JP3759794B2 - 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアスペルギルス・オリゼーから得られた新規グルコアミラーゼ遺伝子、これを含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリゼーまたはサッカロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体及びその利用に関するものである。
アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼは産業上重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転換体は、特に固体培養においても本酵素を著量生産し、これらの酵素を用いる産業界に大いに貢献するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルコアミラーゼは澱粉を非還元末端からグルコース単位で分解する酵素であり、清酒醸造をはじめ味噌、醤油製造の産業において原料澱粉を糖化する工程に広く利用されている。これらの産業においてグルコアミラーゼはアスペルギルス・オリゼーの固体培養物（麹）から得られている。特に清酒醸造においては本酵素の生産性は非常に重要で、麹のグルコアミラーゼ活性が低い場合、その後の発酵工程に悪影響を及ぼす。そこでこの麹中のグルコアミラーゼ活性を高めるためアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の単離が試みられている（特公平７−５７１９４、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５ ９４１−９４９）。取得されたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）はグルコアミラーゼ活性を有する蛋白をコードしていることが、本遺伝子に対応するｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体がグルコアミラーゼ活性を発現することによって確認されている。また本遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに移入した形質転換体は、液体培養においてグルコアミラーゼを顕著に増加したが、清酒醸造などで用いる固体培養においては親株と同程度のグルコアミラーゼしか生産しなかった。従って、固体培養でグルコアミラーゼを高生産させるには、ｇｌａＡ以外の別の遺伝子の働きが必要であると考えられ、現在清酒醸造などの実際に利用しうるグルコアミラーゼ活性のみが上昇した実用菌株の育種は成功していない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術はたしかにすぐれた技術ではあるが、未だ充分に満足できるものではなく、特にわが国においては、麹といった固体培養が多用されており、醸造工業や医薬品製造工業等において重要な位置を占めている現状に鑑み、固体培養においてもグルコアミラーゼを顕著に増産しうる系の開発が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、このような技術の現状に鑑み、従来技術が有している問題点を更に改良、解決するためになされたものであって、液体培養のみでなく固体培養においてもグルコアミラーゼを著量生産する微生物を新たに開発することを目的になされたものである。
【０００５】
上記目的を達成するために各方面から検討の結果、遺伝子組換え技術が最適であるとの観点に至った。
そして、グルコアミラーゼ生産菌であるアスペルギルス・オリゼーを用いて固体培養を行い、そのグルコアミラーゼを精製し、その酵素の機能や蛋白質の１次構造を詳細に検討した。その結果、固体培養で生産されるグルコアミラーゼは既にクローニングされているｇｌａＡ以外の遺伝子の産物であることを見いだした。そこでこの固体培養で高発現しているグルコアミラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに、このグルコアミラーゼをコードすると考えられるｃＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ断片をクローニングすることに成功した。
【０００６】
そしてこのグルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエに移入することにも成功し、得られた形質転換体においてグルコアミラーゼが発現することを確認した。さらにクローニングした染色体ＤＮＡ断片を移入したアスペルギルス・オリゼー形質転換体においてもグルコアミラーゼ生産性が顕著に増大することも確認した。
すなわち本発明者らは、アスペルギルス・オリゼーの新規なグルコアミラーゼ遺伝子に着目し、アスペルギルス・オリゼーのゲノムＤＮＡ制限酵素断片よりグルコアミラーゼをコードするＤＮＡ断片をクローン化し、これをアスペルギルス・オリゼー宿主ベクター系に移入することにより、グルコアミラーゼを著量生産する形質転換体（Ａ）を得ることに成功した。ここで得られた形質転換体（Ａ）はＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として生命研に寄託されている。
さらにアスペルギルス・オリゼーの全ｍＲＮＡを固体培養菌体（麹）から調製し、これに基づいてｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリーを作製し、その中からアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼをコードするクローンを分離した。そしてこのｃＤＮＡを発現ベクターに連結した後サッカロミセス・セレビシアエに移入することにより、アスペルギルス・オリゼーを生産するグルコアミラーゼと同等のグルコアミラーゼを生産する形質転換体（Ｂ）を得ることにも成功した。ここで得られた形質転換体（Ｂ）はＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として生命研に寄託されている。
【０００７】
また、ここで得られた形質転換体（Ａ）を用いて清酒醸造を行ったところ、従来の菌株やｇｌａＡ遺伝子を移入した形質転換体（特公平７−５７１９４、Ｇｅｎｅ．１０８ １４５−１５０）に比べて著量のグルコアミラーゼ活性を有する麹が得られたので、麹歩合を低減させたり、粕歩合を低下させたりし、原料コストを大きく低減させることが可能となった。また、形質転換体（Ｂ）を用いることにより液化した澱粉原料を糖化酵素などによって糖化することなく、直接アルコール発酵が可能となることも確認した。
本発明は、これらの有用新知見に基づき、遂に完成されたものである。
【０００８】
以下、本発明について詳しく説明するが、あくまでもこの方法に限定されるものではない。
本発明に用いた染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびグルコアミラーゼ供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体的にはＯＳＩ−１０１３株である。本発明においては、本菌株の精製グルコアミラーゼを得るため、精白米と本菌株の分生胞子を用いて固体麹を調製する。アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ精製方法はＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１７０７−１７１１（１９８９）に記載された方法に準じて行われる。
【０００９】
次に、得られた精製グルコアミラーゼをＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９８，３０５−３１８に準じてリシルエンドペプチダーゼによって消化し、さらに逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ペプチド断片を分離回収する。得られたペプチド断片をＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，７９９０（１９８１）に準じてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の自動ペプチドシーケンサーＭＯＤＥＬ４７０Ａにて、そのアミノ酸配列を決定する。得られたアミノ酸配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これを後述のプラークハイブリダイゼーションのプローブとして使用する。
【００１０】
また、アスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−１０１３株より染色体を、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に記載された方法にて抽出し、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，５９３（１９８７）に準じて染色体ジーンライブラリーを作製する。この染色体ジーンライブラリーより、上記で得られたオリゴＤＮＡをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法により、新規グルコアミラーゼ遺伝子を単離する。得られたＤＮＡ断片は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有していた。（図１）。
【００１１】
上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼーのベクターとして例えばｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＳＴＡ２４（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））に挿入し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギルス・オリゼーに移入し、形質転換体を得る。ｎｉａＤ欠損株は具体的にはアスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−１０１３株よりＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９）記載の方法に準じて、塩素酸ナトリウム耐性株として得られる。形質転換法としては、公知の方法、例えばＡｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に記載された方法あるいはこれに準じた方法がとられる。この方法により形質転換体（Ａ）を得る。
【００１２】
次に、アスペルギルス・オリゼーの分生胞子と精白米から固体麹を調製し、この固体麹の表面に生育するアスペルギルス・オリゼーの菌体よりＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，１９０５（１９９０）に記載された方法によりｍＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６９（１９８３）の方法にてｃＤＮＡを合成した。一方、グルコアミラーゼ遺伝子のグルコアミラーゼのコーディング領域の開始コドンを含む配列と、終止コドンを含む配列を基にオリゴＤＮＡを合成する。このオリゴＤＮＡをプライマーとして、得られたｃＤＮＡを鋳型として、例えばＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ．（１９８９）に記載されたＰＣＲ法によりグルコアミラーゼｃＤＮＡを合成した。単離したグルコアミラーゼｃＤＮＡは、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有していた（図２）。
【００１３】
上記で得られたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエの発現ベクター、例えば酵母ガラクトースキナーゼ（ＧＡＬ１）のプロモーターを持つ酵母発現ベクターｐＹＥＳ２に挿入し、サッカロミセス・セレビシアエに移入することにより形質転換体を得る。形質転換法としては、公知の方法、例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５３，１６３−１６８（１９８３）に記載されている方法あるいはそれに準じた方法がとられる。この方法によって形質転換体（Ｂ）を得る。
【００１４】
次にこの形質転換体（Ａ）を蒸米上で生育させ、分生胞子を形成させ、得られた分生胞子を用いて公知の方法によって米麹を製造し、これに水、酵母及び蒸米を加え、発酵させることにより、酒類、エタノールなどを製造する。
形質転換体（Ａ）を用いて製造した麹には固体培養で発現するグルコアミラーゼの力価が高いため、酒類、エタノールなどを効率よく製造することができる。
【００１５】
またこのグルコアミラーゼのｃＤＮＡを含むベクターをサッカロミセス・セレビシアエに移入して、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを分泌する形質転換体（Ｂ）を得る。この形質転換体（Ｂ）を用いることにより、グルコアミラーゼなどの糖化酵素を加えることなく、サッカロミセス・セレビシアエによる澱粉から直接アルコール発酵を行うことが可能である。
【００１６】
当然のことながら、形質転換体（Ａ、Ｂ）は、常法にしたがってこれを培養することにより、酵素を効率よく製造することができ、発酵工業のみならず、食品工業、医薬品工業その他各種の工業において様々な用途に利用することができる。特にアスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼは糖含量が高く、熱やプロテアーゼに対する安定性が高いため、これらの工業で安定に利用することができる。
次に本発明の実施例を示す。
【００１７】
【実施例１】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼの精製と部分アミノ酸配列の決定
【００１８】
アスペルギルス・オリゼーの分生胞子を蒸米に接種し、常法に従い米麹を調製する。この米麹１ｋｇに３Ｌの抽出バッファー（１％ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５））を加えて、４℃で１６時間放置後、アドバンテック濾紙Ｎｏ．５Ａにてろ過した。ろ過液に９０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加えて溶解させた後、４℃１６時間放置し塩析を行った。これを遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０分）し、上清を集め、流水１日、水１日、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７））でさらに１日透析を行った。この透析液をあらかじめ上記緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（３００ｍｌ）にロードし、グルコアミラーゼをカラムに吸着させた。カラムを緩衝液で十分洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液５００ｍｌでグルコアミラーゼ画分を溶出した。
【００１９】
このグルコアミラーゼ画分を限外ろ過装置にて濃縮し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムにロードし、０−０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントにて溶出し、グルコアミラーゼ画分を集めた。このグルコアミラーゼ画分をさらにグルコアミラーゼの特異的インヒビターであるアカボースを固定化したアフィニティーカラム（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１７０７−１７１４）にて精製した。最終的には１５０ｍｇの精製グルコアミラーゼを得た。
【００２０】
得られた精製グルコアミラーゼ１０ｍｇを３ｍｌの７Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅを含む０．５Ｍ Ｔｒｉｓバッファーに溶解し、Ｎ2ガス下でＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌとヨード酢酸にて還元カルボキシメチル化（Ｃｍ化）を行った。このＣｍグルコアミラーゼを４Ｍ尿素存在下でリシルエンドペプチダーゼにて消化し、グルコアミラーゼ蛋白をペプチドに分解した。これを逆相ＨＰＬＣにて各ペプチド断片を分離、回収した。各ペプチドは気相式自動ペプチドシーケンサーにて、そのＮ末端付近のアミノ酸配列を決定した。
【００２１】
得られたペプチド断片のアミノ酸配列と、それから類推して合成したオリゴＤＮＡプローブ（Ｎｏ．１及びＮｏ．２）を図５に示す。
【００２２】
【実施例２】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼをコードする染色体ＤＮＡ断片の単離と塩基配列の決定
【００２３】
実施例１記載のオリゴＤＮＡをＥＣＬオリゴＤＮＡラベリングシステムにより、蛍光ラベルしたものをプローブとして用いて、アスペルギルス・オリゼーのλＥＭＢＬ３を用いたファージ染色体ライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりグルコアミラーゼ遺伝子を含むクローン選択を行った。一連の操作はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ６３−６７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の常法に従った。約２０，０００個のプラークより、蛍光ラベルしたプローブにハイブリダイズするクローン１個を得た。
【００２４】
このクローンよりファージＤＮＡを単離し、蛍光プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片（７．０ｋｂ ＳａｌＩ断片）をｐＵＣ１１８にサブクローニングした。その制限酵素地図を図３に示す。この７ｋｂのＳａｌＩ断片のなかで蛍光プローブにハイブリダイズする領域を特定し、ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４、１２９５−１３１０（１９８０））にてその領域周辺の塩基配列を決定した。その結果この遺伝子断片中に、プローブに用いたペプチド断片をコードする塩基配列が見いだされた。他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のグルコアミラーゼ遺伝子と比較した結果、２つのイントロンに分断された３つのエキソン中に４９３アミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームがあると推定された。この新規グルコアミラーゼ遺伝子のコーディング領域とその上流、下流領域の塩基配列を配列番号１に示す（図１）。
【００２５】
【実施例３】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼを多量に発現するアスペルギルス・オリゼーの形質転換体の作製
【００２６】
実施例２に記載するグルコアミラーゼ遺伝子を含む７．０ｋｂ−ＳａｌＩの染色体ＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼーのｎｉａＤ変異を相補する遺伝子を持つベクターｐＮＩＡ−２に連結し、図３に示すプラスミドｐＮＧＢ−１を作製した。挿入したＳａｌＩ断片はグルコアミラーゼのコーディング領域１．７ｋｂとその上流部分２．８ｋｂ下流分２．４ｋｂを含んでおり、グルコアミラーゼのアスペルギルス・オリゼーでの発現に必要な領域はすべて含んでいると考えられる。そこでこのプラスミドをアスペルギルス・オリゼーに移入した。
【００２７】
アスペルギルス・オリゼーの硝酸還元酵素欠損変異株（ｎｉａＤ）をプラスミドｐＮＧＢ−１により、Ａｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）の記載の方法に準じて形質転換を行った。宿主として用いる硝酸還元酵素欠損変異株はＮａＮＯ3を窒素源として利用できないのに対し、ｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドが移入された形質転換体はＮａＮＯ3を単一窒素源として生育が可能であった。次にこの形質転換体をプレートに塗布し分生胞子を集めた。この分生胞子を蒸米に接種し、定法に従い米麹を調製した。得られた米麹のグルコアミラーゼ活性を醸協，８１，４９０−４９４（１９８６）記載の方法に従って測定した。その結果を下記表５に示す。
【００２８】
【表５】
【００２９】
上記のようにこのグルコアミラーゼ遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに移入することにより、グルコアミラーゼ活性のみ上昇する形質転換体が得られた。なおこの形質転換体（Ａ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＧＬＢ−０１と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として寄託した。
【００３０】
【実施例４】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼのｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
【００３１】
実施例２で得られたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列から推定される開始コドン上流と終止コドン下流に対応する２種のプライマーＰ１、Ｐ２を合成した（図６）。
【００３２】
アスペルギルス・オリゼーを固体培養した米麹から、ＤＮＡ，２，３２９−３３５（１９８３）記載の方法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ ＲＮＡよりＱＤ Ｒａｐｉｄ ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（５′Ｐｒｉｍｅ−３′Ｐｒｉｍｅ Ｉｎｃ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを単離した。さらにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ λｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いてｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンペレートとして先の２種類の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｇｌａＢ遺伝子に対応するｃＤＮＡ断片を得た。このｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクローニングし、実施例２に記載の方法と同様にしてその塩基配列を決定した。配列番号２に示すように、全塩基配列は１４８２ｂｐであり、Ｍｅｔで始まる４９３個のアミノ酸をコードしていた（図２）。
【００３３】
【実施例５】
アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを発現するサッカロミセス・セレビシアエの形質転換体の作製
【００３４】
実施例４のグルコアミラーゼｃＤＮＡ断片を酵母発現ベクターに連結し、図４に示すプラスミドｐＹＧＢ−１を作成した。使用した発現ベクターはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）である。このプラスミドはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１プロモータとＣＹＣ１ターミネーターを含んでおり、ＧＡＬ１プロモーター下流に連結されたｃＤＮＡ断片はこのプロモータ制御を受けて酵母内で発現されると考えられる。
次にこのグルコアミラーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＹＧＢ−１をＩｔｏらのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１５３、１６３−１６８，（１９８３）記載の方法に従って、酵母宿主（ＩＮＶＳｃｌａ，ｈｉｓ３，ｔｒｐ１，ｕｒａ３）に導入した。プラスミドに含まれるＵＲＡ３遺伝子により、ウラシル要求性が相補された形質転換体（Ｂ）を選択した。
【００３５】
この形質転換体（Ｂ）を次に示す組成の合成培地１００ｍｌに接種し、３０℃、７２時間培養した。合成培地：２％ガラクトース、２％ポリペプトン、１％イーストエキス、５０ｍｇ／ｌトリプトファン）培養終了後、３，０００ｒｐｍの遠心処理にて酵母菌体を除いた後、上清のグルコアミラーゼ活性を実施例３と同様の方法にて測定した。その結果を下記表６に示す。
この結果から明らかなように、グルコアミラーゼｃＤＮＡが移入された形質転換体（Ｂ）においては、グルコアミラーゼが検出された。なお、この形質転換体（Ｂ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃＧＬＢ−０１と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として寄託した。
【００３６】
【表６】
【００３７】
【実施例６】
ノザン解析によるグルコアミラーゼ遺伝子の発現様式の検討
【００３８】
実施例４記載と同様に米麹からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出しノザン解析によりグルコアミラーゼの発現について検討した。同一菌株を３％デンプン、１％ポリペプトンを含むツァペックドックス液体培地にて、振とう培養し、得られた菌体より同様な方法にてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをそれぞれ２０μｇをＣｕｒｒ．Ｃｅｎｅｔ，２２，８５−９１（１９９２）に記載の方法にて、変性アガロース電気泳動しナイロンメンブレンにブロット後、グルコアミラーゼ断片をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００３９】
今回取得されたグルコアミラーゼ遺伝子をプローブとした場合、固体培養から抽出したＲＮＡには非常に強いシグナルが検出されたが、デンプン培地での液体培養ではほとんどシグナルは検出されなかった。一方既にクローニングされているアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）をプローブとした場合、固体培養、液体培養ともシグナルが認められた。しかし固体培養でのシグナルは今回クローニングされたグルコアミラーゼ遺伝子のものと比較して、非常に弱いものであった。よって固体培養では今回取得されたグルコアミラーゼ遺伝子が優先的に発現しているものと考えられた。
以上の結果よりこの新規グルコアミラーゼ遺伝子は固体培養で特異的、かつ強力に発現する遺伝子であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によって、米麹で発現するグルコアミラーゼ遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングに成功し、その塩基配列も解明された。また本発明においては、クローニングされた上記遺伝子をベクターに挿入して宿主の形質転換を行うことにも成功したものである。したがって、得られた形質転換体を培養することによりグルコアミラーゼを著量生産することができる。
【００４１】
たとえばグルコアミラーゼ遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに導入した形質転換体では、米麹においてもグルコアミラーゼのみを著量生産することができる。酒類の製造やアルコール発酵において、発酵もろみ中のグルコアミラーゼ活性は発酵速度に大きな影響を与えることが知られている。清酒もろみ中ではグルコアミラーゼ活性が不足すると酵母の発酵速度が低下し発酵期間が増加するばかりか、清酒の重要な香味の一つであるエステル類の生産が顕著に抑制され最終製成酒の品質が低下する。従ってグルコアミラーゼを著量生産する麹を用いることはこれらの醸造物の効率的かつ高品質な生産に大きく寄与する。
【００４２】
またグルコアミラーゼｃＤＮＡを導入した形質転換体酵母はデンプンなどの高分子の糖質を資化しアルコール発酵を行うことが可能である。よってデンプンから直接アルコールを製造したり、穀類原料から直接酒類を製造することができる。これは当該発酵産業の効率化に大きく寄与する。
【００４３】
【配列表】
本発明に係るアスペルギルス・オリゼーの新規グルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
下記表１〜４に、配列番号１〜２で示される各配列を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】そのｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図３】プラスミドｐＮＧＢ−１の作成法及び制限酵素地図を示す。
【図４】プラスミドｐＹＧＢ−１の作成法及び制限酵素地図を示す。
【図５】オリゴＤＮＡプローブ（Ｎｏ．１及びＮｏ．２）を示す。
【図６】ＰＣＲ用プライマー（Ｐ１及びＰ２）を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明はアスペルギルス・オリゼーから得られた新規グルコアミラーゼ遺伝子、これを含むベクター、そのベクターをアスペルギルス・オリゼーまたはサッカロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体及びその利用に関するものである。
アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼは産業上重要な酵素であり、本発明によって得られた形質転換体は、特に固体培養においても本酵素を著量生産し、これらの酵素を用いる産業界に大いに貢献するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルコアミラーゼは澱粉を非還元末端からグルコース単位で分解する酵素であり、清酒醸造をはじめ味噌、醤油製造の産業において原料澱粉を糖化する工程に広く利用されている。これらの産業においてグルコアミラーゼはアスペルギルス・オリゼーの固体培養物（麹）から得られている。特に清酒醸造においては本酵素の生産性は非常に重要で、麹のグルコアミラーゼ活性が低い場合、その後の発酵工程に悪影響を及ぼす。そこでこの麹中のグルコアミラーゼ活性を高めるためアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の単離が試みられている（特公平７−５７１９４、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５ ９４１−９４９）。取得されたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）はグルコアミラーゼ活性を有する蛋白をコードしていることが、本遺伝子に対応するｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエに移入した形質転換体がグルコアミラーゼ活性を発現することによって確認されている。また本遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに移入した形質転換体は、液体培養においてグルコアミラーゼを顕著に増加したが、清酒醸造などで用いる固体培養においては親株と同程度のグルコアミラーゼしか生産しなかった。従って、固体培養でグルコアミラーゼを高生産させるには、ｇｌａＡ以外の別の遺伝子の働きが必要であると考えられ、現在清酒醸造などの実際に利用しうるグルコアミラーゼ活性のみが上昇した実用菌株の育種は成功していない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術はたしかにすぐれた技術ではあるが、未だ充分に満足できるものではなく、特にわが国においては、麹といった固体培養が多用されており、醸造工業や医薬品製造工業等において重要な位置を占めている現状に鑑み、固体培養においてもグルコアミラーゼを顕著に増産しうる系の開発が求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、このような技術の現状に鑑み、従来技術が有している問題点を更に改良、解決するためになされたものであって、液体培養のみでなく固体培養においてもグルコアミラーゼを著量生産する微生物を新たに開発することを目的になされたものである。
【０００５】
上記目的を達成するために各方面から検討の結果、遺伝子組換え技術が最適であるとの観点に至った。
そして、グルコアミラーゼ生産菌であるアスペルギルス・オリゼーを用いて固体培養を行い、そのグルコアミラーゼを精製し、その酵素の機能や蛋白質の１次構造を詳細に検討した。その結果、固体培養で生産されるグルコアミラーゼは既にクローニングされているｇｌａＡ以外の遺伝子の産物であることを見いだした。そこでこの固体培養で高発現しているグルコアミラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに、このグルコアミラーゼをコードすると考えられるｃＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ断片をクローニングすることに成功した。
【０００６】
そしてこのグルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエに移入することにも成功し、得られた形質転換体においてグルコアミラーゼが発現することを確認した。さらにクローニングした染色体ＤＮＡ断片を移入したアスペルギルス・オリゼー形質転換体においてもグルコアミラーゼ生産性が顕著に増大することも確認した。
すなわち本発明者らは、アスペルギルス・オリゼーの新規なグルコアミラーゼ遺伝子に着目し、アスペルギルス・オリゼーのゲノムＤＮＡ制限酵素断片よりグルコアミラーゼをコードするＤＮＡ断片をクローン化し、これをアスペルギルス・オリゼー宿主ベクター系に移入することにより、グルコアミラーゼを著量生産する形質転換体（Ａ）を得ることに成功した。ここで得られた形質転換体（Ａ）はＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として生命研に寄託されている。
さらにアスペルギルス・オリゼーの全ｍＲＮＡを固体培養菌体（麹）から調製し、これに基づいてｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリーを作製し、その中からアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼをコードするクローンを分離した。そしてこのｃＤＮＡを発現ベクターに連結した後サッカロミセス・セレビシアエに移入することにより、アスペルギルス・オリゼーを生産するグルコアミラーゼと同等のグルコアミラーゼを生産する形質転換体（Ｂ）を得ることにも成功した。ここで得られた形質転換体（Ｂ）はＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として生命研に寄託されている。
【０００７】
また、ここで得られた形質転換体（Ａ）を用いて清酒醸造を行ったところ、従来の菌株やｇｌａＡ遺伝子を移入した形質転換体（特公平７−５７１９４、Ｇｅｎｅ．１０８ １４５−１５０）に比べて著量のグルコアミラーゼ活性を有する麹が得られたので、麹歩合を低減させたり、粕歩合を低下させたりし、原料コストを大きく低減させることが可能となった。また、形質転換体（Ｂ）を用いることにより液化した澱粉原料を糖化酵素などによって糖化することなく、直接アルコール発酵が可能となることも確認した。
本発明は、これらの有用新知見に基づき、遂に完成されたものである。
【０００８】
以下、本発明について詳しく説明するが、あくまでもこの方法に限定されるものではない。
本発明に用いた染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびグルコアミラーゼ供与体はアスペルギルス・オリゼーであり、具体的にはＯＳＩ−１０１３株である。本発明においては、本菌株の精製グルコアミラーゼを得るため、精白米と本菌株の分生胞子を用いて固体麹を調製する。アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ精製方法はＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１７０７−１７１１（１９８９）に記載された方法に準じて行われる。
【０００９】
次に、得られた精製グルコアミラーゼをＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９８，３０５−３１８に準じてリシルエンドペプチダーゼによって消化し、さらに逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ペプチド断片を分離回収する。得られたペプチド断片をＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，７９９０（１９８１）に準じてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の自動ペプチドシーケンサーＭＯＤＥＬ４７０Ａにて、そのアミノ酸配列を決定する。得られたアミノ酸配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これを後述のプラークハイブリダイゼーションのプローブとして使用する。
【００１０】
また、アスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−１０１３株より染色体を、例えばＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に記載された方法にて抽出し、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，５９３（１９８７）に準じて染色体ジーンライブラリーを作製する。この染色体ジーンライブラリーより、上記で得られたオリゴＤＮＡをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法により、新規グルコアミラーゼ遺伝子を単離する。得られたＤＮＡ断片は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有していた。（図１）。
【００１１】
上記で得られたＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼーのベクターとして例えばｎｉａＤ遺伝子をマーカーに持つｐＳＴＡ２４（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））に挿入し、得られたＤＮＡをｎｉａＤ欠損株のアスペルギルス・オリゼーに移入し、形質転換体を得る。ｎｉａＤ欠損株は具体的にはアスペルギルス・オリゼーＯＳＩ−１０１３株よりＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９）記載の方法に準じて、塩素酸ナトリウム耐性株として得られる。形質転換法としては、公知の方法、例えばＡｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）に記載された方法あるいはこれに準じた方法がとられる。この方法により形質転換体（Ａ）を得る。
【００１２】
次に、アスペルギルス・オリゼーの分生胞子と精白米から固体麹を調製し、この固体麹の表面に生育するアスペルギルス・オリゼーの菌体よりＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，１９０５（１９９０）に記載された方法によりｍＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎｅ，２５，２６３−２６９（１９８３）の方法にてｃＤＮＡを合成した。一方、グルコアミラーゼ遺伝子のグルコアミラーゼのコーディング領域の開始コドンを含む配列と、終止コドンを含む配列を基にオリゴＤＮＡを合成する。このオリゴＤＮＡをプライマーとして、得られたｃＤＮＡを鋳型として、例えばＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ．（１９８９）に記載されたＰＣＲ法によりグルコアミラーゼｃＤＮＡを合成した。単離したグルコアミラーゼｃＤＮＡは、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有していた（図２）。
【００１３】
上記で得られたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼｃＤＮＡをサッカロミセス・セレビシアエの発現ベクター、例えば酵母ガラクトースキナーゼ（ＧＡＬ１）のプロモーターを持つ酵母発現ベクターｐＹＥＳ２に挿入し、サッカロミセス・セレビシアエに移入することにより形質転換体を得る。形質転換法としては、公知の方法、例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５３，１６３−１６８（１９８３）に記載されている方法あるいはそれに準じた方法がとられる。この方法によって形質転換体（Ｂ）を得る。
【００１４】
次にこの形質転換体（Ａ）を蒸米上で生育させ、分生胞子を形成させ、得られた分生胞子を用いて公知の方法によって米麹を製造し、これに水、酵母及び蒸米を加え、発酵させることにより、酒類、エタノールなどを製造する。
形質転換体（Ａ）を用いて製造した麹には固体培養で発現するグルコアミラーゼの力価が高いため、酒類、エタノールなどを効率よく製造することができる。
【００１５】
またこのグルコアミラーゼのｃＤＮＡを含むベクターをサッカロミセス・セレビシアエに移入して、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを分泌する形質転換体（Ｂ）を得る。この形質転換体（Ｂ）を用いることにより、グルコアミラーゼなどの糖化酵素を加えることなく、サッカロミセス・セレビシアエによる澱粉から直接アルコール発酵を行うことが可能である。
【００１６】
当然のことながら、形質転換体（Ａ、Ｂ）は、常法にしたがってこれを培養することにより、酵素を効率よく製造することができ、発酵工業のみならず、食品工業、医薬品工業その他各種の工業において様々な用途に利用することができる。特にアスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼは糖含量が高く、熱やプロテアーゼに対する安定性が高いため、これらの工業で安定に利用することができる。
次に本発明の実施例を示す。
【００１７】
【実施例１】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼの精製と部分アミノ酸配列の決定
【００１８】
アスペルギルス・オリゼーの分生胞子を蒸米に接種し、常法に従い米麹を調製する。この米麹１ｋｇに３Ｌの抽出バッファー（１％ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５））を加えて、４℃で１６時間放置後、アドバンテック濾紙Ｎｏ．５Ａにてろ過した。ろ過液に９０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加えて溶解させた後、４℃１６時間放置し塩析を行った。これを遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０分）し、上清を集め、流水１日、水１日、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７））でさらに１日透析を行った。この透析液をあらかじめ上記緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（３００ｍｌ）にロードし、グルコアミラーゼをカラムに吸着させた。カラムを緩衝液で十分洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液５００ｍｌでグルコアミラーゼ画分を溶出した。
【００１９】
このグルコアミラーゼ画分を限外ろ過装置にて濃縮し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムにロードし、０−０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントにて溶出し、グルコアミラーゼ画分を集めた。このグルコアミラーゼ画分をさらにグルコアミラーゼの特異的インヒビターであるアカボースを固定化したアフィニティーカラム（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１７０７−１７１４）にて精製した。最終的には１５０ｍｇの精製グルコアミラーゼを得た。
【００２０】
得られた精製グルコアミラーゼ１０ｍｇを３ｍｌの７Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅを含む０．５Ｍ Ｔｒｉｓバッファーに溶解し、Ｎ2ガス下でＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌとヨード酢酸にて還元カルボキシメチル化（Ｃｍ化）を行った。このＣｍグルコアミラーゼを４Ｍ尿素存在下でリシルエンドペプチダーゼにて消化し、グルコアミラーゼ蛋白をペプチドに分解した。これを逆相ＨＰＬＣにて各ペプチド断片を分離、回収した。各ペプチドは気相式自動ペプチドシーケンサーにて、そのＮ末端付近のアミノ酸配列を決定した。
【００２１】
得られたペプチド断片のアミノ酸配列と、それから類推して合成したオリゴＤＮＡプローブ（Ｎｏ．１及びＮｏ．２）を図５に示す。
【００２２】
【実施例２】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼをコードする染色体ＤＮＡ断片の単離と塩基配列の決定
【００２３】
実施例１記載のオリゴＤＮＡをＥＣＬオリゴＤＮＡラベリングシステムにより、蛍光ラベルしたものをプローブとして用いて、アスペルギルス・オリゼーのλＥＭＢＬ３を用いたファージ染色体ライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション法によりグルコアミラーゼ遺伝子を含むクローン選択を行った。一連の操作はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ６３−６７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の常法に従った。約２０，０００個のプラークより、蛍光ラベルしたプローブにハイブリダイズするクローン１個を得た。
【００２４】
このクローンよりファージＤＮＡを単離し、蛍光プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片（７．０ｋｂ ＳａｌＩ断片）をｐＵＣ１１８にサブクローニングした。その制限酵素地図を図３に示す。この７ｋｂのＳａｌＩ断片のなかで蛍光プローブにハイブリダイズする領域を特定し、ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４、１２９５−１３１０（１９８０））にてその領域周辺の塩基配列を決定した。その結果この遺伝子断片中に、プローブに用いたペプチド断片をコードする塩基配列が見いだされた。他のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のグルコアミラーゼ遺伝子と比較した結果、２つのイントロンに分断された３つのエキソン中に４９３アミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームがあると推定された。この新規グルコアミラーゼ遺伝子のコーディング領域とその上流、下流領域の塩基配列を配列番号１に示す（図１）。
【００２５】
【実施例３】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼを多量に発現するアスペルギルス・オリゼーの形質転換体の作製
【００２６】
実施例２に記載するグルコアミラーゼ遺伝子を含む７．０ｋｂ−ＳａｌＩの染色体ＤＮＡ断片をアスペルギルス・オリゼーのｎｉａＤ変異を相補する遺伝子を持つベクターｐＮＩＡ−２に連結し、図３に示すプラスミドｐＮＧＢ−１を作製した。挿入したＳａｌＩ断片はグルコアミラーゼのコーディング領域１．７ｋｂとその上流部分２．８ｋｂ下流分２．４ｋｂを含んでおり、グルコアミラーゼのアスペルギルス・オリゼーでの発現に必要な領域はすべて含んでいると考えられる。そこでこのプラスミドをアスペルギルス・オリゼーに移入した。
【００２７】
アスペルギルス・オリゼーの硝酸還元酵素欠損変異株（ｎｉａＤ）をプラスミドｐＮＧＢ−１により、Ａｇｉｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３−３２８（１９８７）の記載の方法に準じて形質転換を行った。宿主として用いる硝酸還元酵素欠損変異株はＮａＮＯ3を窒素源として利用できないのに対し、ｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドが移入された形質転換体はＮａＮＯ3を単一窒素源として生育が可能であった。次にこの形質転換体をプレートに塗布し分生胞子を集めた。この分生胞子を蒸米に接種し、定法に従い米麹を調製した。得られた米麹のグルコアミラーゼ活性を醸協，８１，４９０−４９４（１９８６）記載の方法に従って測定した。その結果を下記表５に示す。
【００２８】
【表５】
上記のようにこのグルコアミラーゼ遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに移入することにより、グルコアミラーゼ活性のみ上昇する形質転換体が得られた。なおこの形質転換体（Ａ）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＧＬＢ−０１と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２６として寄託した。
【００３０】
【実施例４】
アスペルギルス・オリゼーの固体培養で発現するグルコアミラーゼのｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
【００３１】
実施例２で得られたアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列から推定される開始コドン上流と終止コドン下流に対応する２種のプライマーＰ１、Ｐ２を合成した（図６）。
【００３２】
アスペルギルス・オリゼーを固体培養した米麹から、ＤＮＡ，２，３２９−３３５（１９８３）記載の方法によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ ＲＮＡよりＱＤ Ｒａｐｉｄ ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（５′Ｐｒｉｍｅ−３′Ｐｒｉｍｅ Ｉｎｃ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを単離した。さらにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ λｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いてｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンペレートとして先の２種類の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ｇｌａＢ遺伝子に対応するｃＤＮＡ断片を得た。このｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にサブクローニングし、実施例２に記載の方法と同様にしてその塩基配列を決定した。配列番号２に示すように、全塩基配列は１４８２ｂｐであり、Ｍｅｔで始まる４９３個のアミノ酸をコードしていた（図２）。
【００３３】
【実施例５】
アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼを発現するサッカロミセス・セレビシアエの形質転換体の作製
【００３４】
実施例４のグルコアミラーゼｃＤＮＡ断片を酵母発現ベクターに連結し、図４に示すプラスミドｐＹＧＢ−１を作成した。使用した発現ベクターはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）である。このプラスミドはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１プロモータとＣＹＣ１ターミネーターを含んでおり、ＧＡＬ１プロモーター下流に連結されたｃＤＮＡ断片はこのプロモータ制御を受けて酵母内で発現されると考えられる。
次にこのグルコアミラーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＹＧＢ−１をＩｔｏらのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１５３、１６３−１６８，（１９８３）記載の方法に従って、酵母宿主（ＩＮＶＳｃｌａ，ｈｉｓ３，ｔｒｐ１，ｕｒａ３）に導入した。プラスミドに含まれるＵＲＡ３遺伝子により、ウラシル要求性が相補された形質転換体（Ｂ）を選択した。
【００３５】
この形質転換体（Ｂ）を次に示す組成の合成培地１００ｍｌに接種し、３０℃、７２時間培養した。合成培地：２％ガラクトース、２％ポリペプトン、１％イーストエキス、５０ｍｇ／ｌトリプトファン）培養終了後、３，０００ｒｐｍの遠心処理にて酵母菌体を除いた後、上清のグルコアミラーゼ活性を実施例３と同様の方法にて測定した。その結果を下記表６に示す。
この結果から明らかなように、グルコアミラーゼｃＤＮＡが移入された形質転換体（Ｂ）においては、グルコアミラーゼが検出された。なお、この形質転換体（Ｂ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃＧＬＢ−０１と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５８２７として寄託した。
【００３６】
【表６】
【実施例６】
ノザン解析によるグルコアミラーゼ遺伝子の発現様式の検討
【００３８】
実施例４記載と同様に米麹からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出しノザン解析によりグルコアミラーゼの発現について検討した。同一菌株を３％デンプン、１％ポリペプトンを含むツァペックドックス液体培地にて、振とう培養し、得られた菌体より同様な方法にてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをそれぞれ２０μｇをＣｕｒｒ．Ｃｅｎｅｔ，２２，８５−９１（１９９２）に記載の方法にて、変性アガロース電気泳動しナイロンメンブレンにブロット後、グルコアミラーゼ断片をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００３９】
今回取得されたグルコアミラーゼ遺伝子をプローブとした場合、固体培養から抽出したＲＮＡには非常に強いシグナルが検出されたが、デンプン培地での液体培養ではほとんどシグナルは検出されなかった。一方既にクローニングされているアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）をプローブとした場合、固体培養、液体培養ともシグナルが認められた。しかし固体培養でのシグナルは今回クローニングされたグルコアミラーゼ遺伝子のものと比較して、非常に弱いものであった。よって固体培養では今回取得されたグルコアミラーゼ遺伝子が優先的に発現しているものと考えられた。
以上の結果よりこの新規グルコアミラーゼ遺伝子は固体培養で特異的、かつ強力に発現する遺伝子であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によって、米麹で発現するグルコアミラーゼ遺伝子およびｃＤＮＡのクローニングに成功し、その塩基配列も解明された。また本発明においては、クローニングされた上記遺伝子をベクターに挿入して宿主の形質転換を行うことにも成功したものである。したがって、得られた形質転換体を培養することによりグルコアミラーゼを著量生産することができる。
【００４１】
たとえばグルコアミラーゼ遺伝子をアスペルギルス・オリゼーに導入した形質転換体では、米麹においてもグルコアミラーゼのみを著量生産することができる。酒類の製造やアルコール発酵において、発酵もろみ中のグルコアミラーゼ活性は発酵速度に大きな影響を与えることが知られている。清酒もろみ中ではグルコアミラーゼ活性が不足すると酵母の発酵速度が低下し発酵期間が増加するばかりか、清酒の重要な香味の一つであるエステル類の生産が顕著に抑制され最終製成酒の品質が低下する。従ってグルコアミラーゼを著量生産する麹を用いることはこれらの醸造物の効率的かつ高品質な生産に大きく寄与する。
【００４２】
またグルコアミラーゼｃＤＮＡを導入した形質転換体酵母はデンプンなどの高分子の糖質を資化しアルコール発酵を行うことが可能である。よってデンプンから直接アルコールを製造したり、穀類原料から直接酒類を製造することができる。これは当該発酵産業の効率化に大きく寄与する。
【００４３】
【配列表】
本発明に係るアスペルギルス・オリゼーの新規グルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
下記表１〜４に、配列番号１〜２で示される各配列を示す。
【００４４】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】そのｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図３】プラスミドｐＮＧＢ−１の作成法及び制限酵素地図を示す。
【図４】プラスミドｐＹＧＢ−１の作成法及び制限酵素地図を示す。
【図５】オリゴＤＮＡプローブ（Ｎｏ．１及びＮｏ．２）を示す。
【図６】ＰＣＲ用プライマー（Ｐ１及びＰ２）を示す。
Claims (9)
- 配列表の配列番号１の塩基配列で示され、アスペルギルス・オリゼーから単離したグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター及び／又は蛋白質コード領域を含む塩基配列を有するＤＮＡ。
- 配列番号２の塩基配列で示され、アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ。
- 請求項第１項記載のＤＮＡを含んだアスペルギルス・オリゼーのベクター。
- 請求項第２項記載のｃＤＮＡを含んだサッカロマイセス・セレビシアエのベクター。
- 請求項第３項記載のベクターをアスペルギルス・オリゼーに移入することによって得られたグルコアミラーゼ酵素生産が上昇した形質転換体。
- 請求項第４項記載のベクターをサッカロマイセス・セレビシアエに移入することによって得られるグルコアミラーゼを生産する形質転換体。
- 請求項第５項又は第６項に記載の形質転換体を使用することを特徴とするアルコール及び／又は酒類の製造方法。
- 請求項第５項又は第６項に記載の形質転換体を培養し、培養物からグルコアミラーゼを採取することを特徴とするグルコアミラーゼの製造法。
- 該形質転換体を固体培養することを特徴とする請求項第８項に記載のグルコアミラーゼの製造法。
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1996
- 1996-09-19 JP JP26770196A patent/JP3759794B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| JPH1084968A (ja) | 1998-04-07 |
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