JPH119276A

JPH119276A - α‐１→３結合含有糖類生成酵素遺伝子およびその使用

Info

Publication number: JPH119276A
Application number: JP9163110A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Miura; 浦裕三; Yutaka Konishi; 西豊小; Akihiko Iwamatsu; 松明彦岩; Keiji Kondo; 藤恵二近
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1997-06-19
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 1999-01-19
Anticipated expiration: 2017-06-19
Also published as: JP4108154B2

Abstract

(57)【要約】【課題】 α‐１→３結合を分子内に含むオリゴ糖の大
規模な製造技術を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、かつ澱粉及
びその分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体
へのα‐１→３結合のグルコース転移またはα‐１→３
およびα‐１→４結合のグルコース転移を優先的に触媒
する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列。上記のＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、
およびこの発現ベクターにより形質転換された細胞（好
ましくは酵母、特に Candida utilis）。上記の形質転
換細胞を培養し、この培養物中から、澱粉及びその分解
物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα‐１
→３結合のグルコース転移またはα‐１→３およびα‐
１→４結合のグルコース転移を優先的に触媒する糖転移
酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とす
る、糖転移酵素の製造法。上記の糖転移酵素を、澱粉お
よびその分解物から選ばれる基質と接触させることを特
徴とする、α‐１→３結合を分子内に含むニゲロオリゴ
糖の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］

【発明の属する技術分野】本発明は、澱粉及びその分解
物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα‐１
→３結合、またはα‐１→３およびα‐１→４結合のグ
ルコース転移を優先的に触媒する糖転移酵素の遺伝子に
関するものであり、より具体的には、例えば澱粉及びそ
の分解物の中から選ばれた基質の非還元末端グルコース
部の３位に、グルコース単位をα‐１→３結合する糖転
移活性を有し、α‐１→３結合を分子内に含む糖類、特
にニゲロース（３‐Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルグル
コース）等のオリゴ糖を生成する活性を有する糖転移酵
素の遺伝子に関するものである。

【０００２】更に本発明は、該遺伝子を含む組換えプラ
スミド、該プラスミドにより形質転換された生物（微生
物、動植物細胞など）、該形質転換体を用いた糖転移酵
素の製造法、該組換え酵素を用いた糖類の製造方法、特
にニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマル
トース等のニゲロオリゴ糖の製造方法および遺伝子組換
えによって得られる上記転移酵素に関するものである。

【０００３】本発明糖転移酵素は分子内にα‐１→３結
合を含む糖類、特にニゲロオリゴ糖を製造するうえで産
業上重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転
換体は本酵素を著量に生産し、これら酵素を用いる産業
界（食品、医薬など）に大いに貢献するものである。

【０００４】

【従来の技術】オリゴ糖はその構成単糖、結合様式及び
立体構造に応じ、従来から甘味料、医薬品、酵素の検定
用基質、あるいは種々の薬品中間体などの用途に使用さ
れている。天然のものに加え、これまでマルトオリゴ
糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、カップリ
ングシュガー等のオリゴ糖が開発されている。

【０００５】近年、ニゲロース（３‐Ｏ‐α‐Ｄ‐グル
コピラノシルグルコース）、ニゲロシルグルコース（３
‐Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルマルトース）等のα‐
１→３結合を分子中に有するニゲロオリゴ糖について、
免疫賦活活性（特開平９−５２８３４号公報）等の生理
活性を有することが明らかにされた。また機能性食品素
材（特開平３−２２９５８号公報）としての用途につい
ても注目され、本糖の安価な供給が望まれている。

【０００６】従来からα‐１→３結合のオリゴ糖は酒、
蜂蜜、麹汁、ビール等に含まれることが知られている
が、天然には極く僅かにしか存在しない。また本糖の生
産方法としてはAspergillus niger の菌糸中に含まれる
３‐Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルグルコースを構成糖
として含むニゲランを部分酸加水分解する方法、あるい
はα‐１→３結合、α‐１→４結合を有するElsinoe 属
微生物産生の特種な多糖エルシナンをα‐アミラーゼで
酵素分解（特開昭５５−１９００４号公報）する方法が
知られているが、本糖の安価な供給には至っていない。
また一般に利用可能な澱粉分解物等の基質から本糖を酵
素的または化学的に取得しようとする試みに関しても、
公知のα‐グルコシダーゼによる縮合、転移反応では本
糖は極く僅かしか生成しないほか（フジモト、Ｈ.、ニ
シダ、Ｈ.、及びアジサカ、Ｋ. 、：Agric.Biol.Che
m.、５２、１３４５- 、１９８８）、Aspergillus oryz
aeの酵素による、マルトースからニゲロースの生成につ
いても学術報告はあるもののの、その生成量は少なく実
用上の価値は少なかった。

【０００７】ところで本発明者らは先に、Acremonium属
に属するある種の菌株が、優先的にα‐１→３結合への
転移反応を触媒する糖転移酵素を産生することを見いだ
しており、該酵素を用いて、適当な基質、特にマルトオ
リゴ糖に作用させ、α‐１→３結合を分子内に含むニゲ
ロース等のオリゴ糖を高収率で製造する方法を提案して
いる（特開平７−５９５５９号公報）。

【０００８】ニゲロース等のオリゴ糖の大量生産の為に
は、本酵素の大量取得が望まれる。従来の菌株育種方法
は、主として、紫外線や変異誘発剤によって得られる糖
転移酵素生産菌の変異株を選抜する方法に限られていた
ため、安定な変異体を単離するのが困難な場合もある。
また、従来法による育種の場合、好まざる形質変化を伴
うことも多い。

【０００９】［発明の概要］

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上記糖転移酵素の大量
生産のためには、本酵素の遺伝子を取得し、遺伝子工学
的にそれを生産することが望まれる。さらに、遺伝子を
取得出来れば変異体を作成することにより、活性の高い
酵素を得ることができ、更には蛋白工学の技術を用い
て、耐熱性、耐pH性の向上、反応速度が増大された酵素
を得ることも期待できる。

【００１１】本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、優
先的にα‐１→３結合への転移反応を触媒する糖転移酵
素の部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素の生産菌
（Ac remonium sp. S4G13）から調製したcDNAライブラリ
ーより当該酵素をコードする遺伝子を取得することに成
功し、さらに酵母等の微生物での発現にも成功した。本
発明はそれらの知見に基づいて完成されたものである。
従って本発明は該酵素の遺伝子を提供するものである。
さらに、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該プラスミ
ドにより形質転換された生物、該形質転換体を用いた組
換え糖転移酵素及びその製造法、該組換え糖転移酵素を
用いた、α‐１→３結合を分子内に含む糖類、特にニゲ
ロオリゴ糖の製造方法を提供するものである。

【００１２】すなわち、本発明による糖転移酵素遺伝子
は、澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に作用し
て糖受容体へのα‐１→３結合のグルコース転移または
α‐１→３およびα‐１→４結合のグルコース転移を優
先的に触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号２の
アミノ酸番号１〜９２２で示されるアミノ酸配列または
アミノ酸番号３０〜９２２で示されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列（該アミノ酸配列またはその
１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは
付加されたアミノ酸配列）を有し、かつ例えば、澱粉及
びその分解物の中から選ばれた基質の非還元末端グルコ
ース部の３位に、グルコース単位をα‐１→３結合する
糖転移活性を有し、α‐１→３結合を分子内に含むニゲ
ロース（３‐Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルグルコー
ス）等のオリゴ糖を生成する活性を有する糖転移酵素を
コードするＤＮＡ配列である。

【００１３】本発明によるプラスミドは、上記のＤＮＡ
配列を含む組換えプラスミドであり、本発明による形質
転換体は上記の組換えプラスミドにより形質転換された
細胞（微生物、動植物細胞等）である。

【００１４】本発明による糖転移酵素の製造法は、上記
の形質転換細胞を培養し、この培養物中から、澱粉及び
その分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へ
のα‐１→３結合のグルコース転移またはα‐１→３お
よびα‐１→４結合のグルコース転移を優先的に触媒す
る糖転移酵素活性を有するタンパク質を採取することを
特徴とするものである。

【００１５】また、本発明による組換え糖転移酵素は上
記遺伝子の発現産物である。すなわち、本発明による糖
転移酵素は、配列番号２のアミノ酸番号１〜９２２で示
されるアミノ酸配列またはアミノ酸番号３０〜９２２で
示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有し、かつ澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質に
作用して糖受容体へのα‐１→３結合のグルコース転移
またはα‐１→３およびα‐１→４結合のグルコース転
移を優先的に触媒する糖転移酵素活性を有するタンパク
質である。

【００１６】更にまた、本発明によるα‐１→３結合を
分子内に含む糖類、特にニゲロオリゴ糖の製造方法は、
上記組換え糖転移酵素を、澱粉及びその分解物の中から
選ばれた基質と接触させる工程を含んでなるものであ
る。

【００１７】［発明の具体的な説明］糖転移酵素遺伝子上述のように、本発明による糖転移酵素遺伝子は、澱粉
及びその分解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容
体へのα‐１→３（またはα‐１→３およびα‐１→
４）結合のグルコース転移を優先的に触媒する糖転移酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であ
り、優先的にα‐１→３結合への転移反応を触媒する糖
転移酵素の部分アミノ酸配列情報をもとに、当該酵素の
生産菌（Ac remonium sp. S4G13）から調製したcDNAライ
ブラリーより当該酵素をコードする遺伝子を取得するこ
とに成功し、さらに酵母等の微生物での発現にも成功す
ることによって決定されたものである。

【００１８】１）微生物の寄託本発明の典型的な遺伝子を含むプラスミドｐＲＮＧ１１
（後記する実施例６参照）で形質転換された、本発明糖
転移酵素を著量に発現する酵母キャンディダ・ユティリ
スＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１は、工業技術院生命工学技
術研究所に平成９年（１９９７年）６月５日に受託番号
ＦＥＲＭＢＰ−５９５９の番号のもと寄託されてい
る。

【００１９】２）糖転移酵素遺伝子のクローニングAcremonium より得られるα1→３結合（またはα1→３
およびα1→４結合）をもたらす糖転移酵素には互いに
性質の良く似た２種類の酵素が存在し、それぞれが分子
量が異なる２つのサブユニットから成ることが明らかに
されている。特定の蛋白質をコードする遺伝子を単離す
る場合、蛋白質の部分アミノ酸配列を決定し、その縮重
コドンからなる混合オリゴヌクレオチドをプロープとし
て遺伝子ライブラリーから単離することが可能である。
また、本発明において実施したようなPCRによる部分断
片の取得の後、その断片をプロープとして遺伝子ライブ
ラリーから単離することも可能である。しかしながら、
本酵素のように酵素が２種類のサブユニットからなるヘ
テロオリゴマー分子である場合、２つのサブユニットが
それぞれ異なる遺伝子に独立してコードされる可能性が
ある。また、それらがひとつの遺伝子から由来するにし
ても２つのサブユニットをコードする領域が構造遺伝子
のなかでどのような位置関係となっているかなどその構
造については予測ができない。

【００２０】本発明者らは、まず前述した２種類の酵素
のペプチドマップがほぼ同一であることを明らかにし
た。この結果は２種類の酵素のポリペプチド部分が同一
であって、それらの分子量の違いは糖鎖修飾の差異によ
るものであることを示唆するものである。そして、この
うちの１つについて２つのサブユニット双方の部分アミ
ノ酸配列を決定した。さらにPCRによる部分断片の取得
の後、その断片をプロープとしたcDNAのクローニングに
成功し、遺伝子構造を解析することによってこれら２つ
のサブユニットが同一の遺伝子にコードされることを明
らかにした。すなわち、α1→３結合をもたらす糖転移
酵素は、それをコードする遺伝子から１つのポリペプチ
ドとして生成され、まず、１〜２９番目のペプチド（シ
グナルペプチド）が除かれた後、さらに４９０番目のア
ミノ酸のＣ端側で切断されることにより２つの成熟型サ
ブユニットへとプロセスされていることが明らかにされ
た。

【００２１】従って、上記の典型的な遺伝子によってコ
ードされる糖転移酵素は、配列番号２のアミノ酸番号１
〜９２２、または３０〜４９０および４９０番目のアミ
ノ酸のＣ末端側でプロセシングを受けることにより生じ
た２つのサブユニットからなるものである。

【００２２】３）糖転移酵素をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片本発明による糖転移酵素をコードしている遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の具体例としては、図２に示される制限酵素
地図で表されるＤＮＡ断片が挙げられる。この断片は、
Acremonium属に属する菌体、より好ましくはAcremonium
に属するＳ４Ｇ１３株より調製されるmRNAを鋳型とした
cDNAライブラリーより単離することができる。Acremoni
umに属するＳ４Ｇ１３株からのその好ましい単離法につ
いては後記する実施例において詳細に説明されている。
本発明による糖転移酵素遺伝子は、配列番号２（糖転移
酵素遺伝子から推定されるアミノ酸配列およびそれをコ
ードするＤＮＡの塩基配列）のアミノ酸番号１〜９２２
もしくはアミノ酸番号３０〜９２２で示されるアミノ酸
配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数
（たとえば１もしくは数個）のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記
の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列
である。

【００２３】本発明の好ましい態様によれば、本発明に
よる糖転移酵素をコードするＤＮＡ配列の好ましい具体
例としては、配列番号１（糖転移酵素遺伝子の全長を含
むｐＮＧ３のＥｃｏＲＩ部位に挿入された断片の全塩基
配列）に示される塩基配列の１２０番目から２８８５番
目（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜９２２に相
当）までの塩基配列および塩基配列の２０７番目から２
８８５番目（配列番号２におけるアミノ酸番号３０〜９
２２に相当）が挙げられる。

【００２４】蛋白質のアミノ酸配列が与えられば、それ
をコードする塩基配列は、いわゆるコドン表を参照して
決定することができる。よって配列番号２に示されるア
ミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適宜選択する
ことが可能である。本発明の好ましい態様において、配
列番号２のアミノ酸番号１〜９２２または３０〜９２２
に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と
は、配列番号１に示される塩基配列の１２０番から２８
８５番または２０７から２８８５番の配列を有するも
の、およびその縮重関係にあるコドンが使用されている
部分以外は同一の塩基配列を有し且つ上記のアミノ酸を
コードする塩基配列、更には該配列において１もしくは
複数（たとえば１もしくは数個）のコドンが置換、欠
失、挿入もしくは付加された塩基配列をも包含するもの
である。配列番号１に示される塩基配列の１２０番から
２８８５番または２０７から２８８５番までの配列を有
するＤＮＡ断片は塩基配列が決定されていることから、
そのＤＮＡ断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法
たとえば、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（モデル３９
２，アプライドバイオシステムズ）を用い、そのマニュ
アルに記載の方法に従って製造することができる。また
この配列は、前記したAcremonium属に属する菌体、より
好ましくはAcremoniumに属するＳ４Ｇ１３株から遺伝子
工学的な手法を用いて得ることが出きる。例えば、Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook、 Mani
atis ら、 Cold Spring Harbour Laboratory Press(198
9))などに記載の方法で好ましく行なうことができる。
具体的な方法は、後記する実施例に詳細に説明されてい
る。

【００２５】糖転移酵素本発明による糖転移酵素は、以下の活性を保持すること
を特徴とするものである。すなわち、澱粉及びその分解
物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα‐１
→３（またはα‐１→３およびα‐１→４）結合のグル
コース転移を優先的に触媒する活性である。より具体的
には、例えば澱粉及びその分解物の中から選ばれた基質
の非還元末端グルコース部の３位に、グルコース単位を
α‐１→３結合してα‐１→３結合を分子内に含むニゲ
ロース（３‐Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルグルコー
ス）等のオリゴ糖を生成する活性、で特徴付けられる。
従って本発明による糖転移酵素は、澱粉及びその分解物
から、α‐１→３結合を分子内に含むニゲロース（３‐
Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシルグルコース）等のオリゴ
糖を生成することができる。

【００２６】本発明の一つの態様による糖転移酵素のア
ミノ酸配列は、具体的には、配列表の配列番号２で示さ
れるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜９２２のアミノ酸
配列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数
（１もしくは数個）のアミノ酸の挿入、置換、または欠
失、若しくは両末端への付加がなされたものであって、
且つ上記した糖転移酵素活性を依然として保持する、改
変された配列を包含するものとする。その改変配列にお
ける糖転移酵素活性の保持とは、その活性を利用した実
際の使用態様において、配列番号２に示される配列を全
て有するポリペプチドと、同一の条件でほぼ同様の利用
が可能な程度の活性が維持されていることをいうものと
する。このような改変された配列は、配列番号２に示さ
れている配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難
なしに選択し、製造可能であることは明らかである。

【００２７】さらに、本発明の別の態様によれば、配列
表の配列番号２のアミノ酸番号３０番から９２２番まで
に示されるアミノ酸配列が提供される。この配列は、本
酵素が培地に分泌される過程で、１〜２９番に存在する
ペプチドが切断されることにより得られる場合のもので
あり、培地中に回収される酵素は、天然体であっても組
換え体であっても実質的にこの配列を含む（上記改変配
列を包含する）ものである。さらに前述のように、部分
アミノ酸配列分析、および遺伝子構造解析によって天然
体の２つのサブユニットが、前駆体ポリペプチドがその
４９０番目のアミノ酸のＣ末端側で切断されることによ
り生じたものであることが明らかにされている。従っ
て、本発明のもう一つの態様による糖転移酵素のアミノ
酸配列は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列
のアミノ酸番号３０〜９２２のアミノ酸配列、または該
アミノ酸配列において１もしくは複数（１もしくは数
個）のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくは両
末端への付加がなされたものであって、且つ上記した糖
転移酵素活性を依然として保持する改変された配列を包
含するものとする。

【００２８】本発明による糖転移酵素遺伝子によってコ
ードされるタンパク質には、性質の良く似た２種類の酵
素が存在し、これらのペプチドマップがほぼ同一である
ことは前述したところであり、他方の酵素タンパク質は
上記改変配列に包含されるものである。なお、後述のよ
うに本発明遺伝子を酵母で分泌発現させた場合、この酵
素タンパク質は糖鎖が結合した形で得られ、糖鎖の切断
によって糖鎖のない酵素タンパク質とすることができる
が、これらも糖転移酵素活性を保持している限り本発明
の酵素に包含される。

【００２９】Acremoniumに属するＳ４Ｇ１３株本発明によるＤＮＡ断片の起源として有用なAcremonium
に属するＳ４Ｇ１３株は、本発明者らが群馬県の土壌か
ら分離した菌株であって以下のような性質を示すもので
ある。（１）成育麦芽寒天培地、ツアペック培地、オートミール培地、Ｐ
ＤＡ培地、ＭＹ培地での成育は緩やかであり、２０℃
１０日間で直径１５−３６mmに達する。集落は最初やや
黄色を帯びた白色で、後に淡橙色を呈する。

【００３０】気生菌糸は直立で盛り上がり、放射しわ状
を呈する。成育はpH４〜１０．５で最適pHは中性付近、
成育温度範囲は摂氏２０〜３５度で、最適成育温度は摂
氏２５〜３０度である。（２）形態菌糸の直径は０.５〜３.０μｍで、無色で菌糸には隔壁
が認められる。（３）分生子分生子は亜球形（１〜２Ｘ４〜５μｍ）で、無色、球状
に塊る。分生子柄は無色で細長く先細りし、無分岐ある
いは輪生状に菌糸側面より突出している。

【００３１】以上に示した性質を菌類分類法に照合する
と、本菌はAcremonium属に属しており、Acremonium sp.
S4G13と命名した。本菌は平成５年８月２日付けにて工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4373として
国際寄託されている。本発明による糖転移酵素遺伝子
（ＤＮＡ配列）の由来源としては、Acremonium属に属
し、かつまた上述の性能を有する真菌、例えばAcremoni
um sp. S4G13およびその変種がその代表例としてあげら
れる。

【００３２】上記の菌体の培養にあたっては、培地に菌
体を接種し、常法に従い培養すればよい。培地中には、
資化しうる炭素源及び窒素源を適量含有せしめると好ま
しい。この炭素源窒素源については、特に制限はない
が、例えば、コーングルテン、大豆粉、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス等が挙げられる。

【００３３】一方炭素源としては、α‐１→４グルコシ
ド結合を有するポリサッカライドまたはオリゴサッカラ
イド、例えば澱粉やその分解物、加工物やマルトース、
マルトオリゴ糖などの資化し得るマルトオリゴ糖が挙げ
られる。中でも、マルトース、マルトオリゴ糖などが好
ましい。その他に、リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｎ²⁺、
Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺等の無機塩や、さらに有機微量栄養
源を適宜培地中に添加することもできる。

【００３４】糖転移酵素をコードする遺伝子の発現／糖
転移酵素の製造１）発現ベクター本発明による糖転移酵素をコードするＤＮＡ断片を、宿
主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込
まれかつ同遺伝子が発現可能な状態で含むＤＮＡ分子、
特に発現ベクターの形態として宿主細胞の形質転換を行
なえば、宿主細胞において本発明による糖転移酵素を産
生させることができる。

【００３５】従って、本発明によれば、さらに本発明に
よる糖転移酵素をコードする遺伝子を含んだＤＮＡ分
子、特に発現ベクターが提供される。このＤＮＡ分子
は、ベクター分子に本発明による糖転移酵素をコードす
るＤＮＡ断片を組み込むことによって得ることが出き
る。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプ
ラスミドである。

【００３６】本発明によるＤＮＡ分子の作成は、前掲の
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌに記載の方法に準じて行なう
ことが出きる。

【００３７】本発明において利用されるベクターは、使
用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラ
スミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例
えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミ
ド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファー
ジ、ｐＢＲ、ｐＵＣ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥ
ｐ、ＹＣｐ系、ＹＩＰ系のベクター、あるいは後記する
実施例で使用されるｐＣＲＡＬ１０、ｐＣＲＡＬ１１が
挙げられる。

【００３８】このプラスミドは形質転換体の選択マーカ
ーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性
マーカー、栄養要求マーカー遺伝子を使用することがで
きる。

【００３９】さらに、本発明による発現ベクターとして
のＤＮＡ分子は、糖転移酵素遺伝子の発現に必要なＤＮ
Ａ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾ
ーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、
翻訳調節信号などを有しているのが好ましい。

【００４０】プロモーターとしては、枯草菌においては
ズブチリシン、SPAC等のプロモーター、酵母ではアルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ADH）、酸性フォスファターゼ
（PHO）、ガラクトース遺伝子（GAL）、グリセルアルデ
ビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（GAP）等のプロモータ
ーが好ましく用いることができる。配列番号２に示して
いるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番から９２２番まで
の配列にはシグナルペプチドを含んでおり、後記する実
施例で示すようにこの配列をそのまま、酵母由来のプロ
モーター、ターミネーターに挿入し酵母に導入して分泌
発現をさせることが出きる。シグナルペプチドの使用
は、培養上清からの精製も容易になるので好ましい。ま
た、シグナルペプチドを酵母由来のもの（たとえばイン
ベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、
α‐ファクターシグナルなど）に置き換えることも好ま
しい。また、大腸菌においては、一般に慣用されるlac
プロモーターを用いたところ目的の酵素は発現されなか
ったが、プロモーターとしてラクトースオペロン（lac
）、トリプトファンオペロン（trp ）等を用い、シャ
ペロニンを同時に発現させる等の工夫をすれば発現が可
能になることも考えられる。

【００４１】２）形質転換体／培養本発明によれば、更に上記の発現ベクターを適当な宿主
細胞に導入した形質転換細胞、および形質転換細胞を培
養して培養物から糖転移酵素を得る糖転移酵素の製造法
が提供される。

【００４２】形質転換細胞の培養は、使用宿主細胞に関
して一般的な方法を用いることができ、通常１〜４日程
度の培養により細胞内または細胞外の培養物中に糖転移
酵素が生成蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度
等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母
では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的で
あり、たとえば遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等
を参照することができる。

【００４３】宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細
菌、Candida utilis、Saccaromyces cerevisiae 、Pichi
a Pastoris等の酵母以外に、高等真核生物（例えばＣＨ
Ｏ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはBa
cillus属に属する微生物を用いることが好ましい。該属
には蛋白質を菌体外へ分泌する株（たとえば、Baci llus
subtilisなど）が存在することが知られている。また
プロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、この
ような株を宿主として用いることも好ましい。本発明に
おいては、宿主細胞として酵母または細菌が好ましい
が、酵母がより好ましく、特にCandida utilisが好まし
い。後記する実施例に示すように、食用酵母であるCand
ida utilisを宿主としてGAPプロモーターの支配下にこ
の遺伝子を発現させたところ、培地及びペリプラズム中
に高い酵素活性が認められた。酵母で発現させた場合、
糖鎖が結合した形で分泌されるが、必要に応じて切断酵
素（Endo-Hなど）により糖鎖を切断することができる。
さらに蛋白質の解析から、酵母においても天然型の酵素
同様、Ｎ端のシグナルの除去、ポリペプチド内部での切
断（サブユニットの形成）が生じることが明らかにされ
た。このことにより、組換え体において本発明遺伝子を
発現することによって活性型の本糖転移酵素を大量に生
産可能であることが示された。大腸菌を宿主とした場
合、本酵素は全く発現されなかったのに対して酵母では
発現した上、培地中に分泌された。さらにカビ（Acremo
nium S4G13株）と同一の部位でシグナルペプチドが切断
された上、酵素自体もＳＤＳ−ＰＡＧＥでヘテロダイマ
ーになることが確認された。このことは、カビと同様に
内部配列がプロセシングを受けたと考えられ、全く予想
されないことであった。

【００４４】かくして調製された形質転換体の産生する
組換え糖転移酵素の単離・精製には、公知の分離、精製
方法を適当に組み合わせて行なうことが出きる。これら
の分離、精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のよ
うな溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル
濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子
量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー
のような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利
用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差
を利用する方法等が挙げられる。具体的には、例えば実
施例７に記載のように糖転移酵素を精製できるが、一般
的な分離・精製法に関しては例えば蛋白質・酵素の基礎
実験法（南江堂）等を参照することができる。

【００４５】α‐１→３結合を分子内に含む糖類の製造本発明によれば、上記の組換え糖転移酵素を用いたα‐
１→３結合を分子内に含む糖類、特にニゲロース等のオ
リゴ糖の製造方法が提供される。すなわち、本発明によ
るオリゴ等の製造法は、上述のような本発明による糖転
移酵素を、澱粉およびその分解物から選択される基質に
作用させることを特徴とするものである。ここで澱粉の
分解物とは、アミロース及びアミロペクチンの分解物の
他、マルトオリゴ糖等をも包含するものである。基質と
しては澱粉、アミロースおよび／またはアミロペクチン
の分解物、マルトオリゴ糖等をそれぞれ単独で用いても
構わないが、α‐１→３結合を分子内に含むニゲロース
等のオリゴ糖の製造法の好ましい態様によれば、本発明
による組換え糖転移酵素とデンプン分解物、更に好まし
くはマルトオリゴ糖と混合し、接触させることにより、
α‐１→３結合を分子内に含むオリゴ糖（通常は種々の
重合度の混合物）を効率よく製造することができる。

【００４６】本発明糖転移酵素の好ましい基質であるデ
ンプン分解物のグルコース重合度は特に制限されない
が、たとえば、α‐１→３結合を分子内に含むオリゴ糖
をシロップとして使用するのが一般的である食品の場合
には、重合度は２〜１０程度、特定重合度・高純度品を
使用することを要求される医薬用途の場合には、所望の
オリゴ糖重合度・純度に適した基質の重合度・種類を選
択すれば良い。

【００４７】本発明糖転移酵素と基質との混合割合は、
酵素の形態（乾物、溶液など）やその他の反応条件によ
って大きく変化するが、通常糖転移酵素１Ｕに対して基
質０．０００５〜０．５ｇ、好ましくは糖転移酵素１Ｕ
に対して基質０．００１〜０．１ｇである。また反応条
件に関しては、通常ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９、
温度３０〜６５℃、好ましくは４０〜６０℃、反応時間
３〜９６時間、好ましくは１２〜４８時間である。

【００４８】基本的には、得られるオリゴ糖の重合度
は、糖受容体となる基質のグルコース重合度に依存し、
重合度の大きい基質を使用しても反応時間を長くすれば
重合度の小さいオリゴ糖を得ることもできるが、重合度
の小さいオリゴ糖を糖受容体として含む基質を使用すれ
ば、短時間でより効率的にα‐１→３結合含有の低重合
オリゴ糖を得ることができることはいうまでもない。

【００４９】生成したα‐１→３結合を分子内に含む目
的のオリゴ糖は、通常の糖の分離精製法、たとえば脱
色、脱塩、濃縮糖を適宜組み合わせることにより精製す
ることができる。オリゴ糖の分離・精製の一般的方法に
関しては、例えば澱粉・関連糖質実験法（学会出版セン
ター）等を参照することができる。

【００５０】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、これは本発
明を更に具体的に説明するためのものであり、本発明が
以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。ま
た、操作手順は特に記載しない限りMolecular Cloning:
A Laboratory Manual (Sambrook、 Maniatis ら、 Cold
Spring Harbour Laboratory Press(1989))に記載の方
法に従った。また、以下の実施例に於て使用される本発
明糖転移酵素に特異的な活性測定方法は、本発明者らが
以前用いた方法に従った（特開平７−５９５５９号公
報）。この活性測定方法の概要を示せば、以下の通りで
ある。

【００５１】＜ＨＰＬＣを用いた糖転移酵素の測定方法
＞特開平７−５９５５９号公報に従い、酵素液０．２ｍ
Ｌに対して２％マルトース（20mM リン酸ナトリウム pH
7.0に溶解したもの）０．４ｍＬと４０℃で１時間反応
させた。１００℃５分で反応を停止した後、３０Ｕ/ｍ
Ｌのグルコアミラーゼ（生化学工業、１Ｍ酢酸ナトリウ
ムpH4.5に溶解したもの）０．１ｍＬと４０℃、２時間
反応させた。このサンプルについても１００℃、５分で
反応を停止した後、以下の条件のＨＰＬＣで分析した。カラム：Aminex HPX-42A（Bio-Rad）移動相：超純水カラム温度：８０℃ 流速：0.6ml/min. 検出器：ＲＩ上記条件下で、ピーク面積で全糖中１％のニゲロシルグ
ルコースを生成する酵素濃度を、１Ｕ／ｍＬと便宜的に
定義した。＜本酵素のα‐グルコシターゼとしての活性測定方法＞
特開平７−５９５５９号公報と同様に行なった。即ち、
試験管にあらかじめ１．０ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ７．０、および０．５ｍＬの基質溶液（２０ｍＭ
ＰＮＰＧ（シグマ）水溶液）を加え３７℃５分間加熱を
行なった。その後、酵素溶液０．５ｍＬを加え３７℃で
１５分間反応させた後、２．０ｍＬの０．２ＭＮａ₂
ＣＯ₃溶液を加えて反応を停止させた。この溶液につい
て４００ｎｍの吸収の変化を測定し生成したp-Nitrophe
nol の量を測定し、１分間に１μＭのp-Nitrophenol を
生成する活性を１ｕｎｉｔと定義した。

【００５２】［実施例１］糖転移酵素の精製および部
分アミノ酸配列の決定菌体の培養、および酵素精製は特開平７−５９５５９号
公報に記載されている方法（実施例１〜４）に従った。
Acremonium sp. S4G13株（受託番号FERM BP-４３７３の
番号で工業技術院生命工学技術研究所に寄託されてい
る）において上記酵素は２種存在する。糖転移酵素
（１）、糖転移酵素（２）のそれぞれについて精製を行
なった。糖転移酵素（１）、糖転移酵素（２）の両者と
もＳＤＳ−ＰＡＧＥでヘテロダイマーであり、分子量は
糖転移酵素（１）で約１２８０００と約５３０００、糖
転移酵素（２）で約７００００と約５３０００であっ
た。各糖転移酵素のそれぞれのサブユニット、計４サブ
ユニットについて、部分アミノ酸配列分析を岩松（生化
学６３、１３９〜１４３（１９９１））の方法によ
り、またＮ末端アミノ酸配列分析をMatsudaira T (J. B
iol.Chem. 262, 10035〜10038 ( 1987 ))の方法により
行なった。精製酵素を泳動用緩衝液（１０％グリセロー
ル、２.５％ＳＤＳ、２％２−メルカプトエタノー
ル、６２ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６.８））に懸濁
させて、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。
泳動後、エレクトロブロッティングにより当該酵素をゲ
ルより１０ｃｍＸ７ｃｍのＰＶＤＦ膜（（ＰｒｏＢｌｏ
ｔ）アプライドバイオシステムズ）へ転写した。エレ
クトロブロッティング装置としてはザルトブロットＩＩ
ｓ型（ザルトリウス社）を用い、（島津製作所編の（プ
ロテインシーケンサの試料前処理方法について（１））
にしたがって、エレクトロブロッティングを１６０ｍＡ
で１時間行なった。転写後、当該酵素の転写された部分
の膜を切り取り、その一部を直接気相プロテインシーク
エンサーで分析し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。ま
た残りの膜は約３００μｌの還元用緩衝液（８Ｍグア
ニジン塩酸、０.５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.
５）、０.３％ＥＤＴＡ、２％アセトニトリル）に浸
し、１ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、ア
ルゴン下で２５℃、約１時間の還元を行なった。これに
３.０ｍｇのモノヨード酢酸を０.５Ｎ水酸化ナトリウム
液１０μｌに溶かしたものを加え、遮光下で２０分攪拌
した。ＰＶＤＦ膜をとりだし、２％アセトニトリルで充
分洗浄した後、０.５％ポリビニルピロリドン−４０を
含む１００ｍＭ酢酸に浸し、３０分間静置した。このの
ち、ＰＶＤＦ膜を水で充分洗浄し、１ｍｍ四方に切断し
た膜を消化用緩衝液（８％アセトニトリル、９０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０））に浸し、アクロモバク
タープロテアーゼＩ（和光純薬）を１ｐｍｏｌ加え、室
温で１５時間消化した。その消化物をＣ１８カラム（和
光純薬Wakosil AR II C18 300オングストローム 2.0X15
0mm ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（日立
Ｌ６２００）により分離し、各サブユニットについて
１０種類のペプチド断片を得た。ペプチドの溶出溶媒と
してはＡ溶媒（０.０５％トリフルオロ酢酸）、Ｂ溶媒
（０.０２％トリフルオロ酢酸を含む２−プロパノール/
アセトニトリル７：３）を用い、溶出はＢ溶媒に関
し、２〜５０％の直線濃度勾配で０.２５ｍＬ/ｍｉｎの
流速で４０分間溶出させることにより行なった。糖転移
酵素（１）と糖転移酵素（２）のペプチドマップに差が
観察されなかった為、糖転移酵素（１）と糖転移酵素
（２）の違いは糖鎖の修飾等の違いによるものと予想し
た。そこで、糖転移酵素（２）についてのみ、得られた
断片化ペプチドについてアミノ酸配列分析を行なった。
分子量約７００００の断片を２−ＡＰ、分子量約５３０
００の断片を３−ＡＰと命名した。得られた断片化ペプ
チドについてのアミノ酸配列決定試験を、気相プロテイ
ンシークエンサーＰＰＳＯ−１０型（島津製作所）を用
いマニュアルに従って自動エドマン分解法により行なっ
た。以下に得られた部分アミノ酸配列、およびＮ末端ア
ミノ酸配列を記す。部分アミノ酸配列に用いたアクロモ
バクタープロテアーゼＩはリジン残基のカルボキシル基
側を特異的に切断する為、以下の配列にＮ末端側に括弧
書きでＫ（リジン）を記す。2-AP-8はＮ末端アミノ酸配
列であることが判明したため、括弧書きのＫ（リジン）
を除いた。２−ＡＰの消化物については、Ｃ１８カラム
（ジーエルサイエンス Inertsil ODS-3 0.5x40mm）を用
いた逆相高速液体クロマトグラフィー（日立Ｌ6200）
をオンライン化した質量分析機（ＰＥ Sciex API−II
I）で質量分析も合わせて行なった。この際の逆相高速
液体クロマトグラフィーの結果を図１に、また断片化ペ
プチドの質量分析結果を表１に示す。表１断片化ペプチドの質量分析ピークＮｏ．測定分子量理論分子量 △ ＡＰ１３０２０．８３０２１．４＋０．６ＡＰ２．３４１６７．２４１６６．９ −０．３ＡＰ４４０４９．０４０４８．８ −０．２ＡＰ５２０７２．５２０７２．１ −０．４ＡＰ６２６３１．０２６３１．３＋０．３ピークＮｏ．アミノ酸配列ＡＰ１ AVEEYGEIAGRPPMQPYWGLGFHQBK ＡＰ２．３ GFPPTPPPVREPPRELPGFABVLQPEGTEBEDGETAGSS ＡＰ４ DVSSBPGYAASNVQVSDTGLTADLTLAGEPBDAYGEDLK ＡＰ５ DLILEVTYETENRLHVK ＡＰ６ YLEYNTLGGVLDFYFFVGDSPSK Ｂはカルボキシメチルシステインを表す。なお、表１に
おけるアミノ酸配列中の各アミノ酸の略号は、Ｂ以外は
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに基づくものである。表１中、得ら
れた質量のうち、質量（Ｍ+Ｈ＋）４１６７.２を有する
断片はＡＰ２.３の分子量にほぼ一致し、そのＣ末端に
Ｋ（リジン）を有さないことから、この断片化ペプチド
が２−ＡＰのサブユニットのＣ末端断片であると推定し
た。すなわちアクロモバクタープロテアーゼＩで消化し
た断片は、その酵素の基質特異性により、サブユニット
自身のＣ末端断片以外の断片はＫ（リジン）がＣ末端ア
ミノ酸残基となるためである。またＮ末端アミノ酸配列
の決定は２−ＡＰについてのみ行なった。・部分アミノ酸配列 2-AP-2 (K) AVEEYGEIAGRP 2-AP-4 (K) AVEEYGEIAGRPPMQPYWGLGFHQCK 2-AP-5 (K) GFPPTPPPVREPPRELPG 2-AP-8 DVSSCPGYAA 2-AP-9 (K) DLILEVTYETENRLHV 2-AP-10 (K) YLEYNTLGGVLDFYF 2-AP-11 (K) YGYQDAFMVAEVVY 3-AP-1 (K) SFTAGGR 3-AP-2 (K) AAFRDDWNADK 3-AP-3 (K) EIVVEVG 3-AP-5 (K) GELYIDDGESLEQ 3-AP-6 (K) GLPGRDLLYPEYAIHNK 3-AP-8 (K) FELLVALDND 3-AP-9 (K) QSEQGTPAVVPMFYVFPEDK 3-AP-10 (K) GTLELENQYFYGPGVLVAP 3-AP-11 (K) FEYAHGVVTLDGEFSED ・Ｎ末端アミノ酸配列（２−ＡＰ） DVSSCPGY

【００５３】［実施例２］ Acremonium sp. S4G13株cD
NAライブラリーの作製特開平７−５９５５９号公報に記載の方法（実施例１）
に従って、Acremoniumsp. S4G13株の菌体を取得した。
菌体１１.８ｇよりRNA Extraction Kit（Pharmacia Bio
tech）を用いてトータルRNAを抽出した。抽出したトー
タルRNAからmRNAPurification Kit （Pharmacia Biotec
h）を用いてmRNAを精製した。mRNAよりoligo（dT）をプ
ライマーとしてSuperScriptTM Choice System for cDNA
Synthesisキット（GIBCO BRL）を用いてcDNAを合成しE
coRIアダプターを接続し、EcoRIで消化したλZipLoxTM
（GIBCO BRL）に接続（ライゲーション）した。Gigapac
kIII Gold（Stratagene）を用いてパッケージングを行
いライブラリーを完成させた。

【００５４】［実施例３］糖転移酵素cDNAのクローニ
ング２‐ＡＰ‐４、２‐ＡＰ‐５、３‐ＡＰ‐６、３‐ＡＰ
‐９の部分アミノ酸配列を基にそれぞれセンスプライマ
ー、アンチセンスプライマーを設計し、実施例２で得た
ｍＲＮＡを鋳型として１２通りのＲＴ‐ＰＣＲを行なっ
た。このうち２‐ＡＰ‐４（センスプライマー）、２‐
ＡＰ‐５（アンチセンスプライマー）の組み合わせ以外
に驚くべきことに、２‐ＡＰ‐４（センスプライマ
ー）、３‐ＡＰ‐６（アンチセンスプライマー）の組み
合わせにも増幅断片が認められた。以下に２‐ＡＰ‐４
（センスプライマー）、３‐ＡＰ‐６（アンチセンスプ
ライマー）の配列を示す。使用している記号は全てＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢに基づく。 2-AP-4 KAVEEY AARGCNGTNGARGARTAY（センスプライマー） 3-AP-6 YAIHNK TTRTTRTGDATNGCRTA（アンチセンスプライマー）上記プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの条件を以下に示
す。逆転写反応はランダムプライマー（宝酒造）を用い
て、逆転写酵素はSuper Script TM RNaseH Reverse Tra
nscriptase (GIBCO-BRL)を用い、添付のバッファーを用
いて行なった。ＰＣＲの条件は９５度３０秒、５０度１
分、７２度１分で２５サイクル行なった。結果約０.
９ｋｂの断片が増幅された。この断片についてＴＡクロ
ーニングキット（Invitrogen）を用いてpT7Blueにサブ
クローニングを行なった。この断片について塩基配列を
オートシークエンサーＡＢＩ３７０Ａ（アプライド・バ
イオシステムズ）を用いて両側から決定し、アミノ酸配
列に変換したところ2-AP-4、3-AP-6と共に2-AP-11の配
列が存在し、この断片が糖転移酵素遺伝子の一部である
ことを確認した。又、同時に本酵素の２つのサブユニッ
トはそれぞれ同一の遺伝子にコードされていることを確
認した。上記約０.９ｋｂの断片をプローブとしてスク
リーニングに用いた。プローブはMegaprime DNA labell
ing systems(Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いα−^３２Ｐｄ
ＣＴＰ（１１０ＴＢｑ/ｍｍｏｌ）でラベルを行ない、
ライブラリーより約50.000クローンからプラークハイブ
リダイゼーションを行ない、22個のポジティブクローン
を得た。３個のクローン（No.3,6,21）について２次ス
クリーニングを実施してシングルプラークを得た。これ
らのクローンについて制限酵素解析を行なった結果を図
２に示す。No.3クローンのみ上流領域を長く含むクロー
ンであった為、このクローンについて解析を行なった。
この約３ｋｂのEcoRI断片についてはpUC118(宝酒造)のE
coRI部位に挿入した。このプラスミドをpNG3と命名する
（図３）。挿入されていた約３ｋｂのEcoRI断片につい
て塩基配列の決定を行なった。すなわち、pBluescriptI
I KS+ (Strategene)、またはpUC118(宝酒造)に細分化し
た断片をサブクローニングし、さらにエキソヌクレアー
ゼIIIおよびマングビーンヌクレアーゼを用いた連続し
た欠失変異体を作製することにより、種々の変異欠失を
もつプラスミドを作製し、2985bpからなるEcoRI断片の
配列を決定した（配列番号１）。予想される構造遺伝子
の領域の解析を行なったところ、922個から構成される
アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレー
ムが存在し（配列番号２）。このアミノ酸配列が決定し
た部分アミノ酸配列の全てを含んでいることを確認し
た。また決定したＮ末端アミノ酸配列も含んでいること
を確認した。

【００５５】［実施例４］糖転移酵素のオープンリー
ディングフレームの取得実施例３で確認した922アミノ酸をコードしているオー
プンリーディングフレームについて、５’上流側にXbaI
サイト、３’側にBglIIサイトを付加し、pNG3を鋳型と
してＰＣＲを行ない増幅断片を得た。以下にセンス、ア
ンチセンスのプライマー配列を記す。 NigeNF（センスプライマー） GGTCTAGATATGGCTTTGTG
GGGGGCC Nige-R （アンチセンスプライマー）CCAGATCTCCTAGT
GCCTACCCTTTAATTTT pUC12のHindIII、PstI部位をクレノウでブラントにした
後、BglIIリンカー（GAGATCTG）を挿入しpUC12Bglを作
製した。プライマーNigeNF とNige-Rを用いてpNG3から
増幅させた断片をpUC12BglのXbaI、BglII部位に挿入
し、pUC12NigeSと命名した。ｐＵＣ１２ＮｉｇｅＳはＬ
ａｃＺとの融合蛋白として糖転移酵素を発現できるよう
に設計されている。本プラスミドを用いて大腸菌（ＤＨ
５（東洋紡績））の形質転換を行なった。得られたクロ
ーンについて３ｍｌの２ｘＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含む）で３７℃１２時間培養を行なっ
た。菌体を１５００ｇで１０分間遠心を行ない回収し
た。この菌体について、２００μｌの５０ｍＭＴｒｉ
ｓ‐ＨＣＬ（ｐＨ７．５）を加えて超音波破砕（トミ
ー、モデルＵＲ‐２０Ｐ）を行なったのち再度１５００
０ｇで１０分間遠心を行ない、上清を粗酵素とした。Ｈ
ＰＬＣを用いた糖転移酵素の測定を行なったが、本糖転
移酵素活性を確認することはできなかった。

【００５６】［実施例５］ GAP遺伝子プロモーター／
ターミネーターを含む糖転移酵素発現プラスミドの構築キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド３リン
酸デヒドロゲナーゼ（GAP）遺伝子のプロモーター、タ
ーミネーター断片は、それぞれJ.Bacteriol.177:7171-7
177(1995)記載の方法に従って得たCandida utilis IFO0
988株由来のゲノムＤＮＡを鋳型としてPCRにより取得し
た。プロモーターとしては、開始コドン上流-976から開
始コドン直前-1までの974bpの断片(開始コドンＡを+１
とする）を以下のプライマーを用いて取得した。 5′-AGCGGCCGCTAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTGCCC-3′ 5′-GGGATCCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATC-3′ これらプライマーにおいては５’側プライマー末端にNo
tIサイト、３’側開始コドン直前にXbaIとBamHIサイト
をそれぞれ付加して合成した。また、ターミネーターと
しては、終止コドン直後+1006から+1728までの723bpの
断片を取得した。プライマーとしては、 5′-GGGGATCCATTGTATGACTTTTATTTATGG-3′ 5′-CCCTGCAGGGATAAAGCTGAAGAATAAT-3′ を用い、５’側終止コドン直後にはBamHIサイト、３’
側にPstIサイトを付加して合成した。得られた２つの増
幅断片はＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用
いてpT7Blueにクローニングした。これら２つの断片は
それぞれ、NotI-BamHI断片と、BamHI-PstI断片として取
得した後、pBluescriptSK-のNotIとPstI間にクローニン
グして、プラスミドpGAPPT10を構築した。pUC12NigeSに
ついてはインサート領域をpGAPPT10のXbaI,BamHI部位に
挿入しpGAPNG1を作製した（図４）。

【００５７】［実施例６］キャンディダ・ユティリス
rDNA遺伝子座をターゲットとしたキャンディダ・ユテ
ィリス組み込み用糖転移酵素発現ベクターの構築プラスミドpCLRE2(J.Bacteriol、177:7171-7177、95)から
ApaI分解により得られるribosomal DNAを含む約1.2kbの
断片をpBluescriptSK-のApaIサイトにクローン化してプ
ラスミドpCRA1を構築した。次にpCRA1をXhoIで分解後、
クレノウ酵素処理により平滑末端とし、SphIリンカー
（5′GGCATGCC3′）を付加してpCRA2を作製した。ま
た、pCRA1をAsp718で分解後、クレノウ処理により平滑
末端とし、NotIリンカー（5′AGCGGCCGCT3′）を付加し
てpCRA3を作製した。このプラスミドをNotIとBglIIで分
解することにより、0.5kbと0.7kbのNotI-BglII断片を回
収した。一方、pUC19 をHindIIIとEcoRIとで分解した
後、クレノウ処理によりそれぞれを平滑末端とした後Bg
lIIリンカー（5′CAGATCTG3′）を連結して構築したプ
ラスミドpUCBglをBglII分解した後、２種類のNotI-BglI
I断片をクローニングしてpCRA10を構築した（図５）。
また、マーカー遺伝子とするシクロヘキシミド耐性型Ｌ
４１遺伝子に関しては、染色体に組み込まれるベクター
のコピー数をコントロールするために、プロモーターの
長さの異なる２種類の断片をPCRにより取得した。すな
わち、-４０５から+９７４までの断片と-１８４から+９
７４までの断片の２種類を取得した（開始コドンATGのA
を+１とする）。この際、遺伝子の５’側プライマー末
端にはPstIサイトを付加し、３’側プライマー末端には
SalIサイトをもつ様にデザインした。PCRに用いたプラ
イマーの配列は、L41遺伝子の５’側プライマーとし
て、 5′-CCTGCAGGAAACGTAAACAAAGAGGTTTCA-3′ 5′-CCTGCAGGCCCACGCAACACCTGGTGTCTG-3′ ３’側プライマーとして、 5′-GGTCGACTCGCTTTTGTGCGTGTGTGCATT-3′ である。また、鋳型としてはpCLRE2を用いた。２つの増
幅断片はＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用
いてプラスミドpT7Blueにクローニングした。構築した
それぞれのプラスミドからこれら２種類の断片をPstI-S
alI断片として切り出してpCRA10に連結することによ
り、長いL41遺伝子断片を含むプラスミドpCRAL10と短い
L41遺伝子断片を含むプラスミドpCRAL11とを構築した
（図５）。これらのプラスミドpCRAL10とpCRAL11におい
ては組み込みのターゲット配列となるrDNA断片が２分割
され、その間にAmp耐性遺伝子を含むpUCプラスミド由来
の配列を組み込んだ構造となっている。このベクター
は、BglIIサイトで分解してから形質転換に用いるた
め、形質転換体にはターゲットDNA配列とその間のマー
カー遺伝子が組み込まれるが、pUCプラスミド由来のDNA
配列は組み込まれないという特徴を有する。pGAPNG1よ
りNotI-PstI断片として発現カセットを回収し、pCRAL1
0、pCRAL11のNotI、PstI部位に挿入し、pRNG10、pRNG11
を構築した（図６）。

【００５８】［実施例７］糖転移酵素のキャンディダ
・ユティリスでの発現、および同組換え糖転移酵素を用
いたニゲロオリゴ糖の製造プラスミド、pRNG10、pRNG11、pCLRE2について各１０μ
ｇ、ＢｇｌＩＩで分解した後、キャンディダユティリ
スＡＴＣＣ９９５０株を形質転換した。形質転換は電気
パルス法（ＷＯ/９５/３２２８９号実施例１０参照）に
より行なった。パルス条件は電気容量を２５μＦ、抵抗
値を１０００オーム、電圧を５ＫＶ/ｃｍとして行なっ
た。pRNG10、pRNG11由来の株について１株ずつそれぞれ
ＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１０株、ＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１
１株と命名した。そして、菌体内、培養上清、およびペ
リプラズムの３画分について糖転移酵素の活性確認を行
なった。１０ｍＬのYPD培地（４０μｇ/ｍＬシクロヘキ
シミドを含む）で３０度３日間培養した菌について、１
５００ｇ、５分間、４度で遠心を行い培養上清と菌体を
分離し、菌体は蒸留水で洗浄した。菌体についてバイオ
マニュアルシリーズ、酵母による遺伝子実験法（羊土社
p128〜130）の方法に準じて菌体内、およびペリプラ
ズムに分画した。すなわち50mM Tris-HCl pH 7.5 5mM M
gCl₂ 3mM DTT 1Mソルビトール1mM PMSFバッファーを２
倍量（１ｍＬ）加え、よく懸濁した。２００μＬ（5ｍ
ｇ/ｍＬ）のザイモリエース100Ｔ（生化学工業）を加え
て３０度１時間保温した後、１５００ｇ、５分間、４度
で遠心を行なった。沈殿について上記バッファー１ｍＬ
での洗浄を３回繰り返し、これら上清画分をペリプラズ
ム画分とした。沈殿については５００μＬのグラスビー
ズを加え、ボルテックスを行ない50mM Tris-HCl pH 7.5
で３回抽出し、遠心した上清を菌体内画分とした。活
性測定は前記HPLCを用いた方法にしたがった。ポジティ
ブコントロールであるAcremonium培養上清より精製した
酵素（特開平７−５９５５９号公報実施例１参照）と反
応させたサンプルと同様に、ＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１０
株、ＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１株についても培養上清画
分、およびペリプラズム画分と反応させたサンプルから
ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルト
ースと一致するピークが得られた。図７に以下の条件で
ＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１株の培養上清画分とマルトー
スとを反応させ、グルコアミラーゼで処理した反応液の
HPLCチャートを示す。酵素液２０μＬに対して２％マル
トース（20mM リン酸ナトリウム pH7.0に溶解したも
の）４０μＬと４０℃で１時間反応させた。１００℃５
分で反応を停止した後、３０Ｕ/ｍＬのグルコアミラー
ゼ（生化学工業、１Ｍ酢酸ナトリウムpH4.5に溶解した
もの）１０μＬと４０℃、２時間反応させた。このサン
プルについても１００℃、５分で反応を停止した後、以
下の条件のＨＰＬＣで分析した。カラム：Amide-80（東ソー）移動相：６５％アセトニトリルカラム温度：３０℃ 流速：１ml/min. ネガティブコントロールである、シクロヘキシミド遺伝
子のみを含むpCLRE2で形質転換した株の培養上清を用い
たものからは対応するピークは検出されなかった。そこ
でＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１株の培養上清を７倍濃縮
し、脱塩をおこなったものを粗酵素として、１０％マル
トースと反応させ、ニゲロシルグルコースに対応するピ
ークを上記条件のHPLCを用いて分取した。分取したサン
プルをエバポレーターで濃縮したものについて^１Ｈ、
^１３Ｃ−ＮＭＲ分析により、これがニゲロシルグルコー
スと一致することを確認した。表２に培地１ｍＬあたり
の本糖転移酵素の活性（生産量）を示す。なお、培養上
清についてα‐グルコシダーゼとしての活性を測定した
ところ１．３×１０^-3ｕ／ｍｌであった。表２ＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１株由来の本発明糖転移酵素の活性量ＨＰＬＣのピークから求めた酵素活性培養上清２４．５（ｕ／ｍｌ）菌体内０．００（ｕ／ｍｌ）ペリプラズム４１．２（ｕ／ｍｌ）また培養上清を１４倍濃縮したもの、ポジティブコント
ロールであるAcremoniumより精製した酵素、及びネガテ
ィブコントロールであるｐＣＬＲＥ２で形質転換した株
の培養上清を１４倍濃縮したものについて、EndoHで処
理し（生化学工業、プロトコールに従って処理を行なっ
た）、SDS-PAGEを行なったところ、遺伝子から予想され
る位置にＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１株由来の組換え糖転
移酵素はポジティブコントロールであるAcremonium由来
の精製酵素とほぼ完全に一致してバンドが現われた（図
８）。本酵素はAcremoniumに於ては、プロセシングを受
けるが、組換え体に於ても同様なプロセシングを受ける
ことを確認した。またＩＦＯ０９８８ＲＮＧ１１株培養
上清由来の組換え糖転移酵素についても実施例１の方法
に従って、Ｎ末端アミノ酸配列を決定したところ、Acre
moniumより精製した酵素のアミノ酸配列と同一であるこ
とを確認した。

【００５９】

【発明の効果】本発明により、特にニゲロオリゴ糖の生
成に重要な糖転移酵素および該酵素タンパク質をコード
するＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列を含む発現ベクターお
よび形質転換体、該形質転換体を用いた糖転移酵素の製
造法、該糖転移酵素を用いたニゲロオリゴ糖の製造法が
提供された。本発明において、同一機能を有する２種類
の酵素のペプチドマップの近似性、上記糖転移酵素の全
アミノ酸配列、該酵素の２つのサブユニットのアミノ酸
配列が明らかにされた。また、上記の酵素タンパク質を
コードする遺伝子の塩基配列、および上記２つのサブユ
ニットが同一の遺伝子によってコードされていることが
明らかにされた。このことは、酵素が２種類のサブユニ
ットからなるヘテロオリゴマー分子の場合、２つのサブ
ユニットがそれぞれ異なる遺伝子に独立してコードされ
る可能性があり、また、たとえそれらが一つの遺伝子に
由来するとしても、２つのサブユニットをコードする領
域が構造遺伝子の中でいかなる位置関係になっているか
など、その構造については予測ができないことからすれ
ば、思いがけなかったことと解される。本発明によれ
ば、ニゲロオリゴ糖の生成に重要な糖転移酵素タンパク
質をコードする遺伝子の取得および酵母等の微生物での
発現（糖転移酵素の産生）に成功し、本発明ＤＮＡ配列
を含む形質転換体により、該糖転移酵素を著量に製造す
ることができる。特に、食用酵母であるCandida utilis
を宿主としてＧＡＰプロモーターの支配下にこの遺伝子
を発現させると著しく高い酵素活性が認められる。大腸
菌を宿主としてＤＨ５を使用した場合には酵素は全く発
現せず、本発明糖転移酵素遺伝子のシグナル配列が、カ
ビ（Acremonium）のみならず酵母でも正しく機能して著
量の糖転移酵素の菌体外分泌を達成することが可能であ
ったこと、また該酵素自体もヘテロダイマーになること
が確認されたことは予測のできなかったことである。

【００６０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２９８５配列の型：鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：生物名：Acremonium sp. 株名：Ｓ４Ｇ１３配列 GAATTCGCGG CCGCGTCGAC CGACTCTCGA AGCATTGCCA TTGGAGCTCG TTCATTTTCG 60 TGAACGTTGT CGTAGAGTTT CCTGCTGTAT CTTTCTGTCC TGCTCCTTTT ACAGCAAGTA 120 TGGCTTTGTG GGGGGCCTCC GTCCTCGCCT TCGCGGTATC ATCGGTATCT GCGACTGTCA 180 TTCCGAGGAA CAGTATTAGT GCTCGCGATG TCTCGTCTTG CCCAGGATAT GCAGCCTCGA 240 ACGTCCAGGT CTCCGATACC GGATTGACGG CTGATCTCAC TCTTGCCGGC GAGCCATGTG 300 ATGCTTACGG TGAAGACTTG AAAGACCTGA TTCTTGAGGT GACATACGAG ACAGAGAACC 360 GCTTGCATGT CAAGATACAG GACAAGGGGA ACCAAGTCTA CCAAATCCCG GAATCAGTTT 420 TCCCCCGACC AGGAGGCAGC ATAGACCCGG AATCCAGCAG CATCCGCTTTG CCTACGCCG 480 AAGAACCTTT CAGCTTCAAC ATCACCCGCG CTGACACAGA CGAAGTCTTG TTCGACACCT 540 CTGCGGCTTC CATTGTGTTC GAATCGCAAT ACCTGCGGCT TCGTACCTCG ATTCCCACCG 600 ACCCATACCT TTACGGCCTG GGTGCGCACA ATGATCCTAT GAGACTCGAG TCTGTGGGTT 660 ACATCCGCAC ATTCTGGAAC CAGGATAGTT ACGGTGTTCC AAATGGGGCG AATTTGTATG 720 GCAGCCATCC AGTGTATATC GATCATCGGG AGACAGGAAC ACATGGTGTC TTGTTCCTGA 780 ACTCGAATGG TATGGATGTC TTGATTGACG AGGACGAGGA GGGCGGCAAG TACCTTGAGT 840 ACAATACTTT GGGAGGTGTC CTTGACTTCT ACTTCTTCGT TGGAGACTCA CCGTCAAAGG 900 CAGTAGAGGA GTATGGGGAG ATTGCTGGTC GGCCGCCAAT GCAACCCTAC TGGGGCCTTG 960 GTTTCCACCA GTGCAAGTAT GGCTACCAAG ATGCATTCAT GGTTGCCGAG GTTGTGTACA 1020 ACTACAGCCA GGCCGAGATC CCCCTGGAAG TCATGTGGAC AGACATCGAC TACATGGACC 1080 GCCGCCGCGT CTTCACCGTC GACCCAGATC GTTTCCCTCT CCCCAAGATC CGCGCCGTCG 1140 TCGACTATCT GCACGAACAT GACCAGCGGT ACATCGTCAT GGTCGACCCG GCTATCGCAT 1200 ACGTCGAGTC GGGAACACTC GATCGAGGTC TCGATGACGA CGTCTTCCTG TTGCGGTCCA 1260 ATGGATCTGT ATGGCTAGGC GTTGTCTGGC CCGGTGTCAC AGTGTTCCCG GACTGGTTCG 1320 CAGAGAACAT CACTCAGTAC TGGAACAACG AGTTCGCACT CTTCTTCGAT GCGGATGAAG 1380 GGGTGGACAT TGATGGCTTG TGGATCGACA TGAACGAGCC GAGTAACTTC CCTTGCAACT 1440 TCCCGTGTGA TAATCCATAT GAAGCGGCAA AGGGTTTTCC GCCGACACCA CCGCCTGTGA 1500 GGGAGCCTCC GAGGGAGTTA CCTGGGTTCG CCTGTGTATT ACAGCCTGAG GGGACGGAGT 1560 GCGAAGACGG AGAAACTGCT GGGTCATCGA AGCGAGACGG GTCTTTTGGA CAACCAGGTC 1620 TAGTCACTCG ACAACCCGGA TTCTCTCGCC CAAGGCACCC TTTCCACCGT CGCCAGGAGT 1680 ATGAAGGTGA TCAAAAAGGT CTCCCCGGCC GAGACCTGCT TTACCCAGAG TACGCCATAC 1740 ACAACAAAGC AGCGTTCCGA GATGACTGGA ACGCAGACAA AGGCGGCATC TCCAACAAAA 1800 CCGTCAACAC CAACGTGATT CACCAAAACG GCCTCGCCGA ATACGACGTC CACAACCTCT 1860 ATGGCGCCAT GATGTCCAGC GCCTCCCGCG ACGCCATGGA AGCTCGTCGC CCCGGTCTCC 1920 GCCCCTTCAT CATCACCCGC AGCACCTTTC CCCACGCAGG CTCCAAAGTC GGACTCTGGC 1980 TCGGCGACAA TCTCTCCAAC TGGAACCAAT ACCGCGAATC CATCCGTACT ATGCTCGCCT 2040 ACACTTCCAT CTTCCAATTC GGCATGGTCG GCTCTGACGT CTGTGGGTTT GGAGGTGATA 2100 CAAATGAGGA GCTGTGTGCA CGATGGGCGA GTCTCGGTGC GTTCCAGACT TTCTTCAGGA 2160 ACCATGCGCA GTATGAGGCG GTACCGCAGG AGTTTTATCA GTGGGAGAGT GTGGCGGAGA 2220 GTGCGAGGAG GGCTATTGGA GCGAGATATC GGTTGTTGGA TTACATGTAC ACGGCGCTTT 2280 GGAAGCAGAG TGAACAAGGG ACGCCGGCGG TTGTCCCAAT GTTCTACGTG TTCCCGGAAG 2340 ATAAGGGGAC TTTGGAGTTG GAGAATCAGT ACTTCTATGG TCCTGGGGTG TTGGTTGCAC 2400 CGGTGGTTGA ACAGGGTTCG ACGAGCGTTG ACGTGTATCT TCCGGAGGGG AAGGTCTTCT 2460 ATGACTGGTG GACGCACGAG GCTATTCAGG GTGAAGGAGG GAGTTATTCG GTTACGGGGG 2520 TGAACACTAC GATGATCCCT CTGTTCATCA GAGGCGGTGT GATCCTACCA CTGAGGGAGA 2580 ACTCGGCAAT GACAACAACA GAGCTGAGGA AGGAGAAGTT TGAGCTCTTG GTCGCCTTGG 2640 ATAACGATGG AAAGGCAAAG GGGGAGCTGT ACATCGACGA TGGGGAGTCT TTGGAGCAGG 2700 AGAGCTATAC GGCTGTGAAG TTTGAGTATG CGCATGGGGT GGTGACGCTA GATGGGGAGT 2760 TTAGTGAGGA CTGGCCAGTT GAAGTAGCCA GCGTGGTCTT GCTGAGACCC AAGGGCAAGG 2820 AAATTGTGGT GGAGGTCGGG AAGTCTTTCA CAGCGGGAGG GAGGATAAAA TTAAAGGGTA 2880 GGCACTAGGC CTGTATCTTA GTACTTCATC CCCAGTGTCG TAACAATTGG ATTCACTCTC 2940 AAGAGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGTCGA CGCGGCCGCG AATTC

【００６１】配列番号：２配列の長さ：９２２配列の型：鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：生物名：Acremonium sp. 株名：Ｓ４Ｇ１３配列 ATG GCT TTG TGG GGG GCC TCC GTC CTC GCC TTC GCG GTA TCA TCG GTA 48 Met Ala Leu Trp Gly Ala Ser Val Leu Ala Phe Ala Val Ser Ser Val 1 5 10 15 TCT GCG ACT GTC ATT CCG AGG AAC AGT ATT AGT GCT CGC GAT GTC TCG 96 Ser Ala Thr Val Ile Pro Arg Asn Ser Ile Ser Ala Arg Asp Val Ser 20 25 30 TCT TGC CCA GGA TAT GCA GCC TCG AAC GTC CAG GTC TCC GAT ACC GGA 144 Ser Cys Pro Gly Tyr Ala Ala Ser Asn Val Gln Val Ser Asp Thr Gly 35 40 45 TTG ACG GCT GAT CTC ACT CTT GCC GGC GAG CCA TGT GAT GCT TAC GGT 192 Leu Thr Ala Asp Leu Thr Leu Ala Gly Glu Pro Cys Asp Ala Tyr Gly 50 55 60 GAA GAC TTG AAA GAC CTG ATT CTT GAG GTG ACA TAC GAG ACA GAG AAC 240 Glu Asp Leu Lys Asp Leu Ile Leu Glu Val Thr Tyr Glu Thr Glu Asn 65 70 75 80 CGC TTG CAT GTC AAG ATA CAG GAC AAG GGG AAC CAA GTC TAC CAA ATC 288 Arg Leu His Val Lys Ile Gln Asp Lys Gly Asn Gln Val Tyr Gln Ile 85 90 95 CCG GAA TCA GTT TTC CCC CGA CCA GGA GGC AGC ATA GAC CCG GAA TCC 336 Pro Glu Ser Val Phe Pro Arg Pro Gly Gly Ser Ile Asp Pro Glu Ser 100 105 110 AGC AGC ATC CGC TTT GCC TAC GCC GAA GAA CCT TTC AGC TTC AAC ATC 384 Ser Ser Ile Arg Phe Ala Tyr Ala Glu Glu Pro Phe Ser Phe Asn Ile 115 120 125 ACC CGC GCT GAC ACA GAC GAA GTC TTG TTC GAC ACC TCT GCG GCT TCC 432 Thr Arg Ala Asp Thr Asp Glu Val Leu Phe Asp Thr Ser Ala Ala Ser 130 135 140 ATT GTG TTC GAA TCG CAA TAC CTG CGG CTT CGT ACC TCG ATT CCC ACC 480 Ile Val Phe Glu Ser Gln Tyr Leu Arg Leu Arg Thr Ser Ile Pro Thr 145 150 155 160 GAC CCA TAC CTT TAC GGC CTG GGT GCG CAC AAT GAT CCT ATG AGA CTC 528 Asp Pro Tyr Leu Tyr Gly Leu Gly Ala His Asn Asp Pro Met Arg Leu 165 170 175 GAG TCT GTG GGT TAC ATC CGC ACA TTC TGG AAC CAG GAT AGT TAC GGT 576 Glu Ser Val Gly Tyr Ile Arg Thr Phe Trp Asn Gln Asp Ser Tyr Gly 180 185 190 GTT CCA AAT GGG GCG AAT TTG TAT GGC AGC CAT CCA GTG TAT ATC GAT 624 Val Pro Asn Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Val Tyr Ile Asp 195 200 205 CAT CGG GAG ACA GGA ACA CAT GGT GTC TTG TTC CTG AAC TCG AAT GGT 672 His Arg Glu Thr Gly Thr His Gly Val Leu Phe Leu Asn Ser Asn Gly 210 215 220 ATG GAT GTC TTG ATT GAC GAG GAC GAG GAG GGC GGC AAG TAC CTT GAG 720 Met Asp Val Leu Ile Asp Glu Asp Glu Glu Gly Gly Lys Tyr Leu Glu 225 230 235 240 TAC AAT ACT TTG GGA GGT GTC CTT GAC TTC TAC TTC TTC GTT GGA GAC 768 Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Leu Asp Phe Tyr Phe Phe Val Gly Asp 245 250 255 TCA CCG TCA AAG GCA GTA GAG GAG TAT GGG GAG ATT GCT GGT CGG CCG 816 Ser Pro Ser Lys Ala Val Glu Glu Tyr Gly Glu Ile Ala Gly Arg Pro 260 265 270 CCA ATG CAA CCC TAC TGG GGC CTT GGT TTC CAC CAG TGC AAG TAT GGC 864 Pro Met Gln Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Gln Cys Lys Tyr Gly 275 280 285 TAC CAA GAT GCA TTC ATG GTT GCC GAG GTT GTG TAC AAC TAC AGC CAG 912 Tyr Gln Asp Ala Phe Met Val Ala Glu Val Val Tyr Asn Tyr Ser Gln 290 295 300 GCC GAG ATC CCC CTG GAA GTC ATG TGG ACA GAC ATC GAC TAC ATG GAC 960 Ala Glu Ile Pro Leu Glu Val Met Trp Thr Asp Ile Asp Tyr Met Asp 305 310 315 320 CGC CGC CGC GTC TTC ACC GTC GAC CCA GAT CGT TTC CCT CTC CCC AAG 1008 Arg Arg Arg Val Phe Thr Val Asp Pro Asp Arg Phe Pro Leu Pro Lys 325 330 335 ATC CGC GCC GTC GTC GAC TAT CTG CAC GAA CAT GAC CAG CGG TAC ATC 1056 Ile Arg Ala Val Val Asp Tyr Leu His Glu His Asp Gln Arg Tyr Ile 340 345 350 GTC ATG GTC GAC CCG GCT ATC GCA TAC GTC GAG TCG GGA ACA CTC GAT 1104 Val Met Val Asp Pro Ala Ile Ala Tyr Val Glu Ser Gly Thr Leu Asp 355 360 365 CGA GGT CTC GAT GAC GAC GTC TTC CTG TTG CGG TCC AAT GGA TCT GTA 1152 Arg Gly Leu Asp Asp Asp Val Phe Leu Leu Arg Ser Asn Gly Ser Val 370 375 380 TGG CTA GGC GTT GTC TGG CCC GGT GTC ACA GTG TTC CCG GAC TGG TTC 1200 Trp Leu Gly Val Val Trp Pro Gly Val Thr Val Phe Pro Asp Trp Phe 385 390 395 400 GCA GAG AAC ATC ACT CAG TAC TGG AAC AAC GAG TTC GCA CTC TTC TTC 1248 Ala Glu Asn Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Asn Glu Phe Ala Leu Phe Phe 405 410 415 GAT GCG GAT GAA GGG GTG GAC ATT GAT GGC TTG TGG ATC GAC ATG AAC 1296 Asp Ala Asp Glu Gly Val Asp Ile Asp Gly Leu Trp Ile Asp Met Asn 420 425 430 GAG CCG AGT AAC TTC CCT TGC AAC TTC CCG TGT GAT AAT CCA TAT GAA 1344 Glu Pro Ser Asn Phe Pro Cys Asn Phe Pro Cys Asp Asn Pro Tyr Glu 435 440 445 GCG GCA AAG GGT TTT CCG CCG ACA CCA CCG CCT GTG AGG GAG CCT CCG 1392 Ala Ala Lys Gly Phe Pro Pro Thr Pro Pro Pro Val Arg Glu Pro Pro 450 455 460 AGG GAG TTA CCT GGG TTC GCC TGT GTA TTA CAG CCT GAG GGG ACG GAG 1440 Arg Glu Leu Pro Gly Phe Ala Cys Val Leu Gln Pro Glu Gly Thr Glu 465 470 475 480 TGC GAA GAC GGA GAA ACT GCT GGG TCA TCG AAG CGA GAC GGG TCT TTT 1488 Cys Glu Asp Gly Glu Thr Ala Gly Ser Ser Lys Arg Asp Gly Ser Phe 485 490 495 GGA CAA CCA GGT CTA GTC ACT CGA CAA CCC GGA TTC TCT CGC CCA AGG 1536 Gly Gln Pro Gly Leu Val Thr Arg Gln Pro Gly Phe Ser Arg Pro Arg 500 505 510 CAC CCT TTC CAC CGT CGC CAG GAG TAT GAA GGT GAT CAA AAA GGT CTC 1584 His Pro Phe His Arg Arg Gln Glu Tyr Glu Gly Asp Gln Lys Gly Leu 515 520 525 CCC GGC CGA GAC CTG CTT TAC CCA GAG TAC GCC ATA CAC AAC AAA GCA 1632 Pro Gly Arg Asp Leu Leu Tyr Pro Glu Tyr Ala Ile His Asn Lys Ala 530 535 540 GCG TTC CGA GAT GAC TGG AAC GCA GAC AAA GGC GGC ATC TCC AAC AAA 1680 Ala Phe Arg Asp Asp Trp Asn Ala Asp Lys Gly Gly Ile Ser Asn Lys 545 550 555 560 ACC GTC AAC ACC AAC GTG ATT CAC CAA AAC GGC CTC GCC GAA TAC GAC 1728 Thr Val Asn Thr Asn Val Ile His Gln Asn Gly Leu Ala Glu Tyr Asp 565 570 575 GTC CAC AAC CTC TAT GGC GCC ATG ATG TCC AGC GCC TCC CGC GAC GCC 1776 Val His Asn Leu Tyr Gly Ala Met Met Ser Ser Ala Ser Arg Asp Ala 580 585 590 ATG GAA GCT CGT CGC CCC GGT CTC CGC CCC TTC ATC ATC ACC CGC AGC 1824 Met Glu Ala Arg Arg Pro Gly Leu Arg Pro Phe Ile Ile Thr Arg Ser 595 600 605 ACC TTT CCC CAC GCA GGC TCC AAA GTC GGA CTC TGG CTC GGC GAC AAT 1872 Thr Phe Pro His Ala Gly Ser Lys Val Gly Leu Trp Leu Gly Asp Asn 610 615 620 CTC TCC AAC TGG AAC CAA TAC CGC GAA TCC ATC CGT ACT ATG CTC GCC 1920 Leu Ser Asn Trp Asn Gln Tyr Arg Glu Ser Ile Arg Thr Met Leu Ala 625 630 635 640 TAC ACT TCC ATC TTC CAA TTC GGC ATG GTC GGC TCT GAC GTC TGT GGG 1968 Tyr Thr Ser Ile Phe Gln Phe Gly Met Val Gly Ser Asp Val Cys Gly 645 650 655 TTT GGA GGT GAT ACA AAT GAG GAG CTG TGT GCA CGA TGG GCG AGT CTC 2016 Phe Gly Gly Asp Thr Asn Glu Glu Leu Cys Ala Arg Trp Ala Ser Leu 660 665 670 GGT GCG TTC CAG ACT TTC TTC AGG AAC CAT GCG CAG TAT GAG GCG GTA 2064 Gly Ala Phe Gln Thr Phe Phe Arg Asn His Ala Gln Tyr Glu Ala Val 675 680 685 CCG CAG GAG TTT TAT CAG TGG GAG AGT GTG GCG GAG AGT GCG AGG AGG 2112 Pro Gln Glu Phe Tyr Gln Trp Glu Ser Val Ala Glu Ser Ala Arg Arg 690 695 700 GCT ATT GGA GCG AGA TAT CGG TTG TTG GAT TAC ATG TAC ACG GCG CTT 2160 Ala Ile Gly Ala Arg Tyr Arg Leu Leu Asp Tyr Met Tyr Thr Ala Leu 705 710 715 720 TGG AAG CAG AGT GAA CAA GGG ACG CCG GCG GTT GTC CCA ATG TTC TAC 2208 Trp Lys Gln Ser Glu Gln Gly Thr Pro Ala Val Val Pro Met Phe Tyr 725 730 735 GTG TTC CCG GAA GAT AAG GGG ACT TTG GAG TTG GAG AAT CAG TAC TTC 2256 Val Phe Pro Glu Asp Lys Gly Thr Leu Glu Leu Glu Asn Gln Tyr Phe 740 745 750 TAT GGT CCT GGG GTG TTG GTT GCA CCG GTG GTT GAA CAG GGT TCG ACG 2304 Tyr Gly Pro Gly Val Leu Val Ala Pro Val Val Glu Gln Gly Ser Thr 755 760 765 AGC GTT GAC GTG TAT CTT CCG GAG GGG AAG GTC TTC TAT GAC TGG TGG 2352 Ser Val Asp Val Tyr Leu Pro Glu Gly Lys Val Phe Tyr Asp Trp Trp 770 775 780 ACG CAC GAG GCT ATT CAG GGT GAA GGA GGG AGT TAT TCG GTT ACG GGG 2400 Thr His Glu Ala Ile Gln Gly Glu Gly Gly Ser Tyr Ser Val Thr Gly 785 790 795 800 GTG AAC ACT ACG ATG ATC CCT CTG TTC ATC AGA GGC GGT GTG ATC CTA 2448 Val Asn Thr Thr Met Ile Pro Leu Phe Ile Arg Gly Gly Val Ile Leu 805 810 815 CCA CTG AGG GAG AAC TCG GCA ATG ACA ACA ACA GAG CTG AGG AAG GAG 2496 Pro Leu Arg Glu Asn Ser Ala Met Thr Thr Thr Glu Leu Arg Lys Glu 820 825 830 AAG TTT GAG CTC TTG GTC GCC TTG GAT AAC GAT GGA AAG GCA AAG GGG 2544 Lys Phe Glu Leu Leu Val Ala Leu Asp Asn Asp Gly Lys Ala Lys Gly 835 840 845 GAG CTG TAC ATC GAC GAT GGG GAG TCT TTG GAG CAG GAG AGC TAT ACG 2592 Glu Leu Tyr Ile Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ser Tyr Thr 850 855 860 GCT GTG AAG TTT GAG TAT GCG CAT GGG GTG GTG ACG CTA GAT GGG GAG 2640 Ala Val Lys Phe Glu Tyr Ala His Gly Val Val Thr Leu Asp Gly Glu 865 870 875 880 TTT AGT GAG GAC TGG CCA GTT GAA GTA GCC AGC GTG GTC TTG CTG AGA 2688 Phe Ser Glu Asp Trp Pro Val Glu Val Ala Ser Val Val Leu Leu Arg 885 890 895 CCC AAG GGC AAG GAA ATT GTG GTG GAG GTC GGG AAG TCT TTC ACA GCG 2736 Pro Lys Gly Lys Glu Ile Val Val Glu Val Gly Lys Ser Phe Thr Ala 900 905 910 GGA GGG AGG ATA AAA TTA AAG GGT AGG CAC TAG 2769 Gly Gly Arg Ile Lys Leu Lys Gly Arg His 915 920

【図面の簡単な説明】

【図１】２‐ＡＰ消化物の逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの結果を示した図である。

【図２】糖転移酵素遺伝子を含む各種クローンの制限酵
素地図である。

【図３】糖転移酵素遺伝子の全長を含むpNG3の制限酵素
地図である。

【図４】プラスミドｐＧＡＰＮＧ１の構築を表す図で
ある。

【図５】プラスミドｐＣＲＡＬ１０、ｐＣＲＡＬ１１
の構築を表す図である。

【図６】プラスミドｐＲＮＧ１０、ｐＲＮＧ１１の構
築を表す図である。

【図７】プラスミドｐＣＲＡＬ１１を用いて形質転換
を行なったキャンディダ・ユティリス（ＩＦＯ０９８８
ＲＮＧ１１株）の培養上清とマルトースとを反応させた
後、グルコアミラーゼ処理を行ないＨＰＬＣ分析を行な
った際のチャートを示す図である。

【図８】Acremonium sp.S4G13株より精製した糖転移酵
素、プラスミドｐＣＲＡＬ１１を用いて形質転換を行
なったキャンディダ・ユティリス（ＩＦＯ０９８８ＲＮ
Ｇ１１株）の培養上清を１４倍濃縮したもの、及びネガ
ティブコントロールであるプラスミドｐＣＬＲＥ２を用
いて形質転換を行なったキャンディダ・ユティリスの培
養上清を１４倍濃縮したもの、およびそれらをＥｎｄｏ
‐Ｈ処理したもののＳＤＳ‐ＰＡＧＥの電気泳動図（写
真）である。マーカーはＳＤＳ‐ＰＡＧＥスタンダード
ブロードレンジ（ＢＩＯ‐ＲＡＤ）を用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者近藤恵二神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５麒麟麦酒株式会社基盤技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２のアミノ酸番号１〜９２２で示
されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１
もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付
加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉及びその分解物
の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα‐１→
３結合のグルコース転移またはα‐１→３およびα‐１
→４結合のグルコース転移を優先的に触媒する糖転移酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】配列番号２のアミノ酸番号３０〜９２２で
示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において
１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは
付加されたアミノ酸配列を有し、かつ澱粉及びその分解
物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα‐１
→３結合のグルコース転移またはα‐１‐３およびα‐
１→４結合のグルコース転移を優先的に触媒する糖転移
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項３】請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を含
有する組換えプラスミド。
【請求項４】請求項３に記載のプラスミドにより形質転
換された細胞。
【請求項５】宿主細胞が酵母である、請求項４記載の形
質転換細胞。
【請求項６】酵母がCandida utilisである、請求項５記
載の形質転換細胞。
【請求項７】構造遺伝子として請求項１または２に記載
のＤＮＡ配列を、プロモーターとしてグリセルアルデヒ
ド３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターを含有する
組換えプラスミドにより形質転換されたCandida utili
s。
【請求項８】請求項４〜７のいずれか１項に記載の形質
転換細胞を培養し、この培養物中から、澱粉及びその分
解物の中から選ばれた基質に作用して糖受容体へのα‐
１→３結合のグルコース転移またはα‐１→３およびα
‐１→４結合のグルコース転移を優先的に触媒する糖転
移酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴と
する、糖転移酵素の製造法。
【請求項９】形質転換細胞が、構造遺伝子として請求項
１または２に記載のＤＮＡ配列を、プロモーターとして
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモ
ーターを含有する組換えプラスミドにより形質転換され
たCandida utilisである、請求項８記載の糖転移酵素の
製造法。
【請求項１０】遺伝子組換え法によって得られ、配列番
号２のアミノ酸番号１〜９２２で示されるアミノ酸配
列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸
配列を有し、かつ澱粉及びその分解物の中から選ばれた
基質に作用して糖受容体へのα‐１→３結合のグルコー
ス転移またはα‐１→３およびα‐１→４結合のグルコ
ース転移を優先的に触媒する糖転移酵素活性を有するタ
ンパク質。
【請求項１１】遺伝子組換え法によって得られ、配列番
号２のアミノ酸番号３０〜９２２で示されるアミノ酸配
列、または該アミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸
配列を有し、かつ澱粉及びその分解物の中から選ばれた
基質に作用して糖受容体へのα‐１→３結合のグルコー
ス転移またはα‐１→３およびα‐１→４結合のグルコ
ース転移を優先的に触媒する糖転移酵素活性を有する、
遺伝子組換えタンパク質。
【請求項１２】請求項１０または１１に記載の糖転移酵
素活性を有するタンパク質を、澱粉およびその分解物か
ら選ばれる基質と接触させることを特徴とする、α‐１
→３結合を分子内に含む糖類の製造法。