JP3549551B2 - Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組換え宿主細胞におけるサッカロミセス・セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性の発現をコードしかつ制御し、ならびにビタミンＢ２を生産する生物体中のこのビタミン収率を改善することのできるＤＮＡ化合物および組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
リボフラビンまたはビタミンＢ２は、たとえばフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のような、炭水化物の酵素的酸化に必要な補酵素の前生成物である。従って、リボフラビンはすべての生物体における根本的物質代謝にとり不可欠である。植物および多数の微生物はリボフラビンを合成する。しかし、高等動物はリボフラビンを生産しない。不十分なリボフラビン量は、高等動物において脱毛、皮膚炎、視力障害および発育障害を生じうる。
【０００３】
さらに、リボフラビンは、牛乳、卵、脂肪分の少ない肉、肝臓、腎臓、野菜、穀物、殊に酵母中に含まれている栄養物であり、その際酵母は最も豊富なリボフラビン源である（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ”，第９版（１９７６年），Ｗｉｎｄｈｏｌｇ等，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，第１０６４頁）。
【０００４】
リボフラビンは、工業的には、米国特許第２８０７６１１号（Ｍｅｒｃｋ；１９５７年）に記載されているようにリボースから化学合成によるか、または糸状菌エレモテシウム・アッシュビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ）またはアッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，ｓｕｐｒａ）の発酵によって製造することができる。さらに、ニワトリおよびウシ類の飼育用のリボフラビン濃縮物は、米国特許第２８７６１６９号（Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，１９５９年）に記載されているように、発酵法によって製造することができる。
【０００５】
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）の突然変異体からの大量のリボフラビンの製造は下記の特許に記載された：
−米国特許第３９００３８６号（Ｅｎｅｉ等，１９７５年）。ここには、アザグアニンおよびアザキサンチンとの接触によって選択される、バチルス・スブチリスの突然変異体が記載されている。
【０００６】
−フランス国特許第２５４６９０７号（Ｓｔｅｐａｎｏｖ等，１９８４年）。ここには、Ｒｉｂ−オペロンのコピーを含有するプラスミド（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ−Ｏｐｅｒｏｎ）で形質転換された、バチルス・スブチリスの突然変異体が記載されている。このオペロンの性質の根本的な改善は、モロゾフ（Ｍｏｒｏｚｏｖ等）（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｉｋ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．，ｎｏ １２：１４（１９８５年））およびチキウダス（Ｃｈｉｋｉｕｄａｓ等）（Ｄｉｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．，第５版，ソ連邦 ２９８：９９７（１９８８年））により記載されている。これらは本明細書に引用される。
【０００７】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ０４０５３７０号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧ，１９９１年）には、その染色体ＤＮＡ中にＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｉｂ−オペロンの組込まれかつ拡張されたコピーを含有する、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＢ．スブチリスのリボフラビン過剰生産菌株が記載されている。
【０００８】
これらの方法を用いて良好な結果を得ることができるが、若干の研究者は、細菌中のタンパク質を発現する際の低い正確さ、ならびに細菌は、タンパク質のグリコシル化を達成することができないという事実に基づき、大量のリボフラビンを表現する酵母突然変異体を見出すことを試みた。それで、米国特許第４７９４０８１号（Ｋａｗａｉ等，１９８８年）には、プリンをベースとする、リボフラビン生産性Ｓ．セレビシエ突然変異体が記載されている。この特許も、同様に本明細書に引用される。
【０００９】
【発明の構成】
本発明は、なかんずく、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物に関する。この酵素（Ｅ．Ｃ．２．５．１．９）は、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンからのリボフラビンの製造反応を触媒する。この反応は、ビタミンＢ２およびたとえばＦＭＮまたはＦＡＤのような他のフラビン誘導体化合物の生合成の際の臨界過程である。
【００１０】
これらのＤＮＡ化合物には、Ｓ．セレビシエから単離され、リボフラビンシンテターゼ活性を制御する、組換えＤＮＡ発現ベクターの製造に適当である、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする新規ＤＮＡ配列が属する。これらのベクターは、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を高度に制御し、これは本発明による発現ベクターで変換されたＳ．セレビシエの粗製細胞抽出物が、何らかの活性化前処理なしに、高いリボフラビンシンテターゼ活性を示すという事情から認められる。従って、本発明による発現ベクターは、高いリボフラビンシンテターゼ活性を得るための有効な手段である。さらに、本発明による高いリボフラビンシンテターゼ活性は、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン以外のルマジンの縮合のためならびに新規フラビンの生成のために適当である。
【００１１】
本発明による、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物は、酵母、細菌および糸状菌（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ，Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉｉ，Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｉｉおよびＡｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ等）のような他の生物体中でのリボフラビンの生産の際の効率および収率を増加する他の発現ベクター製造のため容易に変更することができる。
【００１２】
リボフラビンシンテターゼ活性をコードする、Ｓ．セレビシエからの本発明によるＤＮＡ化合物は単離されたが、このＤＮＡは、多数の宿主細胞中でのリボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御するベクターの製造のために使用することができる。すべてのリボフラビン生産性生物体は同じ前駆物質、即ち６，６−ジメチル−８−リビチル−ルマジンを使用するので、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ化合物は、すべてのリボフラビン生産性生物体におけるリボフラビン発酵の効率および収率を改善する他のベクターの製造のために使用することができる。
【００１３】
本発明によるリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物は、Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡから誘導され、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするゲノムＤＮＡの発現を調節する、転写および翻訳の活性化配列と一緒に単離された。本発明は、Ｓ．セレビシエおよび近縁の生物体中の遺伝子の発現を制御するのに使用することのできる、これらの転写および翻訳の新規活性化配列を包含する。
【００１４】
次に、本発明の対象を要約する。
【００１５】
本発明の第１の対象は、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物である。これらのＤＮＡ化合物は、（ｉ）専らコーディング領域を包含し、ならびに（ｉｉ）このコーディング領域を、遺伝子のコーディング領域内のコーディング鎖の３′末端に存在するリボフラビンシンテターゼ遺伝子の配列または調節シグナルと一緒に包含する。これらの調節性３′−配列が、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子の転写およびポリアデニル化およびＲＮＡプロセシングの終端を決定する。発現ベクター（表現すべき遺伝子のコーディング鎖の３′−末端における）中の適当な位置にこれらシグナルの存在は、ベクターによってコードされた生成物の発現を高める。これらすべての配列は新規であって、本発明の重要な成分である。これらの配列は遺伝コードの縮退に基づき、リボフラビンシンテターゼ活性のアミノ酸配列をコードすることのできるすべてのヌクレオチド配列、ならびに本発明によるリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡの遺伝的変異型であるすべての配列を包含し、その際これらの変異型は、同じかまたは類似の活性を有することができかつ本発明による化合物との相同性に基づいて得ることのできる、本発明によるＤＮＡの等価物であってもよい。
【００１６】
本発明の第２の対象は、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするアミノ酸を有する本発明によるＤＮＡ化合物、ならびに幾つかのアミノ酸が他の官能的に等しいアミノ酸によって置換されている、同様にこのリボフラビンシンテターゼ活性を有するか、または重要でない配列が欠けているが、自然の配列と類似の活性を有するアミノ酸配列である。
【００１７】
本発明の第３の対象は、リボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御する組換えＤＮＡ発現ベクター、ならびにその製造方法である。これらの発現ベクターは、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物を適当なベクター中へ組込むことによって製造することができる。これらの発現ベクターは、発現を制御しかつ酵母、糸状菌および細菌におけるリボフラビン製造を有効に高めるように構成されていてもよい。
【００１８】
本発明の第４の対象は、発現ベクターで形質転換された組換え微生物であり、その際この発現ベクターはリボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ化合物を含有する。このベクターで形質転換することのできる微生物としては、それぞれの種類のすべてのリボフラビン生産性ならびに非生産性微生物が適当である。これらの組換え微生物の製造方法は本発明の別の対象である。本発明の第５の対象は、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ化合物を含有する発現ベクターで形質転換された微生物の培養によるリボフラビンシンテターゼ活性の生産方法であり、その際この培養は、遺伝子の発現を可能にする条件下で実施される。リボフラビンシンテターゼ活性は、精製するかまたは精製せずに、直接に粗製細胞抽出物から使用することができる。
【００１９】
本発明の第６の対象は、このビタミンを製造する微生物のリボフラビン生産を増加する方法である。このためには、リボフラビン生産性微生物中へ、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ化合物が組込まれる。これらの微生物はとくに種々の種類の酵母、糸状菌および細菌である。
【００２０】
本発明の第７の対象は、６，７−ジメチル−リビチルルマジンから、本発明によるＤＮＡ化合物によってコードされたリボフラビンシンテターゼ活性の使用下にリボフラビンを製造する方法である。この方法は、単離された純合成酵素の使用下またはこの酵素を含有する粗製細胞抽出物の使用下に、溶液中ならびに酵素または細胞を適当な担体に固定することによって実施することができる。
【００２１】
最後に、本発明のもう１つの対象は、基質として本発明によるリボフラビンシンテターゼから識別しうる、６，７−ジメチル−リビチルルマジン以外のルマジンを使用する、新規フラビンまたはフラビン誘導体（天然のフラビンまたはフラビン誘導体は含まない）の製造方法である。
【００２２】
下記に、これらすべての対象を詳述する。
【００２３】
図１および２は、プラスミドＹＥｐ３５２の機能および制限地図（１Ａ）ならびに遺伝子ＲＩＢ５のサブクローニング（１Ｂ）を示す。図３は、プラスミドｐＪＲ２３５の機能および制限地図を示す。
【００２４】
図４〜６は、プラスミドｐＪＲ２９８の構成（図４）、遺伝子置換による遺伝子ＲＩＢ５の破壊（図５）および野生菌株ＪＣ２ａのＫｐｎｌ（ＭＡＴαｈｉｓ−Δ１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２）（系列１）および２つの置換菌株ＡＪ５２およびＡＪ５３（ＭＡＴαｈｉｓ−Δ１ ｌｅｕ２−３ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２ ｒｉｂ５−１１）（ＲＩＢ５：：ＵＲＡ）（系列２および３）で発酵させたゲノムＤＮＡのサザンブロッティング（図６）を示す。フィルターは、α−^３２Ｐで標識し、フラグメントＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ３ｂから誘導されたゾンデでハイブリッド形成した。
【００２５】
図７および８は、組換えＰＣＲによる融合遺伝子ＰＧＫ−ＲＩＢ５の構造（図７）ならびにプラスミドｐＪＲ３７６の機能および制限地図（図８）を示す。
【００２６】
図９は、菌株ＪＭ１０１／ｐＴｒｃ９９−Ａ（系列１，２，３および４）ならびにＪＭ１０１／ｐＪＲ３８０の、ＩＰＴＧで誘導された細胞抽出物（系列３，４，７および８）または誘導されなかった細胞抽出物（系列１，２，５および６）の可溶性画分（系列１，３，５および７）ならびに不溶性画分（系列２，４，６および８）が分析された、クーマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌａｕ）で染色された１４％のポリアクリルアミド・ＳＤＳゲル中での、Ｅ．コリ中のリボフラビンシンテターゼ、Ｒｉｂ５−タンパク質の発現を示す（図Ａ）。図Ｂは、Ｒｉｂ５に対する特異的抗体の使用下に、プレートＡ上に置かれたゲル中で分析された抽出物の可溶性および不溶性画分のウエスタンブロッティングを示す。図１０は、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼの精製および特性表示を示す。図Ａは、イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５）中の総タンパク抽出物からのＦＰＬＣによる精製を示す。線形ＮａＣｌ勾配（不連続系列）を使用し、かつ種々の１ｍｌ画分を、Ｒｉｂ５タンパク質の存在に関し、ウエスタンブロッティング（上部）および特異的リボフラビンシンテターゼ活性（連続系列）により分析した。図Ｂは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動を示す：系列１、Ｓ．セレビシエの総タンパク抽出物；系列２、ＦＰＬＣによって精製したリボフラビンシンテターゼ、系列３、精製したリボフラビンシンテターゼのウエスタンブロッティング。
【００２７】
図１１は、自然条件下でのリボフラビンシンテターゼの分子量決定を示す。
【００２８】
添付図面の図１〜８に示した機能および制限地図は、ここで扱われる組換えＤＮＡのベクターの概略図である。地図の制限フラグメントの広がりはベクターの制限フラグメントの広がりに比例するが、フラグメント間の距離は地図において算出される距離とは若干相違する。制限フラグメントに対する指示は完全ではないので、特定のベクター中には、地図に示されているよりも多くのフラグメントが存在しうる。
【００２９】
Ａ． 定義
本発明を明確にしかつ良好な理解のために、下記に若干の概念を定義する：
ＤＮＡ化合物：ＤＮＡ分子およびＤＮＡ配列、ならびにその遺伝産物をコードするために必要なすべての情報を保持するフラグメント（転写および翻訳を活性化するその配列を含む）、ならびにこのＤＮＡ中に含有されている情報の発現の調節シグナル。本発明においては、ところどころ表現“本発明によるＤＮＡ化合物”は、本発明によるリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ配列が考えられている意味で使用する。
【００３０】
ＲＩＢ５：サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ。
【００３１】
ＵＲＡ３：サッカロミセス セレビシエのオロチジン−５′−ホスフェート−デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
【００３２】
生合成のリボフラビン遺伝子：一次物質代謝産物のリボフラビンへの変換法における反応に必要な活性をコードするＤＮＡセグメント。
【００３３】
リボフラビン生産性生物体：専らではないが、サッカロミセス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エレモテシウム（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）およびアッシュビヤ（Ａｓｈｂｙａ）を含めリボフラビンを生産するかまたは発現の際にリボフラビンを生産する遺伝子を含有する生物体。
【００３４】
ＡｐＲ：アンピシリンに対する抵抗を伝達する遺伝子。
【００３５】
Ｓａｃ ＤＮＡ：サッカロミセス セレビシエのＤＮＡ。
【００３６】
クローニング：組換えＤＮＡのクローニングベクター中へのＤＮＡセグメントの組込みゲノム ゲノテク（Ｇｅｎｏｍｉｓｃｈｅ Ｇｅｎｏｔｈｅｋ）：大体において当該生物体の全ゲノムを表わすＤＮＡセグメントがクローニングされている、組換えＤＮＡのクローニングベクターの束。
【００３７】
ハイブリッド形成：完全または部分的な塩基対であってもよい、２つの相補性１本鎖ＤＮＡ分子の２本鎖ＤＮＡ分子への対合法。
【００３８】
リボフラビンシンテターゼ：６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンからのリボフラビン生成を触媒する酵素。
【００３９】
組換えＤＮＡ−発現ベクター：科学的または工業的に重要なポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの発現を制御するための、転写および／または翻訳を活性化する配列を包含する、（専らではないが）プラスミドを含む自律性複製または組込み手段。
【００４０】
制限フラグメント：１つまたは幾つかの制限酵素の作用によって得られる直鎖ＤＮＡ分子。
【００４１】
形質転換細胞：形質転換を受けた受容宿主細胞。
【００４２】
形質転換：エルブ型を変えて受容細胞への変換を生じる、受容宿主細胞中へのＤＮＡの組込み。
【００４３】
転写の活性化配列：ＤＮＡ転写を促進するＤＮＡ配列。
【００４４】
翻訳の活性化配列：ＡＲＮｍへの転写の際ＡＲＮｍのタンパク質への翻訳を惹起するＤＮＡ配列。
【００４５】
Ｂ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物
本発明の第１の対象は、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡ化合物である。その製造のためには、動原体ベクターＹＣｐ５０中のＳ．セレビシエＧＲＦ８８のゲノムＤＮＡのゲノム・ゲノテク（ＡＴＣＣにＮｏ．３７４１５で寄託された）を使用し、これをＳ．セレビシエの菌株ＡＪ１０のｒｉｂ５−１０の突然変異を例２による形質転換によって相補することのできる配列の立証するために試験した。非機能性リボフラビンシンテターゼ活性をコードする配列に影響を与えるｒｉｂ５−１０突然変異が非機能性リボフラビンシンテターゼの合成を決定し、この突然変異の担体菌株中の６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン媒地中でのリボフラビン栄養素要求性および蓄積を生じる。ゲノムゲノテク中の一連のベクターは、ｒｉｂ５−１０突然変異を相補し、リボフラビン不含最小培地中でのこれらベクターの担体菌株ＡＪ１０の形質転換細胞の成長を可能にすることのできた、Ｓ．セレビシエの組込まれたＤＮＡ−フラグメントを含有していた。例２による遺伝的破壊および配列決定は、ベクターの少なくとも１つは、遺伝子ＲＩＢ５を担持しかつＳ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡフラグメントを組込んで含有していたことを示す。次いで、Ｓ．セレビシエのＲＩＢ５遺伝子を、Ｃ．コリのＪＭ１０１菌株の形質転換のために使用されたプラスミドｐＪＲ２３５（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等，１９８５年，Ｇｅｎｅ ３３：１０３）の形成下にクローニングした。Ｅ．コリの形質転換細胞ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５は、ＮＣＩＭＢにおいてＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０４８０で寄託された。図３は、プラスミドｐＪＲ２３５の機能および制限地図を示す。
【００４６】
Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子のコーディング配列は、プラスミドｐＪＲ２３５の制限フラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ ２．２ｋｂから単離することができる。この制限フラグメントおよびコーディング配列はヌクレオチドの配列決定によって特性表示された。引き続き、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ配列が、Ｓ．セレビシエの遺伝子中のコーディング領域の３′−末端をフランキングするＤＮＡ部分（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）と一緒に示される。２本鎖ＤＮＡ分子のコーディング鎖または“センス”鎖の配列のみが示される。これは、左から右へ５′→３′方向に記入されている。ヌクレオチド配列を番号付けする場合、番号はＤＮＡ配列に沿って出現する。各ＤＮＡ配列の列の直接下方には、アミノ末端方向で左から右へ→末端カルボキシル、ＤＮＡによりコードされるリボフラビンシンテターゼのアミノ酸基配列が示される。各アミノ酸基はそれをコードするヌクレオチドトリプレットの下方に出現する。アミノ酸基の配列を番号付けする場合、番号はアミノ酸基の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２）の下方に出現する。
【００４７】
ここで、記号は次のものを表わす：Ａ デオキシアデニル、Ｇ デオキシグアニル、Ｃ デオキシシチジル、Ｔ チミジル、ＡＬＡ アデニン基、ＡＲＧ アルギニン基、ＡＳＮ アルパラギン基、ＡＳＰ アルパラギン酸基、ＣＹＳ システイン基、ＧＬＮ グルタミン基、ＧＬＵ グルタミン酸基、ＧＬＹ グリシン基、ＨＩＳ ヒスチジン基、ＩＬＥ イソロイシン基、ＬＥＵ ロイシン基、ＬＹＳ リジン基、ＭＥＴ メチオニン基、ＰＨＥ フェニルアラニン基、ＰＲＯ プロリン基、ＳＥＲ セリン基、ＴＨＲ スレオニン基、ＴＲＰ トリプトファン基、ＴＹＲ チロシン基およびＶＡＬ バリン基。
【００４８】
専門家は、ここで示したＤＮＡ配列は本発明の重要な部分であることを知っている。遺伝コードの縮退（これにより停止シグナルおよびアミノ酸基の大多数は１以上のコドンによってコードされている）に基づき、上記に示したリボフラビンシンテターゼのアミノ酸配列は、多数のＤＮＡ配列によってコードすることができる。これらのいずれか一方のＤＮＡ配列が本発明によるアミノ酸配列をコードするので、本発明は同様にこれらいずれか一方の配列をも包含する。
【００４９】
リボフラビンシンテターゼのコーディング配列は、慣例の方法でまたは完全に保護されたデオキシリボヌクレオシドを使用してホスホルアミデート法によって合成することができる。これらの合成法は良く知られており、ボーケージュ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）等（１９８１年，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９）の方法に従って実施することができる。ＤＮＡ配列は、たとえばアプライド・バイオシステムズ社のモデル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ）３８０Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）の自動的ＤＮＡ合成装置を用いて製造することができる。
【００５０】
上記の、リボフラビンシンテターゼのＤＮＡコーディング配列のほかに、本発明によるリボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡ配列の遺伝的変異型が出現しうる。これらの遺伝的変異型は、天然に出現する型の遺伝的多様性を表わし、ヌクレオチドおよびアミノ酸基の配列の、本発明による化合物との本質的相同性を示すことができる。これらは完全に同じ活性を有しないとしても、何らかの方法で、本発明において示した類似のヌクレオチド配列とは識別しうる。これらの遺伝的変異型は本発明による化合物の等価物であり、本発明によるリボフラビンシンテターゼのコーディングＤＮＡ配列との相同性に基づき得ることができる。
【００５１】
Ｂ．１ 転写および翻訳の活性化配列
本発明は、リボフラビンシンテターゼのアミノ酸配列をコードするだけではなく、Ｓ．セレビシエ中でのリボフラビンシンテターゼの発現の調節に必要な、転写および翻訳の活性化配列をもコードする、完全な機能的ＤＮＡ配列のクローニングに基づく。同時に、本発明によるリボフラビンシンテターゼ遺伝子は、コーディング領域に続く、転写の終結に責任がありかつＤＮＡのプロセシング−およびポリアデニル化シグナルを提供する配列を含有する。これらの制御要素５′および３′は本発明の重要なアスペクトである。ｐＪＲ２３５遺伝子≒０．２０ｋｂは、Ｓ．セレビシエのゲノム中で、リボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡに先行するゲノムＤＮＡに含有されているので、ｐＪＲ２３５プラスミドは必然的に、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子の転写および翻訳の活性化配列を含有する。
【００５２】
転写および翻訳の、多数の活性化配列は、リボソームＲＮＡをコードする若干の配列は、コーディング領域に先行しない活性化配列によって活性化されるが、活性化すべきＤＮＡの前でコードされている。この点で、コーディング領域に“先行する”というのは、リボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡのコーディング鎖の５′−末端の５′方向のＤＮＡに関する。ｐＪＲ２３５プラスミド中にコードされている、Ｓ．セレビシエの転写および翻訳の活性化配列は、リボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡの発現を制御するために、正しい位置に存在する。ｐＪＲ２３５の構成において、リボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡのコーディング鎖の５′−末端には、プラスミドｐＪＲ２３５中のリボフラビンシンテターゼ遺伝子の転写および翻訳の活性化配列に影響しうる欠失も挿入も組込まれておらず、その際この活性化配列は、ｐＪＲ２３５プラスミド中のリボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡの傍に存在する、直接に先行する制限フラグメントＫｐｎＩ−ＮｄｅＩ中に単離することができる。位置ＮｄｅＩは、リボフラビンシンテターゼタンパク質のアミノ酸１８および１９をコードするので、リボフラビンシンテターゼのアミノ末端端部のコーディング領域も同様にこのフラグメントＫｐｎＩ−ＮｄｅＩ中に含有されている。上記の≒０．２０ｋｂのフラグメントＫｐｎＩ−ＮｄｅＩを含有する各制限フラグメントは、必然的に、本発明による転写および翻訳の活性化配列をも含有する。次に、ｐＪＲ２３５中のコードされた、Ｓ．セレビシエの転写および翻訳の活性化配列のＤＮＡ配列を記載する。この配列は、化学的に合成し、ｐＪＲ２３５プラスミドから単離するか、またはｐＪＲ２３５プラスミドまたはＳ．セレビシエのゲノム総ＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。ｐＪＲ２３５プラスミド中の活性化配列の配向を明らかにするため、制限フラグメントを、制限酵素ＫｐｎＩに典型的でありかつ翻訳の開始コドンをも包含する、１本鎖の重複ＤＮＡ配列として表わす。
【００５３】
サッカロミセス・セレビシエのＤＮＡ配列
ｐＪＲ２３５プラスミド中にコードされた、転写および翻訳の活性化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）
【００５４】
【表１】

【００５５】
“ＴＡＣ”は、リボフラビンシンテターゼのアミノ末端メチオニン基をコードする５′−ＡＴＧ−３′に対して相補的である。
【００５６】
転写および翻訳の活性化配列は、Ｓ．セレビシエまたは類似の生物体中のそれぞれ任意のＤＮＡ配列中で発現の制御のために使用することができる。Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ遺伝子の転写プロモーターは、種々のタンパク質形のコーディング領域に融合することができる。転写および翻訳５′−ＡＴＧの開始コドンの前にある５′−配列は、たとえば制限に適当な部位、たとえばＮｄｅｌまたはＮｃｏｌをつくるためにＳ．セレビシエのプロモーターを重要なタンパク質のコーディング領域と融合するためポリメラーゼ連鎖反応によって拡張および変更することができる。
【００５７】
タンパク質のコーディング領域は、同様に、結合を可能にする２つの和合性末端を含有するように適合することができる。このために、タンパク質のコーディング領域により、異なる戦略が適用される。Ｓ．セレビシエ プロモーターと重要なタンパク質のコーディング領域との融合は、例３に示した方法に従いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なうこともできる。例３には、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼのコーディング領域と、Ｓ．セレビシエのＰＧＫ遺伝子の転写プロモーターおよび翻訳の活性化配列との融合記録を記載する。類似の方法によって、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼのコーディング領域を各任意の生物体の転写プロモーターおよび翻訳の活性化配列と結合することができる。
【００５８】
本発明は、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡの発現を制御する際の転写および翻訳の特定の活性化配列に制限されていない。本発明は、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性の発現のために転写および翻訳の任意の活性化配列を使用することを包含する。Ｓ．セレビシエ中の転写および翻訳の多数の活性化配列は公知でありかつＳ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性を制御するために使用することができる。これら転写および翻訳の活性化配列は、たとえば、全部ではないが、ＰＧＫ、ＴＰＩ、ＡＤＣｌ、ＥＮＯｌ、ＧＡＬｌおよびＧＡＰの転写および翻訳の活性化配列を包含する。種々の自律性複製配列および上記に例示した、転写および翻訳の活性化配列のほかに、他の生物体の転写および翻訳の自律性複製配列および活性化配列を、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明のＤＮＡ化合物と結合して、自律性複製配列および活性化配列が活動することのできる宿主細胞中のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御する発現ベクターを形成することができる。Ｓ．セレビシエは試験管内での使用のための、リボフラビンシンテターゼ製造のための適当な宿主であるが、Ｓ．セレビシエ以外の宿主細胞中のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御する発現ベクターも、殊に他の生物体中のリボフラビンの効力および生産能力を増加したい場合には使用することができる。若干のリボフラビン生産性生物体は、ビタミンＢ２製造工業において使用される。この生物体のビタミンＢ２生産能力は、発酵の間生合成制限酵素の濃度を高めることにより高め、有効にすることができる。
【００５９】
Ｂ．２ Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子の制御配列
ｐＪＲ２３５プラスミドも同様に、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子の３′−制御配列を包含する。一般に、ｍＲＮＡの転写、ポリアデニル化およびプロセシングの終結に責任のある、遺伝子のコーディング領域の停止コドンに続く配列は、≒５００ｂｐの領域内でコードされている。従って、リボフラビンシンテターゼのカルボキシ末端端部をコードするＤＮＡを包含する≒１．４ｋｂのＳｃａｌ−ＰｓｔＩフラグメントは、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子のｍＲＮＡの転写、ポリアデニル化およびプロセシングの終結シグナルをも含有する。ｐＪＲ２３５プラスミド中の転写の終結配列はこれら遺伝的構造中の転写終結を可能にするため、他の組換え遺伝子構造に接合することができる。
【００６０】
組換えＤＮＡ発現ベクター中の与えられたＤＮＡ配列の発現は、表現すべきコーディング領域のコーディング鎖の３′−末端に、転写、ポリアデニル化およびＲＮＡｍ−プロセシングの終結シグナルを挿入することによって高めることができる。本発明は、Ｓ．セレビシエおよび近縁の宿主生物体中の組換えＤＮＡベクターの任意の遺伝生成物中での発現を高めるために使用することのできる、転写、ポリアデニル化およびｍＲＮＡプロセシングの終結シグナルを提供する。
【００６１】
本発明によるＤＮＡ化合物は、発現ベクターが複製または組込まれ、かつリボフラビンシンテターゼ活性の発現のため転写および翻訳の活性化配列が使用される各任意の宿主細胞中でのリボフラビンシンテターゼの発現を制御する発現ベクターの構成に使用することができる。付加的に、本発明によるＤＮＡ化合物は、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするため、および本発明によるリボフラビンシンテターゼの遺伝的変異型をコードする、Ｓ．セレビシエ以外の菌株の相同ＤＮＡ化合物の単離のために使用することができる。従って本発明は、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする、プラスミドｐＪＲ２３５およびｐＪＲ３７６（下記に記載する）中のリボフラビンシンテターゼをコードする相同のＤＮＡ化合物をも包含する。
【００６２】
Ｃ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御する組換えＤＮＡ発現ベクター
Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ化合物は、この発現を制御する発現ベクターの構成のために使用することができる。それでたとえばｐＪＲ２３５−プラスミドは、Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５から例１に記載した方法に従って単離することができる。このｐＪＲ２３５−プラスミドからは、非常に有用な制限フラグメント、たとえば全ＲＩＢ５−遺伝子を含有する２．２ｋｂのＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ、またはアミノ末端端部を除く全遺伝子を含有する１．４ｋｂのＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ−フラグメントを得ることができる。ｐＪＲ２３５−プラスミドは、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を広範に制御するｐＪＲ３７６の符号を有するプラスミドの構成のための基礎として使用された。ｐＪＲ３７６−プラスミドは、リボフラビンシンテターゼのコーディング配列からなる２．２ｋｂの合成ＤＮＡ−フラグメントを、Ｓ．セレビシエのグリコール性酵素３−ホスホグリコール酸キナーゼ（ＰＧＫ）（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，１９８２年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：７７９１頁）の遺伝子プロモーターの発現下に、Ｅ．コリおよびＳ．セレビシエ中での該プラスミドの自律的複製を可能にする配列を含有する、ＹＥｐ３５２−プラスミドに類似のマルチコピープラスミド、ならびにＥ．コリ中のアンピシリン抵抗を伝達するβ−ラクタマーゼ遺伝子、およびオロチジン−５′ホスフェートのデカルボキシラーゼをコードしかつＥ．コリおよびＳ．セレビシエ中のこの栄養要求性遺伝標識の選択を可能にするＳ．セレビシエのＵＲＡ３−遺伝子中へ接合することによって得られる。添付図面の図１および２は、ＹＥｐ３５２−プラスミドの機能および制限地図を示す。大体において、ＰＧＫ−遺伝子はＳ．セレビシエ中に発現する最も有効な遺伝子の１つであるので、その転写物ならびにコードしたタンパク質は、全転写物および細胞タンパク質の５％にまでに達する。ＰＧＫ−プロモーターは、種々の真核タンパク質の高度に有効な発現ベクターを生産するように操作することができる（Ｔｕｉｔｅ等，１９８２年，ＥＭＢＯ Ｊ． １：６３；Ｄｅｒｙｎｃｋ等，１９８３年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １１：１８１９；Ｍｅｌｌｏｒ等，１９８３年，Ｇｅｎｅ ２４：１；Ｗｏｏｄ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３１４：４４６；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｅｎ等，１９８４年，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３０８：６６２およびＡｄａｍｓ等，１９８７年，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３２９：６８）。
【００６３】
ｐＪＲ３７６−プラスミドは、塩基対の位置−５８０〜−１のＰＧＫ−プロモーターを包含し、その際番号付けは位置１として翻訳の開始コドン５′−ＡＴＧ−３′のデソキンアデノシルヌクレオチドではじまり、該プロモーターはｐＪＲ２３５−プラスミドのリボフラビンシンテターゼ遺伝子のコーディング配列の発現を制御する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用による遺伝的融合の構成は、ヨン（Ｙｏｎ）等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：４８９５，１９８９年）により記載されている。プラスミドｐＪＲ３７６の構成記録は、例３に詳細に記載されている。
【００６４】
ＳＤ−Ｕｒａ培地中でリボフラビンシンテターゼは、菌株Ｓ．セレビシエのプラスミドｐＪＲ３６６担持細胞によって、高度に全細胞タンパク質の２％までの大きさに発現される。Ｓ．セレビシエ形質転換菌株ＡＪ５３／ｐＪＲ３７６の細胞抽出物は、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンのリボフラビンへの形質転換を触媒することができるが、菌株Ｓ．セレビシエＡＪ５３の細胞抽出物はこの形質転換を触媒することはできない。この転換反応の試験法は、例４Ｃに記載されている。プラスミドｐＪＲ３７６は、Ｓ．セレビシエ中で大量のリボフラビンシンテターゼを生産するための有効な機構を、しかも全細胞タンパク質の約１％程度に利用しうる。この理由からおよびＳ．セレビシエの培養は、リボフラビンを天然に生産する他の生物体の培養よりも費用がかからないので、Ｓ．セレビシエ／ｐＪＲ３７６形質転換細胞は、リボフラビンシンテターゼの製造のために、他の組換えないかまたは“天然”のリボフラビンシンテターゼ生産細胞よりも経済的かつ有効に使用することができる。本発明によるＳ．セレビシエ／ｐＪＲ３７６形質転換細胞は高度にリボフラビンシンテターゼを生産するので、Ｓ．セレビシエのゲノムによりコードされたリボフラビンシンテターゼをほぼ純粋な形で単離することができる。例示したリボフラビンシンテターゼの精製記録は、例４Ｃに記載されている。
【００６５】
上記に既述したように、リボフラビンシンテターゼをコードする本発明によるＤＮＡ化合物は、発現ベクターの構成のために使用することができる。これらのリボフラビンシンテターゼ発現ベクターを用いて、リボフラビンをリボフラビンシンテターゼにより触媒される反応により製造する宿主細胞を形質転換する場合、細胞内のリボフラビンシンテターゼの濃度が増加する。
【００６６】
非形質転換宿主細胞中でのリボフラビン生合成の制限因子がリボフラビンシンテターゼ活性である限り、このリボフラビンシンテターゼ発現ベクターを含有する宿主細胞は、非形質転換細胞よりも多量のリボフラビンを生産する。
【００６７】
形質転換された宿主細胞の細胞内部でのリボフラビンシンテターゼの濃度を高めるベクターは、次の要素を含有していなければならない：１）リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物；２）形質転換すべき細胞中で活動しうるだけでなく、リボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡを制御するための正しい位置および定位を有する、転写および翻訳の活性化配列；３）宿主細胞中のベクターを保持する複製および組込み機能。ベクターまたはＤＮＡフラグメントの組込み頻度は、宿主細胞によりコードされる活性に依存する。しかし、ベクターまたはＤＮＡフラグメント中の特定のＤＮＡ配列（たとえば組込みを促進するファージおよびウィルスの配列ならびに宿主細胞のゲノムＤＮＡの相同配列）の存在は組込みを容易にすることがしばしば確認される。
【００６８】
リボフラビンシンテターゼ発現ベクターはもちろん、このベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする選択可能な要素をも含有しうる。しかし、これらの選択可能な要素は、ベクターまたはＤＮＡフラグメントを宿主細胞の染色体ＤＮＡ中へ組込む場合には、不要であるかまたは望ましくない。
【００６９】
本発明によるリボフラビンシンテターゼ発現ベクターは、特定の選択可能な遺伝標識に制限されていない。専門家は、リボフラビンシンテターゼ発現ベクターを使用する場合には多くの選択可能な標識が適当であることを承知している。これらの選択可能な標識は、栄養要求性選択遺伝子、たとえばｌｅｕ２−菌株中の選択可能なＬＥＵ２−遺伝子（Ｈｉｎｎｅｎ等，１９７８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，米国７５：１９２９）、ｈｉｓ２−菌株中の選択可能なＨＩＳ３−遺伝子（Ｓｔｒｕｈｌ １９８２年，Ｎａｔｕｒｅ ３００：２８４）ならびにｔｒｐｌ−菌株中の選択可能なＴＲＰｌ遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎｎ等，１９８０年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：１２０７３）；優位選択を可能にする遺伝子、たとえば銅抵抗を与えるＣＵＰｌ−遺伝子（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等，１９８５年，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，９：１３３）ならびに抗生物質抵抗を与える遺伝子、たとえばＧ４１８、Ｔｎ６０１中の選択可能な遺伝標識（ＴｉｍｅｎｅｚおよびＤａｖｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ、２８７：８６９，１９８０頁）、ヒグロマイシン、プラスミドｐＩＴ１２３中の選択可能な遺伝標識（Ｋａｓｔｅｒ等，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，８：３５３，１９８３年）を包含する。
【００７０】
若干の本発明によるプラスミドは、リボフラビン生産細胞中のリボフラビンシンテターゼ活性濃度を高めるのに適当である。プラスミドｐＪＲ２３５は、Ｓ．セレビシエの完全なリボフラビンシンテターゼ遺伝子を含有するので、プラスミドｐＪＲ２３５でのＳ．セレビシエの形質転換はリボフラビンシンテターゼ遺伝子のコピー数の増加を形成し、これが細胞内部の酵素濃度の増加をもたらす。
【００７１】
Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子は、アッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）およびエレモテシウム・アッシュビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｉｉ）中で機能することから出発する。従って、プラスミドｐＪＲ２３５の組込みによるＡ．ゴッシピィおよびＥ．アッシュビィの形質転換はリボフラビンシンテターゼ遺伝子のコピー数の増加、ひいては細胞内部における酵素濃度の増加を生じる。しかし、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼをコードする本発明による配列は、エレモテシウムおよびアッシュビヤから誘導される転写および翻訳の活性化配列を、とくにこれら生物体に定められた組換え遺伝子の構成のために制御することもできる。
【００７２】
Ｓ．セレビシエの本発明による発現ベクターは、ここに記載した特殊なベクターに制限されていない。本発明は、Ｓ．セレビシエの各任意の発現プラスミドまたはＳ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼの発現を制御する各ベクターを包含する。従って、本発明は、Ｓ．セレビシエ中の機能性複製単位、たとえばプラスミド２μの複製原単位および他の自律性複製配列を使用するリボフラビンシンテターゼ発現ベクターを包含する。また、本発明はプラスミドベクターに制限されておらず、本発明は、リボフラビンシンテターゼ活性を表現しかつゲノム中でのウィルスによる複製または組込みを使用し、例３に記載したように、宿主細胞中に維持する発現ベクターまたはＤＮＡ化合物をも包含する。
【００７３】
Ｄ． リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物を含有する発現ベクターで変換された組換え微生物
本発明の別の対象は、リボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ化合物を含有する発現ベクターで変換された組換え微生物である。これらの形質転換細胞は、適当な宿主細胞中へ本発明による発現ベクターを接合し、引き続きこの細胞を、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中への組込みまたはこの細胞中での複製に適当である条件下で培養し、ならびに形質転換細胞を選択することによって得られる。適当な宿主細胞は、酵母、細菌または糸状菌のような各リボフラビン生産性または非生産性微生物である。とくに、これらの微生物は、サッカロミセス、エシェリキア、カンジダ、エルモテシウムおよびアッシュビヤ属に属するが、他の属の微生物も本発明による発現ベクターで変換することができる。これら宿主細胞の形質転換に適当な条件は、形質転換すべき細胞の種類に依存しかつ専門家に良く知られている。この点で、次の文献を引用する：Ｍａｎｉａｔｉｓ等，１９８２年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨークおよびＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｅｄｓ：Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｍ．ＳｐｅｎｃｅｒおよびＡ．Ｒ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版（１９８３年）、これには微生物用の通常の形質転換技術が記載されている。
【００７４】
本発明の望ましい実施形ではＥ．コリＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の形質転換細胞が製造され、これは、ＮＣＩＭＢにおいてＮｏ．ＮＣＩＭＢ４０４８０で寄託された。
【００７５】
Ｅ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性の製造
本発明のもう１つの重要な対象は、Ｓ．セレビシエ リボフラビンシンテターゼ活性の製造方法である。この方法は大体において、本発明による発現ベクターで形質転換された、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡ化合物を含有する生物体の培養を実施することを要旨とし、その際この培養は、組込まれる遺伝子の発現に適当な条件下に行なわれる。これらの条件は、形質転換される微生物の種類に依存し、既に従前に挙げた条件の範囲内に存在しうる。
【００７６】
リボフラビンシンテターゼ活性は、精製することができるか、または精製せずに直接、この酵素を含有する粗製細胞抽出物から使用することができる（例４）。
【００７７】
既述したように、本発明はＳ．セレビシエ リボフラビンシンテターゼ遺伝子のコーディング配列ならびにＳ．セレビシエ中のこの遺伝子の発現を制御する一連の発現ベクターを利用する。Ｓ．セレビシエ中でのリボフラビンシンテターゼの生産は高い発現速度および酵素の簡単な単離を可能にするので、これは新規フラビン化合物を製造するための新規ルマジン誘導体の試験管内縮合を触媒するのに使用することができる。Ｓ．セレビシエ、カンジダ・グリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉｉ）、エレモセシウム・アッシュビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ）、アッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）および他のリボフラビン生産性生物体を、重要な宿主細胞中でのリボフラビンシンテターゼの発現を制御する本発明による発現ベクターで形質転換すると、形質転換された細胞中に高いビタミン含量が生じる。
【００７８】
リボフラビンシンテターゼは、例４に記載したように、細胞不含系中で６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンからリボフラビンを製造するために使用することができる。リボフラビンは天然のビタミンであるだけではなく、たとえばＦＭＮおよびＦＡＤのような他の重要な補助因子の製造用出発物質である。リボフラビンシンテターゼの別の重要な使用分野は、本発明によるリボフラビンシンテターゼに関し新規フラビン誘導体の製造のために認めることのできる種々の６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン化合物の縮合である。
【００７９】
Ｆ． ６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンからのリボフラビンの製造
本発明のもう１つの重要な対象は、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンからのリボフラビンの製造方法である。この方法は、大体において、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン含有溶液を、本発明によるＳ．セレビシエ リボフラビンシンテターゼと一緒にすることを要旨とする。このシンテターゼは、精製された形で、ならびに既述したように、このシンテターゼを含有する粗製細胞抽出物の使用により精製せずに使用することができる。この方法は、溶液中でまたは酵素またはシンテターゼ含有細胞を適当な担体に固定することにより実施することができる。
【００８０】
この方法は、
−ｐＨ ６．５〜７．５
−温度 ３０℃〜４０℃で
−はじめに１０μｇ／溶液１ｍｌの酵素の最低濃度を用いて実施することができる。
【００８１】
精製された酵素または粗製細胞抽出物からの酵素を結合することのできる固体担体材料としては、この種の方法に常用のもの、たとえばカラゲナン、セファロース（ＳＩＧＭＡ）または他の適当な担体が挙げられる。
【００８２】
本発明の望ましい実施形においては、リボフラビンは６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンから細胞不含の系中で製造される（例４）。
【００８３】
Ｇ． 新規フラビンの製造
本発明のもう１つの重要な対象は、本発明によるリボフラビンシンテターゼの使用下に、この酵素により基質と認識することのできる、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン以外のルマジン誘導体から新規フラビンまたはフラビン誘導体を製造する方法である。
【００８４】
リボフラビンシンテターゼは、単離した純粋な形でまたは粗製細胞抽出物で使用することができ、この方法は溶液で、ならびに純粋な酵素またはこの酵素を含有する細胞抽出物の細胞を、適当な固体担体に固定することにより、上述した形で実施することができる。
【００８５】
細胞抽出物リボフラビン生産性生物体は、天然物でない（天然に産出されない）フラビンを合成するために使用することができる。本発明による発現ベクターは、新規フラビンまたはフラビン誘導体製造のため天然に出現しないルマジンの試験管内縮合のために使用することができ、粗製細胞抽出物中のリボフラビンシンテターゼを製造する有効かつ廉価な方法を提供する。リボフラビンシンテターゼの担体として適当である天然物でないルマジン誘導体の探索は、基質として天然物でないルマジン誘導体を受容するリボフラビンシンテターゼ突然変異体の探索によって完成することができる。本発明は、これらのリボフラビンシンテターゼ突然変異体を探索するための出発物質を提供する。
【００８６】
本発明を次の実施例につき説明するが、該例は本発明を明らかにするだけで、制限するものではない。
【００８７】
【実施例】
例１
Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の培養およびプラスミドｐＪＲ２３５の製造
１．Ａ． Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の培養
ＮＣＩＭＢにＮｏ．４０４８０で寄託されているＥ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５凍結乾燥物は、下記方法において接種培地として使用することができる。
【００８８】
ＬＢ培地（１ｌあたりトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇおよび酵母エキス５ｇ）１ｌ（アンピシリン１００μｍ／ｌを含有する）に、Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５接種培養物を接種し、３７℃で通気下に、５９０ｍｎ（Ｏ．Ｄ．_５９０）における光学密度が≒１になるまでインキュベートした。次いで、培養物にクロラムフェニコール１５０ｍｇを加え、インキュベーションを１６時間続けた。クロラムフェニコールの添加はタンパク合成、それと共にあとでの細胞分裂を阻止するが、プラスミドの複製は妨げない。
【００８９】
１．Ｂ． プラスミドｐＪＲ２３５の製造
例１Ａにより製造した培養物を、４℃で５分間、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＧＳＡロータ（Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｃｏ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ウィルミントン在、ＤＥ１９８８０−００２４）中で６０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した。生じた上澄みは捨て、細胞沈殿物をＴＥＳ緩衝液（トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ，ｐＨ＝７．５；ＮａＣｌ １０ｍＭおよびＡＤＴＡ １ｍＭ）４０ｍｌ中で洗浄し、沈殿させた。上澄みを再び捨て、細胞沈殿物をドライアイスおよびエタノール含有浴中で凍結し、引き続き再び解凍した。解凍した細胞沈殿物を改めて、サッカロース２５％およびＥＤＴＡ５０ｍＭからなる溶液１０ｍｌに懸濁させた。引き続き、この溶液に、リゾチーム５ｍｇ／ｍｌ、ＥＤＴＡ０．２５Ｍ ３ｍｌ、ｐＨ＝８．０、ならびにリボヌクレアーゼＡ１００μｌからなる溶液を混合し、次いでこれを１５分間氷中でインキュベートとした。リゾチームで処理した細胞に、溶解液（１０％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００ ３ｍｌ、ＥＤＴＡ ０．２５Ｍ ７５ｍｌ、ｐＨ＝８．０、トリス−ＨＣｌ １Ｍ１５ｍｌ、ｐＨ＝８．０および水７ｍｌを混合することにより製造）３ｍｌを添加し、混合した後、生じた溶液を１５分間氷中でインキュベートした。凍結乾燥した細胞を、ドライアイス・エタノール浴中で凍結し、引き続き再び解凍した。
【００９０】
細胞廃棄物は、ＳＷ２７−ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，７３６０ Ｌｉｎｃｏｌｎ．Ａｖｅ．，Ｌｉｎｃｏｌｎｗｏｏｄ，ＩＬ６０６４６）中で２５０００ｒ．ｐ．ｍ．で４０分遠心分離し、緩衝したフェノールで抽出することにより溶液から除去した。
【００９１】
ＣｓＣｌ約３０．４４ｇおよび臭化エチジウム５０ｍｇ／ｍｌからなる溶液約１ｍｌを上記溶液に加え、引き続き溶液を４０ｍｌにし、超遠心機Ｖｔｉ５０（Ｂｅｃｋｍａｎ）の管に入れた。管を密封し、溶液をロータＶＴｉ５０中、４２０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した。生成したプラスミドの、紫外線で可視性にした横盤を単離し、管およびロータＴｉ５７に入れ（容積適合は、ＣｓＣｌ ０．７６１ｇ／ｍｌを含有するＴＥＳを用いて実施した）、５００００ｒ．ｐ．ｍ．で１６時間遠心分離した。プラスミド横盤（Ｐｌａｓｍｉｄｑｕｅｒｓｃｈｅｉｂｅ）を改めて単離し、臭化エチジウムを除去するため、食塩で飽和したイソプロパノールで抽出し、ＴＥＳ緩衝液で１：３に希釈した。引き続き、溶液に２容のエタノールを加え、次にこれを夜どおし−２０℃でインキュベートした。プラスミドＤＮＡを、ロータＳＳ３４（Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｃｏ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ １９８８０−００２４）中で１００００ｒ．ｐ．ｍ．で溶液を１５分間遠心分離することにより沈殿させた。
【００９２】
こうして得られたプラスミドＤＮＡ ｐＪＲ２３５（≒１ｍｇ）を、ＴＥ緩衝液（トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ，ｐＨ＝８．０およびＥＤＴＡ １ｍＭ）１ｍｌに再懸濁させ、−２０℃で保存した。
【００９３】
添付図面の図３にはプラスミドｐＪＲ２３５の機能および制限地図が示されている。
【００９４】
例２
Ｓ．セレビシエの遺伝子ＲＩＢ５のクローニングおよび分析
リボフラビンシンテターゼをコードする、Ｓ．セレビシエのＲＩＢ５−遺伝子を含有するＤＮＡ−フラグメントの一般的製造方法は、劣性のｒｉｂ５−１０突然変異体を機能的に相補することのできる、Ｓ．セレビシエのゲノムライブラリーからクローンを単離することを要旨とする。ｒｉｂ５−突然変異体が、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼをコードするＲＩＢ５−遺伝子に影響を及ぼし、この突然変異を含有する菌株は、リボフラビン不含培地中で成長不能になる。
【００９５】
２． リボフラビンシンテターゼをコードする遺伝子中の影響されたｒｉｂ５−突然変異体
ｒｉｂ５突然変異の頻度を上げるために、突然変異原エチルメタンスルホネート（３０μｌ／ｍｌ）（ＥＭＳ；Ｓｉｇｍａ）を使用した。突然変異誘発をＳ．セレビシエの菌株ＳＩ５０２（ＭＡＴａ ｈｉｓ−３−Δ１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２）の細胞中で常法に従って実施した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｗ．Ｇｕｉｄｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 所属、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：２７３，１９９１年）。リボフラビンを補足（２０μｇ／ｍｌ）したＹＰＤ培地中に突然変異誘発した細胞２×１０^５を接種し、引き続きリボフラビンなしの完全な合成培地（ＳＣ−ｒｉｂ）中で複製した後、リボフラビン不含培地中で成長できない栄養要求性突然変異体を検出し、選択した（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｇｕｉｄｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ 所属、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１，１９９１年）。ｒｉｂ５−突然変異体を、リボフラビンに対し栄養要求性の突然変異体のうち、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンを培地中で蓄積する能力につき確認した。ＲＩＢ５−遺伝子のクローニングのために、突然変異体ＡＪ１０（ＭＡＴａ ｈｉｓ−３−Δ１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｒｉｂ５−１０ ｕｒａ３−５２）を選択した。
【００９６】
２．Ｂ． ＲＩＢ５−を含有するプラスミドｐＪＲ２１１の単離
ＲＩＢ５−遺伝子を有しかつＳ．セレビシエの菌株ＡＪ１０のｒｉｂ５−１０突然変異を完成することのできるプラスミドの単離のために、動原体プラスミドＹＣｐ５０中でＳ．セレビシエＧＲＦ８８（ＡＴＣＣからＡＴＣＣ Ｎｏ．３７４１５で得られた）からのＤＮＡを使用した。実際に、酢酸リチウムで処理することによって得た、Ｓ．セレビシエの菌株ＡＪ１０の能力細胞を、例１Ｂに記載した方法と類似に、ＹＣｐ５０中の遺伝子のＤＮＡ６５μｇと共にインキュベートした。反応混合物を、ベクターＹＣｐ５０中に含有されている遺伝標識ＵＲＡ３および遺伝子ライブラリーのプラスミド中に含有されている単離すべきＲＩＢ５−遺伝標識の二重選択を実施するため、リボフラビンもウラシルも含有していなかった完全な合成培地中へ接種した。合計１３０００と評価された形質転換細胞（Ｐｈｅｎｏｔｙｐ Ｕｒａ^＋）から、ウラシルおよびリボフラビン不含培地（Ｐｈｅｎｏｔｙｐ Ｕｒａ^＋，Ｒｉｂ^＋）中で成長しうる３つのクローンを得た。その担体がこの３つの形質転換細胞であったプラスミドを、細菌中での形質転換により回収し、制限酵素を用いて特性決定した（ＳｔｒａｔｈｅｒｎおよびＧｕｉｄｅ，Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：３１９，１９９１年）。この３つのプラスミドは同じ制限モデルを有し、そのうちの１つｐＪＲ２１１を別の分析のために選択した。ベクターＹＣｐ５０および組込まれた≒１３ｋｂのＤＮＡフラグメントからなるプラスミドｐＪＲ２１１は、菌株ＡＪ１０中へ組込む場合、同じ効率でｒｉｂ５−１０およびｕｒａ３−５２突然変異を完成することができる。
【００９７】
２．Ｃ． ＲＩＢ５−遺伝子のサブクローニングおよびプラスミドｐＪＲ２３５の構成
ＲＩＢ５−遺伝子を含有する最小のＤＮＡ−フラグメントを限定するために、プラスミドｐＪＲ２１１のフラグメント≒１３ｋｂの一連の制限酵素の地図を作製し、種々の低位フラグメントを単離し、エピソームベクターＹＥｐ３５２に結合した。生じたプラスミドを、ｒｉｂ５−突然変異を完成する能力を調べ、それから、ＲＩＢ５−遺伝子がフラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ≒２．２ｋｂ中に含まれていたことが明らかになった。ベクターＹＥｐ３５２およびサブクローニングに使用されたフラグメントの機能および制限地図は、添付図面の図１に示されている。フラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩをプラスミドｐＪＲ２３５の生成下にベクターＹＥｐ３５２中にクローニングし、該プラスミドの制限および機能地図は添付図面の図３に示されている。
【００９８】
２．Ｄ． 遺伝子ＲＩＢ５の完全な欠失を有する菌株の構成
ＲＩＢ５−遺伝子のコーディング領域の大部分の安定な遺伝的欠失を有するＳ．セレビシエ菌株を構成するために、１工程の遺伝的破壊法（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｃ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：２０２，１９８３年）を使用した。この方法は、酵母の反応の間ゲノム中の相同配列と直接に相互作用することにより組換えを刺戟する自由端を有するＤＮＡ分子の組換え能力を基礎としている。こうして、重要な遺伝子中で破壊が試験管内で形成されるので、遺伝子の配列は選択可能な標識の１つによって置換される（たとえばＵＲＡ３）。試験管内で形成される破壊は、図４および５に示したように、あとで反応の間ゲノム配列の置換のために使用される。この構成の１例を次に記載する。
【００９９】
図４が示すように、プラスミドｐＪＲ２１４は差当りＮｃｏｌで消化して末端をポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理することにより平滑にし、引き続きＢａｍＨＩおよびフラグメントＢａｍＨＩ−Ｎｃｏｌ≒２ｋｂで消化し、ＲＩＢ５−遺伝子の５′−末端をフランキングし、アガロースゲル中で精製し、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳ^＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に結合し、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化し、Ｅ．コリＪＭ１０１に形質転換した。組換えプラスミドを選択し、ｐＪＲ２７８と命名した。同様にして、ＲＩＢ５−遺伝子の３′末端をフランキングするプラスミドｐＪＲの１４のフラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ≒０．８ｋｂを差当りＰＵＣｌ ９にサブクローニングし（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等，Ｇｅｎｅ ３３：１０３，１９８５年；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ボストン，ＭＡ 米国およびＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，米国で入手）、これからフラグメントとしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ≒０．８ｋｂを除去し、あらかじめＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＪＲ２７８に結合し、Ｅ．コリＪＭ１０１に形質転換した。
【０１００】
組換えプラスミドを選別し、ｐＪＲ２９７と命名した。最後に、Ｓ．セレビシエの機能ＵＲＡ３−遺伝子（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等，Ｇｅｎｅ ８：１７，１９７９年）を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント≒１．１ｋｂを、ｐＪＲ２９８プラスミドの生成下に、ｐＪＲ２９７にクローニングした。ＫｐｎＩでのｐＪＲ２９８の消化は、ＲＩＢ５遺伝子の５′および３′末端をフランキングする配列からフランキングされるＵＲＡ３−遺伝子からなる≒１．９のフラグメントを遊離する。このフラグメントを精製し、ＤＮＡ７μｇをリボフラビンに対し原栄養体菌株Ｓ．セレビシエＪＣ２ａ（ＭＡＴαｈｉｓ ３Δｌ ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２）の転換のために使用した。形質転換は、形質転換細胞の選択のために、転換の際に使用したＤＮＡフラグメントが構成されていたウラシル不含培地ＳＣ−ｕｒａにクリーム状に固まった。
【０１０１】
さらに、得られたＵｒａ^＋形質転換細胞１７のうち２つはＲｉｂ表現型であり、これはここでは天然のＲＩＢ５遺伝子が試験管内欠失によって置換されていたことを示す。引き続き、この菌株に溶解した、ＲＩＢ５遺伝子ＡＪ５３（ＭＡＴαｈｉｓ ３Δｌ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｒｉｂ５−Δ１１：ＵＲＡ３ ｕｒａ３−５２）の分裂を、サザンハイブリッド形成（図３）およびｒｉｂ５突然変異体による完成によって確認した。
【０１０２】
例３
ＲＩＢ５遺伝子の転写変更因子でのプラスミドおよびＳ．セレビシエ菌株の構成既述したように、ＲＩＢ５−遺伝子のプロモーターを、この生合成遺伝子の構成のための大きい発現を可能にするプロモーターによって代えることは非常に有益でありうる。この形質転換体を含有するプラスミドは、大量のリボフラビンを生産する酵母株の製造のために使用することができる。
【０１０３】
ＲＩＢ５−遺伝子のヌクレオチド配列ならびに酵母中へ強く表現可能で、３−ホスホグリセレートキナーゼＰＧＫをコードする構成遺伝子のプロモーターを知ったことによって、ＰＧＫ遺伝子プロモーターによるＲＩＢ５−遺伝子のコーディング領域を、ヤン（Ｙｏｎ）等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：４８９５，１９８９年）により記載された方法に従いポリメラーゼ連鎖反応によって調節する調節が計画された。
【０１０４】
融合ＰＧＫ−ＲＩＢ５を含有するＤＮＡフラグメントの製造のため、４つのヌクレオチドをアプライドバイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のＭｏｄｅｌ３８０Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）の自動ＤＮＡ合成装置中で合成し、引き続きメーカーにより記載されたようにゲル電気泳動によって精製した。このプライマーのヌクレオチド配列およびその明細は次のとおりである：
【０１０５】
【表２】

【０１０６】
プライマーＡは、ＰＧＫ−遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド−５８０〜−６２０，Ｈｉｔｚｅｍａｎ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：７７９１，１９８２年）による番号付けした）に相同である（ヌクレオチド８〜２８）。さらに、このプライマーは、その５′末端に、制限酵素Ｎｃｏｌ（ヌクレオチド１〜６）およびＢａｍＨＩ（ヌクレオチド５〜１０）の認識塩基の配列を有する。プライマーＢはＰＧＫ−遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド−１７〜＋１３）に対して相補的である。プライマーＣは、そのヌクレオチド１〜１５が、ＰＧＫ−遺伝子コーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド−１２〜＋３）およびＲＩＢ５遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド＋１〜＋１５、上記に記載したように番号付けした）に相同である。プライマーＤは、ＲＩＢ５−遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド＋７３８〜＋７５５）に対して相補的である。
【０１０７】
トリス−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．３ １０ｍＭ；ＫＣｌ ５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２ ２ｍＭ、各デソキシヌクレオチド三リン酸８０ｎＭ、各プライマー［ＡとＢ、ＣとＤまたはＡとＤ］５０ｐｍｏｌ、下記に記載したようなＤＮＡ型５０ｎｇおよびＴａｑポリメラーゼ０．５単位からなる反応混合物１００μｌを製造した。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）中で３０サイクル宛実施した。各サイクルは、９４℃で１分の熱作用による変性工程を包含し、これに５５℃で２．５分間のＤＮＡに対するプライマーのリアニーリングおよび７２℃で２．５分間のＴａｑポリメラーゼによる連鎖延長工程が続く。反応混合物に対し、制限酵素反応前にクロロホルムで１回抽出した１滴の鉱油を加えた。
【０１０８】
プライマーＡおよびＢならびにＳ．セレビシエＸ２１８０−１Ａの野生型菌株（この菌株はＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，カリフォルニア大学、Ｂｅｒｋｅｌｙ，ＣＡ，米国で入手することができる）のゲノムＤＮＡを含有しかつＰｈｉｌｉｐｓｅｎ等（Ｇｕｉｄｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 所属、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１６９，１９９１年）により記載された方法に従って製造した第１の反応混合物中に、ＰＧＫ−遺伝子プロモーター（ｎｔ−５８０〜＋３）を含有しかつさらに遠位の５′−末端にＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩの認識配列を有しているＤＮＡフラグメントを複製した。
【０１０９】
プライマーＣおよびＤならびにプラスミドｐＪＲ２３５のＤＮＡを含有する第２の反応生成物においては、ＲＩＢ５−遺伝子（ｎｔ＋１〜＋７５５）のコーディング領域が複製されていて、さらにヌクレオチド＋１に相当する末端にＰＧＫ遺伝子に相当する配列（ｎｔ−１２〜＋３）を有していた。
【０１１０】
プライマーＡおよびＤ、ならびにさきの２つの反応において複製された２つのフラグメントに相当する精製されたＤＮＡ（各フラグメントの２５０ｎｇ）を含有する第３の反応混合物においては、ＲＩＢ５−遺伝子のコーディング領域（ｎｔ＋１〜＋７５５）を有するＰＧＫ−遺伝子プロモーターの配列（ｎｔ−５８０〜＋３）が、図４Ａに示したように存在するＤＮＡ−フラグメントが複製されていた。
【０１１１】
この反応生成物をアガロースゲル中で精製し、ＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化したＹＥｐ３５２−ベクターをクローニングし、これによってプラスミドｐＪＲ３７６が生成した（図８）。引き続き、複製反応後は欠陥のない遺伝的融合ＰＧＫ−ＲＩＢ５の正しいヌクレオチド配列を順列決定によって確認した。
【０１１２】
例４
リボフラビンシンテターゼの特性表示
４．Ａ． Ｅ．コリ中でのＲＩＢ５タンパク質の発現
Ｅ．コリ中でのリボフラビンシンテターゼの発現のために、合成ｔｒｃプロモーターを有するベクターｐＴｒｃ９９Ａを使用した（Ａｍａｎｎ等，Ｇｅｎｅ ６９：３０１，１９８８年。このベクターは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）で入手できる）。ｔｒｃプロモーターの制御下にＲＩＢ５遺伝子のコーディング配列を調節するために、あらかじめカドワキ等（Ｇｅｎｅ ７６：１６１，１９８９年）により記載された方法による突然変異誘導によって、ＲＩＢ５遺伝子のコーディング配列の開始コドン５′−ＡＴＧ−３′のまわりに制限部位Ｎｃｏｌを形成した。このために、プライマーとして２つのオリゴヌクレオチドを使用した：Ｅ，制限部位Ｎｃｏｌの形成のためおよびＤ，さきに例３Ａに記載したものに一致する。これらのオリゴヌクレオチドを、アプライド・バイオシステムス社のモデル３８０Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）のＤＮＡ合成装置中で製造した。その配列は次のとおりである：
【０１１３】
【表３】

【０１１４】
１００μｌの容積を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（トリスＨＣｌ １０ｍＭ，ｐＨ７．３；ＫＣｌ ５０ｍＭ，ＭｇＣｌ_２ ２ｍＭ、個々のデソキシヌクレオチド三リン酸それぞれ８０ｎＭ，プライマーＤおよびＥそれぞれ５０ｐｍｏｌ，プラスミドｐＪＲ２３５のＤＮＡ５０ｎｇおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｋｉｔ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）０．５単位含有）において、開始コドン５′−ＡＴＧ−３′中に制限部位Ｎｃｏｌを有するＲＩＢ５遺伝子の変更配列を含有するＤＮＡ−フラグメントを複製した。このフラグメントをアガロースゲル中で精製し、ＮｃｏＩで消化し、あらかじめＮｃｏＩ−ＳａｍＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−ベクターに結合し、Ｅ．コリＪＭ１０１に形質転換した。組換えプラスミドを選択し、ｐＪＲ３８０と命名した。
【０１１５】
Ｅ．コリ中のＳ．セレビシエのＲＩＢ５−遺伝子の発現のために、プラスミドｐＪＲ３８０で形質転換したＥ．コリＪＭ１０１細胞を１６時間ＮＺＹＡｍＰ^１００−培地中で成長させ（カゼイン加水分解物１％、ＮａＣｌ ０．５％、酵母エキス０．５％、ＭｇＳＯ_４ ０．２％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌ）、それをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭで２時間誘発した。発現プラスミドｐＪＲ３８０で形質転換した細胞は、ｐＴｒｃ９９Ａ−ベクターで形質転換したものよりも緩慢に成長した。ＩＰＴＧで誘発後、発現プラスミドｐＪＲ３８０を含有する細胞は停止するまで成長した。この形質転換細胞の検鏡は、光屈折性細粒（封入体と呼ばれる）を細胞極中に含有しておりかつ大量の不溶性異物タンパク質を含有する形態学に典型的である伸長細胞の出現を示した（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．Ｋ．，１９８６年，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：７０１〜７２６，１９８６年）。
【０１１６】
引き続き、細胞を遠心分離することによって取得し、溶菌緩衝液中に改めて懸濁させ、超音波により分解し、細胞抽出物を、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等により記載された方法（１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に従い、４℃および１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分遠心分離することによって可溶性画分と不溶性画分に分けた。
【０１１７】
これらの画分を変性条件下での電気泳動によって分析し、ゲルをクーマシーブルーで染色した。可溶性画分では正常バンドに対し付加的バンドは出現しなかったが、発現プラスミドｐＪＲ３８０で変換された細胞の不溶性画分は、クローニングＲＩＢ５−遺伝子のコーディング領域の誘導重量に一致する約２４ｋＤａの分子量の強いバンドを示した（図５）。この結果は、Ｅ．コリ中のＲＩＢ５−タンパク質は、タンパク質の大部分が不溶性の酵素不活性の形で存在しかつその抽出のためにデタージェントまたは変性剤の使用が必要であるときでも、高度に表現することができる。
【０１１８】
４．Ｂ． ポリクローナル抗体ａｎｔｉ Ｒｉｂ５の製造および精製
Ｅ．コリＪＭ１０１中に表現される不活性Ｒｉｂ５−タンパク質は、下記に記載するように、ポリクローナル抗体製造の際免疫原として使用するために好適である。発現プラスミドｐＪＲ３８０で形質転換し、ＩｐＴＧで誘導した、例４Ａに記載したように製造した細胞２５０ｍｌからの、Ｒｉｂ５−タンパク質を含有する不溶性沈殿物を、蒸留水２０ｍｌで洗浄し、０．１Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）４ｍｌおよび尿素３Ｍに溶解した。混合物を４℃、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分遠心分離し、尿素を０．１Ｍトリス・ＨＣｌへの透析により除去した。タンパク質９９％の純粋なＲｉｂ５−タンパク質（測光により決定）（図９−Ａ）合計５ｍｇが得られた。
【０１１９】
前免疫血清（Ｐｒａｅｉｍｍｕ−Ｓｅｒｕｍ）を得るためあらかじめ採血したニュージーランドウサギを、１００ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）０．５ｍｌおよび１００℃で３分変性し、完全なフロイントアジュバント（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）で乳化したＳＤＳ２％中のＲｉｂ５−タンパク質１００μｇを皮下注射した。引き続き、ウサギを全部２週間更新用量で接種し、初期免疫化から６週間後に、免疫血清を得るために採血した。
【０１２０】
抗体を、Ｅ．コリＪＭ１０１中に表現されるＲｉｂ５−タンパク質をＡｆｆｉ−ゲル １０−Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に結合して含有していたカラム中でのアフィニティー・クロマトグラフィーにより、メーカーの指示に従って精製した。カラムを、Ｓｔａｐｈ緩衝液（ＮａＨ_２ＰＯ_４１．６μＭ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １．１μＭ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００１％，ＳＤＳ ０．１％，ＮａＮ_３ ０．１％，ＮａＣｌ ０．１Ｍ，デソキシナトリウムコレート ０．５％）で徹底的に洗浄し、引き続き０．２Ｍグリセリン（ｐＨ２．２）２０容量で溶離し、溶離液を直ちに１Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）１／９容量で中和し、０．１％アジドの存在で４℃で保存した。これらの抗体がＥ．コリの総タンパク質のウエスタンブロッティングで検出された場合、適当な大きさのポリペプチドとの反応が観察された。クーマシーブルーで染色されたゲルにおけるように、ウエスタンブロッティングにより検出されたＲｉｂ５−タンパク質の大部分は不溶の形で存在していた（図９−Ｂ）。
【０１２１】
４．Ｃ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼの精製
リボフラビンシンテターゼは、２分子の６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンからのリボフラビン−および５−アミノ−６−リビチル−アミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン分子の生成を触媒する。この酵素は、幾つかの微生物および植物中に見出され、アッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、エシェリキア・コリおよびホウレンソウの半精製製剤が製造された。酵母からのリボフラビンシンテターゼは、精製法が非常に費用がかかりかつ面倒であるにも拘らず、既に約５０００回精製された（Ｐｌａｕｔ，Ｇ．Ｗ．Ｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：７７１〜７８５，１９７０年）。
【０１２２】
低級微生物（高フラビン生産性子のう菌を含む）の細胞抽出物中のリボフラビンシンテターゼ含量は僅かであり、これがその精製および特性表示を困難にする。従って、酵素の簡単で再現可能な精製法ならびに酵素活量によらない別の検出法を使用することが望ましい。
【０１２３】
Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼの精製のために、ＹＰＤ培地中のＯＤ_６００＝１．５〜２．０を有する野生型菌株Ｘ２１８０−１ａの細胞の培養液２５０ｍｌからの、ミカエリ（Ｍｉｃｈａｅｌｉ）等（ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３０４５，１９８９年）の方法による細胞抽出物を製造した。得られた細胞抽出物１ｍｌ（タンパク質≒５ｍｇ／ｍｌ）を、あらかじめトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５）２０ｍＭで平衡にしたイオン交換カラムＭｏｎｏＱ ＨＲ−５／５（ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してＦＰＬＣクロマトグラフィーによって分別した。保持されたタンパク質を、ＮａＣｌ ０〜０．５Ｍの連続的勾配法で溶離し、画分１ｍｌを、例４Ｂからの方法によって得られたａｎｔｉ−Ｒｉｂ５−抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。ａｎｔｉ−Ｒｉｂ５−抗体は画分２２（２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度に一致）中に溶離した約２４ｋＤａのポリペプチドと特異的に反応した。このポリペプチドの分子量は、クローニング遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列の誘導重量と一致する。
【０１２４】
同様に、イオン交換クロマトグラフィー前の画分を、バッシャー（Ｂａｃｈｅｒ）等により記載された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２２：１９２，１９８６年）によりリボフラビンシンテターゼ活性を調べた。試験混合物は実際に、リン酸カリウム（ｐＨ＝７）５０ｍＭ、ＮａＨＳＯ_４ １０ｍＭ、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン（ＰｌａｕｔおよびＨａｒｖｅｙにより記載された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８Ｂ：５１５〜５３８，１９７１年）により合成）０．６ｍＭおよび試験すべき画分１５０μｌ（全容量１ｍｌ中）を含有していた。反応混合物を暗所中で１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間の初めと終りに、試料を採取し、タンパク質をトリクロル酢酸１５％の添加により沈殿させた。
【０１２５】
合成リボフラビンの量は、４７０ｎｍにおける光学密度の増加（４７０ｎｍにおけるリボフラビンのモル吸光＝９３００）から計算し、比活性は毎時タンパク質１ｍｇあたり生成したリボフラビンｎｍｏｌで表わした。結果は、リボフラビンシンテターゼ活性はＮａＣｌ濃度２５０ｍＭで溶離した画分２２において最大を示し、その際これはａｎｔｉ−Ｒｉｂ５−抗体と反応したポリペプチド中に確認されたと同じ画分である。
【０１２６】
画分２２中に存在するタンパク質を変性条件下で電気泳動により分析し、ゲルを銀で染色する（Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７：５０７，１９８１年）場合、抽出物の総タンパク質の９９％以上に達しかつ約２４ｋＤａの分子量を有する単１つの大きいバンドが出現し、これはクローニング遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列の誘導された分子量と一致する（図１０−Ｂ）。
【０１２７】
４．Ｄ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼの特性表示
４．Ｄ．１ リボフラビンシンテターゼのアミノ末端端部の配列決定
真核生物の生物体中では、ポリペプチドへのｍＲＮＡの有効な翻訳の後、しばしば成熟ポリペプチド製造のためあとでの修飾が必要である。Ｒｉｂ５−タンパク質がそのアミノ末端端部に何らかの変化を有するか否かを確認するためおよび本発明により提案された出発コドン（ＯＲＦ中の相中の最初のＡＴＧ）が実際にＲｉｂ５−タンパク質に使用された出発コドン（ＯＲＦ中の相中の最初のＡＴＧ）と一致することを立証するために、Ｒｉｂ５−タンパク質のアミノ末端端部を配列決定した。例４Ｃによる方法に従いイオン交換クロマトグラフィーによって精製したＲｉｂ５−タンパク質５μｇを、アクリルアミド１４％を含有するゲル中で変性条件下での電気泳動にかけ、マツダイラの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１００３５，１９８７年）に従いジフルオロポリビニリデン膜ＰＶＤＦ（Ｉｎｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上へ移した。
【０１２８】
移した後、膜を２０％エタノールで濡らし、Ｒｉｂ５−タンパク質に一致する、照射により可視的になったバンドを切取り、アプライド・バイオシステムズ社のＭｏｄｅｌ ４７０のタンパク質シークエンサー（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（ガス相シークエンサー）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａ，米国）中で配列決定した。最初の８つの分析したアミノ酸基の配列：ＮＨ_２−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−・・・・・−ＣＯＯＨは、クローニング遺伝子のヌクレオチド配列から誘導されたアミノ酸配列と同じであり、これは本発明の範囲内で提案された出発コドン（ＯＲＦ中の相中の最初のＡＴＧ）は適正なものであることおよびＲｉｂ５−タンパク質、リボフラビンシンテターゼはそのアミノ末端端部に変化を有しないことを指摘する。
【０１２９】
４．Ｄ．２ 自然条件下でのリボフラビンシンテターゼの分子量測定
リボフラビンシンテターゼが自然条件下でモノマーの形またはマルチマーの形で存在するか否かを確認するために、Ｒｉｂ５−タンパク質の分子量を自然条件下で測定した。例４Ｃにより精製したＲｉｂ５−タンパク質（０．５μｇ）を４％〜２０％のポリアクリルアミド勾配のゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）中でトリス−グリシン緩衝液（トリス２５ｍＭ，グリシン１５０ｍＭ）中、４℃、２５ｍＡで１２時間、チログロブリン（Ｔｉｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（６６９ｋＤａ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（１４０ｋＤａ）およびウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）からの自然の遺伝標識と一緒に分析した。
【０１３０】
電気泳動の終結後、ゲルを銀で染色し、自然条件下のＲｉｂ５−タンパク質の分子量をアンデルセン（Ａｎｄｅｒｓｅｎ）等（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２０：１９９，１９７１年）により記載された方法に従って評価した。結果（図１１）は、Ｒｉｂ５−タンパク質は非変性条件下では約７２ｋＤａの分子量を有することを示し、これはリボフラビンシンテターゼは自然の状態では３つの同じＲｉｂ５−ポリペプチド−サブユニットからなるマルチマーであることを意味する。この結果は、デービス（Ｄａｖｉｅｓ）およびスターク（Ｓｔａｒｋ）により記載された方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，米国 ６６：６５１，１９７０年）に従いジメチルスベルイミデートの存在における架橋実験によって確認された。
【０１３１】
例５
リボフラビンシンテターゼの製造速度
リボフラビンシンテターゼの製造は、Ｓ．セレビシエの野生型菌株およびリボフラビンシンテターゼに対しコードするＲＩＢ５−遺伝子の種々の修飾体の担体菌株において測定された。野生型菌株Ｘ２１８０−１Ａの定常相における培養のタンパク質抽出物、ＲＩＢ５−遺伝子の完全な欠失の担体、ＡＪ１１３、形質転換細胞ＡＪ５３、ＲＩＢ５−遺伝子を含有するマルチコピープラスミドｐＪＲ２３５の担体、ならびにＡＪ１１２、形質転換細胞ＡＪ５３、遺伝的融合ＰＧＫ−ＲＩＢ５を含有するマルチコピープラスミドｐＪＲ３７６の担体を、例４Ｃによる方法に従ってそのリボフラビンシンテターゼ活量につき分析した。下記に第Ｉ表に記載した結果が得られた。
【０１３２】

第Ｉ表につき、マルチコピープラスミド中のＲＩＢ５−遺伝子の存在は野生型菌株中のリボフラビンシンテターゼ活性の少なくとも２０倍上昇を前提とすると約言することができる。この活性は、強表現プロモーター、たとえばＰＧＫ−遺伝子のプロモーターの使用によってなお付加的に高めることができ、これは菌株ＡＪ１１２が野生型菌株よりも８０倍高いリボフラビンシンテターゼ活性を有することとなる。
【０１３３】
微生物の寄託
Ｅ．コリＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の形質転換細胞は、１９９２年３月１７日にナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ （Ｓｃｈｏｔｔｌａｎｄ，Ｇｒｏｓｓｂｒｉｔａｎｉｅｎ）のＮＣＩＭＢ）にＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０４８０で寄託された。
【０１３４】
配列記録
（１） 一般的情報：
（ｉ） 出願人
（Ａ） 名称 ：ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
（Ｂ） 町名 ：Ｃａｒｌ−Ｂｏｓｃｈ−Ｓｔｒａｓｓｅ ３８
（Ｃ） 都市名：Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ
（Ｅ） 国名 ：Ｂｕｎｄｅｓｒｅｐｕｂｌｉｋ Ｄｅｎｔｓｃｈｌａ
ｎｄ
（Ｆ） 郵便番号：Ｄ−６７００
（Ｇ） 電話 ：０６２１／６０４８５２６
（Ｈ） テレファックス：０６２１／６０４３１２３
（Ｉ） テレックス：１７６２１７５１７０
（ｉｉ） 本願表題：ＤＮＡ化合物およびＳ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコーディングする組換えＤＮＡ−発現ベ
クター
（ｉｉｉ） 配列の数：８
（ｉｖ） コンピュータ読取り可能な形：
（Ａ） データ担体：フロッピィ・ディスク
（Ｂ） コンピュータ：ＩＭＢ ＰＣ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ
（Ｃ） オープンシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ） ソフトウェア：
（２） ＳＥＱに対する情報ＩＤ ＮＯ：１：
（ｉ） 配列特性：
（Ａ） 長さ ：１４３９塩基対
（Ｂ） 種類 ：核酸
（Ｃ） 鎖の形：２本
（Ｄ） トポロジー：線形
（ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム）
（ｉｉｉ） 仮定：なし
（ｉｉｉ） アンチセンス：なし
（ｖｉ） 原出所：
（Ａ） 生物体：サッカロミセス・セレビシエ
（ｉｘ） 特徴：
（Ａ） 名称／符号：ＣＤＳ
（Ｂ） 位置：１． ．７１７
（ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【０１３５】
【表４】

【０１３６】
【表５】

【０１３７】
【表６】

ＧＴＣＡＡＡＣＣＡＡ ＴＴＧＧＴＧＡＧＴＡ ＣＧＴＡＡＣＣＡＴＡ ＧＣＡＣＡ
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対する情報：
（ｉ） 配列特性：
（Ａ） 長さ ：塩基対２８
（Ｂ） 種類 ：核酸
（Ｃ） 鎖の形：１本鎖
（Ｄ） トポロジー：線形
（ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム）
（ｖｉｉ） 直接の出所：
（Ｂ） クローン：プライマーＡ
（ｘｉ） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣ ＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧ ＡＡＴＴＧＡＴＧ
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に対する情報：
（ｉ） 配列特性：
（Ａ） 長さ ：塩基対２０
（Ｂ） 種類 ：核酸
（Ｃ） 鎖の形：１本鎖
（Ｄ） トポロジー：線形
（ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム）
（ｖｉｉ） 直接の出所：
（Ｂ） クローン：プライマーＢ
（ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
ＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧ
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対する情報：
（ｉ） 配列特性：
（Ａ） 長さ ：塩基対２７
（Ｂ） 種類 ：核酸
（Ｃ） 鎖の形：１本鎖
（Ｄ） トポロジー：線形
（ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム）
（ｖｉｉ） 直接の出所：
（Ｂ） クローン：プライマーＣ
（ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：
ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡ ＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣ ＴＧＧＴＡＴＴ
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対する情報：
（ｉ） 配列特性：
（Ａ） 長さ ：塩基対１８
（Ｂ） 種類 ：核酸
（Ｃ） 鎖の形：１本鎖
（Ｄ） トポロジー：線形
（ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム）
（ｖｉｉ） 直接の出所：
（Ｂ） クローン：プライマーＤ
（ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：
ＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴ ＴＡＴＧＡＣＧＡ
（２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対する情報：
（ｉ） 配列特性：
（Ａ） 長さ ：塩基対２０
（Ｂ） 種類 ：核酸
（Ｃ） 鎖の形：１本鎖
（Ｄ） トポロジー：線形
（ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム）
（ｖｉｉ） 直接の出所：
（Ｂ） クローン：プライマーＥ
（ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
ＡＴＡＧＣＡＣＣＡＴ ＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴ
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドＹＥｐ３５２の機能および制限地図。
【図２】遺伝子ＲＩＢ５のサブクローニングを示す図。
【図３】プラスミドｐＪＲ２３５の機能および制限地図。
【図４】プラスミドｐＪＲ２９８の構成を示す図。
【図５】遺伝子置換による遺伝子の破壊を示す図。
【図６】野生菌株および置換菌株で発酵したゲノムＤＮＡのサザンブロッティング図。
【図７】組換えＰＣＲによる遺伝子融合ＰＧＫ−ＲＩＢ５の構成を示す図。
【図８】プラスミドｐＪＲ３７６の機能および制限地図。
【図９】Ｅ．コリ中でのリボフラビンシンテターゼの発現を示すもので、Ａは染色したポリアクリルアミド・ＳＤＳゲル中で誘導または非誘導細胞抽出物の可溶性または不溶性画分の分析を示す図、Ｂは上記抽出物の可溶性または不溶性画分のウエスタンブロッティング図。
【図１０】Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼの精製および特性表示を示し、Ａは全タンパク抽出物からのＦＰＬＣによる分析図、ＢはそのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電子泳動による分析図。
【図１１】天然条件下でのリボフラビンシンテターゼの分子量決定を示す図。
【符号の説明】
図２：
（ａ） プラスミド
（ｂ） ｒｉｂ５−１０−突然変異の相補
図４：
（ａ） Ｎｃｏｌによる消化
（ｂ） クレノウフラグメントでの処理
（ｃ） ＢａｍＨＩによる消化
（ｄ） フラグメントＢａｍＨＩ−ＮｃｏｌＩＫ １．６ｋｂの精製
（ｅ） ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩによる消化
（ｆ） 結合
（ｇ） ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化
（ｈ） ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩによる消化
（ｉ） ＨｉｎｄＩＩＩによる消化
図１０Ａ：
（ａ） 比活性（Ｂ２ ｎモル／ｍｇ）
（ｂ） 画分数
（ｃ） ＮａＣｌ（Ｍ）

Claims (2)

1. （ａ）サッカロミセス・セレビシエからのリボフラビンシンテターゼ活性をコードする、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１のＤＮＡ化合物、または
   （ｂ）上記化合物の遺伝的変異型であり、リボフラビンシンテターゼ活性を表現する配列、
   を有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、宿主細胞中のリボフラビン合成における収率を上昇させる方法。
2. サッカロミセス・セレビシエからのリボフラビンシンテターゼを発現させることのできる発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによるリボフラビンの組換えによる製造法において、好適な発現ベクター中で
   （ａ）リボフラビンシンテターゼ活性をコードする、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ１のＤＮＡ化合物、または
   （ｂ）上記化合物の遺伝的変異型であり、リボフラビンシンテターゼ活性を表現する配列
   をクローニングすることを特徴とする、組換えによるリボフラビンの製造法。

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