JPH09173077A - 超耐熱性酸性α−アミラーゼおよび該α−アミラーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片 - Google Patents
超耐熱性酸性α−アミラーゼおよび該α−アミラーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片Info
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- JPH09173077A JPH09173077A JP8191138A JP19113896A JPH09173077A JP H09173077 A JPH09173077 A JP H09173077A JP 8191138 A JP8191138 A JP 8191138A JP 19113896 A JP19113896 A JP 19113896A JP H09173077 A JPH09173077 A JP H09173077A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 超耐熱性酸性α-アミラーゼを提供するこ
と。 【解決手段】 KOD-1株を培養してその培養液から超耐
熱性酸性α-アミラーゼを単離する。このα-アミラーゼ
産生遺伝子を含むDNA断片を取得して遺伝子組換え技術
を用いてα-アミラーゼを産生する。このα-アミラーゼ
は酸性条件下で優れたデンプン液化能をもち、工業的な
デンプン液化工程の改善に有用である。
と。 【解決手段】 KOD-1株を培養してその培養液から超耐
熱性酸性α-アミラーゼを単離する。このα-アミラーゼ
産生遺伝子を含むDNA断片を取得して遺伝子組換え技術
を用いてα-アミラーゼを産生する。このα-アミラーゼ
は酸性条件下で優れたデンプン液化能をもち、工業的な
デンプン液化工程の改善に有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はα-アミラーゼ、特
に超好熱菌由来の超耐熱性酸性α-アミラーゼおよびそ
の酵素をコードするα-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA
断片に関する。α-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA断片
を組込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターで
形質転換した宿主細胞を培養してα-アミラーゼ遺伝子
を発現させることにより、工業的に有利な条件で目的の
酵素を大量生産することが可能となる。さらに、部位特
異的変異導入法等により、酸性条件下や高温条件下で安
定性の増大した酵素を生産することも可能となる。
に超好熱菌由来の超耐熱性酸性α-アミラーゼおよびそ
の酵素をコードするα-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA
断片に関する。α-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA断片
を組込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターで
形質転換した宿主細胞を培養してα-アミラーゼ遺伝子
を発現させることにより、工業的に有利な条件で目的の
酵素を大量生産することが可能となる。さらに、部位特
異的変異導入法等により、酸性条件下や高温条件下で安
定性の増大した酵素を生産することも可能となる。
【０００２】
【従来の技術】1972年、Brockらによってイエロースト
ーンの温泉中より好熱好酸性細菌Sulfolobusが単離され
て以来、多数の超好熱菌が分離されている。超好熱菌
は、80℃以上に生育最適温度を有する微生物であるの
で、これらの菌が生産する酵素群が非常に耐熱性に優れ
ていることが期待されている。事実、超好熱菌の生産す
る酵素の熱失活温度が菌の生育可能上限温度より高い温
度である場合が多く、中には100℃以上の至適温度をも
つ酵素もある。このような超耐熱性酵素は、産業上の利
用面からも有用性が高く、その探索および研究開発が世
界中で広く進められている。
ーンの温泉中より好熱好酸性細菌Sulfolobusが単離され
て以来、多数の超好熱菌が分離されている。超好熱菌
は、80℃以上に生育最適温度を有する微生物であるの
で、これらの菌が生産する酵素群が非常に耐熱性に優れ
ていることが期待されている。事実、超好熱菌の生産す
る酵素の熱失活温度が菌の生育可能上限温度より高い温
度である場合が多く、中には100℃以上の至適温度をも
つ酵素もある。このような超耐熱性酵素は、産業上の利
用面からも有用性が高く、その探索および研究開発が世
界中で広く進められている。
【０００３】他方、α-アミラーゼは広く天然界に分布
しており、これまでに種々の性質のα-アミラーゼが取
得され、産業上利用されている。α-アミラーゼの活性
は、例えば、工業的には、デンプンの液化として知られ
る工程で、α-1,4グルコシド結合をエンド型で加水分解
することにより特徴づけられる。工業的なデンプン液化
においては、デンプン液の粘度が高く、物質移動の問題
があるため、できる限り高い温度で行われる。このデン
プン液化の工程は、安価な原料から、大量のオリゴ糖あ
るいはＤ-グルコースを製造する際の重要な工程となっ
ている。従来、工業的に利用できる耐熱性α-アミラー
ゼは、中性付近（pH６〜８）に至適pHをもつため、工業
的なデンプンの液化は通常pH６付近で行われている。し
かしながら、特に、Ｄ-グルコースの製造においては、
デンプンの液化工程に続いて行われる糖化工程で用いら
れるグルコアミラーゼの至適pHが4.5付近であるため、
液化工程終了後に、液化液のpHを4.5に調整する必要が
あること、および酸性条件化で液化した液化液を用いて
糖化を行った方がＤ-グルコースの収率が向上すること
より酸性条件下での液化工程の優位性が広く知られてお
り、酸性条件下でデンプン液化能をもつ工業用α-アミ
ラーゼの供給が望まれている。
しており、これまでに種々の性質のα-アミラーゼが取
得され、産業上利用されている。α-アミラーゼの活性
は、例えば、工業的には、デンプンの液化として知られ
る工程で、α-1,4グルコシド結合をエンド型で加水分解
することにより特徴づけられる。工業的なデンプン液化
においては、デンプン液の粘度が高く、物質移動の問題
があるため、できる限り高い温度で行われる。このデン
プン液化の工程は、安価な原料から、大量のオリゴ糖あ
るいはＤ-グルコースを製造する際の重要な工程となっ
ている。従来、工業的に利用できる耐熱性α-アミラー
ゼは、中性付近（pH６〜８）に至適pHをもつため、工業
的なデンプンの液化は通常pH６付近で行われている。し
かしながら、特に、Ｄ-グルコースの製造においては、
デンプンの液化工程に続いて行われる糖化工程で用いら
れるグルコアミラーゼの至適pHが4.5付近であるため、
液化工程終了後に、液化液のpHを4.5に調整する必要が
あること、および酸性条件化で液化した液化液を用いて
糖化を行った方がＤ-グルコースの収率が向上すること
より酸性条件下での液化工程の優位性が広く知られてお
り、酸性条件下でデンプン液化能をもつ工業用α-アミ
ラーゼの供給が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、優れた耐熱
性を有する酸性α-アミラーゼを提供すること、および
この酵素を、α-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA断片を
取得し、遺伝子操作による育種を利用して産生して提供
することを目的とする。
性を有する酸性α-アミラーゼを提供すること、および
この酵素を、α-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA断片を
取得し、遺伝子操作による育種を利用して産生して提供
することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、以下の
理化学的性質を有することを特徴とするα-アミラーゼ
が提供される： （１）至適pHが5.0付近である； （２）pH5.0における至適温度が100℃付近である；およ
び （３）デンプンおよびカルシウムイオンの非存在下で、
pH5.0、100℃、３時間の熱処理後、少なくとも50％以上
活性が残存する。
理化学的性質を有することを特徴とするα-アミラーゼ
が提供される： （１）至適pHが5.0付近である； （２）pH5.0における至適温度が100℃付近である；およ
び （３）デンプンおよびカルシウムイオンの非存在下で、
pH5.0、100℃、３時間の熱処理後、少なくとも50％以上
活性が残存する。
【０００６】好ましい実施態様においては、前記α−ア
ミラーゼは超好熱菌菌株KOD-1株から得られる。
ミラーゼは超好熱菌菌株KOD-1株から得られる。
【０００７】好ましい実施態様においては、前記α-ア
ミラーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列またはその配
列中のアミノ酸の１またはそれ以上の欠失、付加、また
は置換を含むアミノ酸配列を有する。
ミラーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列またはその配
列中のアミノ酸の１またはそれ以上の欠失、付加、また
は置換を含むアミノ酸配列を有する。
【０００８】本発明によれば、前記α-アミラーゼをコ
ードするDNA断片が提供される。
ードするDNA断片が提供される。
【０００９】好ましい実施態様においては、前記DNA断
片は配列番号１の530位のＧから1834位のＡまでのDNA配
列またはその配列中のヌクレオチドの１またはそれ以上
の欠失、付加、または置換を含むDNA配列を有する。
片は配列番号１の530位のＧから1834位のＡまでのDNA配
列またはその配列中のヌクレオチドの１またはそれ以上
の欠失、付加、または置換を含むDNA配列を有する。
【００１０】本発明によれば、前記DNA断片を含むα-ア
ミラーゼ発現ベクターが提供される。
ミラーゼ発現ベクターが提供される。
【００１１】本発明によれば、前記発現ベクターで形質
転換された宿主細胞が提供される。
転換された宿主細胞が提供される。
【００１２】本発明によれば、前記形質転換された宿主
細胞を培養することを特徴とする、α-アミラーゼの産
生方法が提供される。
細胞を培養することを特徴とする、α-アミラーゼの産
生方法が提供される。
【００１３】本発明によれば、以下の工程： （ａ）約30（W/V）%濃度のデンプンスラリーに、α-ア
ミラーゼを添加し、pHを4.0〜6.0に調整する工程； （ｂ）塩化カルシウムを添加する工程； （ｃ）ジェットクッカーで液化を行う工程； （ｄ）pHを4.5に調整する工程； （ｅ）グルコアミラーゼを添加して、糖化を行う工程、
を含む、グルコースの製造方法が提供される。
ミラーゼを添加し、pHを4.0〜6.0に調整する工程； （ｂ）塩化カルシウムを添加する工程； （ｃ）ジェットクッカーで液化を行う工程； （ｄ）pHを4.5に調整する工程； （ｅ）グルコアミラーゼを添加して、糖化を行う工程、
を含む、グルコースの製造方法が提供される。
【００１４】本発明によれば、以下の工程： （ａ）約30（W/V）%濃度のデンプンスラリーに、α-ア
ミラーゼを添加し、pHを4.0〜6.0に調整する工程； （ｂ）塩化カルシウムを添加する工程； （ｃ）ジェットクッカーで液化を行う工程； （ｄ）pHを5.5に調整する工程； （ｅ）β-アミラーゼを添加して糖化を行う工程、を含
む、マルトースの製造方法が提供される。
ミラーゼを添加し、pHを4.0〜6.0に調整する工程； （ｂ）塩化カルシウムを添加する工程； （ｃ）ジェットクッカーで液化を行う工程； （ｄ）pHを5.5に調整する工程； （ｅ）β-アミラーゼを添加して糖化を行う工程、を含
む、マルトースの製造方法が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。
【００１６】本発明は、超好熱菌が産生する耐熱性α-
アミラーゼを、本来の産生菌株を培養することにより、
またはα-アミラーゼ産生遺伝子を合むDNA断片を取得
し、このDNA断片を含む発現ベクターを構築し、この発
現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することによ
り耐熱性α-アミラーゼを産生する方法に関する。
アミラーゼを、本来の産生菌株を培養することにより、
またはα-アミラーゼ産生遺伝子を合むDNA断片を取得
し、このDNA断片を含む発現ベクターを構築し、この発
現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することによ
り耐熱性α-アミラーゼを産生する方法に関する。
【００１７】本発明に用いる超好熱菌は、80℃以上で生
育する微生物であると定義される。好ましくは超好熱菌
は、優れた耐熱性を有する酸性α-アミラーゼを産生す
る、本発明者らが単離した耐熱性チオールプロテアーゼ
産生菌KOD-1株（Appl. Environ. Microbiol. 60(12), 4
559-4566(1994)）である。KOD-1株は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はFE
RM P-15007号である。なお、このKOD-1株は、上記文献
に記載されているように、分離された当初Pyrococcus属
に分類されていたが、その後の知見の集積により、DNAS
IS（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製）に入力
されているGenBank（登録商標）R91.0 October, 1995＋
Daily Updateの登録データを用いた16S rRNAの配列の比
較から、KOD-1株はPyrococcus属よりはむしろThermococ
cus属に近縁であることが示唆されている。
育する微生物であると定義される。好ましくは超好熱菌
は、優れた耐熱性を有する酸性α-アミラーゼを産生す
る、本発明者らが単離した耐熱性チオールプロテアーゼ
産生菌KOD-1株（Appl. Environ. Microbiol. 60(12), 4
559-4566(1994)）である。KOD-1株は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はFE
RM P-15007号である。なお、このKOD-1株は、上記文献
に記載されているように、分離された当初Pyrococcus属
に分類されていたが、その後の知見の集積により、DNAS
IS（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製）に入力
されているGenBank（登録商標）R91.0 October, 1995＋
Daily Updateの登録データを用いた16S rRNAの配列の比
較から、KOD-1株はPyrococcus属よりはむしろThermococ
cus属に近縁であることが示唆されている。
【００１８】本発明で用いる微生物を培養して、本発明
のα-アミラーゼを生産させるには、例えば前述の報文
（Appl. Environ. Microbiol. 60(12), 4559-4566(199
4)）に記載の培養条件により、静置培養あるいは窒素ガ
スによる通気撹拌培養により、連続的あるいは回分的に
行うことができる。なお、かかる微生物を培養して、本
発明のα-アミラーゼを生産させるための培養条件は、
微生物が生育する範囲内であれば特に限定はない。
のα-アミラーゼを生産させるには、例えば前述の報文
（Appl. Environ. Microbiol. 60(12), 4559-4566(199
4)）に記載の培養条件により、静置培養あるいは窒素ガ
スによる通気撹拌培養により、連続的あるいは回分的に
行うことができる。なお、かかる微生物を培養して、本
発明のα-アミラーゼを生産させるための培養条件は、
微生物が生育する範囲内であれば特に限定はない。
【００１９】このようにして培養した後、得られる培養
物から常法により本発明のα-アミラーゼを回収する。
例えば培養物を遠心分離またはろ過することによって菌
体を分離して上澄を得、この上澄から通常の手段、例え
ば、塩析法、溶媒沈澱法（例えば、エタノール、アセト
ン等）によって目的酵素蛋白を沈澱させたり、また、限
外ろ過（例えば、ダイヤフローメンブレンＹＣ、アミコ
ン社製）により濃縮させて、本発明のα-アミラーゼを
得る。塩析法、溶媒沈澱法では、α-アミラーゼを沈澱
させ、ろ過あるいは遠心分離、脱塩処理した後、これを
凍結乾燥粉末とすることもできる。さらに上記で得られ
たα-アミラーゼを塩析、溶媒沈澱、等電点沈澱、電気
泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフ
ィニティークロマトグラフィー、晶出等の通常の酵素の
精製手段を適宜組合せることによって、比活性の向上し
た粗酵素ないし精製酵素とすることもできる。
物から常法により本発明のα-アミラーゼを回収する。
例えば培養物を遠心分離またはろ過することによって菌
体を分離して上澄を得、この上澄から通常の手段、例え
ば、塩析法、溶媒沈澱法（例えば、エタノール、アセト
ン等）によって目的酵素蛋白を沈澱させたり、また、限
外ろ過（例えば、ダイヤフローメンブレンＹＣ、アミコ
ン社製）により濃縮させて、本発明のα-アミラーゼを
得る。塩析法、溶媒沈澱法では、α-アミラーゼを沈澱
させ、ろ過あるいは遠心分離、脱塩処理した後、これを
凍結乾燥粉末とすることもできる。さらに上記で得られ
たα-アミラーゼを塩析、溶媒沈澱、等電点沈澱、電気
泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフ
ィニティークロマトグラフィー、晶出等の通常の酵素の
精製手段を適宜組合せることによって、比活性の向上し
た粗酵素ないし精製酵素とすることもできる。
【００２０】得られたサンプルを用いて、酵素のより詳
細な性質を調べることができる。酵素活性は、基質（例
えば、可溶性デンプン）溶液に供試酵素液を加え、反応
させた後、生成した還元糖をDNS法（3,5-ジニトロサリ
チル酸法）により測定することで測定し得る。
細な性質を調べることができる。酵素活性は、基質（例
えば、可溶性デンプン）溶液に供試酵素液を加え、反応
させた後、生成した還元糖をDNS法（3,5-ジニトロサリ
チル酸法）により測定することで測定し得る。
【００２１】デンプンへの作用は、酵素を可溶性デンプ
ンと反応させた後、オリゴ糖の生成パターンを薄層クロ
マトグラフィー（TLC）で検出することにより調べ得
る。
ンと反応させた後、オリゴ糖の生成パターンを薄層クロ
マトグラフィー（TLC）で検出することにより調べ得
る。
【００２２】至適pHおよび至適温度は、可溶性デンプン
を基質として、各種pHまたは各種温度で酵素反応させて
調べることができる。
を基質として、各種pHまたは各種温度で酵素反応させて
調べることができる。
【００２３】温度安定性は、緩衝液中で酵素を、一定の
温度（例えば、100℃）で一定時間（例えば、40，60，1
20，180分間）熱処理し、氷冷した後、残存活性を測定
することにより調べることができる。
温度（例えば、100℃）で一定時間（例えば、40，60，1
20，180分間）熱処理し、氷冷した後、残存活性を測定
することにより調べることができる。
【００２４】α-アミラーゼの分子量は、酵素をSDS-ポ
リアクリルアミトゲル電気泳動した後、活性染色するこ
とにより測定し得る。即ち、電気泳動後のゲルを可溶性
デンプンを含む緩衝液に浸漬し、インキュベートした
後、ゲルを水洗し、水洗後のゲルをＩ2−ＫＩ水溶液に
つけ、ゲル中に残存しているデンプンを発色させる。こ
のときα-アミラーゼのバンドは、無色のバンドとして
検出される。
リアクリルアミトゲル電気泳動した後、活性染色するこ
とにより測定し得る。即ち、電気泳動後のゲルを可溶性
デンプンを含む緩衝液に浸漬し、インキュベートした
後、ゲルを水洗し、水洗後のゲルをＩ2−ＫＩ水溶液に
つけ、ゲル中に残存しているデンプンを発色させる。こ
のときα-アミラーゼのバンドは、無色のバンドとして
検出される。
【００２５】超好熱菌菌株由来の耐熱性α-アミラーゼ
産生遺伝子を含むDNA断片は、例えば、超好熱菌菌株か
ら染色体DNAを単離し、この染色体DNAを含むライブラリ
ーを作製し、このライブラリーをスクリーニングするこ
とにより取得できる。
産生遺伝子を含むDNA断片は、例えば、超好熱菌菌株か
ら染色体DNAを単離し、この染色体DNAを含むライブラリ
ーを作製し、このライブラリーをスクリーニングするこ
とにより取得できる。
【００２６】超好熱菌菌株の染色体DNAは、菌株を培養
し、集菌後、N-ラウリルサルコシン溶液を加えて完全に
溶菌させ、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心法により分
画して得ることができる。ライブラリーは、染色体DNA
を各種制限酵素で切断した後、同一の制限酵素または共
通の切断末端を与えるの制限酵素で切断したベクターDN
AにT4 DNAリガーゼを用いて連結することにより得るこ
とができる。スクリーニングは、このライブラリーによ
り宿主、例えばEscherichia coliを形質転換し、得られ
た形質転換株から、目的のα-アミラーゼ産生遺伝子を
含むDNA断片が組込まれたプラスミドを保持する株を選
択することにより行うことができる。その選択法の一例
は、形質転換株が生育している寒天平板培地上に架橋デ
ンプン（例えば、日澱化学社製セレックス）寒天培地を
重層し、一定時間経過後、架橋デンプンがα-アミラー
ゼにより分解されることによってコロニーの周囲にクリ
アーゾーンが形成されることを指標として行う。
し、集菌後、N-ラウリルサルコシン溶液を加えて完全に
溶菌させ、塩化セシウム平衡密度勾配超遠心法により分
画して得ることができる。ライブラリーは、染色体DNA
を各種制限酵素で切断した後、同一の制限酵素または共
通の切断末端を与えるの制限酵素で切断したベクターDN
AにT4 DNAリガーゼを用いて連結することにより得るこ
とができる。スクリーニングは、このライブラリーによ
り宿主、例えばEscherichia coliを形質転換し、得られ
た形質転換株から、目的のα-アミラーゼ産生遺伝子を
含むDNA断片が組込まれたプラスミドを保持する株を選
択することにより行うことができる。その選択法の一例
は、形質転換株が生育している寒天平板培地上に架橋デ
ンプン（例えば、日澱化学社製セレックス）寒天培地を
重層し、一定時間経過後、架橋デンプンがα-アミラー
ゼにより分解されることによってコロニーの周囲にクリ
アーゾーンが形成されることを指標として行う。
【００２７】得られたクローンの解析は、例えば選択さ
れた形質転換株からの組換えDNA分子の回収、制限地図
の作製、および塩基配列の決定などにより行われる。選
択されたEscherichia coli形質転換株からのプラスミド
の抽出は次のような常法によって行うことができる。目
的のプラスミドを保持するEscherichia coliを培養し、
集菌後、リゾチーム溶液を加えて一定時間おく。次にSD
S−NaOH溶液を加えて完全に溶菌させた後、酢酸ナトリ
ウム溶液を添加し、一定時間氷中においた後、遠心分離
により上清を得、フェノール処理、エタノール沈澱によ
りプラスミドDNAを回収する。DNAを緩衝液に溶解し、RN
aseを添加し、一定時間保温した後、フェノール処理、
エタノール沈澱によりプラスミドDNAを回収する。塩基
配列は、制限地図を作製し、配列を決定しようとするDN
A断片を適切なベクターにサブクローン化した後、ジデ
オキシ法により決定し得る。
れた形質転換株からの組換えDNA分子の回収、制限地図
の作製、および塩基配列の決定などにより行われる。選
択されたEscherichia coli形質転換株からのプラスミド
の抽出は次のような常法によって行うことができる。目
的のプラスミドを保持するEscherichia coliを培養し、
集菌後、リゾチーム溶液を加えて一定時間おく。次にSD
S−NaOH溶液を加えて完全に溶菌させた後、酢酸ナトリ
ウム溶液を添加し、一定時間氷中においた後、遠心分離
により上清を得、フェノール処理、エタノール沈澱によ
りプラスミドDNAを回収する。DNAを緩衝液に溶解し、RN
aseを添加し、一定時間保温した後、フェノール処理、
エタノール沈澱によりプラスミドDNAを回収する。塩基
配列は、制限地図を作製し、配列を決定しようとするDN
A断片を適切なベクターにサブクローン化した後、ジデ
オキシ法により決定し得る。
【００２８】得られたクローン由来のα-アミラーゼ遺
伝子を含むDNA断片を、宿主細胞に適合性の発現ベクタ
ー中に作動可能に挿入し、この発現ベクターで適切な宿
主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞を培養す
ることにより、α-アミラーゼが発現される。本発明で
用いられる宿主細胞は、遺伝子組換えの宿主として使用
されるものであれば特に限定しないが、好ましくはEsch
erichia coli、Bacillussubtilisなどの細菌細胞が好ま
しい。
伝子を含むDNA断片を、宿主細胞に適合性の発現ベクタ
ー中に作動可能に挿入し、この発現ベクターで適切な宿
主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞を培養す
ることにより、α-アミラーゼが発現される。本発明で
用いられる宿主細胞は、遺伝子組換えの宿主として使用
されるものであれば特に限定しないが、好ましくはEsch
erichia coli、Bacillussubtilisなどの細菌細胞が好ま
しい。
【００２９】グルコースの製造は基本的には以下のよう
に実施し得る：約30（W/V）%濃度のデンプンスラリー
に、α-アミラーゼ２〜20 U/gDSを添加し、pHを4.0〜6.
0に調整する；塩化カルシウムを添加すれば酵素の安定
性が増加され得る。添加する濃度は後処理を考慮すると
０〜５mM程度が良い、好ましくは１mM〜３mM程度であ
る；ジェットクッカーで105〜120℃、５分間液化を行
う；基本的には熟成は不要であるが、熟成を行う場合に
は、90〜95℃で適切な時間熟成を行う、０〜45分間程度
が好適である；pHを4.5に調整する；グルコアミラーゼ
４U/gDSを添加する（グルコアミラーゼとしては糸状菌
などの微生物由来のものが使用可能であるが、Aspergil
lus属由来のものが好ましい；60℃、48時間糖化を行
う。反応は、HPLCを用いた糖の定量により評価し得る。
ここでDSは乾燥デンプンを表す。なお、グルコアミラー
ゼ活性は以下のように測定し得る：0.56%の可溶性デン
プン（pH4.5,M/10酢酸緩衝液）９mlに１mlの酵素を加
え、40℃、30分間反応させた時、10 mgのグルコースに
相当する還元力を生成する活性を１単位（U）とする。
に実施し得る：約30（W/V）%濃度のデンプンスラリー
に、α-アミラーゼ２〜20 U/gDSを添加し、pHを4.0〜6.
0に調整する；塩化カルシウムを添加すれば酵素の安定
性が増加され得る。添加する濃度は後処理を考慮すると
０〜５mM程度が良い、好ましくは１mM〜３mM程度であ
る；ジェットクッカーで105〜120℃、５分間液化を行
う；基本的には熟成は不要であるが、熟成を行う場合に
は、90〜95℃で適切な時間熟成を行う、０〜45分間程度
が好適である；pHを4.5に調整する；グルコアミラーゼ
４U/gDSを添加する（グルコアミラーゼとしては糸状菌
などの微生物由来のものが使用可能であるが、Aspergil
lus属由来のものが好ましい；60℃、48時間糖化を行
う。反応は、HPLCを用いた糖の定量により評価し得る。
ここでDSは乾燥デンプンを表す。なお、グルコアミラー
ゼ活性は以下のように測定し得る：0.56%の可溶性デン
プン（pH4.5,M/10酢酸緩衝液）９mlに１mlの酵素を加
え、40℃、30分間反応させた時、10 mgのグルコースに
相当する還元力を生成する活性を１単位（U）とする。
【００３０】また、マルトースの製造は熟成まではグル
コースと同様に実施し得る。その後の工程は以下のとお
りである：β-アミラーゼ５U/gDSを添加する（β-アミ
ラーゼとしては、高等植物および細菌などの微生物由来
のものが使用可能であるが、ダイズ由来のものが好まし
い）；55℃、48時間糖化を行う。反応は、HPLCを用いた
糖の定量により評価し得る。なお、β-アミラーゼ活性
は以下のように測定し得る：1.2%のバレイショデンプン
糊液（pH5.5, N/20酢酸緩衝液）５mlに酵素液１mlを加
え、40℃で20分間反応させ、この条件下で１分間に100
μｇのグルコース相当の還元力を生成する活性を１単位
（U）とする。
コースと同様に実施し得る。その後の工程は以下のとお
りである：β-アミラーゼ５U/gDSを添加する（β-アミ
ラーゼとしては、高等植物および細菌などの微生物由来
のものが使用可能であるが、ダイズ由来のものが好まし
い）；55℃、48時間糖化を行う。反応は、HPLCを用いた
糖の定量により評価し得る。なお、β-アミラーゼ活性
は以下のように測定し得る：1.2%のバレイショデンプン
糊液（pH5.5, N/20酢酸緩衝液）５mlに酵素液１mlを加
え、40℃で20分間反応させ、この条件下で１分間に100
μｇのグルコース相当の還元力を生成する活性を１単位
（U）とする。
【００３１】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はそれら実施例に限定されるもの
ではない。
に説明するが、本発明はそれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００３２】実施例１ 超好熱菌の産生するα-アミラ
ーゼの精製および特徴づけ （１）酵素の粗精製 本発明で用いるKOD-1株を前述の報文（Appl. Environ.
Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）に記載の0.5×2
216マリンブロース培地（2216マリンブロース18.7g/L、
PIPES 3.48g/L、CaCl2・H2O 0.725g/L、0.4 mL 0.2%レザ
ズリン、475mL人工海水（NaCl 28.16 g/L、KCl 0.7 g/
L、MgCl2・6H2O 5.5 g/L、MgSO4・7H2O 6.9 g/L）、蒸留
水500 mL、pH7.0）1,000mlに接種して、２リットルの発
酵槽により培養した。培養に際しては、発酵槽内を窒素
ガスに置換し、同ガスで内圧を0.1Kg/cm2に維持し、培
養温度85±１℃にて14時間培養した。なお、培養は静置
培養で実施し、培養中窒素ガスの通気および撹拌は行わ
なかった。培養終了後、培養液（約1,000ml）を10,000r
pmで10分間の遠心分離により除菌し、限外ろ過法（旭化
成社製 限外ろ過モジュール AIP-1010）により約50ml
まで濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥し、粗酵素サンプ
ル3.36gを得た。酵素活性の測定法は以下の通りであ
る：0.5mlの基質溶液（最終濃度１％となるように可溶
性デンプンを0.2M酢酸−NaOH緩衝液（pH4.5）の溶解し
た液）に供試酵素液0.5mlを加え、100℃で30分間反応す
る；次いで氷水中で反応停止後、生成した還元糖をDNS
法（3,5-ジニトロサリチル酸法）により測定する。この
反応条件下で、１分間に１μmolのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位（U）とする。粗酵
素サンプルのα-アミラーゼ活性は6.43U/gであり、総活
性は、21.6Uであった。また、本培養で得られた菌株
は、下記の実施例２の染色体DNA調製用として凍結保存
した。得られた粗酵素を使用して本発明のα-アミラー
ゼの酵素学的性質および物理化学的性質を以下のように
検討した。
ーゼの精製および特徴づけ （１）酵素の粗精製 本発明で用いるKOD-1株を前述の報文（Appl. Environ.
Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）に記載の0.5×2
216マリンブロース培地（2216マリンブロース18.7g/L、
PIPES 3.48g/L、CaCl2・H2O 0.725g/L、0.4 mL 0.2%レザ
ズリン、475mL人工海水（NaCl 28.16 g/L、KCl 0.7 g/
L、MgCl2・6H2O 5.5 g/L、MgSO4・7H2O 6.9 g/L）、蒸留
水500 mL、pH7.0）1,000mlに接種して、２リットルの発
酵槽により培養した。培養に際しては、発酵槽内を窒素
ガスに置換し、同ガスで内圧を0.1Kg/cm2に維持し、培
養温度85±１℃にて14時間培養した。なお、培養は静置
培養で実施し、培養中窒素ガスの通気および撹拌は行わ
なかった。培養終了後、培養液（約1,000ml）を10,000r
pmで10分間の遠心分離により除菌し、限外ろ過法（旭化
成社製 限外ろ過モジュール AIP-1010）により約50ml
まで濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥し、粗酵素サンプ
ル3.36gを得た。酵素活性の測定法は以下の通りであ
る：0.5mlの基質溶液（最終濃度１％となるように可溶
性デンプンを0.2M酢酸−NaOH緩衝液（pH4.5）の溶解し
た液）に供試酵素液0.5mlを加え、100℃で30分間反応す
る；次いで氷水中で反応停止後、生成した還元糖をDNS
法（3,5-ジニトロサリチル酸法）により測定する。この
反応条件下で、１分間に１μmolのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位（U）とする。粗酵
素サンプルのα-アミラーゼ活性は6.43U/gであり、総活
性は、21.6Uであった。また、本培養で得られた菌株
は、下記の実施例２の染色体DNA調製用として凍結保存
した。得られた粗酵素を使用して本発明のα-アミラー
ゼの酵素学的性質および物理化学的性質を以下のように
検討した。
【００３３】（２）作用 （１）のα-アミラーゼを下記の酸性条件下でデンプン
に作用させ、オリゴ糖の生成パターンを薄層クロマトグ
ラフィー（TLC）で調べた。
に作用させ、オリゴ糖の生成パターンを薄層クロマトグ
ラフィー（TLC）で調べた。
【００３４】基質：可溶性デンプン（最終１％） pH：5.0（0.2M 酢酸−NaOH緩衝液） 温度：100℃ 作用時間：0，10，30，60，120，180，240分間 酵素添加量：2U 前記条件でα-アミラーゼを作用させた反応液（3μl）
をシリカゲル60TLCプレート（メルク社製）にスポット
し、イソプロピルアルコール：アセトン：水−４：４：
２で室温にて約240分間展開後、発色液（アニリン4ml、
ジフェニルアミン4g、アセトン200ml、85％リン酸30ml
の混合液）を噴霧し、105℃で30分間加熱して発色させ
た。この結果、作用時間とともにマルトテトラオース、
マルトトリオース、マルトース、グルコースの顕著な生
成が認められた。
をシリカゲル60TLCプレート（メルク社製）にスポット
し、イソプロピルアルコール：アセトン：水−４：４：
２で室温にて約240分間展開後、発色液（アニリン4ml、
ジフェニルアミン4g、アセトン200ml、85％リン酸30ml
の混合液）を噴霧し、105℃で30分間加熱して発色させ
た。この結果、作用時間とともにマルトテトラオース、
マルトトリオース、マルトース、グルコースの顕著な生
成が認められた。
【００３５】（３）至適pH 可溶性デンプン１％を含む各pHの0.2M酢酸−NaOH緩衝液
に１Uのα-アミラーゼを加え、90℃、30分間反応を行な
った。至適pHでの活性を100％としたときの各pHでの相
対活性を図１に示した。
に１Uのα-アミラーゼを加え、90℃、30分間反応を行な
った。至適pHでの活性を100％としたときの各pHでの相
対活性を図１に示した。
【００３６】この図から明らかな如く、本発明のα-ア
ミラーゼの至適pHは5.0付近である。
ミラーゼの至適pHは5.0付近である。
【００３７】（４）至適温度 可溶性デンプンを基質として、pH5.0にて30分間各温度
で１Uのα-アミラーゼを反応させ、至適温度での活性を
100％としたときの各温度での相対活性を図２に示し
た。
で１Uのα-アミラーゼを反応させ、至適温度での活性を
100％としたときの各温度での相対活性を図２に示し
た。
【００３８】この図から明らかな如く、本発明のα-ア
ミラーゼの至適温度は100℃付近である。
ミラーゼの至適温度は100℃付近である。
【００３９】（５）温度安定性 0.2M酢酸−NaOH緩衝液（pH5.0）に１Uのα-アミラーゼ
を加えて、100℃で40，60，120，180分間熱処理し、氷
冷した後、可溶性デンプンを基質として残存活性測定し
た。その結果を図３に示した。
を加えて、100℃で40，60，120，180分間熱処理し、氷
冷した後、可溶性デンプンを基質として残存活性測定し
た。その結果を図３に示した。
【００４０】この図より明らかな如く、本発明のα-ア
ミラーゼは、100℃、pH5.0の条件下で３時間熱処理した
後においても、少なくとも50％以上の活性が残存してい
た。
ミラーゼは、100℃、pH5.0の条件下で３時間熱処理した
後においても、少なくとも50％以上の活性が残存してい
た。
【００４１】（６）SDS-ポリアクリルアミトゲル電気泳
動 12％のポリアクリルアミド濃度のSDS-ポリアクリルアミ
トゲル電気泳動により、本発明のα-アミラーゼの分子
量を推定した。目的のα-アミラーゼのバンドの検出
は、以下の条件での活性染色により行った。即ち、電気
泳動後のゲルを１％可溶性デンプンを含む0.1M酢酸−Na
OH緩衝液（pH5.0）に浸漬し、85℃で30分間インキュベ
ート後、ゲルを水洗し、水洗後のゲルを0.005％Ｉ2−0.
05％ＫＩ水溶液につけ、ゲル中に残存しているデンプン
を発色させた。α-アミラーゼのバンドは、無色のバン
ドとして検出された。なお、標準蛋白としてフォスフォ
リラーゼｂ（Mw：94,000)、牛血清アルブミン（Mw：67,
000）、卵白アルブミン（Mw：43,000）、炭酸脱水酵素
（Mw：30,000）、トリプシンインヒビター（Mw：20,10
0）を用い、本発明のα-アミラーゼと同条件で泳動後、
クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（CBB）により
染色し、分子量マーカーとした。その結果、本発明のα
-アミラーゼのバンドは43,000付近に認められた。
動 12％のポリアクリルアミド濃度のSDS-ポリアクリルアミ
トゲル電気泳動により、本発明のα-アミラーゼの分子
量を推定した。目的のα-アミラーゼのバンドの検出
は、以下の条件での活性染色により行った。即ち、電気
泳動後のゲルを１％可溶性デンプンを含む0.1M酢酸−Na
OH緩衝液（pH5.0）に浸漬し、85℃で30分間インキュベ
ート後、ゲルを水洗し、水洗後のゲルを0.005％Ｉ2−0.
05％ＫＩ水溶液につけ、ゲル中に残存しているデンプン
を発色させた。α-アミラーゼのバンドは、無色のバン
ドとして検出された。なお、標準蛋白としてフォスフォ
リラーゼｂ（Mw：94,000)、牛血清アルブミン（Mw：67,
000）、卵白アルブミン（Mw：43,000）、炭酸脱水酵素
（Mw：30,000）、トリプシンインヒビター（Mw：20,10
0）を用い、本発明のα-アミラーゼと同条件で泳動後、
クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（CBB）により
染色し、分子量マーカーとした。その結果、本発明のα
-アミラーゼのバンドは43,000付近に認められた。
【００４２】以上から、本発明のα-アミラーゼは、酸
性かつ高温の条件下で優れたデンプン分解活性を発揮
し、さらに同条件下で高い安定性を示した。従って、本
発明のα-アミラーゼは、酸性条件下でデンプン液化能
を有する優れた耐熱性を持つ酸性α-アミラーゼである
ことが明らかとなった。
性かつ高温の条件下で優れたデンプン分解活性を発揮
し、さらに同条件下で高い安定性を示した。従って、本
発明のα-アミラーゼは、酸性条件下でデンプン液化能
を有する優れた耐熱性を持つ酸性α-アミラーゼである
ことが明らかとなった。
【００４３】実施例２ α-アミラーゼ産生遺伝子のク
ローニング （１）KOD-1株からの染色体DNAの調製 実施例１の培養で得られた菌体１gを10mlのＡ溶液（50m
M Tris-HCl、50mM EDTA、pH8.0）に懸濁し、遠心分離
（8,000rpm、５分間、４℃）により集菌後、３mlの15％
ショ糖を含むＡ溶液に懸濁し、37℃にて30分間保温後、
１％Ｎ-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３mlを添加し
た。この液にさらに5.4gの塩化セシウムと10mg/mlの臭
化エチジウム溶液300μlを添加し、55,000rpm、16時
間、18℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分画し
た。得られた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出によ
り臭化エチジウムを除去後、TE溶液（10mM Tris-HCl、
0.1mM EDTA、pH8.0）に対して一夜透析し、染色体DNAを
得た。
ローニング （１）KOD-1株からの染色体DNAの調製 実施例１の培養で得られた菌体１gを10mlのＡ溶液（50m
M Tris-HCl、50mM EDTA、pH8.0）に懸濁し、遠心分離
（8,000rpm、５分間、４℃）により集菌後、３mlの15％
ショ糖を含むＡ溶液に懸濁し、37℃にて30分間保温後、
１％Ｎ-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３mlを添加し
た。この液にさらに5.4gの塩化セシウムと10mg/mlの臭
化エチジウム溶液300μlを添加し、55,000rpm、16時
間、18℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分画し
た。得られた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出によ
り臭化エチジウムを除去後、TE溶液（10mM Tris-HCl、
0.1mM EDTA、pH8.0）に対して一夜透析し、染色体DNAを
得た。
【００４４】（２）ショットガンクローニングによる本
発明のα-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA断片の検索 ベクターDNA pUC18および（１）で調製した染色体DNAを
制限酵素PstＩで切断した。なお、このDNAの切断におい
ては、DNA１μgの切断に対し制限酵素を10単位の割合で
添加し、制限酵素のカタログ記載の条件で反応を行っ
た。上記のPstＩで切断されたpUC18および染色体DNAを
およそ１：１の割合になるように混合し、DNAライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いて両者を連結させる
ことにより、組換えプラスミドを得た。連結方法はライ
ゲーションキットの使用説明書に従った。
発明のα-アミラーゼ産生遺伝子を含むDNA断片の検索 ベクターDNA pUC18および（１）で調製した染色体DNAを
制限酵素PstＩで切断した。なお、このDNAの切断におい
ては、DNA１μgの切断に対し制限酵素を10単位の割合で
添加し、制限酵素のカタログ記載の条件で反応を行っ
た。上記のPstＩで切断されたpUC18および染色体DNAを
およそ１：１の割合になるように混合し、DNAライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いて両者を連結させる
ことにより、組換えプラスミドを得た。連結方法はライ
ゲーションキットの使用説明書に従った。
【００４５】次に上記組換えプラスミドをEscherichia
coliJM109のコンピテントセルに添加し、氷中に30分間
放置した後、42℃で２分間保温した。これを1.5mlのト
リプトン１％、酵母エキス0.5％、NaCl 0.5％からなる
培地（以下「LB培地」という）に接種して、37℃で１時
間培養した。この培養液を100μg/mlアンピシリン、200
μg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラク
トピラノシド（X-gal）、24μg/mlイソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド（IPTG）を含むLB寒天培地に塗
抹し、37℃で一夜培養することによって、アンピシリン
耐性かつ白色のコロニーを作るEscherichia coli形質転
換株約300株を得た。これらの白色コロニーを上記のLB
寒天培地に釣菌し、37℃で一夜培養後、架橋デンプン寒
天培地（セレックス（日澱化学社製）0.5％、0.2M酢酸
−NaOH緩衝液（pH5.0）、寒天２％）を重層し、60℃で
２日間保温後コロニーの周囲のクリアーゾーンの形成度
合を観察した。その結果、クリアーゾーンを形成するコ
ロニーを１株得、T-16株と命名した。
coliJM109のコンピテントセルに添加し、氷中に30分間
放置した後、42℃で２分間保温した。これを1.5mlのト
リプトン１％、酵母エキス0.5％、NaCl 0.5％からなる
培地（以下「LB培地」という）に接種して、37℃で１時
間培養した。この培養液を100μg/mlアンピシリン、200
μg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラク
トピラノシド（X-gal）、24μg/mlイソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド（IPTG）を含むLB寒天培地に塗
抹し、37℃で一夜培養することによって、アンピシリン
耐性かつ白色のコロニーを作るEscherichia coli形質転
換株約300株を得た。これらの白色コロニーを上記のLB
寒天培地に釣菌し、37℃で一夜培養後、架橋デンプン寒
天培地（セレックス（日澱化学社製）0.5％、0.2M酢酸
−NaOH緩衝液（pH5.0）、寒天２％）を重層し、60℃で
２日間保温後コロニーの周囲のクリアーゾーンの形成度
合を観察した。その結果、クリアーゾーンを形成するコ
ロニーを１株得、T-16株と命名した。
【００４６】（３）取得形質転換株（T-16株）の生産す
るα-アミラーゼの検出 （２）で得られたT-16株を200mlのLB培地（100μg/mlの
アンピシリンを含む）に接種し、37℃にて振とう培養し
た。培養開始後４時間目にIPTGを最終１mMとなるように
添加し、さらに４時間培養した。培養後、遠心分離によ
り集菌し、菌体を50mM酢酸−NaOH緩衝液（pH5.5）10ml
に懸濁し、氷冷下で超音波処理により菌体を破砕し、遠
心分離により上澄10mlを得、酵素液とした。この酵素液
を用いて、T-16株の生産するα-アミラーゼを実施例１
に記載のSDS-ポリアクリルアミトゲル電気泳動および活
性染色により検出したところ、元株であるKOD-1株の生
産する本発明のα-アミラーゼ同様、43,000付近に活性
バンドを与えた。また、宿主Escherichia coliJM109の
菌体破砕液には、上記の活性バンドが認められなかった
ことより、T-16株が本発明のα-アミラーゼ産生遺伝子
を含むDNA断片を有するクローンであることが判明し
た。
るα-アミラーゼの検出 （２）で得られたT-16株を200mlのLB培地（100μg/mlの
アンピシリンを含む）に接種し、37℃にて振とう培養し
た。培養開始後４時間目にIPTGを最終１mMとなるように
添加し、さらに４時間培養した。培養後、遠心分離によ
り集菌し、菌体を50mM酢酸−NaOH緩衝液（pH5.5）10ml
に懸濁し、氷冷下で超音波処理により菌体を破砕し、遠
心分離により上澄10mlを得、酵素液とした。この酵素液
を用いて、T-16株の生産するα-アミラーゼを実施例１
に記載のSDS-ポリアクリルアミトゲル電気泳動および活
性染色により検出したところ、元株であるKOD-1株の生
産する本発明のα-アミラーゼ同様、43,000付近に活性
バンドを与えた。また、宿主Escherichia coliJM109の
菌体破砕液には、上記の活性バンドが認められなかった
ことより、T-16株が本発明のα-アミラーゼ産生遺伝子
を含むDNA断片を有するクローンであることが判明し
た。
【００４７】（４）クローニングされたDNA断片の確認 （２）で得られたT-16株から、以下の常法によってプラ
スミドDNAを抽出した。即ち、T-16株を100μg/mlアンピ
シリンを含むLB培地500mlに接種し、37℃で一夜振とう
培養後、遠心分離により集菌した。菌体を緩衝液（50mM
グルコース、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH8.0）８ml
に懸濁し、これに50mg/mlリゾチーム溶液２mlを加え、
氷中に５分間おき、次いでSDS溶液（0.2N NaOH、１％SD
S）20mlを加え、氷中に10分間おき、３M酢酸カリウム
（pH4.8）15mlを加え、氷中に30分間おき、遠心分離に
より上澄を得、フェノール抽出、エタノール沈澱でプラ
スミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNAを８mlの
ＴＥ溶液に溶解し、20μg/mlとなるようにRNaseAを加
え、37℃で１時間保温後、再度フェノール抽出、エタノ
ール沈澱でプラスミドDNAを回収し、これを９mlのTE溶
液に溶解した。得られたプラスミドDNAを（２）に記載
の条件でPstＩにて切断し、１％アガロースゲル電気泳
動を行い、λ／HindIII digest−φＸ174／HaeIII dige
st（東洋紡社製）をサイズマーカーとして、プラスミド
DNA上の挿入DNA断片の大きさを測定したところ、約2.2K
bであった。なお、本プラスミドDNAをpAA-7と命名し
た。
スミドDNAを抽出した。即ち、T-16株を100μg/mlアンピ
シリンを含むLB培地500mlに接種し、37℃で一夜振とう
培養後、遠心分離により集菌した。菌体を緩衝液（50mM
グルコース、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH8.0）８ml
に懸濁し、これに50mg/mlリゾチーム溶液２mlを加え、
氷中に５分間おき、次いでSDS溶液（0.2N NaOH、１％SD
S）20mlを加え、氷中に10分間おき、３M酢酸カリウム
（pH4.8）15mlを加え、氷中に30分間おき、遠心分離に
より上澄を得、フェノール抽出、エタノール沈澱でプラ
スミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNAを８mlの
ＴＥ溶液に溶解し、20μg/mlとなるようにRNaseAを加
え、37℃で１時間保温後、再度フェノール抽出、エタノ
ール沈澱でプラスミドDNAを回収し、これを９mlのTE溶
液に溶解した。得られたプラスミドDNAを（２）に記載
の条件でPstＩにて切断し、１％アガロースゲル電気泳
動を行い、λ／HindIII digest−φＸ174／HaeIII dige
st（東洋紡社製）をサイズマーカーとして、プラスミド
DNA上の挿入DNA断片の大きさを測定したところ、約2.2K
bであった。なお、本プラスミドDNAをpAA-7と命名し
た。
【００４８】（５）クローニングされたDNA断片の塩基
配列の決定 プラスミドpAA-7上の挿入DNA断片の塩基配列の決定のた
め、段階的欠損法によって塩基配列決定用プラスミドを
構築し、塩基配列の決定をジデオキシ法により行った。
段階的欠損法にはキロシークエンス用デレーションキッ
ト（宝酒造社製）を、また、ジデオキシ法にはAutoRead
Sequencing Kit（ファルマシア社製）を用い、A.L.F.D
NAシークエンサーII（ファルマシア社製）により塩基配
列を決定した。なお、方法はそれぞれの使用説明書に従
った。
配列の決定 プラスミドpAA-7上の挿入DNA断片の塩基配列の決定のた
め、段階的欠損法によって塩基配列決定用プラスミドを
構築し、塩基配列の決定をジデオキシ法により行った。
段階的欠損法にはキロシークエンス用デレーションキッ
ト（宝酒造社製）を、また、ジデオキシ法にはAutoRead
Sequencing Kit（ファルマシア社製）を用い、A.L.F.D
NAシークエンサーII（ファルマシア社製）により塩基配
列を決定した。なお、方法はそれぞれの使用説明書に従
った。
【００４９】その結果、挿入DNA断片の塩基配列は、配
列表の配列番号１に示す通りであり、また、挿入DNA断
片の全長は2179bpであった。また得られたDNA断片中に
見出された最大のオープンリーディングフレームは配列
表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでいた。この
アミノ酸配列を公知のPyrococcus furiosus DSM 3638株
由来の超耐熱性α-アミラーゼ（国際公開第WO 94/19454
号）のアミノ酸配列と比較したところ、全体にわたって
約11％の差異が認められた（図４参照）。
列表の配列番号１に示す通りであり、また、挿入DNA断
片の全長は2179bpであった。また得られたDNA断片中に
見出された最大のオープンリーディングフレームは配列
表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含んでいた。この
アミノ酸配列を公知のPyrococcus furiosus DSM 3638株
由来の超耐熱性α-アミラーゼ（国際公開第WO 94/19454
号）のアミノ酸配列と比較したところ、全体にわたって
約11％の差異が認められた（図４参照）。
【００５０】実施例３ グルコースの製造 （１）塩化カルシウムによる安定化効果 塩化カルシウムの添加によるα-アミラーゼの安定化効
果を検討した。α-アミラーゼを0.1 M酢酸緩衝液（pH6.
0）に150 DUN/mlになるように加え、塩化カルシウム０
または１mMおよび基質（サンデック#100）０、10、20、
または30%の存在下で種々の温度で15分間インキュベー
トした後、残存する酵素活性を測定した。結果を図５に
示す。α-アミラーゼは、塩化カルシウムおよび基質の
存在により安定化されることが示された。１DUNは１%バ
レイショデンプン糊液（pH6.0, M/10酢酸緩衝液）10 ml
に１mlの酵素を加え、40℃、１分間作用させた時、I2呈
色値を１%減少させる活性と定義する。
果を検討した。α-アミラーゼを0.1 M酢酸緩衝液（pH6.
0）に150 DUN/mlになるように加え、塩化カルシウム０
または１mMおよび基質（サンデック#100）０、10、20、
または30%の存在下で種々の温度で15分間インキュベー
トした後、残存する酵素活性を測定した。結果を図５に
示す。α-アミラーゼは、塩化カルシウムおよび基質の
存在により安定化されることが示された。１DUNは１%バ
レイショデンプン糊液（pH6.0, M/10酢酸緩衝液）10 ml
に１mlの酵素を加え、40℃、１分間作用させた時、I2呈
色値を１%減少させる活性と定義する。
【００５１】（２）熟成時間の影響 グルコースの製造は基本的には以下のように実施し得
る：約30（W/V）%濃度のデンプンスラリーに、α-アミ
ラーゼ５〜15 DUN/gDSを添加し、pHを4.0〜6.0に調整す
る；塩化カルシウムを添加すれば酵素の安定性が増加さ
れ得る。添加する濃度は後処理を考慮すると０〜５mM程
度が良い、好ましくは１mM〜３mM程度である；ジェット
クッカーで105〜120℃、５分間液化を行う；基本的には
熟成は不要であるが、熟成を行う場合には、90〜95℃で
適切な時間熟成を行う。０〜45分間程度が好適である；
pHを4.5に調整する；Aspergillus属由来グルコアミラー
ゼ４U/gDSを添加する；60℃、48時間糖化を行う。反応
は、HPLCを用いた糖の定量により評価し得る。
る：約30（W/V）%濃度のデンプンスラリーに、α-アミ
ラーゼ５〜15 DUN/gDSを添加し、pHを4.0〜6.0に調整す
る；塩化カルシウムを添加すれば酵素の安定性が増加さ
れ得る。添加する濃度は後処理を考慮すると０〜５mM程
度が良い、好ましくは１mM〜３mM程度である；ジェット
クッカーで105〜120℃、５分間液化を行う；基本的には
熟成は不要であるが、熟成を行う場合には、90〜95℃で
適切な時間熟成を行う。０〜45分間程度が好適である；
pHを4.5に調整する；Aspergillus属由来グルコアミラー
ゼ４U/gDSを添加する；60℃、48時間糖化を行う。反応
は、HPLCを用いた糖の定量により評価し得る。
【００５２】デンプン濃度30（W/V）%、酵素量15 DUN/g
DS、塩化カルシウム濃度１mM、液化pH6.0、液化温度115
℃（液化にはジェットクッカーを使用）の条件で熟成時
間を０分間または45分間としてグルコース（G1）の生成
量を測定した。結果を表１に示す。この結果から、熟成
時間は不要であることが示された。
DS、塩化カルシウム濃度１mM、液化pH6.0、液化温度115
℃（液化にはジェットクッカーを使用）の条件で熟成時
間を０分間または45分間としてグルコース（G1）の生成
量を測定した。結果を表１に示す。この結果から、熟成
時間は不要であることが示された。
【００５３】
【表１】
【００５４】（３）液化pHの影響 デンプン濃度30（W/V）%、酵素量15 DUN/gDS、塩化カル
シウム濃度１mM、液化温度105℃（液化にはジェットク
ッカーを使用）、熟成時間45分間の条件で液化pHを4.0
〜6.0の間で変化させて、グルコース（G1）の生成量を
測定した。結果を表２に示す。この結果から、pH4.0〜p
H6.0の間では液化工程に差がないことが判明し、これに
続く糖化工程におけるG1収率にも顕著な差がないことか
ら、この範囲のpHでは液化前のpH調整が不要であること
が示された。
シウム濃度１mM、液化温度105℃（液化にはジェットク
ッカーを使用）、熟成時間45分間の条件で液化pHを4.0
〜6.0の間で変化させて、グルコース（G1）の生成量を
測定した。結果を表２に示す。この結果から、pH4.0〜p
H6.0の間では液化工程に差がないことが判明し、これに
続く糖化工程におけるG1収率にも顕著な差がないことか
ら、この範囲のpHでは液化前のpH調整が不要であること
が示された。
【００５５】
【表２】
【００５６】実施例４ マルトースの製造 （１）熟成時間の影響 マルトースの製造は熟成まではグルコースと同様に実施
し得る。その後の工程は以下のとおりである：β-アミ
ラーゼ５U/gDSを添加する；55℃、48時間糖化を行う。
反応は、HPLCを用いた糖の定量により評価し得る。
し得る。その後の工程は以下のとおりである：β-アミ
ラーゼ５U/gDSを添加する；55℃、48時間糖化を行う。
反応は、HPLCを用いた糖の定量により評価し得る。
【００５７】デンプン濃度30（W/V）%、酵素量15 DUN/g
DS、塩化カルシウム濃度１mM、液化pH6.0、液化温度115
℃（液化にはジェットクッカーを使用）の条件で熟成時
間を０分間または45分間としてマルトース（G2）の生成
量を測定した。結果を表３に示す。この結果から、グル
コースの場合と同様に、この範囲のpHでは熟成時間は不
要であることが示された。
DS、塩化カルシウム濃度１mM、液化pH6.0、液化温度115
℃（液化にはジェットクッカーを使用）の条件で熟成時
間を０分間または45分間としてマルトース（G2）の生成
量を測定した。結果を表３に示す。この結果から、グル
コースの場合と同様に、この範囲のpHでは熟成時間は不
要であることが示された。
【００５８】
【表３】
【００５９】（２）液化pHの影響 デンプン濃度30（W/V）%、酵素量15 DUN/gDS、塩化カル
シウム濃度１mM、液化温度105℃（液化にはジェットク
ッカーを使用）、熟成時間45分間の条件で液化pHを4.0
〜6.0の間で変化させて、マルトース（G2）の生成量を
測定した。結果を表４に示す。この結果から、グルコー
スの場合と同様に、pH4.0〜pH6.0の間では液化工程に差
がないことが判明し、これに続く糖化工程におけるG2収
率にも顕著な差がないことから、この範囲のpHでは液化
前のpH調整が不要であることが示された。
シウム濃度１mM、液化温度105℃（液化にはジェットク
ッカーを使用）、熟成時間45分間の条件で液化pHを4.0
〜6.0の間で変化させて、マルトース（G2）の生成量を
測定した。結果を表４に示す。この結果から、グルコー
スの場合と同様に、pH4.0〜pH6.0の間では液化工程に差
がないことが判明し、これに続く糖化工程におけるG2収
率にも顕著な差がないことから、この範囲のpHでは液化
前のpH調整が不要であることが示された。
【００６０】
【表４】
【００６１】
【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、酸性かつ高
温条件下で優れたデンプン分解活性を発揮するα-アミ
ラーゼが取得された。本α-アミラーゼは、酸性条件下
でデンプン液化能を有する優れた耐熱性をもつ酸性α-
アミラーゼであり、工業的なデンプン液化工程の工程改
善に有用な酵素である。
温条件下で優れたデンプン分解活性を発揮するα-アミ
ラーゼが取得された。本α-アミラーゼは、酸性条件下
でデンプン液化能を有する優れた耐熱性をもつ酸性α-
アミラーゼであり、工業的なデンプン液化工程の工程改
善に有用な酵素である。
【００６２】また、本発明のα-アミラーゼ産生遺伝子
を合むDNA断片が取得された。このDNA断片を用いること
によりこのα-アミラーゼの高生産微生物を育種するこ
とができ、α-アミラーゼを効率よく製造する道が開か
れた。さらに、このDNA断片は、部位特異的変異導入法
等により、酸性条件下や高温条件下で安定性の増大した
α-アミラーゼを創製するための材料にもなり得る。
を合むDNA断片が取得された。このDNA断片を用いること
によりこのα-アミラーゼの高生産微生物を育種するこ
とができ、α-アミラーゼを効率よく製造する道が開か
れた。さらに、このDNA断片は、部位特異的変異導入法
等により、酸性条件下や高温条件下で安定性の増大した
α-アミラーゼを創製するための材料にもなり得る。
【００６３】
【００６４】
【配列番号１】 配列の長さ：2179 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 株名：ＫＯＤ−１（受託番号FERM P-15007） 配列 CTGCAGGTCG AGGCTGAAAG AATAGTTATG ATACTCGAAA AGAGTGGCTT CCAGATAAAG 60 GACAGGGAAG CCCTCAAGGC CCTTATAAAG GAAGTCCTCA ATACAATCGA ACTCCGCTCT 120 CAGCCAGTCA TAAAGAGAAT TTCAGATGCC AACATTGAAC TGACGGAGAT AGAGCTGTTC 180 CACCTCCTCA ACATGCTCGT CTTCTTCCAG AGCTGCGAGC TCTGCGATCA CGCGAAAAGA 240 GTTAAAGACC TCATCTCGTT CTGATGCATC CATTCTTGTT AATTTCTATT TTGGACTTTC 300 AAGTTGTTGG CAACTCCAAC GTAACATAAA GACACAAAAC CAATATTGAG CATTGTGCAT 360 AGTAATGTTC TCCAATGTTC TTAAATGGCA AAACTTAAAT ATTTCACCAG CAGTGATACA 420 TAGAGACACC GCTGAACACA GAGGTGGTTC CATGAAGAAG TTTGTCGCCC TGCTCATAAC 480 CATGTTTTTC GTAGTGAGCA TGGCTGCCGT TGCACAGCCA GCTAGCGCCG CAAAGTATTC 540 CGAACTCGAA GAAGGCGGCG TTATAATGCA GGCCTTCTAC TGGGACGTTC CAGCGGGAGG 600 AATCTGGTGG GATACAATCA GAAGCAAGAT ACCGGAGTGG TACGAGGCTG GAATCTCCGC 660 CATCTGGATT CCGCCAGCCA GCAAGGGCAT GGGAGGAGCT TATTCAATGG GCTACGACCC 720 ATACGACTTC TTCGACCTCG GCGAGTACAA CCAGAAGGGA ACAGTTGAAA CTCGCTTTGG 780 CTCAAAGCAG GAGCTTATCA ACATGATAAA CACCGCCCAT GCCTACGGCA TAAAGGTCAT 840 AGCTGATATC GTCATAAACC ACCGCGCGGG CGGAGACCTC GAGTGGAACC CGTTCGTTGG 900 GGACTACACC TGGACGGACT TCTCGAAGGT GGCCTCGGGC AAATATACCG CCAACTACCT 960 CGACTTCCAC CCCAACGAGG TCAAGTGCTG TGACGAGGGC ACATTTGGAG GTTTCCCAGA 1020 CATAGCCCAC GAGAAGGAGA GGGACCAGCA CTGGCTCTGG GCGAGCGACG AGAGCTACGC 1080 CGCCTACCTC AGGAGCATCG GCGTTGATGC CTGGCGTTTC GACTACGTAA AGGGCTACGG 1140 AGCGTGGGTC GTCAAGGACT GGCTCAACTG GTGGGGCGGC TGGGCCGTCG GTGAGTACTG 1200 GGACACGAAC GTTGATGCAC TCCTCAATTG GGCATACTCG AGCGGCGCCA AGGTCTTCGA 1260 CTTCCCGCTC TACTACAAAA TGGACGAGGC CTTTGACAAC ACCAACATCC CGGCCTTGGT 1320 TGATGCCCTC CAGAACGGGG GAACCGTCGT CTCTCGCGAC CCGTTCAAGG CCGTAACCTT 1380 TGTAGCAAAC CACGACACCG ATATAATCTG GAACAAGTAC CCTGCTTATG CTTTCATCCT 1440 CACCTACGAG GGCCAGCCCG TCATATTCTA CCGCGACTAC GAGGAGTGGC TCAACAAGGA 1500 CAAGCTTAAC AACCTAATCT GGATACACGA CCACCTCGCG GGTGGAAGCA CGAGCATAGT 1560 CTACTACGAC AGCGACGAGC TGATCTTCGT GAGGAACGGC GACTCCAAGA GGCCGGGACT 1620 GATAACGTAC ATCAACCTCG GCTCTAGCAA GGTCGGAAGG TGGGTGTACG TGCCGAAGTT 1680 CGCGGGCGCG TGCATCCACG AGTACACCGG CAACCTCGGA GGCTGGGTAG ACAAGTACGT 1740 CGAGTCGAGC GGCTGGGTCT ATCTCGAAGC TCCAGCTTAC GACCCCGCCA GCGGGCAGTA 1800 CGGCTACACC GTCTGGAGCT ACTGCGGGGT TGGATGATAG CCCCCCTTTT CATTCCTTTT 1860 GGATTTCATA GACCTCATCC GTTAGATAAT TTCCTGTAAC TCTCTCGACC GGAATCTCAA 1920 CCGTCCCATT TCCTGTTTCA ATTCTTACCA GCACATCGTA GAGCCTCCCC CTCACTTCGA 1980 CGGTCTCGTT CACGCAGGTG GTCTCATTCG CTGTCCTGAA CTTGAAGATT AGTATTGCAT 2040 TCCTCTCTAG GCTGTAACCT ATGTAAATGG CATTGAGACA GCCGGTCAAG GTTATGCGTC 2100 TCGTTAAGGC ATCATCAAGA GTTTTGTAGC AGTTCTCTCT CCTGAAAACA AAAGTGTCAT 2160 TCTGGCTCTC CCCCTGCAG 2179
【００６５】
【配列番号２】 配列の長さ：435 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Trp Asp Val Pro Ala Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro 35 40 45 Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro 50 55 60 Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asn Gln Lys Gly Thr Val Glu 65 70 75 80 Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gln Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala 85 90 95 His Ala Tyr Gly Ile Lys Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg 100 105 110 Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Gly Asp Tyr Thr Trp 115 120 125 Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu 130 135 140 Asp Phe His Pro Asn Glu Val Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly 145 150 155 160 Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Glu Trp Asp Gln His Trp Leu 165 170 175 Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Val 180 185 190 Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val Val 195 200 205 Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr Trp 210 215 220 Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala 225 230 235 240 Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp 245 250 255 Asn Thr Asn Ile Pro Ala Leu Val Asp Ala Leu Gln Asn Gly Gly Thr 260 265 270 Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn His 275 280 285 Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 290 295 300 Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Val Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp 305 310 315 320 Leu Asn Lys Asp Lys Leu Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu 325 330 335 Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Val Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Leu Ile 340 345 350 Phe Val Arg Asn Gly Asp Ser Lys Arg Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile 355 360 365 Asn Leu Gly Ser Ser Lys Val Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys Phe 370 375 380 Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Val 385 390 395 400 Asp Lys Tyr Val Glu Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro Ala 405 410 415 Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Tyr Thr Val Trp Ser Tyr Cys 420 425 430 Gly Val Gly 435
【図１】α-アミラーゼの各pHにおける相対活性を表す
グラフである。
グラフである。
【図２】pH5.0での各温度における相対活性を表すグラ
フである。
フである。
【図３】pH5.0、100℃にて種々の時間保温した後の残存
活性を示すグラフである。
活性を示すグラフである。
【図４】KOD-1株およびP.furiosus DSM 3638株由来のα
-アミラーゼのアミノ酸配列を比較する図である。
-アミラーゼのアミノ酸配列を比較する図である。
【図５】α-アミラーゼの安定性に塩化カルシウムがお
よぼす影響を示すグラフである。
よぼす影響を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 鈴木 裕治 京都府福知山市長田野町１の52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内 (72)発明者 小島 岩夫 京都府福知山市長田野町１の52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内 (72)発明者 卯津羅 健作 京都府福知山市長田野町１の52 ナガセ生 化学工業株式会社福知山工場内
Claims (10)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有することを特徴
とするα-アミラーゼ： （１）至適pHが5.0付近である； （２）pH5.0における至適温度が100℃付近である；およ
び （３）デンプンおよびカルシウムイオンの非存在下で、
pH5.0、100℃、３時間の熱処理後、少なくとも50％以上
活性が残存する。 - 【請求項２】 超好熱菌菌株KOD-1株から得られる、請
求項１に記載のα-アミラーゼ。 - 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列または該
配列中のアミノ酸の１またはそれ以上の欠失、付加、ま
たは置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載
のα-アミラーゼ。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のα-ア
ミラーゼをコードするDNA断片。 - 【請求項５】 配列番号１の530位のＧから1834位のＡ
までのDNA配列または該DNA配列中のヌクレオチドの１ま
たはそれ以上の欠失、付加、または置換を含むDNA配列
を有する、請求項４に記載のDNA断片。 - 【請求項６】 請求項４または５に記載のDNA断片を含
むα-アミラーゼ発現ベクター。 - 【請求項７】 請求項６に記載の発現ベクターで形質転
換された、宿主細胞。 - 【請求項８】 請求項７に記載の形質転換された宿主細
胞を培養することを特徴とする、請求項１に記載のα-
アミラーゼの産生方法。 - 【請求項９】 以下の工程： （ａ）約30（W/V）%濃度のデンプンスラリーに、請求項
１〜３のいずれかに記載のα-アミラーゼを添加し、pH
を4.0〜6.0に調整する工程； （ｂ）塩化カルシウムを添加する工程； （ｃ）ジェットクッカーで液化を行う工程； （ｄ）pHを4.5に調整する工程；および （ｅ）グルコアミラーゼを添加して、糖化を行う工程、
を含む、グルコースの製造方法。 - 【請求項１０】 以下の工程： （ａ）約30（W/V）%濃度のデンプンスラリーに、請求項
１〜３のいずれかに記載のα-アミラーゼを添加し、pH
を4.0〜6.0に調整する工程； （ｂ）塩化カルシウムを添加する工程； （ｃ）ジェットクッカーで液化を行う工程； （ｄ）pHを5.5に調整する工程； （ｅ）β-アミラーゼを添加して、糖化を行う工程、を
含む、マルトースの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8191138A JPH09173077A (ja) | 1995-07-20 | 1996-07-19 | 超耐熱性酸性α−アミラーゼおよび該α−アミラーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21645495 | 1995-07-20 | ||
| JP7-216454 | 1995-07-20 | ||
| JP8191138A JPH09173077A (ja) | 1995-07-20 | 1996-07-19 | 超耐熱性酸性α−アミラーゼおよび該α−アミラーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173077A true JPH09173077A (ja) | 1997-07-08 |
Family
ID=26506524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8191138A Withdrawn JPH09173077A (ja) | 1995-07-20 | 1996-07-19 | 超耐熱性酸性α−アミラーゼおよび該α−アミラーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09173077A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0923608A4 (en) * | 1996-05-22 | 2001-04-11 | Diversa Corp | ENDOGLUCONASE |
| US6579699B1 (en) * | 1998-08-11 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing fermentative product and stress-resistant microorganism |
| EP1392815A4 (en) * | 2001-02-21 | 2005-09-21 | Diversa Corp | ENZYMS WITH ALPHA AMYLASE ACTIVITY AND METHOD FOR THEIR USE |
| US7465571B1 (en) | 1996-05-22 | 2008-12-16 | Verenium Corporation | Endoglucanases |
| JP2009039074A (ja) * | 2007-08-10 | 2009-02-26 | Toray Ind Inc | 連続発酵によるタンパク質の製造方法 |
| US7659102B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-02-09 | Verenium Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US7759093B2 (en) | 2003-03-06 | 2010-07-20 | Verenium Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8343747B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-01-01 | Verenium Corporation | Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| JP2014522700A (ja) * | 2011-07-18 | 2014-09-08 | エンピ・インコーポレイテッド | 電極、電極システム及びその製造方法 |
-
1996
- 1996-07-19 JP JP8191138A patent/JPH09173077A/ja not_active Withdrawn
Cited By (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7465571B1 (en) | 1996-05-22 | 2008-12-16 | Verenium Corporation | Endoglucanases |
| US6329187B1 (en) | 1996-05-22 | 2001-12-11 | Diversa Corporation | Endoglucanases |
| EP0923608A4 (en) * | 1996-05-22 | 2001-04-11 | Diversa Corp | ENDOGLUCONASE |
| US6579699B1 (en) * | 1998-08-11 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing fermentative product and stress-resistant microorganism |
| EP2292784A3 (en) * | 2001-02-21 | 2011-06-22 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
| US7785855B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-08-31 | Syngenta Participations Ag | Nucleic acids encoding polypeptides having amylase activity and methods of making and using them |
| JP2008206525A (ja) * | 2001-02-21 | 2008-09-11 | Verenium Corp | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| AU2002240489B2 (en) * | 2001-02-21 | 2006-01-12 | Basf Enzymes Llc | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
| AU2002240489C1 (en) * | 2001-02-21 | 2009-02-05 | Basf Enzymes Llc | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
| US10066222B2 (en) | 2001-02-21 | 2018-09-04 | Basf Enzymes Llc | Amylases, nucleic acids encoding them and method of producing an oil |
| US7659102B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-02-09 | Verenium Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US7666633B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-02-23 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of making and using them |
| AU2006207843B2 (en) * | 2001-02-21 | 2010-03-04 | Syngenta Participations Ag | Enzymes having alpha amylase activity and method of use thereof |
| EP2169076A3 (en) * | 2001-02-21 | 2010-06-30 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
| US9062295B2 (en) | 2001-02-21 | 2015-06-23 | Basf Enzymes Llc | Recombinant polypeptides |
| AU2006207843C1 (en) * | 2001-02-21 | 2010-07-29 | Syngenta Participations Ag | Enzymes having alpha amylase activity and method of use thereof |
| US7781201B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-08-24 | Syngenta Participations Ag | Polypeptides having amylase activity and methods of making and using them |
| JP2008142080A (ja) * | 2001-02-21 | 2008-06-26 | Verenium Corp | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| US7816108B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-10-19 | Syngenta Participations Ag | Methods for using polypeptides having amylase activity and nucleic acids encoding them |
| JP4690381B2 (ja) * | 2001-02-21 | 2011-06-01 | ヴェレニウム コーポレイション | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| EP2333099A2 (en) * | 2001-02-21 | 2011-06-15 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
| JP2017074070A (ja) * | 2001-02-21 | 2017-04-20 | ビーエーエスエフ エンザイムズ エルエルシー | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| EP2333099A3 (en) * | 2001-02-21 | 2011-09-07 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
| JP2011172566A (ja) * | 2001-02-21 | 2011-09-08 | Verenium Corp | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| JP2014230543A (ja) * | 2001-02-21 | 2014-12-11 | ヴェレニウム コーポレイション | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| US8334118B2 (en) | 2001-02-21 | 2012-12-18 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of making and using them |
| US8338131B2 (en) | 2001-02-21 | 2012-12-25 | Verenium Corporation | Amylases and methods for use in starch processing |
| EP1392815A4 (en) * | 2001-02-21 | 2005-09-21 | Diversa Corp | ENZYMS WITH ALPHA AMYLASE ACTIVITY AND METHOD FOR THEIR USE |
| US9701950B2 (en) | 2001-02-21 | 2017-07-11 | Basf Enzymes Llc | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8222035B2 (en) | 2003-03-06 | 2012-07-17 | Verenium Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US7759093B2 (en) | 2003-03-06 | 2010-07-20 | Verenium Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8343747B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-01-01 | Verenium Corporation | Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US10100299B2 (en) | 2006-12-21 | 2018-10-16 | Basf Enzymes Llc | Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US10883098B2 (en) | 2006-12-21 | 2021-01-05 | Basf Enzymes Llc | Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| JP2009039074A (ja) * | 2007-08-10 | 2009-02-26 | Toray Ind Inc | 連続発酵によるタンパク質の製造方法 |
| JP2014522700A (ja) * | 2011-07-18 | 2014-09-08 | エンピ・インコーポレイテッド | 電極、電極システム及びその製造方法 |
| US11040190B2 (en) | 2011-07-18 | 2021-06-22 | Djo, Llc | Electrodes, electrode systems, and methods of manufacture |
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