KR960014703B1

KR960014703B1 - 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자 및 이 유전자에 의해 코딩된 단백질

Info

Publication number: KR960014703B1
Application number: KR1019910006792A
Authority: KR
Inventors: 겐지 미쓰시마; 아끼오 다끼모또; 시게오 야기; 다까야스 소노야마
Original assignee: 시오노기세이야꾸 가부시끼가이샤; 요시또시 가즈오
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-27
Publication date: 1996-10-19
Also published as: US5338676A; CN1227872A; CN1155712C; DK0454478T3; IL97915A0; AU7535491A; EP0454478A1; DE69116593D1; AU638124B2; IL97915A; DE69116593T2; US5281525A; CN1058045A; CA2040707C; JPH04228079A; CN1047202C; KR910018549A; JP2651288B2; RU2103364C1; EP0454478B1

Abstract

내용없음.

Description

세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자 및 이 유전자에 의해 코딩된 단백질

제1도는 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

제2도는 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 염기 서열(아래줄)과 이로부터 추론된 아미노산 서열(윗줄)을 나타낸 것이다.

제3도는 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 부분결정 아미노산 서열(34 아미노산 잔기)을 나타낸 것이다.

제4도는 제3도의 밑줄친 아미노산 서열로부터 추론된 유전학적으로 가능한 모든 DNA 염기서열을 함유한 4가지의 합성 올리고뉴클레오타이드 탐침을 나타낸 것이다.

제5도는 재조합 플라스미드 pCAH01의 제한요소 절단지도와 CNA 탐침이 하이브리드화된 위치를 나타낸 것이다.

제6도는 재조합 플라스미드 pCAH03의 제한효소 절단지도를 나타낸 것이다.

제7도는 클론화 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자 절단의 CNA 서열을 나타낸 것이다.

제8도는 플라스미드 pCAH03에 상응하나 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자의 하류 영역을 삭제한 소형화 플라스미드 pCAH10의 제작을 나타낸 것이다.

제9도는 이. 콜리에서 사용된 발현 플라스미드 pCAH21의 제작을 나타낸 것이다.

제10도는 이. 콜리에서 사용된 발현 플라스미드 pCAH211과 pCAH212의 제작을 나타낸 것이다.

본 발명은 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 숙주-벡터계 에서 사용된 벡터에 이 유전자를 도입시켜 제조된 제조합 DNA 분자, 이 재조합 DNA 분자로 형질 전환된 이. 콜리 균체, 이 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열을 가진 단백질, 이 단백질의 멀티머(multimer), 바람직하게는 테트라머 또는 옥타머를 함유하는 효소 및 이러한 단백질 또는 효소의 제조방법에 관한 것이다.

지금까지 세팔로스포린 C 및 7-아미노세팔로스포란산(이하, 7-ACA라고 약기한다)과 같은 세팔로스포린류는 3-위치의 히드록시메틸기에 결합되어 있는 아세틸기를 제거(이하, 탈아세틸반응이라 한다)함으로써 탈아세틸세팔로스포린 C 및 탈아세틸 7-ACA와 같은 탈아세틸 화합물로 유도되었으며, 이들은 이미 시판중인 것인 포함한 각종의 세팔로스포린 항생물질을 합성하는 출발물질로서 유용하다.

세팔로스포린의 탈아세틸 방법으로서, 화학적 및 효소적 방법이 있다. 이들 방법 중에서, 어느정도 약 중성의 pH와 온화한 온도에서 수행될 수 있으며 부반응을 덜 수반하기 때문에 후자의 반응이 유리한 것으로 여겨진다. 몇가지의 효소적 반응이 이미 기재되어 있다(예: 일본국 특허 공보 제108,790/1984호, 제132,294/1974호 및 제67,489/1986호, 및 미합중국 특허 제3,304,236호).

본 발명자들은 모양으로부터 분리해낸 바실러스 서브틸리스(Bacilus Subtilis)의 균주가 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 생산하며 세팔로스포린의 탈아세틸화에 의해 탈아세틸세팔로스포린을 효과적으로 생산함을 알아내었다. 이러한 발견으로서 본 발명자들은 재조합 DNA 기술에 의해 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 선택적으로 생산할 수 있는 미생물을 구성하면 공업적으로 탈아세틸세팔로스포린을 제조하는데 매우 유리할 것이라고 생각하게 되었다. 이렇게 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제만을 현저하게 생산하는 미생물은 지금까지 공지되지 않았다.

본 발명자들은 광범위하게 연구하여 토양으로부터 새로이 단리해 낸 바실러스 서브틸리스로부터 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 보유하고 있는 DNA 단편을 단리하고 이. 콜리에서 이 단편을 클로닝하는데 성공하였다. 또한 이 DNA 단편을 삽입한 플라스미드 DNA 벡터로 형질전환된 이. 콜리가 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 상당량 생산함을 알아내었다. 본 발명은 이러한 발견을 근거로하여 완성되었다.

따라서, 본 발명은 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자, 이 재조합 DNA 분자에 의해 형질전환된 이. 콜리 균체, 이 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이 단백질의 멀티머를 보유하는 효소 및 이러한 단백질 또는 효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따라 수득한 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 생산하는 새로이 단리된 균주 바실러스 서브틸리스 SHS 0133은 부다페스트 조약에 따라 통상 산업상 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(일본국 305 이바라까껭 쓰꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 수탁번호 FERM BP-2755(수탁일 : 1990. 2.15.)로 기탁되어 있다.

바실러스 서브틸리스 SHS 0133의 특성

1. 염색체 DNA의 몰 퍼센트(G+C)(%) : 43.4

2.형택적 특성

이 균주는 그램 양성의 단간균이며, 길이가 0.7~0.8×1.8~2.6㎛이고, 편모가 돌출되어 있다. 이 균주는 호기적 조건하에서 잘 생육하며 혐기적 조건하에 글루코스를 함유한 천연 배지에서도 약하게 생육한다. 균체의 중앙에는 크기가 0.8×1.3~1.7㎛인 포자가 형성된다.

3. 배양 특성

(1) 육즙 한천 평판 배지(30℃,7일간)

콜로니 형성 : 접종 후 24시간

모양 : 불규칙

표면 : 주름이 있음

가장자리 : 물결 모양

높은 곳 : 볼록

색상 : 크림색

광택 : 흐림

광학적 성질 : 불투명

(2)육즙 한천 사면배지(30℃, 7일간)

생육 : 양호

모양 : 섬유모양

표면 : 주름이 있음

색상 : 크림색

광택 : 흐림

광학적 성질 : 불투명

점조성 : 버터질

(3) 육즙 액체 배양(30℃, 7일간)

표면의 생육상태 : 두꺼운 필름이 형성

탁도 : 소량

냄새 : 약간의 향기

침강 : 점조

침강량 : 소량

(4) 육즙 젤라틴 천자 배양(24℃, 30일간)

생육 : 천자 가장자리를 따라 균일하게 생육

균층의 모양 : 섬유모양

액화의 형태 : 24 ℃에서 7일간 지층상에 0.5㎜ 액화함(층상형)

(5) 리트머스 밀크 배양

리트머스는 환원됨. 카제인 응집없이 신속히 분해된다.

4. 생화학적 특성

(1) 질산염의 환원 : 양성

(2) 탈질소 반응 : 양성

(3) MR 시험 : 음성

(4) VP 시험 : 양성

(5) 인돌의 생성 : 음성

(6) H₂S의 생성 : 아세트산납지 : 음성

TSI : 음성

크리글러 : 음성

(7) 전분의 가수분해 : 양성

(8) 시트르산의 이용 : 코서 : 양성

크리스텐센 : 양성

(9) 무기질소원의 이용 : 질산염 : 양성

암모늄 : 양성

(10) 색소의 생성 : 갈색의 색소가 생성

(11) 우레아제 시험 : 양성

(12) 옥시다아제 시험 : 양성

(13) 카탈라아제 시험 : 양성

(14) pH : 생육범위 : 1.5~8.8

최적 : 6.0~8.8

(15) 온도 : 생육 범위 : 16.5~50.5℃

최적 : 26.0~36.0℃

(16)OF 시험 : D-글루코스: 발효적으로 발생기체 없이 산을 생산함.

락토오스 : 발효적으로 발생기체 없이 산을 생산함.

(17) 당류로부터의 산과 기체의 생성 :

i) 하기의 당류는 산을 생성하고 기체를 생성하지 않음.

L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-만노오스, D-프룩토스, 말토오스, 슈크로오스,트레할로스, D-만니톨, 글리세롤 및 전분 :

ii)하기의 당류는 산과 기체를 모두 생성하지 않음.

D-갈락토스, 락토오스, D-소르비톨 및 이노시톨

(18) 영양 요구성 : 없음

(19) 펙틴의 분해 : 양성

(20) 마뇨산의 분해 : 음성

(21) 레반의 생성(슈크로오스, 라피노오스로부터) : 양성

(22) 아르기닌 히드롤라아제 : 음성

(23) 레시티니아제 : 음성

(24) 혐기적 조건하에서의 생육 : D-글루코스를 함유하는 천연 배지에서 약하게 생육

상기의 결과로부터, 본 균주는 문현(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. Ⅱ,1986)을 근거로 하여 바실러스 서브틸리스 균주의 일종임을 확인하였으며 바실러스 서브틸리스 SHS 0133이라 명명하였다.

본 발명은 제1도에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 염기 서열, 바람직하게는, 제2도에 나타낸 염기 서열을 단리하여 이. 콜리 숙주-벡터계에서 사용된 벡터에 도입함으로써 제조된 제조함 DNA 분자로 형질전환된 재조합 미생물을 사용하여 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 제조하는 방법을 포함한다. 이 방법은 본 발명에 의해 세팔로스포린 아세릴히드롤라아제를 코딩하는 DNA 염기 서열이 밝혀졌으므로 더욱 간단하게 수행할 수 있으나, 본 발명의 발전 과정을 나타내는 하기의 7 단계로 나타낼 수 있다.

(1) 바실러스 서브틸리스(FERM BP-2755)를 적당한 배지에 배양하여 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 생산하게 하고, 생성된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 배지로부터 분리하고 정제한다. 정제된 효소를 단백질의 단편화에 사용되는 적당한 프로테아제로 분해시키고, 생성된 펩타이드 단편을 분리한 후, 아미노 말단으로부터 펩타이드 단편의 아미노산 서열을 결정한다.

(2) 결정된 아미노산 서열 부분에 상응하는 가능한 DNA 염기서열을 추론해내고, 추론된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 풀(pool)을 화학적으로 합성하고, 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단을³²P로 라벨링한다. 라벨된 올리고뉴클레오타이드를 유전자 클로닝의 탐침으로서 사용한다.

(3) 바실러스 서브틸리스(FERM BP-2755)로부터 염색체 DNA를 추출 및 정제하고, 각종의 제한효소로 분해하고, 아가로스 겔 상에서 전기영동하고, 분리된 DNA 단편을 겔에서 니트로셀룰로오스 막상으로 이동시킨다. 니트로셀룰로오스 막과 상기의 단계 (2)에서 제조된³²P-라벨 탐침을 사용하여 서던 하이브리드화 (Southern hybridization)를 행하여 탐침과 동일함을 나타내는 DNA 단편을 선택한다. DNA 단편 중에서, 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 단백질의 분자량으로부터 기대되는 목적하는 유전자의 크기보다 다소 큰 단편을 선택하여, DNA 단편을 함유하는 아가로스 겔 상의 관련 영역을 절제하고, DNA를 추출한다. (4) 상기의 단계(3)으로부터의 DNA 단편을 이. 콜리 클로닝 벡터에 삽입하고 생성된 재조합 플라스미드를 이. 콜리 세포로 도입하여 형질전환시킨다. 형질전환체를 한천 배지 상에 얇게 덮어 콜로니를 형성시키고,³²P-라벨탐침을 사용하여 콜로니 하이브리드화를 행한다. 탐침과 동일함을 나타내는 이. 콜리의 콜로니를 선택하여 단리한다.

(5) 선택된 이. 콜리 균체로부터 재조합 플라스미드 DNA 를 추출하고 제한 효소 절단 지도를 작성한다. 이어서, 세팔로스포린 히드롤라아제 유전자와 관계없는 부분을 제거한다. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 코딩하는 바실러스 서브틸리스-유래의 DNA 단편의 염기서열을 결정한다. 결정된 DNA 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열을 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 부분 아미노산 서열, 분자량, 말단 아미노산 분석 및 아미노산 조정 분석과 비교하여, 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 구조 유전자를 결정한다.

(6) 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 보유하는 DNA 단편을 적당하게 변형한 후 이. 콜리용 유전자 발현 벡터에 도입하여 이. 콜리로부터 프로모터가 유도된 후 구조 유전자를 연결하여 발현용 재조합플라스미드를 제작한다.

(7) 상기에서 수득한 재조합 발현 플라스미드를 이. 콜리 숙주에 도입하여 형질전환시켜 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 생산하는 신규의 이. 콜리 균주를 제조한다.

상기의 단계에서 사용된 방법은 본 분야의 숙련자들에게는 공지된 것이며 일반적인 실험 조작서[예 : "Molecular Cloning", T. Maniatis등, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]에 기재된 실험 방법에 따라 용이하게 행할 수 있다. 효소 및 시약과 같이 사용된 모든 재료는 시판되는 것이며 제품에 지정된 사용 조건에 따라 사용할 수 있다.

숙주로서 사용되는 이. 콜리는 HB101, DH1, C600, JM103, JM105 및 JM109와 같은 이. 콜리 K-2 계통의 균주이다. 클로닝에 사용되는 이. 콜리 벡터로는 λ_gt10과 같은 파아지 벡터 이외에 pUC 13, pBR 332 및 pAT 153과 같은 플라스미드 벡터를 예시할 수 있다. 상기의 숙주와 벡터는 시판 중인 것이며 쉽게 얻을 수 있다.

상기의 단계 (1)에서, 단백질의 아미노산 서열결정방법은 공지되어 있다(예를 들면, 시판 중인 자동 아미노산 서열기를 사용할 수 있다). 상기의 단계(2)에서, 실험서의 조작서에 따라, 시판 중인 DNA 합성기를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 합성을 행할 수 있다. 상기의 단계(5)에서, DNA 염기서열의 결정은 공지의 M13 벡터계를 사용한 생거(Sanger)등에 의한 방법(Proc. Natl. Acad, Sci U.S.A., 74, 5463~5467(1977)DP eKFK TNGOD에 다라 수행할 수 있다.

상기의 단계(6)에서, 이. 콜리에서 목적하는 유전자를 효과적으로 발현시키는 플라스미드의 제작은 목적하는 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 구조 유전자를 보유하는 DNA 단편을 숙주내에서 작용하는 적당한 프로모터(Lac, Tac, Trc, Trp, P_L등) 및 시네-달가르노(Shine-Dalgarno : SD) 서열을 갖는 발현 벡터(pKK 223-3, pBS,pDR 540, pPL-람브다 등)에 삽입하건, 또는 추가로 번역개시 코돈 ATCT를 보유하는 ATG 벡터(pKK 233-2 등)에 삽입함으로써 수행할 수 있다. 발현 플라스미드를 적당한 숙주(예 : 이.콜리 JM103,JM109,HB101 및 C600과 같은 균주)에 도입함으로써 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 효과적으로 발현하는 미생물을 수득한다.

통상적인 정제법에 따라, 예를 들면, 원심분리, 컬럼 크로마토그래피 등을 함께 사용함으로써 발현된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 정제할 수 있다.

본 발명을 하기의 실시예예 의해 추가로 예시하며, 여기에 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 분리와 정제 및 아미노산 서열의 부분 결정

(1) 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 분리와 정제

2.5% 글루코스, 0.75% 콘스팁리쿼,1.0% 아미노산 혼합물, 0.3% KH₂PO₄및 0.8ppm MnSO₄4H₂O 로 구성된 pH 7.0의 배지(20ℓ)을 30ℓ 용량의 자(jar)-발효조에 주입한다. 살균후, 05% 글루코스, 0.75% 콘스팁리쿼, 05% 아미노산 혼합물, 및 0.02% KH₂PO₄로 구성된 pH 7.0의 배지에서 전배양한 바실러스 서브틸리스(FERM BP-2755)를 배지에 부여 접종수가 6%가 되도록 한다. 28℃에서 48시간 배양 후, 배양액에1%의 활성탄을 가하여 2시간동안 교반한다. 그후 여과하여 여과액으로서 조효소 용액을 수득한다. 이 조효소 용액에 0.7%로 DEAE 세파덱스 A-50(Pharmacia사 제조)를 가하고, 2N N_aOH를 사용하여 혼합물의 pH를 8.0으로 조절한 후, 1시간동안 교반한다. 여과후, 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 활성이 흡착된 DEAE 세파텍스 A-50을 0.1M N_aCI을 함유한 50mM 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0, 4ℓ)로 세척한 후, 0.4M N_aCl을 함유한 동일 완충용액으로 활성을 용출해낸다. 한외여과 장치(Tosoh사 제작)를 사용하여 농축 및 탈염한 후, 동일 완충용액으로 미리 평형을 맞춘 DEAE 세팔로스 CL-6B(Pharmacia 사 제조)로 채운 컬럼상에 활성을 흡착시킨다. 컬럼을 동일 완충용액으로 세척한 후 0.15M N_aCl을 함유한 완충용액으로 세척하고, 0.2M N_aCl 을 함유한 동일 완충용액으로 활성을 용출해낸다. 한외여과에 의해 농축 및 탈염한 후, 고성능 액체 크로마토그래피(이하, HPLC 라 한다)로 정제를 행한다. 컬럼으로서 DEAE 도요피얼팩(Toyopearlpak) 650M(Tosoh사 제조)을 사용한다. 활성은 염농도기 연속적으로 상승하는 농도구배 용출법에 의해 용출해낸다. 따라서, 0.15M N_aCl 을 함유하는 동일 완충용액으로 시작하여, 최종 N_aCl 의 농도는 연속적으로 0.5M까지 상승한다. 용출된 활성을 함유하는 분획을 수집하고, 한외여과로 농축한 후 분자체 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제한다. 컬럼으로서 TSK-G3000(Tosoh사 제조)을 사용하고 이동상으로서 0.2M포스페이트 완충용액(pH 7.0)을 사용한다. 용출된 활성 분획을 수집하고, 한외여과로 농축한 후 역상 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제한다. 컬럼으로서 마이크로본다팩(Microbondapak) C₁₈(Waters사 제조)을 사용하며 아세토니트릴 농도가 연속적으로 상승하는 농도구배 용출법으로 용출을 행한다. 따라서 0.1% 트리플루오 아세트산을 함유하는 수성계로 출발하여, 아세토니트릴 농도는 최종적으로 98%까지 상승한다. 용출된 세팔로스포린 아세틸히드를라아제를 함유하는 분획을 50℃에서 감압하에 농축하고 잔류물을 6M 구아니딘히드로클로라이드를 함유하는 0.5M 트리스-HCl 완충용액 (pH 8.0)에 용해시킨다. 이 용액에 EDTAC에틸 렌디아민테트라아세트산)을 가하여 2mM의 농도가 되도록하고, 이 용액에 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제에 대하여 200배 몰량의 2-메르캅토에탄올을 가하고, 질소 대기하에서 37℃에서 4시간동안 환원을 행한다. 이어서, 이 용액에 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제에 대하여 190배 몰량의 나트륨 요오도아세테이트를 가하고 차광하에 37℃에서 10분간 환원 카르복시메틸화 반응을 행한다. 이어서, 상기의 방법에 따라 역상 컬럼을 사용하여 HPLC로 다시 정제를 행한다 라엠리(Laemmli)의 방법(Nature, 277, 680~685(1970)에 따라 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 생성된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 분획을 분석한다. 분자량 35_KD의 위치에서 단일 밴드만이 검출되었으며, 이는 정제가 균일하게 수행되었음을 나타내는 것이다. 또한, 7M 우레아를 함유하는 0.1M 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)에 용해된 정제된 세팔로스포린 아세틸히디를라아제가 0.1M 포스페이트 완충용액(pH 7.0)으로 10배 희석하여 재활성화되고, 상기의 HPLC를 사용한 분자체 컬럼 크로마토그래피에 의해 분자량이 280kD인 위치에서 활성이 용출된다는 사실은 천연상태의 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제가 균일한 서브유니트로 구성된 옥타머(octamer)임을 나타내는 것이다.

한편, 헤드리크(Hedrick)등의 방법(Arch, Biochem, Biophys, 126, 155~164(1968))을 사용하여 결정한 분자량은 150kD이었으며 관련 위치에서 활성을 검출하였으며, 이는 테트라머도 역시 활성이 있음을 나타내는 것이다.

에드만(Edman) 분해과 히드라진 기수분해에 의해 정제된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 아미노산말단 분석을 행하여 아미노 말단이 메티오닌이며 카르복시 말단이 글리신임을 확인하였다.

(2) 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 아미노산 서열의 부분결정

정제된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제(1㎎)을 2M 우레아를 함유하는 01M 트리스-HCl 완충용액(pH 8.8) (1.0ml)에 용해시키고, 이 용액에 리실렌도펩티디아제(0.01㎎)을 가하고 혼합물을 37℃에서 4시간동안 반응시킨다. 이어서 반응 혼합물을 HPLC로 분리시킨다. 컬럼으로서 마이크로본다팩 C₁₈(Waters사 제조)을 사용하고 아세토니트릴 농도가 연속적으로 상승하는 농도구배 용출법으로 용출을 행한다. 따라서, 0.1%트리플루오로아세트산을 함유하는 수성계로 시작하여, 아세토니트릴의 최종 농도는 98%로 상승한다. 검출은 214nm에서 행한다. 분리된 피크 중에서, 체류시간이 긴 명확한 분획을 수집하고 동일한 역상컬럼을 사용하여 다시 정제하고, 기체상 자동 아미노산 서열기(Applied Biosystems사 제작)를 사용하여 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하여 제3도에 나타낸 바와 같이. 펩타이드 분획의 아미노 말단에서 34번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 결정한다.

2. DNA 탐침의 합성과 5-말단의 라벨링

상기의 단계 1에서 수득한 제3도에 나타낸 아미노산 서열에서 밑줄친 서열을 선택하고 이 아미노산 서열로부터 추론되는 모든 유전학적으로 가능한 DNA 염기 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드의 풀을 합성한다. 제4도에서 나타낸 바와 같이. DNA 탐침 CAH-RM1, CAH-RM2, CAH-RM3 및 CAH-RM4로 표시된 4군의 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 올리고뉴클레오타이드의 합성은 자동 DNA 합성기 제온-제네트(ZEON-GENET) A-Ⅱ(Nihon Zeon사 제작)을 사용하여 행한다.

생성된 DNA 탐침의 5'-말단은 왈레이스(Wallace)등의 방법(Nucleic Acids Res, 6, 3543 3557(1979))에 따라서 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 및 [γ-³²P] ATP를 사용하여 라벨링한다.

3. 바실러스 서브틸리스로부터의 염색체 DNA의 추출과 정제 및 서던 하이브리드화 반응

바실러스 서브틸리스(FERM BP-2755)의 균체를 리소자임으로 처리한 후 나트륨 N-라우로일사르코시네이트로 처리하고, 해리스-와리크(Harris-Warrick) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 2207~2211(1975))에 따라서 CsC1-에티듐 브로마이드 평형 밑도구배 초원심분리법에 의해 생성된 라이세이XM로부터 염색체 DNA를 추출 및 정제한다. 적당한 조건하에서 각종의 제한 효소(각각 약 10유니트)로 DNA (1㎍)를 분해시키고, 0.8% 아가로스겔 상에서 반응물을 전기DUD동시킨다. 제한효소 절단 패턴을 분석한 후, 서던(Southern)등의 방법(J. Mo1. Bio1., 98, 503 517(1975))에 따라 겔을 서던 하이브리드화 한다. 0.5N N_aOH를 함유하는 1.5M N_aCl 용액으로 겔을 실온에서 1시간도안 처리하여 DNA를 변경시킨 후, 실온에서 1.5M N_aCl을 함유하는 1M 트리스-HC1 완충용액(pH 7.0)으로 1시간동안 중화시킨다. 겔 위에 니트로셀룰로오스 막을 놓고 DNA를 겔에서 막으로 이동시킨다. DNA가 이동된 니트로셀룰로오스 막을 사용하여, 라벨된 탐침으로 하이브리드화를 행한다. 4배 농도의 SSC(1×SSC : 0.15M N_aC1, 0.015M 나트륨 시트레이트, pH 7.0), 10배 농도의 덴하르트(Denhardt) 용액(1×덴하르트 용액 : 0.02% 피콜, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소의 혈청 알부민), 및 약 1×10⁶cpm/ml의 라벨된 탐침을 사용하여 38℃에서 하룻밤 하이브리드화를 행한다. 실온에서 SSC 의4배 농도로 막을 수회 세척한 후, 오토라디오그래피를 행한다. 또한, 막의 세척온도를 단계적으로 상승시키고, 각 경우마다 반복하여 막에 오토라디오 그래피를 행한다. 48℃ 및 53℃의 높은 세척 온도에서도 몇몇 DNA 벤드는 양성 시그날을 나타내었으며, 사용된 제한 효소에 따라 하이브리드화 밴드의 크기는 각각 다르다는 것을 알아내었다. 양성 시그날을 나타내는 DNA 분획 중에서, 목적하는 유전자보다 크기가 크기 때문에, 2.5~3kb의 Dra I 로 분해된 분획과 4~4.5kb의 HindⅢ로 분해된 분획이 유전자 클로닝에 바람직하다.

4. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자의 클로닝

(1) 유전자 라이브러리의 제작

상기의 단계 3에서 추출 및 정제한 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA(12㎍)에 제한효소 Dra I(약 120유니트)를 가하고 37℃에서 90분간 배양한다. 같은 부피의 페놀로 반응물을 추출한 후, 생성된 수층에 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. 생성된 DNA TE 완충용액[10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0](60㎕)에 용해시키고, 생성된 용액을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동시키고, 2~4kb의크기에 상응하는 겔의 영역을 절제한다. DNA 분획을 용출하고 시판 중인 키트(kit)(Bio 101사 제조, GENECLEAN)을 사용하여 겔로부터 회수하고, TE 완충용액(30㎕)에 용해시킨다.

한편, 유전자 라이브러리를 제작하기 위한 벡터로서 pUC13을 사용한다. pUC13(10㎍)을 제한 효소 SmaI(약 100유니트)와 혼합하고, 37℃에서 140분간 배양한 후 65℃에서 80분간 반응시킨다. 상기의 방법에 따라 DNA를 페놀 추출 후 에탄올 침전법을 행하고 최종적으로 DNA를 TE 완충용액(50㎕)에 용해시킨다.

바실러스 서브틸리스 염색체의 Dra I로 분해된 분획을 함유하는 용액(7.5㎕)과 벡터 pUC13(2.5㎕)의 Sma I-BAP 처리 분획을 함유하는 용액을 혼합하고, 이 혼합물을 6℃에서 20시간동안 T4 DNA 리가아제와 배양하여 분획을 연결시켜 제조합 DNA를 형성한다. 하나한(Hanahan)등의 방법(J.Mol.Biol. 166, 557~580(1983)에 따라 생성된 재조합 DNA를 이. 콜리 HB101 균주를 형질전환시키는데 사용한다. 이어서, 40㎕/ml 앰피실린을 함유하는 L-브로스[1% 박토-트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaC1(pH 7.3)한천 배지가 놓인 니트로셀룰로오스 막에 콜로니를 형성시킨다. 이들 콜로니를 바실러스 서브틸리스의 유전자 라이브러리로서 나타낸다.

(2) 콜로니 하이브리드화에 의한 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제-양성클론의 선택

상기의 단계(1)의 니트로셀룰로오스 막에 형성된 콜로니를 다른 니트로 tpf룰로오스막에 복제한다. 40㎍/m1의 앰피실린을 함유한 L-브로스 한천 배지에 복제막을 놓고 37℃에서 3시간동안 배양한다. 이어서, 250㎍/m1의 클로르암페sl콜을 함유하는 L-브로스 한천 배지상에 막을 이동시키고 37℃에서 하룻밤 배양한다. 이어서, 그룬스xk인(Grunstein) 등의 방법(Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961~3965 (1975))에 따라 실질적으로 콜로니 하이브리드화를 행한다. 막을 0.5N NaOH로 처리하여 콜로니를 용균하고 DNA를 변성시킨다. 이어서, 1M 트리스-HC1 완충용액(pH7.2)으로 5~10분간 처리한 후 추가로 1.5M NaC1을 함유하는 1M 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 10~15분간 처리하여 막을 중화시킨다. 막을 80℃에서 2시간동안 감압하에 베이크하여 DNA를 막에 고정시키고, 고정화 DNA를 라벨된 탐침 CAH-RM2로 하이브리드화 한다. 반응은 4배 농도의 SSC, 10배 농도의 덴하르트 용액 및 약 2×10⁶cpm/m1의 라벨된 탐침을 함유한 용액에서 38℃에서 16시간동안 수행한다. 이어서, 실온에서 4배 농도의 SSC로 막을 3~4회 세척한 후 38℃에서 2분간 세척하고 오토라디오그래피 행한다(김광조건: -80℃, 3시간). 세척 온도와 오토라디오그래피상의 시그날의 감도와의 관례를 조사하기 위하여, 세척온도를 단계적으로 상승시키고 각각의 경우에 오토라디오그래피를 행한다. 43℃, 48℃ 및 53℃에서 각각 2분간 세척을 행한다.

그 결과, 약 30,000 콜로니 중에서 3개가 높은 세척온도에서 양성 시그날을 나타냄을 알았다. 이들 콜로니를 37℃에서 40㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 L-브로스(5ml)에서 액체 배양하여 wo조합 플라스미드를 제작한다[비른보임(Birnboim) 등의 방법, Nucleic Acids Res., 7, 1513~1523(1979)]. 벡터] DNA(pUC13)에 절단 부위가 있는 EcoR I, HindⅢ 및 PvuⅡ과 같은 제한효소로 이들 프라스미드를 절단하고 단편화한다. 이어서, 아가로스 겔 상에서 전기영동을 행하고 라벨된 탐침과의 서던 하이브리드화를 행한다. 그 결과, 제한효소로 분해된 분획을 함유하는 제조합 플라스미드 3개중 2개가 DNA 탐침과 명백히 하이브리드화 되었음을 알 수 있다. 두 양성 플라스미드 간에 하이브리드화 단편의 크기가 다르기 때문에, 벡터 DNA에 삽입된 DNA 단편은 서로 다르게 나타난다. 따라서, 각각의 재조합 플라스미드는 구별되며 pCAH01과 pCAH02로 나타낸다.

5. 양성 클론의 확인 및 염기 서열의 결정

(1) 양성 클론의 확인

각종의 제한효소로 절단함으로써 재조합 플라스미드 pCAH01과 pCAH02의 제한효소 절단지도를 작성하는 과정에서, 플라스미드 pCAH01은 2가지의 다른 Dra I 로 분해된 단편이 있으며 플라스미드 pCHAH02는 벡터 DNA상의 Smai 부위에 삽입딘 적어도 3개의 다른 Dra I로 분해된 단편이 있고, DNA 탐침이 이들 Dra I 단편 중 하나와 하이브리드화되었음을 알아내었다. 결과적으로, 계속되는 조작에서 재조합 플라스미드 pCAH01이 사용된다. DNA 탐침이 하이브리드화된 위치와 함께 플라스미드 pCAH01의 제한효소 절단지도를 제5도에 나타내었다.

플라스미드 pCAH01은 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA로부터 유래된 두개의 외래 Dra I 단편(1.8kb 및 2.5kb)을 보유하고 있으며 2.5kb 단편만이 DNA하이브리드화 되어 있으므로, 1.8kb Dra I 단편은 플라스미드로부터 삭제한다. 2.5kb 단편을 보유하는 Dra I -Pst I 단편(2.4kb)을 플라스미드 pCADl로부터 제거하고 벡터 플라스미트 pUC13의 Sma I-pst 부위에 삽입하여 소형화된 재조합 플라스미드

pCAH03(5.3kb)를 수득한다. 재조합 플라스미드 pCAH03의 제한효소 절단지도를 제6도에 나타내었다.

(2) 염기 서열의 결정

재조합 플라스미드 pCAH03으로부터, DNA 탐침이 하이브리드화 되어 있는 0.24kb EcoR I-HindⅢ 단편을 제거하고 생거(Sanger) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 74, 5463~5467(1977)) 에 따라 그의 DNA 염기서열을 결정한다. 그 결과, 상기의 단계 1에서 수득한 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 부분 아미노산 서열에 상응하는 염기서열을 결정한다. 그 결과, 상기의 단계 1에서 수득한 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 부분아미노산 서열에 상응하는 염기서열을 EcoR I - HindⅢ 단편에서 발견하였으며, 이 단편은 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자의 일부를 보유함을 밝혀내었다. 플라스미드 pCAH03의 제한효소 절단지도를 근거로하여 Dra I 와 HindⅢ 부위 사이의 염기서열(0.38kb)과 EcoR I 과 EcoR I 부위 사이의 염기 서열(1.45kb)을 차례로 결정하여, Dra I 와 EcoR I 부위 사이의 약 2kb의 염기서열을 제7도에 나타내었다. 이는 번역 개시 코돈 ATG에 의해 코딩된 메티오닌을 포함한 318 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코딩하는 염기서열이 존재함을 증명하는 것이다. 또한, 상기의 염기 서열에 의해 코딩된 것으로 추정되는 단백질은 분자량, 아미노-말단 및 카르복시-발단의 아미노산, 및 리실렌도펩티타아제로 분해된 분획의 아미노산 조성의 면에서 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제와 일치됨을 나타내므로, 이 단백질은 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제인 것으로 믿어진다. 따라서, 플라스미드 pCAH03 상의 바실러스 서브틸리스-유래의 DNA 단편에는 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 구조 유전자를 완전히 보유하고 있음이 명백해진다.

6. 발현 플라스미도의 제작

플라스미드 pCAH03 상에 클론된 바실러스 서브틸리스- 유래의 DNA 단편은 세팔로스포린 아세틸하드롤라아제 유전자 이외의 영역을 보유하고 있으므로, 제8도에 나타낸 방법에 따라 유전자의 형질 발현과 무관하다고 생각되는 영역을 삭제한다.

일반적으로 이. 콜리내의 이종 유전자를 고발현시키기 위해서, 고발현 효능을 가진 프로모터, SD 서열 및 번역 개시 코돈 ATG 가 배열된 직후 목적하는 구조 유전자를 연결한 발현 플라스미드를 제작하는 것이 효과적이다. 따라서, 이 콜리 내에서 다량의 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 생산하기 위해서, 제9도에 나타낸 방법에 따라, 프로모터, SD 서열 및 ATC를 보유하는 벡터를 사용하여 발현 플라스미드를 제작한다. 제작과정 중에서, 세팔로스포린 아서틸히드롤라아제 구조 유전자는 하기와 같이 제조할 수 있다. 목적하는 유전자를 보유하는 영역을 모두 M13mp계 벡터에 클론하여 1가닥의 DNA를 수득한다. 소위 프라이머신장법에 따라, 프라이머로서 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 아미노 말단 서열상의 메티오닌을 제외한 수개의 아미노산을 규정한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 구조 유전자 부분만이 2가닥인 DNA 단편을 수득하였다.

제10도는 제9도의 방법에 의해 제작된 발현 플라스미드에 비하여 카피수가 증가된 변형된 발현 플라스미드를 제작하는 방법을 나타낸 것이며, 이 플라스미드는 앰피실린 내성 마커(Ap^r)대신에 테트라사이클린 내성 마커(Tc^r)을 가지고 있다.

하기에서 각 단걔를 더욱 자세하게 기술하겠다.

(1) 소형화 플라스미드의 제작

세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 구조 유전자(제8도에서는 CAH로서 약기)의 하류영역을 단축시키기 위해서, EcoRV 와 BamH I 으로 플라스미드 pCAH03을 절단하고, 수득한 약 4.1kb의 DNA 단편을 정제한후, DNA 폴리머라아제 클레노우 단편을 사용하여 BamH I 분해에 의해 생긴 비어있는 3'-말단을 채운다 (제8도). 추가의 정제 후, T4 DNA리카아제를 사용하여 연결 반응을 행하여 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 보유하는 소형화 플라스미드 pCAH10을 제작한다.

(2) 발현 플라스미드 제작을 위한 1가닥 DNA의 제조

상기의 단계(1)에서 제조한 소형화 플라스미드 pCAH10을 Sac I 과 Sal I 으로 절단하여 수득한 약 1.5kb의 단편을 정제하여 Sac I -Sa1 I 단편으로서 회수한다. 한편, 파아지 M13mp11의 2가닥 DNA를 Sac I 과 Sal I 으로 절단한다. 후자의 DNA에 상기의 Sac I -Sal I 단편을 첨가하고 T4 DNA 리가아제로 연결하여 완전한 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 보유하는 파아지 M13-CAH 2가닥 DNA를 제작한다. 이어서, 메싱(Messing)의 방법(Methods in Enzymology, 101, 20~78 (1983))에 따라 1가닥 DNA를 제조한다.

(3) 프라이머 신장

기본적으로 고에델(Goeddel) 등의방법(NucleicAcidsRes.,8, 4057~ 4074 (1980))에 따라, 바실러스 서브틸리스의 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 개시 부위(ATG) 상류에 위치하는 단백질 -비코딩 영역을 제거함으로써 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 구조 유전자를 함유하는 영역을 제조한다. 프라이머 신장법에 사용되는 프라이머로서 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 아미노 말단 글루타민으로부터 6번재의 프롤린에 상응하는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 CAH-P1이라 명명한다. 이어서, 상기의 단계(2)에서 제조한 파아지 MB-CAH의 1가닥 DNA(7.5㎍)에 프라이머 CAH-P1(3피코몰)을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 20분간 가열한 후 실온에서 유지시킨다. 이어서, 혼합물에 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(각 0.25mM)와 DNA 폴리머라아제 클레노우 단편(2유니트)을 첨가하여, 7mM 트리스-HCl 완충용액(pH 7.5) MgCl₂0.1mM EDTA 및 20mM NaCl의 반응 혼합물(20㎕)내에서 37℃에서 2시간동안 프라이머 신장을 행한다. 반응후, 페놀 추출법과 에탄올 침전법을 행한다.소량의 증류수에 DNA를 효ㅇ해시키고, 여기에 S1 뉴클레아제(4유니트)를 가하고 30mM 아세트산나트륨(pH 4.6), 10mM NaCl 및 1mM ZnSO₄의 반응 혼합물(40 ㎕)에서 37℃에서 30분간 배양하여 잔류의 1가닥 DNA를 분해한다. 수득한 2가닥 DNA 단편을 함유한 용액을 페놀 추출후 에탄올 침전법을 행하고, 일단부의 수복 반응을 위해 상기의 방법에 따라 DNA 폴리머라아제 클레노우 단편으로 DNA를 처리한다.

(4) 발현 플라스미드의 제작

본 실시예에서 사용된 발현 플라스미드 제작에 사용된 벡터pKK233-2(암피실린 내성)는 파마시아(Pharmacia)사이에 시판하는 것이다. 이 벡터는 Trc 프로모터를 함유하며 제한 효소 Nco I 에 의한 분해 및 개시 코돈 ATG 직후에 비어있는 3'말단부가 채워지는 ATCT 벡터의 일종이다. 제9도에 나타낸 바와 같이. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 구조 유전자를 보유하는 상기의 단계(3)에서 수득한 DNA 단편을 Pst I으로 절단하고, 1.27kb DNA 단편을 분리하고 정제한다. 한편, Trc 프로모터를 보유하는 pKK233-2fmf Nco I으로 절단하고 DNA 폴리머라아제 클레노우 단편으로 처리한다. 이어서 생성된 단편을 Pst I 으로 절단하여 약 4.6kb DNA 단편을 수득한다. 이어서, 상기의 두 단편을 혼합하고 각각 T4 DNA 리가아제로 연결하고, 생성된 혼합물을 이. 콜리 JM103 균주를 형질전환시키는데 사용하고, 40㎕/ml 앰피실린을 함유하는 L-브로스 한천 베지에 형성된 콜로니를 선택한다. 이들 콜로니를 L-브로스에서 하룻밤 액체 배양하고, 균체를 수집하고, 균체로부터 플라스미드 DNA를 주출하고, ATG 벡터와 세세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 보유하는 단편과의 연결부분의 염기 서열을 결정한다. 그 결과, ATG 코돈 직후에 아미노-말단 메티오닌을 제외한 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 구조 유전자를 삽입한 발현 플라스미드를 수득하고 pCAH21이라 명명하였다. 또한, 발현 플라스미드를 보유한 이. 콜리를 이. 콜리 JM103/pCH21이라고 명명하였다.

발헌 플라스미드 pCAH21의 복제계는 pBR322로부터 유래한 것이다. 따라서, 플라스미드의 카피수를 증대시키고 이. 콜리내에서의 발현 정도를 상승시킬 목적으로, 복제개시영역(ori)를 pAT153 유래의 영역으로 변경시킨다. 동시에, 내약제성 마커를 앰피실린 내성(AP^r)에서 테트라사이클린 내성(TC^r)으로 변경한다. 플라스미드를 변형하는 과정을 제10도에 나타내었다. 먼저 플라스미드 pCAH21을 BamH I 으로 절단하고 DNA 폴리머라아제 클레노우 단편으로 처리한다. 이어서 생성된 단편을 Sca I으로 절단하여 Trc 프로모터, 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자 및 5S 리보좀 RNA의 T₁T₂터미네이터(5SrrnBT₁T₂)를 보유하는 약 2.4kb DNA 단편을 수득한다. 시판중인 플라스미드 pAT153는 벡터 플라스미드로서 사용한다. 플라스미드 pAT153을 EcoR I으로 절단하고, DNA폴리머라아제 클레노우 단편으로 처리한 후, Dra I으로 절단한다. 또한, 벡터의 자기-연결(self-ligation)을 방지하기 위하여, 알카리 포스파타아제 처리를 행하여, pAT153 유래의 복제 영역과 테트라사이클린 내성 유전자를 보유하는 약 2.5kb DNA 단편을 제조한다. 이어서, 상기의 두 DNA 단편을 혼합하고 T4 DAN 리가아제로 연결시켜, 생성된 혼합물을 이. 콜리 JM103 균주로 형질전환시키는데 사용하고 , 20㎍ml 테트라사이클린을 함유하는 L-브로스 한천 배지에 형성된 콜로니를 선택한다. 이들 콜로니를 L-브로스에서 하룻밤 배양한 후, 균체를 수집하고, 균체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 절단으로 분석한다. 그 결과, 연결방향이 다른 두가지 재조합 플라스미드를 수득한다. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자의 방향이 테트라사이클린 내성 유전자와 동일한 플라스미드를 pCAH211이라 명명하고, 이들 유전자가 역방향으로 삽입된 프라스미드를 pCAH212이라 명명한다. 또한, 이들 재조합 발현 플라스미드를 보유하는 이. 콜리 균주를 각각 이. 콜리 JM103/ pCAH211 및 이. 콜리 JM103/pCAH212이라 명명한다.

7. 이. 콜리 내에서의 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자의 발현

(1) 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자의 발현

이. 콜리 JM103/pCAH211 또는 이. 콜리 JM103/pCAH212를 (0.5리터 용량의 플라스크에서) 20㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 2배 농도의 L-브로스(50ml)에 접종하고 37℃에서 진탕하에 24시간동안 배양한다. 배양액(0.5ml)을 원심분리하여 균제를 수집한다. 이 균체를 0.1M 포스페이트 완충용액(pH 7.0)(0.5ml)에 현탁하고 초음파처리기로 분쇄한다. 용액을 원심분리하여 수득한 상층액을 목적하는 효소를 함유하는 샘플 용액으로서 사용한다. 한편, 상기의 단계 1에서 수득한 바실러스 서브틸리스(FERM BP-2755) 반응액을 원심분리하여 수득한 상층액을 대조용 효소용액으로 사용한다. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제는 세팔로스포린 C와 7-ACA에 작용할 뿐 아니라 p-니트로페닐 아세테이트(이하, pNPA라고 약기)에도 작용하여 색채를 띤 물질인 p-니트로페놀(이하, pNP라 약기한다)을 형성한다 pNP는 분광학적으로 검출할 수 있으므로, 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 활성을 결정하는 간단한 방법으로서 기질로서 pNPA를 사용하는 방법을 채택할 수 있다. 0.02% pNPA, 0.1M 포스페이트 완충용액(pH 6.8) 및 상기-언급한 효소용액을 포함하는 혼합물(3ml) 중에서 30℃에서 반응을 수행하고, 분광 광학계를 사용하여 400nm에서 흡광도를 측정함으로써 효소 활성을 결정한다. pH 6.8 및 30℃의 온도에서 1분당 1μmole의 pNP를 생산하는 효소의 양을 1유니트(unit; U)로 정의한다. 그 결과, 이. 콜리 JM103 pCAH211 및 이. 콜리 JM103/pCAH212의 배양액 당 효소 활성은 각각 9.9U/ml 및 12.4U/ml임을 발견하였다. 한편, 바실러스 서브틸리스의 효소 활성은 0.36U/ml이다.

또한, 발현 플라스미드 pCAH211의 Trc 프로모터와 SD-ATG 서열을 이. 콜리 트리토판 오페론 유래의 Trp 프로모터와 SD-ATG 서열로 대체함으로써 플라스미드를 제작한다. 플라스미드를 이. 콜리 JM109에 도입하여 형질전환시킨후, 생성된 형질전환체를 상기한 바와 동일한 방법으로 배양하여, 배양액당 75.5U/ml의 효소 활성을 수득한다.

생성된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 양은 자-발효조와 같은 대량 단위의 배양장치를 사용하여 적당한 배양 조건하에 적당한 배지에서 상기 발현 플라스미드를 보유하는 이. 콜리를 생육시킴으로써 증가될 수 있다.

(2) 세팔로스포린 C 및 7-ACA의 탈아세틸화반응

이. 콜리 JM103/pCAH212로부터의 효소용액에 의한 탈아세틸화반응은 기질로서 세팔로스포린 C 또는 7-ACA를 사용하여 수행한다. 반응은 10mM의 기질을 함유하는 0.1M 포스페이트 완충용액(pH 7.0)(1.0ml)에 효소용액(0.2ml)를 가한 후 37℃에서 40분동안 수행하고, 0.2M 아세테이트 완충용액(pH 4.0)(1.2ml))를 가하여 종결된다. 생성된 용액을 HPLC를 행하고, 탈아세틸세팔로스포린 C 또는 탈아세틸-7-ACA을 측정한다. 코스모실(Cosmosil) 5C₈(Nacalai tesque사 제조)를 컬럼으로서 사용하고, 메탄올 농도를 단계적으로 증가시키는 농도구배 용출방법으로 용출을 행한다. 따라서, 20mM NaH₂PO₄및 5mM 테트라-n-부틸암모늄 히드록사이드(TBAH)를 함유하는 용액을 사용하여 메탄올 농도를 20%까지 증가시킨다. 탈아세틸화 생성물을 254mm에서 검출한다. 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 활성은 하기와 같이 정의된다. 따라서 37℃의 온도 및 pH 7.0의 조건하에서 1분당 1μmole의 생성물을 생산하는 효소의 양을 1유니트(U)로 정의한다. 그 결과, 이. 콜리 JM103/pCAH212의 효소용액의 배양액 당 활성은 세팔로스포린 C 및 7-ACA모두에 대해 7.4U/ml임을 알아내었다.

(3) 재조합 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 구조

이. 콜리에서 생산된 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 활성형 및 서브유니트의 분자량을 결정하여 상기의 단계 1에서 수득한 것과 동일한 결과를 수득하는데, 이는 재조합 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제도 또한 천연형과 유사한 옥타머형으로 존재함을 나타내는 것이다.

또한, 재조합 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 역상 컬럼을 사용한 HPLC로 정제한다. 히드라진 가수분해 및 에드만 분해에 의한 말단의 분석은 효소의 아미노 및 카르복시 말단이 각각 메티오닌 및 글리신이며, 천연형의 것과 동일함을 알 수 있다. 또한, 자동 아미노산 서열결정기를 사용하여 아미노 말단 서열을 결정하여, 25번째 아미노산까지의 아미노산 서열은 구조 유전자에서 추론한 것과 완전히 동일함을 알 수 있다.(제2도).

상기 실시예에서 상세히 기재한 대로, 본 발명자들은 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 대단히 효율적인 생산이 바실러스 서브틸리스에 의해 생산되는 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제를 코오딩하는 유전자를 클로닝하고 이. 콜리에서 발현 가능한 벡터를 사용하여 상기 유전자를 함유하는 재조합 플라스미디를 형성함으로써 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제가 대단히 효율적으로 생산될 수 있음을 확인하였다. 이는 상기 효소의 광범위한 이용에 대한 전제를 제공한다. 추가로, 클론화 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자를 보유하는 DNA 단편은 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제의 작용을 유리하게 이용하는 매우 강한 수단을 제공한다.

Claims

제1도에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 염기서열.
이. 콜리 숙주-벡터계에서 사용된 벡터에 제1항의 DNA 염기 서열을 도입함으로써 제조된 재조합 DNA 분자.
제2항의 제조합 DNA 분자로 형질 전환된 이. 콜리 균체.
제1도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질.
제1도에 나타낸 아미노산 서열의 아미노-말단에 추가로 메티오닌을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질
제4항에 있어서, 제3항의 이. 콜리 균체에 의해 생산된 단백질.
제5항에 있어서, 제3항의 이. 콜리 균체에 의해 생산된 단백질.
제4항의 단백질 멀티머로 구성된 효소.
제5항의 단백질의 멀티머로 구성된 효소.
제6항의 단백질의 멀티머로 구성된 효소.
제7항의 단백질의 멀티머로 구성된 효소.
제8항에 있어서, 상기 단백질의 테트라머 또는 옥타머인 효소.
제9항에 있어서, 상기 단백질의 테트라머 또는 옥타머인 효소.
제10항에 있어서, 상기 단백질의 테트라머 또는 옥타머인 효소.
제11항에 있어서, 상기 단백질의 테트라머 또는 옥타머인 효소.
제3항의 이. 콜리 균체가 배지에서 배양되며 상기 단백질이 이 배양액으로부터 회수됨을 특징으로 하는 제4항의 단백질의 제조방법.
제3항의 이. 콜리 균체가 배지에서 배양되며 상기 단백질이 이 배양액으로부터 회수됨을 특징으로 하는 제5항의 단백질의 제조방법.
제3항의 이. 콜리 균체가 배지에서 배양되며 상기 효소가 이 배양액으로부터 회수됨을 특징으로 하는 제8항의 효소의 제조방법.
제3항의 이. 콜리 균체가 배지에서 배양되며 상기 효소가 이 배양액으로부터 회수됨을 특징으로 하는 제9항의 효소의 제조방법.
제3항의 이. 콜리 균체가 배지에서 배양되며 상기 효소가 이 배양액으로부터 회수됨을 특징으로 하는 제12항의 효소의 제조방법.
제3항의 이. 콜리 균체가 배지에서 배양되며 상기 효소가 이 배양액으로부터 회수됨을 특징으로하는 제13항의 효소의 제조방법.