JP2000050894A

JP2000050894A - 発酵生産物の製造法及びストレス耐性微生物

Info

Publication number: JP2000050894A
Application number: JP10227436A
Authority: JP
Inventors: Takasane Kikuchi; 慶実菊池; Osamu Kurahashi; 修倉橋; Kenzo Yokozeki; 健三横関; Takashi Tanaka; 崇田中
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2000-02-22
Also published as: EP0979876A3; US6579699B1; BR9903603A; CN1250102A; EP0979876A2; CN1230551C

Abstract

(57)【要約】【課題】アミノ酸等の有用物質の発酵生産において、
微生物の生育及び／又は発酵生産物の生産を抑制するス
トレスの影響を減少させ、生産性や収率を改善する。【解決手段】微生物を培地中に培養し、その培地中に
発酵生産物を生成蓄積させ、該発酵生産物を採取する、
微生物を利用したアミノ酸等の有用物質の発酵生産にお
いて、超好熱始原菌KOD-1株由来のヒートショックタン
パク質をコードする遺伝子が導入されることにより細胞
細胞内においてヒートショックタンパク質を発現した微
生物を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発酵生産物の製造
法に関し、詳しくは微生物を利用した発酵によるアミノ
酸等の有用物質の製造法ならびに微生物の生育及び／又
は発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性が
付与された微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞を高温、高浸透圧、代謝阻害、重金
属の存在、ウイルス感染等のストレスにさらすと、ヒー
トショックタンパク質（以下、「ＨＳＰ」という）と呼
ばれる一群のタンパク質が短時間に誘導合成され、スト
レスに対する防御反応が起こる。このＨＳＰは、原核細
胞から真核細胞まで広く相同性があり、大きくいくつか
のグループ（ＨＳＰ６０群、ＨＳＰ７０群、ＨＳＰ９０
群、ＴＲｉＣ群、その他の群）に分けられている（Hend
rick, J. P. and Hartl, F. -V. Annu. Rev. Biochem.,
62, 349-384(1993)）。

【０００３】ＨＳＰによるストレス耐性のメカニズム
は、ＨＳＰが持つタンパク質の高次構造の形成（タンパ
ク質の折り畳み(folding)）機能による。すなわち、ス
トレスにより変性し、正しい高次構造がとれなくなった
タンパク質にＨＳＰが結合し、正しい高次構造に折り畳
み直す(refolding)ことにより、そのタンパク質の機能
を正常に戻すことができる。

【０００４】このようなタンパク質の高次構造形成にお
けるＨＳＰの機能は、変性タンパク質に対してだけでは
なく、正常な状態の細胞においても、タンパク質の折り
畳み、会合(assembly)、及び膜透過(transport)等の過
程に分子シャペロンとして働くことが明らかとなりその
重要性が認識され、注目を集めている（Ellis, R. J.et
al., Science, 250, 954-959(1990)）。シャペロン（c
haperon）とは、介添え役を意味し、ＨＳＰが種々のタ
ンパク質に結合してその機能を発揮することから名付け
られた。

【０００５】ＨＳＰは、上記のようなストレスに細胞が
さらされると発現が誘導される。通常、この誘導は一時
的であり、まもなく減衰し、新たな定常状態に達する。
このＨＳＰの誘導は、転写レベルで行われることが明ら
かにされている（Cowing, D.C. et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 80, 2679-2683(1985), Zhou, Y. N.et
al., J. Bacteriol., 170, 3640-3649(1988)）。一群の
ＨＳＰ遺伝子は、ヒートショックプロモーターと呼ばれ
るプロモーター構造を持ち、このヒートショックプロモ
ーターに特有に機能するσ（シグマ）因子であるシグマ
−３２（σ³²）が存在することが知られている。σ³²は
ｒｐｏＨ遺伝子によってコードされる半減期が約１分と
非常に短いタンパク質であり、ＨＳＰの一時的な誘導と
密接な関係があることが知られている（Straus, D. B.
et al., Nature, 329, 348-351(1987)）。σ³²自身の発
現調節は転写レベル及び翻訳レベルで行われることが明
らかにされているが、主たる調節は翻訳レベルで行われ
ている。

【０００６】ヒートショックによるＨＳＰの誘導は、σ
³²の合成量の増加と安定化の２つの機構によるものであ
る。これらのうち、σ³²の合成量の増加については、σ
³²のｍＲＮＡの構造が熱により変化し、翻訳が促進され
ることが既に明らかになっており（Yura, T. et al., A
nnu. Rev. Microbiol., 47, 321-350(1993)）、σ³²の
安定化については、ＨＳＰ（ＤｎａＫ等）がσ³²の分解
に関与することが示されており、ＨＳＰによるフィード
バック制御が働いていると考えられている（Tilly, K.
et al., Cell, 34, 641-646(1983), Liberek, K., Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA, 89, 3516-3520(1994)）。

【０００７】エシェリヒア・コリ（E. coli）では、ス
トレス存在下における上記のようなＨＳＰと細胞の生育
との関係（Meury, J. et al., FEMS Microbiol. Lett.,
113, 93-100(1993)）や、ヒト成長ホルモンの生産にｄ
ｎａＫが、プロコラゲナーゼの分泌にｇｒｏＥが影響す
ること（Hockney, R. C., Trends in Biotechnology,1
2, 456 (1994)）が知られている。

【０００８】ＷＯ９６／２６２８９号国際公開パンフレ
ットには、ＨＳＰをコードする遺伝子及びＨＳＰ遺伝子
に特有に機能するσ因子をコードする遺伝子の少なくと
も一方を微生物に導入し、細胞内におけるＨＳＰの発現
量を増強させることによって、微生物の生育及び／又は
発酵生産物の生産を抑制するストレスに対する耐性を微
生物に付与できることが記載されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アミノ酸等
の有用物質の発酵生産において、微生物の生育及び／又
は発酵生産物の生産を抑制するストレスの影響を減少さ
せ、発酵生産物の生産性や収率を一層改善することを課
題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、超好熱始原菌KO
D-1株由来のＨＳＰをコードする遺伝子を微生物に導入
し、前記ＨＳＰを発現させることによって、高ストレス
条件下で生産性や生育を一層改善させることができるこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。

【００１１】すなわち本発明は、微生物を培地中に培養
し、その培地中に発酵生産物を生成蓄積させ、該発酵生
産物を採取する、微生物を利用した発酵生産物の製造法
において、前記微生物が、超好熱始原菌KOD-1株由来の
ＨＳＰをコードする遺伝子が導入されることにより細胞
内において前記ＨＳＰを発現したものであることを特徴
とする方法を提供する。

【００１２】本発明はまた、発酵生産物を産生する微生
物であって、超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコー
ドする遺伝子が導入されることにより細胞内において前
記ＨＳＰを発現した微生物である。

【００１３】上記の本発明の方法及び本発明の微生物に
おいて、発酵生産物としてはアミノ酸（例えばＬ−スレ
オニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラ
ニン）、核酸またはヌクレオシド（例えばグアニル酸、
イノシン、イノシン酸）、ビタミン類、抗生物質等が挙
げられ、好ましくは、アミノ酸である。

【００１４】本発明が適用される微生物としては、エシ
ェリヒア属細菌またはコリネホルム細菌が挙げられる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明が適用される発酵生産物としては、微生物を
用いた発酵生産により製造されるものであれば特に制限
されないが、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−
バリン、Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ
酸、グアニル酸、イノシン、イノシン酸等の核酸類また
はヌクレオシド、ビタミン類、抗生物質など、微生物に
より生産されるものが挙げられる。また、現在微生物を
利用して生産されていない物質であっても、遺伝子組換
え等により生産されるようになった物質についても本発
明は適用され得る。上記の物質の中では、特にアミノ酸
のように、培地中に分泌され、培地の浸透圧を高めるも
のについて、本発明の方法は好適に適用され得る。

【００１６】超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコー
ドする遺伝子を導入して細胞内において前記ＨＳＰを発
現させるのに使用する微生物としては、発酵により発酵
生産物を産生するものであれば特に制限されず、エシェ
リヒア属細菌、コリネホルム細菌、バチルス属細菌、セ
ラチア属細菌等、従来発酵生産に用いられてきたものが
挙げられる。好ましくは、その微生物において、プラス
ミドの複製開始起点を含むＤＮＡ断片が取得されてい
て、上記ＨＳＰ遺伝子が機能し、これらの遺伝子のコピ
ー数を上昇させることが可能な微生物である。尚、上記
のコリネホルム細菌とは、バージーズ・マニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargey's
Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁
（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気
性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌
であり、コリネバクテリウム属細菌、及び従来ブレビバ
クテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウ
ム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、
さらにコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビ
バクテリウム属細菌を含む。

【００１７】上記微生物は、具体的には、例えば、発酵
生産物がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリVK
PM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号参照）、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318
（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）等であ
り、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11442
（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,170
号参照）、エシェリヒア・コリW3110(tyrA)（同株はエ
シェリヒア・コリW3110(tyrA)/pHATerm（FERM BP-365
3）からプラスミドpHATermを脱落させることにより得ら
れる。WO 95/16042国際公開パンフレット参照）、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12435（FERM
BP-2294)（米国特許第5,304,476号参照）、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)
(米国特許第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−グルタミ
ン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-38
53)(フランス特許出願公開第2,680,178号参照）、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821（FERM
BP-4172)（特開平5-26811号、フランス特許出願公開第
2,701,489号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,0
67号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ13029（FERM BP-5189)(JP 95/01586号国際公開パン
フレット参照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェ
リヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397
号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ3718（FERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照）
等であり、Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コ
リKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号
参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM
BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−
バリンの場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-44
11）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-17
63)(米国特許第5,188,948号参照）等であり、Ｌ−フェ
ニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ12604
（FERM BP-3579)(特開平5-236947号、欧州特許出願公開
第488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出願公
開第 2,686,898号参照）等である。

【００１８】本発明の微生物は、上記のような微生物で
あって、超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコードす
る遺伝子が導入されることにより細胞内において前記Ｈ
ＳＰが発現した微生物である。このＨＳＰの発現によ
り、微生物の生育及び／又は前記発酵生産物の生産を抑
制するストレスに対する耐性が微生物に付与される。

【００１９】超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコー
ドする遺伝子は、このＨＳＰの発現量が増強される形態
で導入することが好ましい。具体的にはこのＨＳＰ遺伝
子を微生物細胞内に導入する際、微生物細胞内で自律複
製可能なベクター、特にマルチコピー型のプラスミドを
ベクターとして用いると、ＨＳＰ遺伝子の細胞内コピー
数を高めることができる。また、発現効率のよいプロモ
ーターを用いてＨＳＰ遺伝子当たりの発現量を高めるこ
とによってもＨＳＰの発現を効率的に増強することがで
きる。

【００２０】超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコー
ドする遺伝子は、特開平９−１７３０７８号公報に記載
された方法によって取得することができる。具体的に
は、超好熱始原菌KOD-1株（Appl. Environ. Microbio
l., 60(12), 4559-4566(1994)）から調製された染色体
ＤＮＡを鋳型として用い、そして、特開平９−１７３０
７８号公報などに記載された、超好熱始原菌KOD-1株由
来のＨＳＰをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて作
成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
ＰＣＲを行う方法が挙げられる。上記のプライマー用の
オリゴヌクレオチドとしては、特開平９−１７３０７８
号公報に記載された配列番号８及び９に示される塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００２１】また、超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰ
をコードする遺伝子は、この遺伝子を含むＤＮＡ断片を
組み込んだプラスミドとして得ることもできる。このよ
うなプラスミドとしては、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａｃ
ｐｋＢがあり、このプラスミドｐＴｒｃ９９ＡｃｐｋＢ
を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９は、エシェリ
ヒア・コリＡＪ１３４７８と命名され、１９９８年７月
８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目１
番３号）に、ＦＥＲＭＰ−１６８８７の受託番号で寄
託されている。

【００２２】上記のようにして得られた遺伝子をエシェ
リヒア属細菌に導入するには、例えば、上記遺伝子を含
むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌細胞内において自律
複製可能なベクターＤＮＡに接続し、得られた組換えベ
クターでエシェリヒア属細菌を形質転換すればよい。ま
た、上記遺伝子を、エシェリヒア属細菌以外の微生物に
導入するには、その微生物細胞内において自律複製可能
なベクターＤＮＡに上記遺伝子を含むＤＮＡ断片を接続
し、得られた組換えベクターで前記微生物を形質転換す
ればよい。

【００２３】本発明において用いることのできるベクタ
ーＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好まし
く、遺伝子が導入される微生物がエシェリヒア属細菌の
場合には、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHS
G399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージＤＮＡ
のベクターも利用できる。ＨＳＰの発現を効率的に達成
するために、ＨＳＰ遺伝子固有のプロモーターに代えて
ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーター
を用いてもよい。尚、ＨＳＰ遺伝子を微生物に導入する
には、これらの遺伝子を含むＤＮＡをトランスポゾン
（Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 41
7(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）
または相同性組換え（Experiments in Molecular Genet
ics, ColdSpring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で
前記微生物の染色体に組み込んでもよい。また、遺伝子
が導入される微生物がコリネホルム細菌の場合には、コ
リネホルム細菌で自律複製可能なプラスミドベクター、
例えばｐＡＭ３３０（特公平１−１１２８０号公報参
照）や、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公
報参照）等が挙げられる。

【００２４】形質転換は、通常の微生物の形質転換体の
作製と特に変わるところはなく、例えばエシェリヒア属
細菌の場合には、D. M. Morrisonの方法（Methods in E
nzymology, 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ma
ndel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）等により行うことができる。また、コリネホルム細
菌の形質転換は、上記のMandelらの方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様に細胞がＤＮ
Ａを取り込み得る様に増殖段階（いわゆるコンピテント
セル）に導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A.
and Young, F. E., Gene, 1, 153(1977)）により行う
ことができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線
菌類及び酵母について知られている様に（Chang, S. an
d Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111(197
9); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., N
ature, 274, 398(1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. an
d Fink, G. R., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 75, 1929
(1978)）、ＤＮＡ受容菌を組換えＤＮＡを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフェロプラストにして組換え
ＤＮＡを導入することも可能である。さらに、電気パル
ス法（杉本ら,特開平2-207791号公報）によっても、組
換えＤＮＡをブレビバクテリウム属またはコリネバクテ
リウム属細菌に導入することができる。

【００２５】通常の微生物は、培養温度の上昇、発酵生
産物や高濃度の培地成分による高浸透圧、あるいは目的
とする発酵生産物の産生に伴う代謝異常等によるストレ
スを受けると、生育が抑制されたり発酵生産物の生産性
や収率が低下したりするが、超好熱始原菌KOD-1株由来
のＨＳＰを発現させることによって、これらのストレス
に対する優れた耐性を付与することができる。その結
果、前記のようなストレスを微生物が受ける環境下で、
発酵生産物の生産性を一層向上させることができる。従
って、超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコードする
遺伝子が導入されて細胞内において前記ＨＳＰを発現し
た微生物における前記ＨＳＰの発現は、前記ＨＳＰの直
接的な検出による他、上記のようなストレス耐性の評価
によっても確認することも可能である。

【００２６】尚、ストレスに対する耐性とは、完全な耐
性を意味するものではなく、ストレスから受ける影響を
減少させる性質も含む。また、導入する遺伝子の種類や
宿主微生物の種類によっては、生育の抑制と発酵生産物
の生産性や収率の低下の両方が解消されるものとは限ら
ず、生育は抑制されるが発酵生産物の収率が向上する場
合がある。本発明の方法により耐性を付与することがで
きるストレスとしては、微生物の生育に好ましくない温
度（例えば高温）、培地の浸透圧（例えば高浸透圧）、
培地中の高濃度のアミノ酸等が挙げられる。

【００２７】本発明の方法に用いる発酵生産用の培地
は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた
周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素
源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有
する通常の培地である。本発明を実施するための特別な
培地は必要とされない。

【００２８】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類等を用いることができる。

【００２９】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００３０】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ₁、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

【００３１】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施し、培
養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御
する条件が挙げられる。尚、ｐＨ調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。

【００３２】培養終了後の培地液からの代謝産物の採取
は、本発明において特別な方法が必要とされることはな
い。すなわち、本発明における代謝産物の採取は従来よ
り周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の
方法を組み合わせることにより実施できる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３４】

【実施例１】超好熱始原菌KOD-1株由来のＨＳＰをコ
ードする遺伝子（ｃｐｋＢ遺伝子）を導入したＬ−リジ
ン生産性エシェリヒア・コリによるＬ−リジン生産Ｌ−リジン生産の宿主には、エシェリヒア・コリＷ３１
１０（ｔｙｒＡ）株を用いた。Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）
株については、欧州特許出願公開第４８８４２４号公報
に詳しい記載があるが、その調製方法について簡単にふ
れると以下の通りである。国立遺伝学研究所（静岡県三
島市）よりE. coli Ｗ３１１０株を入手した。同株をス
トレプトマイシン含有のＬＢプレートにまき、コロニー
を形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を取
得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、E. col
i K-12 ME8424株を混合して、完全培地（L-Broth：1％
Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で
３７℃の条件下、１５分間静置培養して接合を誘導し
た。E. coli K-12 ME8424株は、（HfrPO45,thi, relA1,
tyrA::Tn10, ung-1, nadB）の遺伝形質を有し、国立遺
伝学研究所より入手できる。その後、培養物を、ストレ
プトマイシン、テトラサイクリン及びＬ−チロシンを含
有する完全培地（L-Broth：1％ Bacto trypton, 0.5％
Yeast extract,0.5％ NaCl, 1.5％ agar）にまき、コロ
ニーを形成する株を選択した。この株を、E. coli Ｗ３
１１０（ｔｙｒＡ）株と命名した。

【００３５】欧州特許出願公開第４８８４２４号公報に
は、この菌株にプラスミドを導入して形成される株が多
く記載されている。たとえば、プラスミドｐＨＡＴｅｒ
ｍを導入して得られる株は、エシェリヒア・コリＷ３１
１０（ｔｙｒＡ）／ｐＨＡＴｅｒｍと命名され、１９９
１年１１月１６日に通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市
東一丁目１番３号）に、ブダペスト条約に基づき国際寄
託されており、ＦＥＲＭＢＰ−３６５３の受託番号が
付与されている。この菌株からプラスミドｐＨＡＴｅｒ
ｍを常法により脱落させることによってエシェリヒア・
コリＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を取得することができ
る。

【００３６】このエシェリヒア・コリＷ３１１０（ｔｙ
ｒＡ）株に、ＷＯ９５／１６０４２号国際公開パンフレ
ットに記載の、リジン生合成遺伝子を持つプラスミドｐ
ＣＡＢＤ２を導入した。プラスミドが導入された形質転
換体は、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬ
プレート培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
ＮａＣｌ５ｇ、寒天１５ｇを純粋１Ｌ中に含む。ｐＨ
７．２）にて選択した。

【００３７】一方、ｃｐｋＢ導入用のプラスミドは次の
ように構築した。特開平９−１７３０７８号公報の実施
例５に記載の方法に従ってｃｐｋＢ遺伝子を含むＰＣＲ
断片を得、このＰＣＲ断片をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで
消化して切り出される断片をベクタープラスミドｐＴｒ
ｃ９９Ａ（ファルマシア社製）のＮｃｏＩ部位とＢａｍ
ＨＩ部位との間にクローニングし、プラスミドｐＴｒｃ
９９ＡｃｐｋＢを得た。プラスミドｐＴｒｃ９９Ａｃｐ
ｋＢを保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９は、エシ
ェリヒア・コリＡＪ１３４７８と命名され、１９９８年
７月８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目
１番３号）に、ＦＥＲＭＰ−１６８８７の受託番号で
寄託されている。さらに、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａｃ
ｐｋＢをＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで消化することによ
り切り出される、ｔｒｃプロモーターの付加されたｃｐ
ｋＢ遺伝子断片をｐＭＷ２１８（和光純薬工業（株）
製）のＳｍａＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニ
ングし、プラスミドｐＭＷｃｐｋＢを得た。このプラス
ミドの構築の概要を図１に示す。このｐＭＷｃｐｋＢを
上記の方法によりエシェリヒア・コリＷ３１１０（ｔｙ
ｒＡ）／ｐＣＡＢＤ２株へ導入した。プラスミドが導入
された形質転換体は５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシ
ン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬプレート
培地にて選択した。

【００３８】また、ｒｐｏＨ遺伝子導入用のプラスミド
は次のように構築した。ＷＯ９６／２６２８９号国際公
開パンフレットの実施例１の＜１＞に記載された方法に
よりｒｐｏＨ遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、得られた
増幅産物の両端を市販のＤＮＡ末端平滑化キット（宝酒
造社製、Ｂｌｕｎｔｉｎｇｋｉｔ）を用いて平滑末端
化した後、ベクタープラスミドｐＭＷ１１９（和光純薬
社製）のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングし、プラスミ
ドｐＭＷｒｐｏＨを得た。このプラスミドは上記の方法
によりエシェリヒア・コリＷ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐ
ＣＡＢＤ２株へ導入した。プラスミドが導入された形質
転換体は５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬプレート培地にて選択
した。

【００３９】以上のようにして得られたエシェリヒア・
コリＷ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＣＡＢＤ２株、エシェ
リヒア・コリＷ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＣＡＢＤ２＋
ｐＭＷｒｐｏＨ株及びエシェリヒア・コリＷ３１１０
（ｔｙｒＡ）／ｐＣＡＢＤ２＋ｐＭＷｃｐｋＢ株のＬ−
リジン生産性を評価した。

【００４０】得られた形質転換体のＬ−リジン生産性の
評価は以下の様にして行った。Ｌプレート培地にて培養
して細胞のリフレッシュを行い、リフレッシュされた各
々の形質転換体を、グルコース４０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄１
ｇ、ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ０．０１ｇ、酵母エキス２ｇ、Ｌ−チロシン０．１
ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１ｇ、ＣａＣＯ₃２５ｇを純水
１Ｌ中に含む培地（ＫＯＨを用いてｐＨは７．０に調整
されている）中で３７℃で３０時間培養した。この時、
Ｌ−リジン塩酸塩を培養開始当初に４０ｇ／Ｌ添加した
ものについても培養を行った。Ｌ−リジンの定量を、旭
化成（株）製バイオテックアナライザーＡＳ２１０を使
用して行った。Ｌ−リジンの生産量（培養後の培地中の
Ｌ−リジン量から初添Ｌ−リジン量を引いたもの）は、
培地中の糖に対するＬ−リジン塩酸塩の収率（重量％）
として示した。その結果を表１に示す。

【００４１】

【表１】表１ ──────────────────────────────── Ｌ−リジン塩酸塩の対糖収率(%) ───────────────── 菌株初添Ｌ-リジン塩酸塩(g/L) ０４０ ──────────────────────────────── W3110(tyrA)/pCABD2 ３０．０２７．４ W3110(tyrA)/pCABD2＋pMWrpoH ３０．２２８．８ W3110(tyrA)/pCABD2＋pMWcpkB ３０．４２９．３ ──────────────────────────────── この結果から、ｃｐｋＢ遺伝子が導入されたエシェリヒ
ア・コリは、高濃度のＬ−リジン存在下でも、ｃｐｋＢ
遺伝子が導入されていない菌株及びｒｐｏＨ遺伝子が導
入された菌株よりＬ−リジンの生産性が向上しているこ
とが明らかである。

【００４２】また、同様に、培養開始当初にＮａＣｌを
２２ｇ／Ｌ添加した条件でのＬ−リジン生産性を評価し
た。その結果を表２に示す。

【００４３】

【表２】表２ ──────────────────────────────── Ｌ−リジン塩酸塩の対糖収率(%) ───────────────── 菌株初添ＮａＣｌ(g/L) ０２２ ──────────────────────────────── W3110(tyrA)/pCABD2 ３０．０２４．３ W3110(tyrA)/pCABD2＋pMWrpoH ３０．２２５．０ W3110(tyrA)/pCABD2＋pMWcpkB ３０．４２５．５ ──────────────────────────────── この結果から、ｃｐｋＢ遺伝子が導入されたエシェリヒ
ア・コリは、高濃度のＮａＣｌ存在下でも、ｃｐｋＢ遺
伝子が導入されていない菌株及びｒｐｏＨ遺伝子が導入
された菌株よりＬ−リジンの生産性が向上していること
が明らかである。従って、高浸透圧に対する耐性が優れ
ていることが分かる。

【００４４】次に、Ｌ−リジン生産培養時の温度の影響
を調べた。標準条件の３７℃、及び、４２℃での培養を
行った他は、上記と同様にＬ−リジン生産性を評価し
た。その結果を表３に示す。

【００４５】

【表３】表３ ──────────────────────────────── Ｌ−リジン塩酸塩の対糖収率(%) ───────────────── 菌株培養温度（℃）３７４２ ──────────────────────────────── W3110(tyrA)/pCABD2 ３０．０２６．３ W3110(tyrA)/pCABD2＋pMWrpoH ３０．２２７．７ W3110(tyrA)/pCABD2＋pMWcpkB ３０．４２７．９ ──────────────────────────────── この結果から、ｃｐｋＢ遺伝子が導入されたエシェリヒ
ア・コリは、高温培養時でも、ｃｐｋＢ遺伝子が導入さ
れていない菌株及びｒｐｏＨ遺伝子が導入された菌株よ
りＬ−リジンの生産性が向上していることが明らかであ
る。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、アミノ酸等の有用物質
の発酵生産において、一層、ストレスの影響を減少さ
せ、生産性や収率を改善することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpMWcpkBの構築を示す説明図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者横関健三神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社アミノサイエンス研究所内 (72)発明者田中崇神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA71 BA72 BA80 DA06 DA10 EA04 FA02 GA11 GA19 4B064 AE03 AE25 CA02 CA19 CC24 CD02 CD13 DA16 4B065 AA01Y AA22X AA24X AA26X AB01 AC02 AC08 AC14 AC20 BA02 BB12 BB20 CA17 CA41 CA43 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を培地中に培養し、その培地中に
発酵生産物を生成蓄積させ、該発酵生産物を採取する、
微生物を利用した発酵生産物の製造法において、前記微生物が、超好熱始原菌KOD-1株由来のヒートショ
ックタンパク質をコードする遺伝子が導入されることに
より細胞内において前記ヒートショックタンパク質を発
現したものであることを特徴とする方法。
【請求項２】前記発酵生産物がアミノ酸である請求項
１記載の方法。
【請求項３】前記微生物が、エシェリヒア属細菌また
はコリネホルム細菌である請求項１または２記載の方
法。
【請求項４】発酵生産物を産生する微生物であって、
超好熱始原菌KOD-1株由来のヒートショックタンパク質
をコードする遺伝子が導入されることにより細胞内にお
いて前記ヒートショックタンパク質を発現した微生物。
【請求項５】前記発酵生産物がアミノ酸である請求項
４記載の微生物。
【請求項６】エシェリヒア属細菌またはコリネホルム
細菌である請求項４または５記載の微生物。