JP4844396B2 - 塩基性物質の製造法 - Google Patents

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Description

本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法による塩基性物質の製造方法に関するものである。発酵法により製造できる塩基性物質、例えばＬ−リジンは動物飼料用の添加物として、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンは輸液等の医薬品として有用である。
発酵法による塩基性物質の製造方法では、塩基性物質の生産能を有する微生物を培養し、培養液中に塩基性物質を生成、蓄積させ、培養液から塩基性アミノ酸を採取する。その際、培養方法は、回分方式、流加方式、又は連続方式で行われる。
このような塩基性物質の発酵生産においては、従来、培地のｐＨを中性に保つために、培養液中で解離して陽イオンとなる目的物質に対して、カウンタアニオンとして、硫酸イオン又は塩化物イオンが培地に添加される（特開平５−３０９８５号公報、特開平５−２４４９６９号公報）。
培養液からの塩基性物質の採取は、精製を必要とする場合は、イオン交換によって行われることが多い。例えば、Ｌ−リジンの場合では、発酵液を弱酸性に調整し、Ｌ−リジンをイオン交換樹脂に吸着させた後、アンモニウムイオンで樹脂から脱離させ、リジンベースとしてそのまま用いるか、あるいは塩酸を用いてＬ−リジン塩酸塩として結晶化する。
前記のＬ−リジンの精製において、培養液中のカウンタアニオンとして塩化物イオンを用いる場合、培養液を濃縮すれば直接Ｌ−リジン塩酸塩が得られるが、現実的には塩化物イオンは金属製の発酵槽等を腐食するため、培地中に高濃度に存在させることは好ましくない。
一方、精製しない場合は、発酵液をそのまま濃縮するか、あるいは、発酵液を塩酸又は硫酸で弱酸性に調整した後、噴霧造粒する。この場合は、培養中に添加したカウンタアニオンも残留成分となり、得られる発酵生産物中の塩基性物質の含有率を低下させる。
ところで、特開２００２−６５２８７（米国特許出願公開第２００２０２５５６４号）では、塩基性アミノ酸の発酵において、炭酸イオンや重炭酸イオンを塩基性アミノ酸のカウンタアニオンとして利用し、硫酸イオンや塩化物イオンの一部を代替する方法が示されている。培養液中の炭酸イオンや重炭酸イオンは、ｐＨを酸性にするか、又は濃縮するか、或いはその両方により、比較的容易に除くことが可能である。該文献には、炭酸イオンや重炭酸イオンを培養液中に添加する方法として、発酵中の発酵槽内圧力を正になるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは、炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給する方法が示されている。しかしながら、炭酸ガスは、通常の培地条件である中性付近のｐＨでは殆ど培養液に溶解しない。したがって、硫酸イオンや塩化物イオンの削減効果を高めるために、それに見合った重炭酸イオンや炭酸イオンを培養液中に存在させるには、アルカリ性のｐＨで培養する必要がある。しかし、ｐＨが高くなると、一般に細菌の生育速度や目的物質の生産能力は低下する。
本発明は、目的の塩基性物質の生産能を有する微生物を用いて、炭酸イオンや重炭酸イオンを塩基性物質のカウンタアニオンとして利用する塩基性物質の発酵生産において、微生物の生育速度や目的物質の生産能力の低下を回避して、硫酸イオンや塩化物イオンの削減と効率的な目的物質の生産を両立することができる方法を提供することを課題とする。
通常、コリネ型細菌やエシェリヒア属細菌を用いる発酵法による塩基性物質の製造においては、ｐＨが高くなると生育速度や目的物質の生産能力は低下する。本発明者は、その主要因は塩基性物質の生成、あるいは生育のための窒素源として、又は塩基性物質のカウンタイオン源として培地に添加されるアンモニアにあり、総アンモニア濃度を適切な濃度範囲に調整しながら発酵することにより、高ｐH条件における微生物の生育速度や目的物質の生産能力の低下を大幅に抑制することが可能であることを見出した。
本発明は、上記知見に基づいて完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）塩基性物質を生産する能力を有する微生物を液体培地を含む発酵槽中で培養し、同培地中に前記塩基性物質を生成、蓄積させる、発酵法による塩基性物質の製造法において、全培養工程の内少なくとも一部の期間、培地中の総アンモニア濃度を一定の濃度範囲に調整することにより、前記塩基性物質のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することを特徴とする方法。
（２）前記総アンモニア濃度の一定範囲が、次の条件を満たす範囲である（１）の方法。
（Ａ）培地中のアンモニウムイオン濃度が、培地中に溶存する重炭酸イオン及び／または炭酸イオン、並びに他のアニオンのイオン当量の合計が、培地中に蓄積した前記塩基性物質のうちイオン化しているもののイオン当量よりも大きくなるような濃度であること、及び
（Ｂ）培地中の総アンモニア濃度が、予め以下の方法により決定された、前記微生物の塩基性物質の生産を阻害しない濃度であること：
前記微生物を、培地のｐＨ及び総アンモニア濃度を変えて培養して、塩基性物質の生産性を測定し、最適な条件での塩基性物質の生産性の５０％以上の生産性をそれぞれのｐHで示す総アンモニア濃度を決定する。
（３）前記総アンモニア濃度の一定範囲が、以下の方法によって予め決定される（１）の方法：
（Ａ’）目的の塩基性物質のカウンタイオン源として、pH7.2以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地で、アンモニアガス、アンモニア水及び尿素の少なくともいずれかを添加することで培地のpHをpH6.5からpH7.2の範囲に保って培養し、塩基性物質の生産性を測定し、
（Ｂ’）前記手順１（Ａ’）で用いた培地成分から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ削減した培地を用いて培養を行い、目的の塩基性物質の蓄積に伴い、カウンタイオンである硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが不足することにより培地のpHを７．２以下に保つことが不可能な期間に総アンモニア濃度を変化させて培養を行い、（Ａ’）で測定された生産性の５０％以上の生産性が得られる総アンモニア濃度の範囲を決定する。
（４）前記少なくとも一部の期間が、目的の塩基性物質の蓄積に対してカウンタイオンが不足することにより、培地のpHが上昇する期間、及び培地にカチオンを添加することでｐHが上昇する期間の少なくともいずれかを含む（１）の方法。
（５）前記培地中の総アンモニア濃度の調整を、培地中の溶存酸素濃度、培地中の炭素源の消費速度、培地の濁度、前記塩基性物質の生産性、及び培地のｐＨ変化を指標とする前記微生物の活動が低下又は停止したときに培地にアンモニア又は尿素を添加することにより行うことを特徴とする、（１）の方法。
（６）前記培地として、前記塩基性物質のカウンタイオン源としてｐＨ７．２以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地の組成から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ減らした培地を用い、かつ、
前記少なくとも一部の期間が、前記培地に蓄積する前記塩基性物質に対してカウンタイオンが不足することによりｐＨを７．２以下に保つことが不可能な期間であることを特徴とする、（１）の方法。
（７）前記他のアニオンが、硫酸イオン、塩化物イオン、リン酸イオン及びイオン化した有機酸から選ばれる（２）の方法。
（８）前記他のアニオンの合計が９００meq/l以下であることを特徴とする、（２）又は（７）の方法。
（９）培養液中の総アンモニア濃度を２００ｍＭ以下に調整することを特徴とする（１）の方法。
（１０）前記微生物を増殖させる工程を含む（１）の方法。
（１１）前記微生物を増殖させる工程においては、前記総アンモニア濃度の調整を行わないことを特徴とする（１０）の方法。
（１２）前記塩基性物質がＬ−リジン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンから選ばれる（１）の方法。
（１３）塩基性物質がＬ−リジンである（１２）の方法。
（１４）塩基性物質がＬ−アルギニンである（１２）の方法。
（１５）発酵後に培地又はその処理物を加熱して、重炭酸イオン及び炭酸イオンを除去することを特徴とする、（１）の方法。
（１６）前記微生物がコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌である（１）の方法。
（１７）（１５）の方法により得られる、塩基性物質を含む発酵液又は発酵生産物。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、塩基性物質を生産する能力を有する微生物を液体培地を含む発酵槽中で培養し、同培地中に前記塩基性物質を生成、蓄積させる、発酵法による塩基性物質の製造法である。本発明の方法は、全培養工程の内少なくとも一部の期間、培地中の総アンモニア濃度を一定の濃度範囲に調整することにより、前記塩基性物質のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することを特徴とする。すなわち、本発明は、窒素源として微生物の生育又は目的物質の生産に必要な量の総アンモニアを確保しつつ、総アンモニア濃度が微生物の生育又は目的物質の生産を阻害しない ような濃度とすることにより、硫酸イオン及び塩化物イオンを削減した培地で塩基性物質を生産する方法である。
前記総アンモニア濃度の一定範囲としては、次の条件を満たす範囲が挙げられる。
（Ａ）培地中のアンモニウムイオン濃度が、培地中に溶存する重炭酸イオン及び／または炭酸イオン、並びに他のアニオンのイオン当量の合計が、培地中に蓄積した前記塩基性物質のうちイオン化しているもののイオン当量よりも大きくなるような濃度であること、及び、
（Ｂ）培地中の総アンモニア濃度が、予め以下の方法により決定された、前記微生物の塩基性物質の生産を阻害しない濃度であること：
前記微生物を、培地のｐＨ及び総アンモニア濃度を変えて培養して、塩基性物質の生産性を測定し、最適な条件での塩基性物質の生産性の５０％以上の生産性をそれぞれのｐHで示す総アンモニア濃度を決定する。
また、本発明の他の態様では、前記総アンモニア濃度の一定範囲は、以下の方法によって予め決定される：
（Ａ’）（手順１：中性条件における発酵成績の評価）
目的の塩基性物質のカウンタイオン源として、pH7.2以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地で、アンモニアガス、アンモニア水及び尿素の少なくともいずれかを添加することで培地のpHをpH6.5からpH7.2の範囲に保って培養し、塩基性物質の生産性を測定する。
（Ｂ’）（手順２：硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムの使用量を削減し、制御するアンモニウムイオンの濃度を変化させて発酵成績を評価）
前記手順１（Ａ’）で用いた培地成分から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ削減した培地を用いて培養を行い、目的の塩基性物質の蓄積に伴い、カウンタイオンである硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが不足することにより培地のpHを７．２以下に保つことが不可能な期間に総アンモニア濃度を変化させて培養を行い、（Ａ’）で測定された生産性の５０％以上の生産性が得られる総アンモニア濃度の範囲を決定する。
また、本発明の他の態様では、前記総アンモニア濃度の一定範囲を予め決定しなくても、総アンモニア濃度を所定の範囲に調整することができる。具体的には、前記培地中の総アンモニア濃度の調整を、培地中の溶存酸素濃度、培地中の炭素源の消費速度、培地の濁度、前記塩基性物質の生産性、及び培地のｐＨ変化を指標とする前記微生物の活動が低下又は停止したときに培地にアンモニア又は尿素を添加することにより行う。、前記培地として、前記塩基性物質のカウンタイオン源としてｐＨ７．２以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地の組成から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ減らした培地が用いられる。また、前記少なくとも一部の期間としては、前記培地に蓄積する前記塩基性物質に対してカウンタイオンが不足することによりｐＨを７．２以下に保つことが不可能な期間が挙げられる。
前記他のアニオンとしては、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、及び有機酸（酢酸、乳酸、コハク酸）等が挙げられる。また、前記培地中に溶存する重炭酸イオン及び／または炭酸イオンは、塩基性物質のカウンタアニオンとして働く。
本発明において、イオン当量とは各イオンのモル濃度にそれぞれの価数を乗じた値であり、eq/lの単位で表される。即ち１価のイオン１ｍMは１meq/lであり、２価のイオン１ｍMは２meq/lである。
上記総アンモニア濃度の調整は、培地に、微生物の生育又は塩基性物質の生成に必要な量であって、かつ、前記微生物の塩基性物質の生産を阻害しない濃度の総アンモニアを存在させるためのものであり、それによって、自動的に塩基性物質のカウンタアニオンとして必要な重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを溶解させるのに適したｐＨに調整される。
本発明において、「総アンモニア」とは、解離していないアンモニア（ＮＨ3）及びアンモニウムイオン（ＮＨ4 +）の合計をいう。尚、総アンモニア濃度の調整においては、測定するのは解離していないアンモニアであってもよいし、アンモニウムイオンであってもよく、さらにはこれらの両方であってもよい。
従来、一般的には、塩基性物質のカウンタアニオンの供給源及び窒素源として、硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムが培地に添加される。また、通常、培地のｐＨの調整にはアンモニアや尿素が使用されるため、培地中には高濃度のアンモニア及びアンモニウムイオンが存在する。培地に添加する硫酸イオンや塩化物イオンの量を削減する為に硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムの量を削減する場合、削減する分に相当する窒素源を、例えばアンモニア等として供給する必要がある。その際に、目的の塩基性物質などのように、菌によって生成され、培養が進むに従って増加していくカチオンや添加したアンモニアのうちイオン化しているカチオン、及びナトリウムイオンやカリウムイオンなどのように培地に添加しされたカチオンと、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンのように、菌の呼吸により発生したり培地に添加することで培地中に増加していくアニオンとのバランスが考慮されたアンモニアの供給方法を開発する必要があった。このバランスが保たれなければ、アンモニアが高濃度になりすぎたり、ｐHが過剰に高くなったり、逆にアンモニアが枯渇することにより発酵が成立しない。本発明においては、総アンモニアの濃度を一定の範囲に調整するアンモニアの添加方法を開発したことによって、上記のようなカチオンとアニオンのバランスを良好に保つことが出来るようになり、培地に含まれる硫酸イオンやムや塩化物イオンの量を削減した条件においても良好な微生物の生育及び塩基性物質の生成を実現することができる。
培地中の総アンモニア濃度の調整は、培地中の総アンモニア濃度が許容量となるように、培地にアンモニアガス、アンモニア溶液、又は尿素の少なくともいずれかを添加することにより行われる。また、本発明の効果を損わない限り、塩化アンモニウムや硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を加えてもよい。また、培養終了後に気体として容易に除くことが出来る重炭酸イオン及び又は炭酸イオンを対イオンとするアンモニウム塩は使用しても良い。総アンモニア濃度は、培地中又は排気ガス中のアンモニウムイオン又はアンモニアの濃度を測定し、その測定値を指標として調節することができる。また、アンモニアでｐＨを調整したときに、総アンモニア濃度が許容値となるようなｐＨを予め設定し、そのようなｐＨとなるようにアンモニアを添加することによって、総アンモニア濃度を調整してもよい。この場合、必要に応じて、培養中に、前記のようにして設定されたｐＨを変化させてもよい。
また、培地中の総アンモニア濃度の調整は、培地中の溶存酸素濃度、培地中の炭素源の消費速度、培地の濁度、前記塩基性物質の生産性、及び培地のｐＨ変化を指標とする前記微生物の活動が低下又は停止したときに培地にアンモニア又は尿素を添加することによっても行うことができる。すなわち、培地中の窒素源が不足又は枯渇すると、微生物の増殖又は目的物質の生産のような微生物の活動が低下又は停止する。通常、微生物の活動は、培地中の溶存酸素及び炭素源の消費、培地の濁度の上昇、目的物質の生産、アンモニアの消費や呼吸による二酸化炭素の放出に起因する培地のｐHの低下として表れる。よって微生物の活動が低下又は停止した場合には、単位時間当たりの通気量や攪拌速度が一定の場合には、培地中の溶存酸素濃度が上昇し、また、アンモニアの消費と炭酸ガスの排出が低下することにより培地のpHは上昇する。更に、炭素源の消費速度や培地の濁度の上昇速度、及び目的物質の生産速度が低下する。したがって、窒素源以外の培地成分が充足している状態において、これらを指標として微生物の活動の停滞が観察されたときは、窒素源が不足又は枯渇しているときである。その際に、微生物の生育又は目的物質の生産に必要な量のアンモニア又は尿素を培地に添加する。これを繰り返すことにより、結果的に培地中の総アンモニア濃度が一定範囲に保たれる。培地に尿素を添加して培養すると、微生物によって尿素が資化され、アンモニアが培地に放出される。上記のようにしてアンモニア又は尿素の添加を繰返すと、培地のｐＨは徐々に上昇する。アンモニア又は尿素の添加量としては、培地中の総アンモニアの終濃度として一回に、３００ｍM、好ましくは２００ｍM、より好ましくは１００ｍMが挙げられる。あるいは、アンモニア又は尿素を添加した後のｐＨの上昇が０．３、好ましくは０．１５、より好ましくは０．１以内となるようにアンニモア又は尿素を添加してもよい。
尚、培地中の溶存酸素濃度は、例えば溶存酸素電極により測定することができる。
培地中に溶存する重炭酸イオン及び／または炭酸イオン、並びに他のアニオンのイオン当量の合計が、培地中に蓄積した塩基性物質のイオン当量当量よりも高いことは、重炭酸イオン炭酸イオン、及び他のアニオンの濃度、並びに前記塩基性物質の濃度を測定することによって確認することができる。また、予備実験を行って、上記条件を満たすｐＨ及び／又はアンモニアの添加量を設定し、そのようなｐＨ及び／又はアンモニアの添加量で培養を行うことによっても、上記条件を満たすことができる。
本発明においては、培養ｐＨは一定であってもよいし、一定でなくてもよい。また、培地のｐＨを制御する場合、ｐＨの制御はｐＨ自体を指標として行ってもよいし、直接的には制御せず、総アンモニア濃度を制御することによって、間接的に制御されてもよい。また、前記のように、微生物の活動を指標にしてアンモニアや尿素を添加すると、培地中の総アンモニア濃度が適正な濃度範囲に調節され、塩基性物質の蓄積に伴って徐々に高いｐHに変化させることになる。また、総アンモニア濃度を一定の範囲内に制御して培養すると、培地中に種々のカチオンとアニオンの蓄積バランスが変化していく結果としてｐHが変化する。どちらの手段を選択しても、結果として培地中の総アンモニア濃度が一定の濃度範囲に調整され、前記塩基性物質のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することが出来る。
本発明において、「塩基性物質の生産を阻害しない」とは、本発明に用いる微生物が良好に生育し、かつ、塩基性物質が生産されることを意味する。微生物の生育が悪い場合、及び、微生物が良好に生育したとしても、塩基性物質が効率よく生産されない場合は、塩基性物質の生産は阻害されたといえる。
具体的には、本発明に用いる微生物を、培地のｐＨ及び総アンモニア濃度を変えて培養して、培地に蓄積する塩基性物質の生産性を測定し、最適な条件、例えば従来の中性における一般的な条件での塩基性物質の生産性の好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の成績がそれぞれのｐＨで得られるような総アンモニア濃度は、「塩基性物質の生産を阻害しない」濃度である。尚、本発明において、「生産性」とは、収率、生産速度、又は総生産量をいう。「収率」とは、培地中の資化可能な炭素源に対する塩基性物質の生産量をいい、「生産速度」とは、単位時間当りの生産量をいう。また、単に「生産量」というときは、炭素源を完全に消費したときの培地中の塩基性物質の蓄積量をいう。
また、本発明に用いる微生物を、最適な条件、例えば従来の中性における一般的な条件で培養した場合に培地に蓄積する塩基性物質の生産性を測定し、次に、同じ組成の培地から硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ削減した培地を用いて培養を行い、生産性を測定する。この場合、目的の塩基性物質の蓄積に伴い、カウンタイオンである硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが不足することにより培地中のpHが上昇する期間が存在する。その期間の総アンモニア濃度を一定の濃度範囲に制御して培養する。制御する濃度範囲として1mMから500mMの範囲の種々の濃度範囲に設定して培養を行い、その生産性が最適な条件の場合に比べて好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の成績を得るような濃度範囲を「塩基性物質の生産を阻害しない」濃度とする。前記「従来の中性における一般的な条件」に用いる培地としては、pH7.2以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地が挙げられる。
尚、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを削減する所望の量は、塩基性物質の目的とする生産性が得られる限り、特に制限されない。
「塩基性物質の生産を阻害しない」総アンモニアの濃度は、例えば、以下のようにしても決定することができる。本発明に用いる微生物を、培地のｐＨ及び総アンモニア濃度を変えて培養して、培地に蓄積する塩基性物質の量を測定する。各々の条件での塩基性物質の蓄積量を、最適な条件での蓄積量と比較する。このようにして、塩基性物質の生産を阻害しない総アンモニア濃度を決定することができる。最適な条件とは、例えば従来の中性における一般的な条件のように中性で培養するのに充分なカウンターイオンを使用して培養する条件をいう。
さらに、「塩基性物質の生産を阻害しない」総アンモニアの濃度は、例えば、以下のようにしても決定することができる。本発明に用いる微生物を、最適な条件、例えば従来の中性における一般的な条件で培養した場合に培地に蓄積する塩基性物質の生産性を測定し、次に、同じ組成の培地から硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ削減した培地を用いて培養を行い、生産性を調べる。この場合、目的の塩基性物質の蓄積に伴い、カウンタイオンである硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが不足することにより培地中のpHが上昇する期間が存在する。その期間の総アンモニア濃度を一定の濃度範囲に制御して培養する。制御する濃度範囲として1mMから500mMの範囲の種々の濃度範囲に設定して培養を行い、その生産性が最適な条件の場合と比較する。
「塩基性物質の生産を阻害しない」には、例えば、最適な条件において塩基性物質を生産する場合の生産性の好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の生産性が得られる条件が含まれる。具体的には、培地中の総アンモニア濃度としては、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２００ｍＭ、特に好ましくは１００ｍＭ以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、前記「塩基性物質の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度の範囲としてもよい。
一方、微生物の生育及び塩基性物質の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度としては、培養中に窒素源が不足することにより微生物による目的物質の生産性が低下しない限り特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときの濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、特に好ましくは１０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。
本発明の方法は、主として塩基性物質を生産する能力を有する微生物を増殖させる培養工程と、主として前記微生物に塩基性物質を生産させる培養工程とを含んでいてもよい。また、本発明の方法は、微生物の増殖と塩基性物質の産生とが並行して行われてもよい。さらに、上記のような培養、これらは主発酵あるいは本培養等と呼ばれることがあるが、これとは別に、前培養を行ってもよい。
本発明においては、上記したように、培地中の総アンモニア濃度を調整することに加えて、培地中に重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが溶存しやすくなるような操作を行ってもよい。このような操作としては、前記発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給するか、又は、培地中に重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが溶存するように発酵槽への吸気を制限することか、又はアンモニウムイオン以外のカチオン、例えばナトリウムイオンやカリウムイオンなどを培地に添加することでｐHを上昇させることなどが挙げられる。
発酵槽内圧力が正となるようにするには、例えば、発酵槽への給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を高くすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解し、重炭酸イオン又は炭酸イオンを生じる。発酵槽内圧力として具体的には、０．１３〜０．３ＭＰａ、好ましくは０．１５〜０．２５ＭＰａが挙げられる。
また、培養液に炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給することによって、培養液に炭酸ガスを溶解させてもよい。あるいは、発酵槽への通気を制限することによっても、発酵により生成する炭酸ガスを培養液に溶解させることができる。好適な通気量は、例えば培地中の重炭酸イオン又は炭酸イオンを測定することや、ｐHやアンモニア濃度を測定することによって、決定することができる。培養液に炭酸ガスを供給する場合は、例えば、純炭酸ガス又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを吹き込めばよい。尚、培地に重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを溶解させる上記の方法は、単独でもよいし、複数を組み合わせてもよい。
前記培地中の総アンモニア濃度を調整する操作、及び必要に応じて培地中に重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが溶存しやすくなるような操作は、全培養工程の内少なくとも一部の期間行えばよい。
前記「少なくとも一部の期間」とは、所望の生産性が得られる限り特に制限されないが、具体的には、例えば、本培養における全培養工程の１／１０以上、好ましくは１／５以上が上げられる。より具体的には目的の塩基性物質の蓄積に対して、培地に使用する硫酸イオン及び／又は塩化物イオン等のカウンタイオンが不足することにより、培地のｐＨが上昇する期間、培地にカチオンを添加することでｐHが上昇する期間、及びこれらの両方の期間が含まれる。
本発明に用いる培地は、少なくとも総アンモニア濃度を調整する操作を行う際に、総アンモニア濃度が上記の範囲となる限り、特に制限されず、炭素源、窒素源などの有機、無機栄養源及びその他の微量栄養素を含む培地を、使用する微生物に応じて適宜使用することができる。
炭素源は微生物が資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えば、サッカロース、グルコース、フルクトース、糖蜜、澱粉加水分解物などの糖、酢酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール、メタンなどの炭化水素が挙げられる。
窒素源としては、アンモニアなどの無機物や蛋白加水分解物や、酵母エキスなどが挙げられる。微量栄養素としては、アミノ酸やビタミン、微量金属元素が挙げられる。
培地に含まれる重炭酸イオン及び／または炭酸イオン以外の他のアニオンには、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、及び水酸化物イオン等が挙げられる。これらの他のイオンのイオン当量の合計は、通常は９００meq/l以下、好ましくは７００meq/l以下、より好ましくは５００meq/l以下、さらに好ましくは３００meq/l以下、特に好ましくは２００meq/l以下である。
本発明においては、硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであり、培地に含まれる硫酸イオンもしくは塩化物イオン、又はこれらのイオン当量の合計は、通常、７００meq/l以下、好ましくは５００meq/l以下、より好ましくは３００meq/l以下、さらに好ましくは２００meq/l以下、特に好ましくは１００meq/l以下である。
発酵形態については、特別な制限はなく、培地を流加しない回分法、仕込み糖が消費した時点から、更に培地を流加する流加法、培地が発酵槽の許容量を超える時点から培地を引く抜く連続法、菌体を再回収するセルリサイクル法などのいずれでも構わない。培養温度は、使用する微生物に応じて適宜設定すればよい。通常、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃である。また、発酵中は十分な攪拌と酸素を供給することが好ましい。
目的の塩基性物質を生産するための培養は、具体的には、例えば以下のようにして行う。通常の一般的に用いられる培地成分から、硫酸アンモニウムや塩化アンモニウム等のアンモニウム塩を一部、又は全て削除した培地を作製する。この培地に、別途培養した微生物を接種し、前記のようにして決定した、使用する微生物に好適な総アンモニア濃度範囲に制御して培養する。発酵槽中の培養液又はサンプリングした培養液中のアンモニア濃度は、例えば、市販されているイオンメーター等を用いて測定することができる。その測定値を指標として、総アンモニア濃度を制御すればよい。総アンモニア濃度が所定の濃度範囲になるように、アンモニアガス又はアンモニア水又は尿素を培養液に添加すればよい。発酵槽からの排気ガス中のアンモニア濃度を一般的なアンモニア電極によって測定することによっても、培地中の総アンモニア濃度を間接的に測定することができる。
また、本発明において、前記培地中の総アンモニア濃度の調整は、前記したように、以下に示す方法によって培地のｐHを指標に行うことができる。
目的の塩基性物質のカウンタイオン源として、pH7.2以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地の組成から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ削減した培地で、アンモニアガス、アンモニア水及び尿素の少なくともいずれかを添加して培地のｐHを変化させながら培養し、
培地に蓄積する目的の塩基性物質に対して、カウンタイオンが不足することによりｐHを７．２以下に保つことが不可能な期間に、培地中の溶存酸素濃度の経時変化、培地中の炭素源の消費速度の経時変化、培地の濁度の経時変化、または培地のｐＨ変化などを指標とし、アンモニアガス、アンモニア水及び尿素の少なくともいずれかを添加することによって、間接的に培地中の総アンモニア濃度を好適な濃度範囲に保って培養する。
本発明により製造する塩基性物質としては、塩基性アミノ酸、具体的にはＬ−リジン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンが挙げられる。これらの中ではＬ−リジンが好ましい。
塩基性物質生産能を有する微生物には特別の制限はなく、発酵法により塩基性物質を生産することが可能である限り、いずれの微生物も使用できる。特に、培地のｐＨが高くても、培地中の総アンモニア濃度が低ければ塩基性物質を良好に生産する微生物が好適に用いられる。このような微生物としては、コリネ型細菌、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属に属する細菌を挙げることができる。
以下に、コリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌について説明するが、本発明の方法に用いられる微生物は、これらの細菌に制限されない。
本発明に用いるコリネ型細菌には、コリネバクテリウム属細菌、及び、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌が含まれ（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌も含まれる。具体的には以下のものが例示される。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・エフィシエンス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
また、エシェリヒア属に属する細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリを遺伝子工学的手法にて育種する場合には、E. coli K12株及びその誘導体であるエシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）を用いることができる。エシェリヒア・コリK12株は、1922年にスタンフォード大学で分離されたものであり、λファージの溶原菌であるとともに、F因子を持ち、接合等遺伝的組み換え体の作成が可能である汎用性の高い菌株である。またエシェリヒア・コリＫ１２株のゲノム配列は既に決定されており、遺伝子情報も自由に利用出来る。エシェリヒア・コリＫ１２株や、誘導株を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。
Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、AECと略記する）耐性変異株、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特 開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開 昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イ ノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号、特 開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を 示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレン グリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許出願第333455号）が挙げられる。
具体的には、例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC31269、ブレビバクテリウム・フラバムATCC21475、コリネバクテリウム・アセトグルタミクムATCC21491が挙げられる。
また、実施例に記載したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869/pVK-C*,plysEも、好ましいＬ−リジン生産コリネ型細菌である。同株は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除された脱感作型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子（lysC*）を含むプラスミドpVK-C*と、コリネバクテリウム属細菌で知られているＬ−リジンの排出を促進する遺伝子（国際公開パンフレット第9723597A2号）の相同遺伝子であるlysE遺伝子を含むプラスミドplysE（米国特許出願公開第2003113899）を、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株であるATCC13869株に導入した株である。
lysC*遺伝子は、例えば、ATCC13869株より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産性変異株AJ3463（FERM P-1987）（特公昭51-34477号公報参照）から単離することができる。AJ3463株は、1973年3月22日より、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 工業技術院生命工学工業技術研究所）（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、FERM P-1987の受託番号で寄託されている。また、lysC*遺伝子断片は、同遺伝子を含むプラスミドp399AK9Bを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12691株から単離することもできる。AJ12691株は、1992年4月10日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-12918として寄託され、1995年2月10日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。前記プラスミドp399AK9Bは、AJ3463株由来のlysCをクローニングベクターpHSG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参照）に挿入した得たプラスミドp399AK9に、コリネバクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片を挿入することにより、得たものである（米国特許第5,766,925号）。
上記脱感作型アスパルトキナーゼは、野生型アスパルトキナーゼのαサブユニットの２７９位のアラニン残基、及びβサブユニットの３０位のアラニン残が、それぞれスレオニン残基に置換されている。αサブユニット及びβサブユニットは、ともにlysC遺伝子に同一のフレームでコードされている。lysC*遺伝子の塩基配列と脱感作型アスパルトキナーゼのαサブユニットを配列番号５及び６に、同遺伝子及び脱感作型アスパルトキナーゼのβサブユニットのアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。
コリネ型細菌のlysE遺伝子は、報告されているその塩基配列（GenBank accession X96471）に基づいて作製したプライマー、例えば配列番号３および４に示すプライマーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、lysE遺伝子を取得することができる。コリネバクテリウム・グルタミカムlysGおよびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（GenBank accession X96471）を配列番号９に、同遺伝子によってコードされるLysEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。尚、LysGは、配列番号８の塩基番号1723〜2352に相当する位置の相補鎖にコードされている。
アスパルトキナーゼのαサブユニット、βサブユニット、及びLysEタンパク質をコードするＤＮＡには、それらのタンパク質の活性が失われない限り、各々のタンパク質の１または複数の位置での１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含む可能性のあるタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。「複数」のアミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類よって異なるが、それぞれのタンパク質に対して好ましくは２〜３０、より好ましくは２〜２０、特に好ましくは２〜１０である。これは以下の理由による。いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そしてそのようなアミノ酸における差異はタンパク質の三次元構造およびその活性に大きくは影響しないからである。したがって、それぞれのタンパク質は、配列番号６、８、又はに記載のアミノ酸残基に対して５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつアスパルトキナーゼ又はLysEタンパク質の活性を有するものであり得る。
上記のようなタンパク質の改変は、それぞれのタンパク質の活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。それぞれのタンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
配列番号６、８又は１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１または複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加されるように部位特異的突然変異法を使用して、配列番号６、８又は１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変することにより、得ることができる。そのような改変ＤＮＡは、変異を発生させる試薬および条件での処理を用いる従来法により得られ得る。そのような処理として、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミンでの処理、またはＤＮＡを保持する細菌のＵＶ照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたは亜硝酸などの試薬での処理が挙げられる。
上記のような改変タンパク質をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でlycC遺伝子もしくはlysE遺伝子またはこれらの遺伝子の一部分とハイブリダイズし、かつアスパルトキナーゼ活性又はLysEタンパク質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られ得る。用語「ストリンジェントな条件」には、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、かつ、非特異的ハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件には、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が含まれる。あるいは、ストリンジェントな条件には、サザンンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄の条件、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、を含む。
また、エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が例示できる。このＬ−リジンアナログは、エシェリヒア属細菌の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的に解除されるようなものである。例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１８５；特開昭５６−１８５９６号及び米国特許第４３４６１７０号参照）、エシェリヒア・コリ VL611が挙げられる。ＡＪ１１４４２株は、１９８１年５月１日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 工業技術院生命工学工業技術研究所）（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号 FERM P-5084として寄託されており、１９８７年１０月２９日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、FERM BP-1543として寄託されている。以上の微生物のアスパルトキナーゼは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
また、例えば、脱感作型アスパルトキナーゼ以外の、Ｌ−リジン生合成系に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増強した細菌も好適なＬ−リジン生産菌として利用できる。例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以上、国際公開96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（国際公開00/61723号パンフレット）等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。
Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリとして具体的には、例えば、エシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pCABD2（国際公開第WO95/16042号記載）等を挙げることができる。エシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pCABD2は、エシェリヒア・コリのtyrA欠損株であるW3110(tyrA)（AJ12604と命名され、平成３年１月28日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 工業技術院生命工学工業技術研究所）（住所 〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-11975の受託番号で寄託され、平成３年９月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、FERM BP-3579の受託番号で寄託されている）に、Ｌ−リジン生合成系酵素遺伝子を保持するプラスミドpCABD2を導入した株である。
pCABD2は、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に変異し、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に変異し、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型アスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子、及び、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保持している。
また、E. coliW3110(tyrA)株は、以下のようにして得ることができる。ところで、欧州特許公開９２年４８８４２４号公報には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミドpHATermを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyrA)/pHATerm株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、登録番号FERM BP-3653が付与されている。このE. coli W3110(tyrA)/pHATerm株からプラスミドpHATermを脱落させることによって、W3110(tyrA)株を取得することができる。プラスミドの脱落は常法によって行うことができる。
また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌としては、WC196株（WO96/17930号国際公開パンフレット参照）を用いることもできる。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン）耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
本発明に用いることができる微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−リジン生産に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイムがあり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分を欠失させることによっても達成出来る（Journal of biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645、米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
また、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンの排出遺伝子であるybjEの発現量を増強するように改変した微生物も本発明に用いることができる（国際公開WO2005/073390号パンフレット）。
セラチア属に属するＬ−リジン生産菌としては、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡが細胞内に導入されて形質転換されたセラチア属細菌、さらにＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼを保持するセラチア属細菌が挙げられる（国際公開第WO96/41871号）。
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンのリプレッサーを欠損したコリネ型細菌（米国特許出願公開2002-0045233号明細書）、及び、グルタミン酸デヒドロゲナー活性を上昇させたコリネ型細菌（欧州特許出願公開1057893号明細書）も、Ｌ−アルギニン生産に好適な菌株である。
具体的には、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092（FERM BP-6906）、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）、ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）が挙げられる。AJ11169株及びAJ12092株は特開昭５４−４４０９６号記載の２−チアゾールアラニン耐性株、AJ11336株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性及びサルファダイアジン耐性を有する株、AJ11345株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール耐性、２−チアゾールアラニン耐性、サルファグアニジン耐性、及びヒスチジン要求性を有する株、及びAJ12430株は特開平２−１８６９９５号記載のオクチルグアニジン耐性及び２−チアゾールアラニン耐性を有する株である。
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092（FERM BP-6906）は、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-12092として寄託され、1999年10月01日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6906が付与されている。
Ｌ−アルギニン生産能を有すエシェリヒア属細菌としては、argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）や、酢酸資化性変異株のＬ−アルギニン生産性誘導体であるエシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）が挙げられる。２３７株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika、住所：Russia, 117545, Moscow, 1 Dorozhnyproezd, 1）にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。２３７株の誘導体であるＬ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有する株である３８２株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ３８２株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムスにVKPM B-7926の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
Ｌ−アルギニン生産能を有するセラチア属細菌としては、Ｌ−アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参照）が挙げられる。
Ｌ−ヒスチジン生産能を有するコリネ型細菌としては、ブレビバクテリウム属に属し、サイアミンアンタゴニストに耐性を有する微生物、具体的にはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムFERM P-2170、FERM P-2316、FERM P-6478、FERM P-6479、FERM P-6480、FERM P-6481が挙げられる（特開昭５９−６３１９４号）。また、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、ポリケタイド類に耐性を有し、Ｌ−ヒスチジン生産能を有する変異株、具体的にはFERM P-4161、FERM P-7273、FERM P-8371、FERM P-8372、ATCC14067が挙げられる。
Ｌ−ヒスチジン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア属に属しヒスチジンアナログに耐性を有する変異株、例えばエシェリヒア・コリR-344株、及び、同株より抽出したＬ−ヒスチジン合成系酵素遺伝子が導入されたエシェリヒア属細菌が挙げられる。具体的には、エシェリヒア・コリNRRL-12116、NRRL-12118、NRRL-12119、NRRL-12120、NRRL-12121が挙げられる（特開昭５６−５０９９号）。
また、Ｌ−ヒスチジン生産能を有するバチルス属細菌としては、バチルス属に属しヒスチジンアナログに耐性を有する変異株、及び、同変異株より得たヒスチジンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子が導入されたバチルス属細菌が挙げられる。具体的には、FERM BP-218、FERM BP-224、FERM BP-219（特開昭５８−１０７１９２号）が挙げられる。
本発明により得られる塩基性物質を含む発酵液又はその処理物は、炭酸イオン又は重炭酸イオンを、解離した塩基性物質に対するカウンタアニオンとして含んでいる。この炭酸イオン又は重炭酸イオンは、培養液を加熱することや、培養液を濃縮することや、塩酸などの強酸を添加してｐHを低下させることによって、炭酸ガスとして放出される。従って発酵液又は発酵生産物中の固形成分にしめる塩基性物質の含量が高められる。
本発明によって、塩化物イオンや硫酸イオンを重炭酸イオンや炭酸イオンなどで置き換えることにより、塩化物イオンの使用量を設備の腐食を起こさないレベルにまで削減し、あるいは硫酸イオンを削減することができる。また、発酵後、培養液に塩酸を加えるだけで、重炭酸イオンや炭酸イオンを塩化物イオンに置き換えることが可能であり、更に濃縮するだけで、イオン交換を行わなくともリジン塩酸塩を得ることができ、さらには直接リジン塩酸塩の結晶を分取することが可能である。
本発明において、「発酵生産物」とは、前記発酵液から得られる濃縮液、乾燥物、及び、発酵液又はその乾燥物を加工した製品を含む。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
〔実施例１〕コリネ型Ｌ−リジン生産菌の構築
野生型コリネ型細菌に、脱感作型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子と、及びリジン排出因子をコードする遺伝子を導入し、Ｌ−リジン生産菌を構築した。
（１）脱感作型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の取得
Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除された脱感作型アスパルトキナーゼ（Ask*）をコードする遺伝子（lysC*）は、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869株より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産性変異株AJ3463（FERM P-1987）（特公昭51-34477号公報参照）からＰＣＲ法により単離した。
AJ3463株をCM-Dex培地で培養し、得られた菌体より染色体DNAを通常の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619-629 (1963)）により抽出した。この染色体DNAを鋳型にして、制限酵素BamHI部位を、目的DNA断片の5’末端に持つように導入するようなオリゴヌクレオチドASK-F（配列番号１）、制限酵素KpnI部位を、目的DNA断片の3’末端に持つように導入するようなオリゴヌクレオチドASK-R（配列番号２）をPCRのプライマーとして、目的遺伝子であるlysC*を含む遺伝子DNA断片を増幅した。増幅の条件は、変性（デナチュレーション）工程98℃：10秒、対合（アニーリング）工程55℃：30秒、伸長（イクステンション）工程72℃：2分からなるサイクルを25回行った。使用した酵素はPyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造製）で、メーカーの使用指示書に従って使用した。
増幅されたDNA断片をフェノール・クロロフォルム処理とエタノール沈殿により精製した後、制限酵素BamHIとKpnIにて消化した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動にて展開し、lysC*遺伝子を含むバンドを切り出し、定法に従って遺伝子断片を精製した。
一方、エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・グルタミカムのシャトルベクターであるpVK7（米国特許第6,004,773号参照）を、同様に制限酵素BamHIとKpnIにて処理した後、上記のlysC*断片とライゲーションした。このライゲーション反応液を用いて、E. coli JM109株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、カナマイシン耐性のコロニーを数個選択した。
前記のpVK7は、以下のようにして、エシェリヒア・コリ用ベクターであるpHSG299（Kmr；Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330を結合することによって構築した（特開平11-266881号、WO99/07853号国際公開パンフレット参照）。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株より調製した。pHSG299をAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、T4 DNAポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）製）にて切断し、T4 DNAポリメラーゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。こうしてpVK7を取得した。pVK7は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプルクローニングサイトと、lacZ’及びマーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を保持している。
前記のようにして得られたカナマイシン耐性のコロニーから、定法に従ってプラスミドDNAを抽出し、目的のlysC*遺伝子を含むプラスミドをpVK-C*と命名した。
（２）リジン排出因子lysEをコードする遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株の染色体ＤＮＡを鋳型として、コリネバクテリウム属細菌で知られているＬ−リジンの排出を促進する遺伝子（国際公開パンフレット第９７２３５９７Ａ２号）であるlysE遺伝子を、ＰＣＲ法によって単離した（米国特許出願公開第2003113899号参照）。前記菌株の染色体ＤＮＡは、上記と同様にして調製した。
DNAプライマーには、LysE-F（配列番号３）及びLysE-R（配列番号４）を用いた。またPCR反応は、Pyrobest（宝酒造（株）製）を用い、94℃、90秒の熱処理の後、変性94℃、20秒、アニーリング55℃、30秒、伸長反応72℃、60秒のサイクルを30サイクル行い、その後72℃で10分間保温することにより行った。この反応により、目的の大きさのDNA断片を取得した。このDNA断片を精製後、クローニングベクターpCR2.1（Invitrogene社製）に、製造元のプロトコールに従いクローニングした。このライゲーション反応液を用いて、E. coli JM109株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを数個選択した。これらのコロニーからプラスミドDNAを抽出し、目的の構造を有しているプラスミドをpCRlysEと命名した。
次に、pCRlysEを、制限酵素BamHIとXbaIにより消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、lysE遺伝子を含む断片を取得した。一方、エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・グルタミカムのシャトルベクターであるpKC（米国特許出願公開第2003113899号参照）を、同様に制限酵素BamHIとXbaIにて処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む遺伝子断片を取得し、精製した後、上記のlysE断片とライゲーションした。このライゲーション反応液を用いて、E. coli JM109株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを数個選択した。そうして得られたコロニーからプラスミドを調製することで、LysE発現プラスミドplysEを取得した。
尚、pKC4は、以下のようにして作製されたものである。既に取得されているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)）由来の複製起点を持つプラスミドpHK4（特開平5-7491号公報参照）を制限酵素BamHIおよびKpnIで消化して、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られた断片をDNA平滑末端化キット（宝酒造）を用い平滑末端化した後、KpnIリンカー（宝酒造）を用いて、pHSG399（宝酒造）のKpnI部位にライゲーションにより挿入した。このライゲーション反応液を用いて、E.coli JM109株のコンピテントセル（宝酒造製）を、製造元のプロトコールに従い形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを数個選択した。そうして得られたコロニーからプラスミドを調製することで、pKC4を取得した。
（３）Ｌ−リジン生産性コリネ型細菌の構築
上記の２つのプラスミド、pVK-C*及びplysEを、エレクトロポレーション法により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株に導入した。エレクトロポレーションは、BIO-RAD社製 Gene Pulserを用い、キュベットの電極間隔は0.1cm、パルス条件は、25μF, 200Ω, 1.8kVの条件で行った。尚、得られたプラスミド導入株は、クロラムフェニコール5μg/lとカナマイシン25μg/lを含むCM-Dex寒天プレート（培地組成は下記参照）で選択した。得られたプラスミド導入株を、クロラムフェニコール5μg/lとカナマイシン25μg/l含むCM-Dex液体培地で、31.5℃で一晩振とう培養した。尚、振とう培養は、試験管を用いて３mlの培養液中で行った。
CM-Dex培地は、以下のようにして調製した。表１の成分を全て混ぜ合わせてからKOHでpH7.5に調整し、その後、120℃で20分間オートクレーブして滅菌した。また、寒天培地の場合は、寒天を最終濃度で20g/Lとなるように添加した。
Figure 0004844396
上記のようにして、Ｌ−リジン生産性コリネ型細菌ATCC13869/pVK-C*,plysEを得た。
〔実施例２〕アルカリ性の培地におけるＬ−リジン生産菌の生育及びＬ−リジン生産に対する総アンモニア濃度の影響
実施例１で構築したＬ−リジン生産菌を用いて、アルカリ性の培地におけるＬ−リジンの生産性が阻害されない総アンモニア濃度を調べた。
まず、従来の一般的な培養方法、即ち、Ａ培地（組成を表２に示した）にグルコースに対して５５％（w/w）の硫酸アンモニウムを添加した培地（Ｂ培地）を使用して、培養中、アンモニアガスにより培養液のｐＨを一定に保つ方法で、Ｌ−リジン発酵を行った。前記ｐＨは、7.0又は8.0とした。
Figure 0004844396
具体的には以下のようにして培養を行った。前記菌株を3mlのCM-Dex液体培地に植菌し、31.5℃で一晩振盪培養した後、その培養液200μlをCM-Dex寒天培地に均一に塗布し、31.5℃で一晩静置培養した。その後、同寒天培地に生育したＬ−リジン生産菌を１枚のプレートの1/3に相当する分を、300mlのＢ培地を入れたジャーファーメンターに植菌して培養を行った。培養中、フィルターによって除菌した空気を１分間に300ml通気し、攪拌速度は700rpmに、培養液の温度は31.5℃に保った。結果を図１に示す。
その結果、pH7.0ではＬ−リジンが17.4g/L蓄積し、生産速度は、0.725g/L/hrであった。一方、pH8.0では殆ど増殖が認められず、発酵は成立しなかった。（図１）
次に、前記Ｌ−リジン生産菌を用いて、硫酸アンモニウムを含まない培地で発酵を行った。
前記Ｌ−リジン生産菌を3mlのCM-Dex液体培地に植菌し、31.5℃で一晩振盪培養した。その培養液200μｌをCM-Dex寒天培地に均一に塗布し、31.5℃で一晩放置し、Ａ培地（硫酸アンモニウム無添加）に300mlをジャーファーメンターに入れ、アンモニアガスを吹き込んで、pH7.8, pH8.2, pH8.9の各pH条件に調整した。この培地に、上記の寒天培地に生育したリジン生産菌を１枚の培地の1/3に相当する分を植菌して培養を行った。培養中は、フィルターによって除菌した空気を１分間に300ml通気し、攪拌速度は700rpmに、培養液の温度は31.5℃で一定に保った。培養中は、アンモニアガスを培養液に吹き込むことによってpHを一定に調整した。その結果、pH8.9の条件では培養液中の総アンモニア濃度が100mMを超えた後、特に生育やＬ−リジン生産が強く阻害されることが確認された。
上記の培養方法では、培養時間が経過するに従ってＬ−リジン生産菌が発生する炭酸ガスが、炭酸イオンや重炭酸イオンとして培養液中に溶け込みpHを下げるため、pHを設定値に調整するために添加されるアンモニアの量が多くなる。また、制御するpHが高いほど炭酸イオンや重炭酸イオンの溶け込む濃度が高くなるため、pHを設定値に調整するために添加されるアンモニアの濃度やより高くなる。
解離していないアンモニアは細胞内に容易に浸透し、菌体に害を与える。pHが高いほどアンモニアの解離度が低くなることから、総アンモニア濃度が同じであっても、pHが高いほど菌が受ける生育阻害はより大きい。したがって、pH8.9以下では総アンモニア濃度を低濃度に、例えば100mM以下に制御すれば、菌の生育やＬ−リジン蓄積の悪化は少ないと判断した。
次に、培地中の総アンモニア濃度を100mM以下に制御して、pH7.8, pH8.2, pH8.9の各pH条件においてＬ−リジン生産培養を行った。
前記菌株を3mlのCM-Dex液体培地に植菌し、31.5℃で一晩振盪培養した。その培養液200μlをCM-Dex寒天培地に均一に塗布し、31.5℃で一晩静置培養した。Ａ培地（硫酸アンモニウム無添加）300mlをジャーファーメンターに入れ、同培地にアンモニアガスを吹き込んで、pH7.5、pH7.8、pH8.2又はpH8.9の各pH条件に調整した。この培地に、上記の寒天培地に生育したＬ−リジン生産菌を１枚のプレートの1/3に相当する分を植菌して培養を行った。培養中、フィルターによって除菌した空気を１分間に300ml通気し、攪拌速度は700rpmに、培養液の温度は31.5℃に保った。培養中のpHは、アンモニアの代わりに６規定の濃度の水酸化カリウムを用いて各設定値に保った。
培養液中の総アンモニア濃度は、培養液を経時的にサンプリングして、アンモニア電極とイオン計（Orion社製）を用いて測定し、必要に応じて10%アンモニア水溶液を添加して、0から100mMの間になるように制御した。また、培養液中の溶存酸素濃度を観察することによって、アンモニアが枯渇した時に溶存酸素濃度が急激に上昇することを検知し、その際、10%アンモニア水溶液を添加することで、培養液中のアンモニアが継続して枯渇しないようにした。結果を図２に示す。
その結果、pH7.8からpH8.9までの間のどのpH条件でも、良好な生育及びＬ−リジン生産がみられた。また、従来の一般的な培養方法でｐH7.0で発酵を行った場合に比べて、生産速度では115%以上の成績が得られた。
〔実施例３〕Ｌ−リジンの生産
本実施例では、総アンモニア濃度のみを制御し、pHの制御は行わずに、Ｌ−リジン発酵を行った。総アンモニア濃度を制御する範囲は、実施例２の結果より１００ｍM以下の範囲を選択した。
前記Ｌ−リジン生産菌を3mlのCM-Dex液体培地に植菌し、31.5℃で一晩振盪培養した。その培養液200μlをCM-Dex寒天培地に均一に塗布し、31.5℃で一晩静置培養した。Ａ培地（硫酸アンモニウム無添加）300mlをジャーファーメンターに入れ、同培地にアンモニアガスを吹き込んで、総アンモニア濃度を23.8mMに調整した。この培地に、上記の寒天培地に生育したＬ−リジン生産菌を１枚のプレートの1/3に相当する分を植菌して培養を行った。培養中、フィルターによって除菌した空気を１分間に300ml通気し、攪拌速度は700rpmに、培養液の温度は31.5℃に保った。培養液を経時的にサンプリングして総アンモニア濃度を測定し、0から100mMの間になるように、必要に応じて10%アンモニア水を適量培地に添加した。その結果、15.9g/Lのリジンを蓄積し、Ｌ−リジン発酵が成立した（図３）。
〔実施例４〕エシェリヒア・コリＬ−リジン生産菌の構築
＜１＞リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
まずリジンデカルボキシラーゼ非産生株の構築を行った。リジンデカルボキシラーゼは、cadA遺伝子（Genbank Accession No. NP_418555. 配列番号15）、ldcC遺伝子（Genbank Accession No. NP_414728. 配列番号17）によってコードされている（国際公開WO96/17930号パンフレット参照）。ここで親株は、WC196株を用いた。
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA、ldcC遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI， Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る（特開2005-058227）。
（１）cadA遺伝子の破壊
PCRの鋳型としてPCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attＬ−Cm-attR（特開2005-058827）を使用した。pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attＬ−cat-attRの順で挿入されている
このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、目的遺伝子であるcadA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に有する配列番号１１及び１２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、 第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196株の染色体に組み込むために必要である。
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ−アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＣｍ（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むＬ−寒天培地上で平板培養し、Ｃｍ耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をWC196ΔcadA::att-cat株と名づけた。
次に、cadA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-ts（特開2005-058827）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである
上記で得られたWC196ΔcadA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、３０℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているcadA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAと名づけた。
（2）WC196ΔcadA 株のldcC遺伝子の欠失
WC196ΔcadA 株におけるldcC遺伝子の欠失は、上記手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号１３、１４のプライマーを使用して行った。これによって、cadA ldcC破壊株であるWC196ΔcadAΔldcCを得た。
＜２＞ WC196ΔcadAΔldcC株のlys生産用プラスミド導入
WC196ΔcadAΔldcC株をdapA、dapB及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2株（WC196LC/pCABD2）を得た。
〔実施例５〕エシェリヒア・コリを用いたL-リジン生産
本実施例ではエシェリヒア・コリによるL-リジンの生産に応用した例を示す。本実施例では、一般的に、L-リジンを発酵生産する場合に、窒素とL-リジンに対する対イオンの供給のために培地に添加される硫酸アンモニウム（硫安）や塩化アンモニウム（塩安）を添加せずにL-リジンを発酵生産した。具体的には、pHの制御は行わず、培地中のアンモニア濃度を制御して培養を行った。事前に培地中のアンモニア濃度の制御範囲を検討した結果、総アンモニア濃度として50mMから100mMの範囲が好ましいことが確認された。よって実際の本培養では総アンモニア濃度として100mMを超えないようにアンモニアガスを吹き込むことにより制御した。また、総アンモニア濃度が50mMまで低下した後は、その濃度を維持するようにアンモニアガスにより制御した。
L-リジン生産株としては、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2を用い、培養には、表３に示したE. coli用L-リジン生産培地300mlを入れたジャーファーメンターにアンモニアガスを吹き込み、総アンモニア濃度を95mMに調整したものを用いた。この培地に、ストレプトマイシンを20μg/L含むLB寒天培地全面にL-リジン生産株を塗布し、37℃で24時間培養した菌を植菌した。植菌量は寒天培地３枚分に生育した菌量である。培養は温度を37℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に50mL通気し、攪拌速度は700rpmにして行った。尚、通気量は培養液中の溶存酸素濃度が飽和の２０％に低下した時点で、1分間に100mLに変更した。培地中のグルコースが枯渇しないように、また30g/L以上にはならないように表４に示したE. coli用Feed液を適宜培地に滴下した。最終的には36gのグルコースを消費した時点で培養を停止した。その結果、培養は順調に行われ、３３時間後に添加したグルコースは全て消費され、L-リジンが13.4g蓄積し、L-リジンの生産速度は1.2g/L/hrであった。この際の収率は、37%であった。
対照として、一般的な塩基性アミノ酸の製造方法と同様に、硫安を添加し、総アンモニア濃度は制御せず、pHの制御を行って同じ生産株を用いてL-リジンの生産を行った場合の結果を示す。表３に示したE. coli用L-リジン生産培地に硫酸アンモニウムを1リットルあたり13g添加した培地を用い同じ菌を同様に植菌してアンモニアガスを適宜吹き込むことでpH6.7で一定に制御して培養した。培養温度、通気量の設定、及び攪拌速度は上記と同様に行った。この場合には、表４に示したE. coli用Feed液に代えて、硫安を1リットルあたり112.5g加えたE. coli用Feed液（硫安を含む。表４）を添加して、培地中のグルコースが枯渇しないように、また30g/L以上にはならないように調節しながら最終的には36gのグルコースを消費させた。その結果、33時間後に添加した全てのグルコースを消費し、L-リジンが14.7g蓄積し、L-リジンの生産速度は1.3g/L/hrであった。その際の収率は、４０％であった。
尚、ここで示したリジンの濃度は、どれもリジン塩酸塩に換算した濃度である。また、上記の培養における総アンモニア濃度及びｐＨの経時的変化を図４に示す。これらの結果の比較から、本特許に示した方法を用いれば、L-リジンの発酵生産において、硫安や塩安を添加しなくても、硫安を添加した一般的な発酵生産に比べて、約92%の生産速度で、約93%の収率にて、かつ、約91%のL-リジンの生産量を得ることが可能であると確認された。
Figure 0004844396
Figure 0004844396
Figure 0004844396
〔実施例６〕L-アルギニンの生産
本実施例ではコリネ型細菌によるL-アルギニンの生産に応用した例を示す。L-アルギニン生産株としては、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12092(FERM BP-6906)を使用した。
先ず対照として、一般的な塩基性アミノ酸の製造方法と同様に、硫安を添加し、総アンモニア濃度は制御せず、pHの制御を行って同じ生産株を用いてL-アルギニンの生産を行った場合の結果を示す。表６のL-アルギニン生産培地組成に、硫安を65g/L追加し、さらにグルコース濃度を40g/Lに変更した組成の培地300mlを入れたジャーファーメンターにアンモニアガスを吹き込み、pHを7.0に調整した。コリネバクテリウム・グルタミクムAJ12092株をCM-Dex寒天培地全面に塗布し、31.5℃で24時間培養した後、ジャーファーメンターに寒天培地2枚分に生育した菌量を植菌した。培養は温度を31.5℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に150mL通気し、攪拌速度は700rpmにして行った。また培養のpHは別に殺菌した6NのKOH溶液を添加し6.9に制御した。培養の進行とともに、低下する培地中のグルコース濃度を30〜40g/Lに保つように、別に殺菌した692g/Lのグルコース溶液を適宜添加した。培養は54時間行った。その結果、L-アルギニンが23.4g/L蓄積し、L-アルギニンの生成収率は消費したグルコースの26.7%であり、生産速度は0.43g/L/hrであった。なおこの間に消費されたグルコース量はバッチ当たり29.1gであった。
次に硫安を添加せず、総アンモニア濃度のみを制御し、pHの制御を行わないL-アルギニンの生産の結果を示す。表６に示した硫酸アンモニウムを含まないL-アルギニン生産培地300mlを入れたジャーファーメンターにアンモニアガスを吹き込み、総アンモニア濃度を12.6mMに調整した。この培地に、対照と同様にして培養したL-アルギニン生産菌を、寒天培地2枚分に生育した菌量で植菌した。培養は対照と同様に、温度を31.5℃に保ち、フィルターで除菌した空気を1分間に150mL通気し、攪拌速度は700rpmにして行った。培養液を経時的にサンプリングして総アンモニア濃度を測定するか、またはアンモニア濃度制御装置を用いて、培養液中の総アンモニアを種々の濃度で制御して培養を行った結果、培養液中の総アンモニア濃度は、約20mMとなるように必要に応じてアンモニアガスを添加し制御するのが良好な結果を与えることを確認した。以上より、培養液中の総アンモニア濃度を約20mMに制御した培養は、順調に進行し、51時間後にL-アルギニンが24.2g/L蓄積し、L-アルギニン発酵が成立した(図４)。なおこの間に消費されたグルコースはバッチ当たり35.1gであり、L-アルギニンの生成収率は消費したグルコースの20.6%でり、生産速度は0.47g/L/hrであった。また培養液のpHは培養開始時の7.92より、培養終了時には8.02まで上昇した。
この結果は対照の実験と比較し、L-アルギニンの発酵生産において、硫安や塩安を添加しなくても、硫安を添加した一般的な発酵生産に比べて、約77%の収率で、また生産速度は約9%高く生産可能であることが示された。
Figure 0004844396
〔配列表の説明〕
配列番号１：lysC遺伝子クローニング用のプライマー配列
配列番号２：lysC遺伝子クローニング用のプライマー配列
配列番号３：lysE遺伝子クローニング用のプライマー配列
配列番号４：lysE遺伝子クローニング用のプライマー配列
配列番号５：lycC*遺伝子の塩基配列と阻害解除型アスパルトキナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号６：阻害解除型アスパルトキナーゼのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号７：lycC*遺伝子の塩基配列と阻害解除型アスパルトキナーゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号８：阻害解除型アスパルトキナーゼのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号９：lysE遺伝子の塩基配列及びLysEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：LysEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：cadA遺伝子破壊用プライマー
配列番号１２：cadA遺伝子破壊用プライマー
配列番号１３：ldc遺伝子破壊用プライマー
配列番号１４：ldc遺伝子破壊用プライマー
配列番号１５：cadA遺伝子の塩基配列及びリジンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号１６：リジンデカルボキシラーゼ（cadA）のアミノ酸配列
配列番号１７：ldc遺伝子の遺伝子配列及びリジンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号１８：リジンデカルボキシラーゼ（ldc）のアミノ酸配列
本発明によれば、従来の一般的な培養法において得られる生産性など本来の性能を大きく損なうことなく、硫酸アンモニウムなどの工業原料の使用量を低減できるような高ｐＨにおいても、塩基性物質を発酵法で製造することができる。
本発明の方法により得られた発酵液は、炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンを含むが、これらは加熱により容易に大気中に放出されるため、固形成分中の塩基性物質含量が高い発酵液又は発酵生産物を得ることができる。また、精製を必要とする場合、従来の製造方法では通常行われているイオン交換を行わなくとも、発酵液に炭酸より強い酸を加えれば、容易に炭酸と置換できる。更に、発酵液を濃縮することにより直接リジン塩酸塩の結晶を得ることが出来る。
一般的な培地及び培養法でのＬ−リジン生産培養の結果を示す図。 アンモニウム濃度を制限した培地でのＬ−リジン生産培養の結果を示す図。 総アンモニア濃度のみを制御し、ｐＨの制御は行わない場合のＬ−リジン生産培養の結果を示す図。 一般的な培地、並びに硫安及び塩安無添加の培地における総アンモニア濃度とｐＨの経時的変化を示す図。 アンモニウム濃度を制限した培地でのＬ−アルギニン発酵における生育、総アンモニア濃度、ｐＨ、残糖の経時変化を示す図。 アンモニウム濃度を制限した培地でのＬ−アルギニン生産培養の結果を示す図。

Claims (18)

  1. 塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を液体培地を含む発酵槽中で培養し、同培地中に前記塩基性アミノ酸を生成、蓄積させる、発酵法による塩基性アミノ酸の製造法において、全培養工程の内少なくとも一部の期間、培地中の総アンモニア濃度を一定の濃度範囲に調整することにより、前記塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することを特徴とし、
    前記微生物がコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌であり、
    前記総アンモニア濃度の一定範囲が、以下の方法によって予め決定される方法：
    （Ａ’）目的の塩基性アミノ酸のカウンタイオン源として、pH7.2以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地で、アンモニアガス、アンモニア水及び尿素の少なくともいずれかを添加することで培地のpHをpH6.5からpH7.2の範囲に保って培養し、塩基性アミノ酸の生産性を測定し、
    （Ｂ’）前記手順１（Ａ’）で用いた培地成分から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ削減した培地を用いて培養を行い、目的の塩基性アミノ酸の蓄積に伴い、カウンタイオンである硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが不足することにより培地のpHを７．２以下に保つことが不可能な期間に総アンモニア濃度を変化させて培養を行い、（Ａ’）で測定された生産性の５０％以上の生産性が得られる総アンモニア濃度の範囲を決定する。
  2. 塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を液体培地を含む発酵槽中で培養し、同培地中に前記塩基性アミノ酸を生成、蓄積させる、発酵法による塩基性アミノ酸の製造法において、全培養工程の内少なくとも一部の期間、培地中の総アンモニア濃度を一定の濃度範囲に調整することにより、前記塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することを特徴とし、
    前記微生物がコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌であり、
    前記総アンモニア濃度の一定範囲が、次の条件を満たす範囲である方法。
    （Ａ）培地中のアンモニウムイオン濃度が、培地中に溶存する重炭酸イオン及び／または炭酸イオン、並びに他のアニオンのイオン当量の合計が、培地中に蓄積した前記塩基性アミノ酸のうちイオン化しているもののイオン当量よりも大きくなるような濃度であること、及び
    （Ｂ）培地中の総アンモニア濃度が、予め以下の方法により決定された、前記微生物の塩基性アミノ酸の生産を阻害しない濃度であること：
    前記微生物を、培地のｐＨ及び総アンモニア濃度を変えて培養して、塩基性アミノ酸の生産性を測定し、目的の塩基性アミノ酸のカウンタイオン源として、pH7.2以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地で、アンモニアガス、アンモニア水及び尿素の少なくともいずれかを添加することで培地のpHをpH6.5からpH7.2の範囲に保って培養した場合の塩基性アミノ酸の生産性の５０％以上の生産性をそれぞれのpHで示す総アンモニア濃度を決定する。
  3. 塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を液体培地を含む発酵槽中で培養し、同培地中に前記塩基性アミノ酸を生成、蓄積させる、発酵法による塩基性アミノ酸の製造法において、全培養工程の内少なくとも一部の期間、培地中の総アンモニア濃度を２００ｍＭ以下に調整することにより、前記塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして使用する硫酸イオン、及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することを特徴とし、
    前記微生物がコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌であり、
    前記少なくとも一部の期間が、目的の塩基性アミノ酸の蓄積に対してカウンタイオンが不足することにより、培地のpHが上昇する期間、及び培地にカチオンを添加することでpHが上昇する期間の少なくともいずれかを含む、方法。
  4. 前記少なくとも一部の期間、前記総アンモニア濃度を１００ｍＭ以下に調整する、請求項３に記載の方法。
  5. 糖、アルコール、及び炭化水素からなる群より選択される化合物を炭素源として用いることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記少なくとも一部の期間が、目的の塩基性アミノ酸の蓄積に対してカウンタイオンが不足することにより、培地のpHが上昇する期間、及び培地にカチオンを添加することでpHが上昇する期間の少なくともいずれかを含む請求項１または２に記載の方法。
  7. 前記培地中の総アンモニア濃度の調整を、培地中の溶存酸素濃度、培地中の炭素源の消費速度、培地の濁度、前記塩基性アミノ酸の生産性、及び培地のｐＨ変化を指標とする前記微生物の活動が低下又は停止したときに培地にアンモニア又は尿素を添加することにより行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記培地として、前記塩基性アミノ酸のカウンタイオン源としてｐＨ７．２以下で培養するのに充分な量の硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを含む培地の組成から、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを所望する量だけ減らした培地を用い、かつ、
    前記少なくとも一部の期間が、前記培地に蓄積する前記塩基性アミノ酸に対してカウンタイオンが不足することによりｐＨを７．２以下に保つことが不可能な期間であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記他のアニオンが、硫酸イオン、塩化物イオン、リン酸イオン及びイオン化した有機酸から選ばれる請求項２、６〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記他のアニオンの合計が９００meq/l以下であることを特徴とする、請求項２、５〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記微生物を増殖させる工程を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記微生物を増殖させる工程においては、前記総アンモニア濃度の調整を行わないこと
    を特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. 前記塩基性アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンから選ばれる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 塩基性アミノ酸がＬ−リジンである請求項１３に記載の方法。
  15. 塩基性アミノ酸がＬ−アルギニンである請求項１３に記載の方法。
  16. 発酵後に培地又はその処理物を加熱して、重炭酸イオン及び炭酸イオンを除去することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムまたはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
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