gat ttc ttt ggt ccg aat acc atg 528
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
aaa tct gat att tcc att tca gta tct gaa ctg ggt tct ctg ctg gat 576
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
cac agt ggt cca cac aaa gaa gca gaa cag tat atc gct cgc gtc ttt 624
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
aac gca gac cgc agc tac atg gtg acc aac ggt act tcc act gcg aac 672
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
aaa att gtt ggt atg tac tct gct cca gca ggc agc acc att ctg att 720
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
gac cgt aac tgc cac aaa tcg ctg acc cac ctg atg atg atg agc gat 768
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
gtt acg cca atc tat ttc cgc ccg acc cgt aac gct tac ggt att ctt 816
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
ggt ggt atc cca cag agt gaa ttc cag cac gct acc att gct aag cgc 864
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
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Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
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aac tct acc tat gat ggt ctg ctg tac aac acc gac ttc atc aag aaa 960
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
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aca ctg gat gtg aaa tcc atc cac ttt gac tcc gcg tgg gtg cct tac 1008
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
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acc aac ttc tca ccg att tac gaa ggt aaa tgc ggt atg agc ggt ggc 1056
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cgt gta gaa ggg aaa gtg att tac gaa acc cag tcc act cac aaa ctg 1104
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atc aaa ttc cgt aaa gag atc aaa cgt ctg aga acg gaa tct gat ggc 1344
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Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
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aac gag cac atg tat ctt gac ccg atc aaa gtc acc ctg ctg act ccg 1488
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
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Claims (18)
- 염기성 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 액체 배지를 함유하는 발효조 중에서 배양하여 당해 배지 중에서 염기성 물질을 생성 및 축적시킴을 포함하고, 전체 배양공정 내의 적어도 일부의 기간 동안, 배지중 총 암모니아 농도를 일정한 농도 범위로 조정함으로써, 염기성 물질의 카운터 이온으로서 사용되는 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용양을 감소시킴을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 총 암모니아 농도의 일정 범위가,(A) 배지 중의 암모늄 이온 농도는, 배지 중에 용존된 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온 및 다른 음이온의 이온 당량의 합계가 배지 중에 축적된 염기성 물질 중의 이온화된 염기성 물질의 이온 당량보다 커지도록 하는 농도이고,(B) 배지 중의 총 암모니아 농도는, 미생물을 배지의 pH 및 총 암모니아 농도를 변경하여 배양하고, 염기성 물질의 생산성을 측정하고, 최적 조건에서의 염기성 물질의 생산성의 50% 이상의 생산성을 나타내는 총 암모니아 농도를 각각의 pH에서 측정함으로써 미리 결정된 상기 미생물의 염기성 물질의 생산을 억제하지 않는 농도인 조건을 만족시키는 범위인, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 총 암모니아 농도의 일정 범위가,(A') 목적하는 염기성 물질의 카운터 이온원으로서 pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하고 pH가 암모니아 가스, 암모니아수 및 요소 중 하나 이상을 첨가함으로써 pH 6.5 내지 pH 7.2의 범위로 유지되는 배지 중에서 배양하고, 염기성 물질의 생산성을 측정하고,(B') 상기 단계(A')에서 사용되는 배지 성분에서 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 저하시킨 배지를 사용하여 배양을 실시하고, 목적하는 염기성 물질의 축적에 의해 카운터 이온인 황산 이온 및/또는 염화물 이온이 부족됨으로 인해 배지의 pH를 7.2 이하로 유지할 수 없는 기간 동안에는 총 암모니아 농도를 변화시켜 배양을 실시하여, (A')에서 측정된 생산성의 50% 이상의 생산성을 제공하는 총 암모니아 농도의 범위를 측정함으로써 미리 측정되는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 적어도 일부의 기간이 목적하는 염기성 물질의 축적에 의해 카운터 이온이 부족됨으로써 배지의 pH가 상승하는 기간 및 배지에 양이온을 첨가함으로써 pH가 상승하는 기간 중 하나 이상을 포함하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 배지 중의 총 암모니아 농도가, 배지 중의 용존 산소 농도, 배지 중의 탄소원의 소비속도, 배지의 탁도, 염기성 물질의 생산성 및 배지의 pH 변화를 지표로 하여 측정되는 바에 따라 미생물의 활성이 저하되거나 정지할 때에 배지에 암모니아 또는 요소를 첨가함으로써 조정됨을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 배지로서, pH 7.2 이하에서 배양하기에 충분한 양의 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 함유하는 배지의 조성으로부터 황산 이온 및/또는 염화물 이온을 목적하는 양만큼 감소시킨 배지를 사용하며,적어도 일부의 기간이 배지에 축적되는 염기성 물질에 대한 카운터 이온이 부족됨으로써 pH를 7.2이하로 유지할 수 없는 기간임을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제2항에 있어서, 다른 음이온이 황산 이온, 염화물 이온, 인산 이온 및 이온화된 유기산으로부터 선택되는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제2항 또는 제7항에 있어서, 다른 음이온의 합계가 900meq/l 이하임을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 배양액 중의 총 암모니아 농도가 200mM 이하로 조정됨을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 미생물을 증식시키는 공정을 포함하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제10항에 있어서, 미생물을 증식시키는 공정 동안에는 총 암모니아 농도를 조정하지 않음을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 염기성 물질이 L-라이신, L-아르기닌 및 L-히스티딘으로부터 선택되는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제12항에 있어서, 염기성 물질이 L-라이신인, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제12항에 있어서, 염기성 물질이 L-아르기닌인, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 발효후에 배지 또는 이의 처리물을 가열하여, 중탄산 이온 및 탄산 이온을 제거함을 특징으로 하는, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제1항에 있어서, 미생물이 코리네형 세균 또는 에세리키아(Escherichia) 속 세균인, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
- 제15항의 방법에 따라 수득되는, 염기성 물질을 함유하는 발효액 또는 발효 생산물.
- 제16항에 있어서, 에세리키아 속 세균이 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 발효에 의한 염기성 물질의 제조법.
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