JP2001501466A - ロドスポリジウム・トルロイド由来のセファロスポリンエステラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ロドスポリジウム・トルロイド（Rhodospori dium toruloides）由来のセファロスポリンエステラーゼをコード化する核酸、並びに単離セファロスポリンエステラーゼ、発現ベクター、宿主細胞およびセファロスポリンエステラーゼの産出方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ロドスポリジウム・トルロイド由来のセファロスポリンエステラーゼ遺伝子 技術分野 本発明はロドスポリジウム・トルロイド（Rhodosporidium Toruloides）由来 の単離セファロスポリンエステラーゼおよび該エステラーゼをコード化する核酸 に関するものである。背景技術 セファロスポリンエステラーゼとは、下記一般構造式Ｉのセファロスポリンの ３’-アセチル基を加水分解して対応する脱アセチル化合物IIにすることが可能 な酵素に対する一般用語である。 セファロスポリンの化学的脱アセチル化反応は、目的の脱アセチル化合物に加え て副生成物を一般に与える傾向にある極端なｐＨ条件下で行なわれる。酵素的脱 アセチル化反応は、これまで多くの雑誌および特許に記載されている。ピンク酵 母ロドスポリジウム・トルロイドのセファロスポリンＣエステラーゼ活性につい ては、最初にグラクソ研究所でのスミス（Smith）らにより米国特許番号4,533,6 32において報告され、また米国特許番号5,512,454において使用されている。し かしながら、該変換に対して全細胞または粗エキスを使用し、該酵素は精 製および特性決定されていないものであった。 これまで、ロドスポリジウム・トルロイド由来の単離セファロスポリンエステ ラーゼおよび該エステラーゼをコード化する核酸については、知られてはいない 。発明の概要 本発明は、ロドスポリジウムトルロイド由来の単離かつ精製セファロスポリン エステラーゼで、好ましくはSEQ.I.D.NO.:２または４の配列を有するものに関連 する。SEQ.I.D.NO.:２は完全または無傷エステラーゼのアミノ酸配列であり、一 方、SEQ.I.D.NO.:４は無傷のエステラーゼにおける最初の（Ｎ-末端）２８アミ ノ酸を切除した、５５１アミノ酸フラグメントである成熟ペプチドの配列である 。最初の２８アミノ酸の切断は、いくつかの宿主細胞、例えば大腸菌で起こる。 該成熟ペプチドは典型的に、該無傷のエステラーゼよりも酵素活性が高いことを 示す。 本発明はまた、該エステラーゼをコード化する核酸、好ましくはSEQ.I.D.NO: １のｃＤＮＡまたはSEQ.I.D.NO:３のゲノムＤＮＡにも関連する。図面の簡単な説明 図１は、セファロスポリンエステラーゼの至適温度を示す。 図２は、セファロスポリンエステラーゼの熱安定性を示す。 図３は、セファロスポリンエステラーゼの至適ｐＨを示す。 図４は、たんぱく質のＮ-末端（SEQ.I.D.NO:９）、ゲノムＮ-末端の逆転（rev erse）翻訳配列（SEQ.I.D.NO:１０）、該逆転翻訳配列に相補的な反転（inverse ）翻訳配列（SEQ.I.D.NO:１１）およびエステラーゼに対する遺伝子を同定する のに用いた４個のオリゴヌクレオチドプローブ（各プローブ１−４はSEQ.I.D.NO .:５−８に対応）を示す。Ｘは任意。 図５Ａは、本発明のエステラーゼをコード化するｃＤＮＡ配列（SEQ.I.D.NO.: １）および本発明のエステラーゼの対応するアミノ酸配列（SEQ.I.D.NO.:２）を 示す。 図５Ｂは、図５Ａの続きを示す。 図６Ａは、本発明のエステラーゼをコード化するゲノムＤＮＡ配列（SEQ.I.D. NO.:３）および本発明のエステラーゼの対応するアミノ酸配列（SEQ.I.D.NO.:２ ）を示す。 図６Ｂは、図６Ａの続きを示す。 図７は、完全たんぱく質よりも高い酵素的活性を典型的に有する成熟ペプチド の５５１アミノ酸配列（SEQ.I.D.NO.:４）を表す、５７９アミノ酸を含有する本 発明のエステラーゼのアミノ酸配列（SEQ.I.D.NO.:２）を示す。 図８は、本発明の無傷エステラーゼのアミノ酸組成分析を示す。発明の詳細な説明 本発明は、ロドスポリジウム・トルロイド由来のセファロスポリンエステラー ゼの全部もしくは一部をコード化する核酸配列からなる単離核酸分子に関する。 ロドスポリジウム・トルロイドの好ましい菌株は、当該技術分野でよく知られか つ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロック ビル）に寄託され入手可能なATCC 10657であって、米国特許番号4,533,632に記 載されている。該核酸分子はＤＮＡ分子、および該核酸配列はＤＮＡ配列が好ま しい。全ＤＮＡ配列を本明細書中では、式（左から右への配向は５’から３’へ の従来通りの方向である）で表す。本明細書中で使用したヌクレオチド塩基の略 語は、当技術分野における従来通りであり、例えばＴはチミン、Ａはアデニン、 ＣはシトシンおよびＧはグアニン；また、ＸはＡ、Ｔ、ＣもしくはＧ、Ｐｕはプ リン（すなわち、ＧもしくはＡ）およびＰｙはピリミジン（すなわち、Ｔもしく はＧ）である。実質的に、図５および６で示されるヌクレオチド配列の全部もし くは一部を有するＤＮＡ配列；またはこれらのＤＮＡ配列の一つに相補的なＤＮ Ａ配列；またはこれらのＤＮＡ配列の一つに相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイ ズする(hybridizes)ＤＮＡ配列がさらに好ましい。ＤＮＡ配列は厳密な（string ent）条件下でハイブリダイズするのが好ましい。厳密なハイブリダイゼーショ ン条件により、ＤＮＡ配列が相同８０％以上、好ましくは８５％以上、もしくは より好ましくは９０％以上で選別される。厳密な条件下でのＤＮＡスクリーニン グは、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：４０２−４０４（１９８５）に記載の方 法にしたがって実行可能である。本出願に開示したＤＮＡと厳密な条件でハイブ リダイズすることが可能なＤＮＡ配列とは、例えば開示したＤＮＡ配列の対立遺 伝子変異体、ロドスポリジウム・トルロイド中に天然に存在するが、開示したＤ ＮＡ配列に関連するもの、もしくは他のバクテリア源から導かれるものであって よい。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な技法については、マニアティス ，Ｔ．（Maniatis,T.）らによるMolecular Cloning ，a Laboratory Manual,コー ルド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８２）、およびハイメス，Ｂ .Ｄ．（Haymes，B．D.）らによるNucleic Acid Hybridization ，a Practical Ap proach ，ＩＲＬプレス，ワシントンＤＣ（１９８５）に開示されており、これら の文献を本明細書中に盛り込む。セファロスポリンエステラーゼの一部をコード 化するヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）の場合、該ヌクレオチド配列は その長さが少なくとも２０以上のヌクレオチドであることが好ましい。 好ましいＤＮＡフラグメントは、SEQ.ID.NO.:５−８のプローブである。本発 明のセファロスポリンエステラーゼ分子は、必ずしも触媒活性を有することを要 しない。例えば、触媒的に不活性なセファロスポリンエステラーゼもしくはその フラグメントは、たんぱく質に対する抗体を増加するのに有効である。 また、本発明は修飾配列をも包含することが意図される。本発明で用いる、語 句“修飾（modified）”とは、ヌクレオチドもしくはポリペプチド配列を言及す るとき、天然に見られる野生型とは異なるヌクレオチドもしくはポリペプチド配 列を意味する。 本発明のＤＮＡ配列は、当技術分野における通常の知識を有するものによく知 られた様々な方法を用いて得ることが可能である。少なくとも３つの主要方法： (1) ゲノムＤＮＡもしくは該配列を含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から２本 鎖ＤＮＡ配列の単離法； (2) 該ＤＮＡ配列の化学的製造法；および (3) ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による該ＤＮＡ配列の製造法 を択一的に用いることが可能である。 最初のアプローチでは、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリを、セファロスポ リンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列を同定するため にスクリーニングしてもよい。例えば、Ｒ．トルロイドゲノムＤＮＡライブラリ は、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配 列を同定するのにスクリーニングしてもよい。様々な技法がゲノムＤＮＡもしく はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするのに使用され得る。 例えば、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化する標 的ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ内に存在する配列を複製するラベルした１本鎖 ＤＮＡプローブ配列を、１本鎖形態に変成したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの コピーをクローンするのに用いるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法にお いて使用可能である。 ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリはまた、免疫ブロット分析技法を用 いて、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化するゲノム ＤＮＡもしくはｃＤＮＡに対してスクリーニングすることが可能である。 免疫ブロット分析もしくはハイブリダイゼーション技法に適当な典型的なスク リーニング方法の一つでは、通常ベクター中に含まれるゲノムＤＮＡライブラリ もしくはｃＤＮＡライブラリをまず、寒天プレート上に塗り広げ、次いでクロー ンをフィルター膜、例えばニトロセルロース膜に移す。次いで、ＤＮＡプローブ をハイブリダイズするか、あるいはセファロスポリンエステラーゼの全部もしく は一部をコード化するゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含有するこれらのクロー ンを同定するために、該クローンに抗体を結合させることも可能である。 ２番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部 をコード化する本発明のＤＮＡ配列を化学的に製造することが可能である。例え ば、セファロスポリンエステラーゼをコード化するＤＮＡ配列は、ヌクレオチド の正確な直鎖配列を形成できるように、連続してライゲーション可能な（適当な 末端制限部位もしくは相補的末端配列を介して）一連の１００塩基オリゴヌクレ オチドとして製造可能である。 ３番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部 をコード化する本発明のＤＮＡ配列を、ＰＣＲを用いて製造可能である。簡潔に 言えば、長さが少なくとも１５塩基で、標的ＤＮＡ配列の反対鎖にハイブリダイ ズする合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの対（ＰＣＲプライマー）を、標的配列上 の介在領域を酵素的に増幅するのに使用する。鋳型の熱変成、プライマーのアニ ーリングおよびＤＮＡポリメラーゼでのアニーリングしたプライマーの３'−末 端の伸張といったサイクルを繰り返すことにより、ＰＣＲプライマーの５'−末 端により決めたセグメントの増幅が生じる。ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らによるTr ends Genet.５，１８５−１８９（１９８９）を参照。 本発明のＤＮＡ配列は、本発明にしたがって様々な方法に使用可能である。該 ＤＮＡ配列のもっとも顕著な使用としては、セファロスポリンの３’アセチル基 を加水分解するのに有用なセファロスポリンエステラーゼの製造が挙げられる。 しかしながら、それらはまたセファロスポリンエステラーゼに関連したタンパク 質をコード化する他のＤＮＡ配列をハイブリダイゼーションして選別する目的で 、他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのＤＮ Ａプローブとして使用可能である。加えて、セファロスポリンエステラーゼの全 部もしくは一部をコード化する本発明のＤＮＡ配列を、他のｃＤＮＡおよびゲノ ムＤＮＡライブラリをスクリーニングし、かつＲ．トルロイド以外の微生物由来 のセファロスポリンエステラーゼ分子をコード化するＤＮＡ配列をハイブリダイ ゼーションすることで選別するためのＤＮＡプローブとして使用可能である。 セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化する本発明のＤ ＮＡ配列はまた、様々な突然変異体を製造するのに修飾（すなわち、突然変異） 可能である。そういった突然変異体は、変性（すなわち該突然変異体は突然変異 したコドンによるコード化されたアミノ酸配列を変化させる）も、または非変性 （すなわち該突然変異体は突然変異したコドンによるコード化されたアミノ酸配 列を変化させない）にいずれであってもよい。これらの修飾されたＤＮＡ配列は 、例えば、セファロスポリンエステラーゼＤＮＡ配列を突然変異させることによ って製造し、結果、該突然変異に基づき、当該技術分野で公知の様々な方法を用 いて、コード化されたポリペプチド中に一個以上のアミノ酸を欠失、置換、挿入 、反転もしくは追加することが可能となる。例えば、モリナガら（Bio／Technol ．２、６３６-６３９（１９８４））、タイラー（Taylor）ら（Nucl．Acids Res ．１３、８７４９-８７６４（１９８５））およびクンケル（Kunkel）(Proc．Na tl．Acad．Sci．USA、８２、４８２-４９２（１９８５）)により記載された 部位特異的突然変異誘発法を用いることが可能である。加えて、部位特異的突然 変異誘発のためのキットを商業売主から購入可能である。例えば、部位特異的突 然変異誘発のためのキットを、アメルシャム（Amersham）社（アーリントンハイ ト(Arlington Heights)、IL）から購入可能である。加えて、サイヤー（Sayers ）らにより記載（Nucl．Acids Res．１６、７９１-８０２（１９８８）））され た分裂、欠失および切断方法を使用することも可能である。変性および非変性な 突然変異体は両方共に、本発明のポリペプチドを産出もしくは使用する際利点を 有する。例えば、これらの突然変異体は高水準の産出、簡便な精製を許容し、あ るいは更なる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を供する。該修飾ＤＮＡおよびポ リペプチド分子の全ては本発明の技術範囲内である。 本発明は、さらにセファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード 化するＤＮＡ配列からなる発現ベクターに関する。発現ベクターとしては、実質 的に図６もしくは７に示される、ヌクレオチド配列を有する１個のＤＮＡ配列の 全部もしくは一部から成ることが好ましい。セファロスポリンエステラーゼの全 部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列に有効に結合した、１個以上の規則的 なＤＮＡ配列から成ることがより好ましい。本明細書中で用いる際、語句“有効 に結合（operatively linked）”とは、規則的なＤＮＡ配列がセファロスポリン エステラーゼの全部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列の複製および／また は発現を管理（direct）できることを意味する。 本発明における有用な発現ベクターとしては、時にそれらのベクター形態中で 染色体に結合しない、環状二重鎖ＤＮＡループと称される、“プラスミド”の形 態をとる。しかしながら、本発明では同等の機能を果たし、かつ引き続きこれま で該技術分野で公知である、他の形態の発現ベクターをも含めることを意図する 。 本発明において有用な発現ベクターは典型的に、複製起点、ＤＮＡ配列の前部 （すなわち、上流）に位置するプロモーターを、続いて該構造タンパク質の全部 もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列からなる。さらに該構造タンパク質の全 部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列に続いて、末端配列の転写物および残 存ベクターからなる。該発現ベクターはまた、該技術分野で公知の他のＤＮＡ配 列、例えば発現生成物の安定性を供する安定性リーダー配列、発現生成物の分泌 を供する分泌性リーダー配列、構造遺伝子の発現がモジュレート（例えば成長培 地中の栄養素もしくは、他の誘導物質の存在有無による）されるのを許容する配 列、形質転換宿主細胞中で表現型選択を供することが可能な指示配列、プラスミ ドへの有糸分裂安定性を供する動原体といった安定性因子および制限エンドヌク レアーゼによる切断用部位を供する配列を含んでもよい。実際に用いた発現ベク ターの特性は、使用予定の宿主細胞と合わなければいけない。例えば、真菌細胞 システム中でクローニングする際、発現ベクターは真菌細胞のゲノムから単離し たプロモーター（例えば、Ｒ．トルロイド由来のセファロスポリンエステラーゼ プロモーターもしくは、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans ）由来のｔｒｐＣプロモーター）を含有すべきである。特定の発現ベクターは、 真菌宿主の自己複製プラスミドのインビボ産出を促進する真菌の自律複製配列（ autonomously replicating sequence）（ＡＲＳ；例えば、フサリウム・オキシ スポラム（Fusarium Oxysporum）およびサッカロミセス・セレビジアエ（Saccha romyces cerevisiae）由来のＡＲＳ）を含む。本発明の真菌発現ベクターは、真 菌ＡＲＳといった配列を有さず、したがって宿主細胞のプラスミド入り口上の宿 主染色体に組み込まれることが好ましい。そういった組み込みは、遺伝子の安定 性を増大するので好ましい。本発明によって考えられる発現ベクターは、少なく とも大腸菌内の複製および真菌細胞内の組み込み、好ましくは本発明のセファロ スポリンエステラーゼＤＮＡ配列の発現を管理することが可能なものである。大 腸菌の様々な宿主における複製の適当な起点としては、例えばＣｏｌＥ１プラス ミド複製起点が挙げられる。適当なプロモーターとしては、例えばＡ．ニジュラ ンス由来のｔｒｐＣプロモーター、および大腸菌由来のネオ−ｒ遺伝子プロモー ターが挙げられる。適当な末端配列としては、例えばＡ．ニジュランス由来のｔ ｒｐＣターミネーターおよび大腸菌由来のネオ−ｒ遺伝子ターミネーターが挙げ られる。また、発現ベクターとしては選別可能なマーカーをコード化する配列を 含むことが好ましい。選別可能なマーカーとは抗体耐性であることが好ましい。 選別可能なマーカーとして、フレオマイシン（phleomycin）耐性（真菌細胞に対 して）、アムピシリン耐性およびネオマイシン耐性（バクテリア細胞に対して） を、便宜的に用いることができる。これらの物質の全てが当該技術分野 で公知であり、商業的に入手可能である。 所望のコードおよびコントロール配列を含有する適当な発現ベクターは、当該 技術分野で公知である標準組換えＤＮＡ技法を用いて作ることができ、該技法の 多くはサンブルック（Sambrook）らによる、分子クローニング（Molecular Clon ing）：研究所マニュアル（A Laboratory Manual），セカンドエディション，コ ールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）研究所，ニューヨーク（ １９８９）に記載されている。本発明はさらに、セファロスポリンエステラーゼ の全部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列からなる発現ベクターを含有する 宿主細胞に関する。宿主細胞は、実質的に図６もしくは７に示されるヌクレオチ ド配列を有するＤＮＡ配列の全部もしくは一部からなる発現ベクターを含むこと が好ましい。セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化する ＤＮＡ配列の複製および／または発現を管理することができ、かつ上記ＤＮＡ配 列に有効に結合した１個以上の規則的なＤＮＡ配列からなる発現ベクターを含有 する宿主細胞であることがさらに好ましい。加えて、触媒的に活性でないセファ ロスポリンエステラーゼ分子をコードするのに修飾（例えば、分裂、欠失もしく は切断）されたＤＮＡ配列からなる発現ベクターを含有した宿主細胞が挙げられ る。適当な宿主細胞としては、真核宿主細胞および、例えば大腸菌などの原核宿 主細胞の両方が挙げられる。適当な真核宿主細胞としては、例えばＲ．トルロイ ド、セファロスポリウム・アクレモニウムおよびペニシリウム・クリソゲナム細 胞が挙げられる。 発現ベクターを当技術分野で公知の様々な方法により、宿主細胞に導入可能で ある。例えば、発現ベクターとの宿主細胞のトランスフェクションは、ポリエチ レングリコール関与プロトプラスト形質転換法により行なうことができた。しか しながら宿主細胞に発現ベクターを導入する他の方法、例えば、エレクトロポレ ーション、生体分解注入もしくはプロトプラスト融合をも使用可能である。 一度、発現ベクターを適当な宿主細胞に導入すると、該宿主細胞を大量のポリ ペプチドの発現を許容する条件下で培養することも可能であり、ポリペプチド分 子がセファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部からなる場合が好ましい 。 セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列 を含有する発現ベクターからなる宿主細胞を、以下の６つの一般的なアプローチ ：(a)ＤＮＡ-ＤＮＡハイブリダイゼーション；(b)マーカー遺伝子機能の存在の 有無；(c)宿主細胞中のセファロスポリンエステラーゼｍＲＮＡ転写物の産出に より測定される転写レベルの評価；(d)遺伝子生成物の免疫学的な検出；(e)比色 計検出；(f)酵素アッセイ の内の１つ以上の方法により同定可能であり、なかでも酵素アッセイが好ましい 同定方法である。 １番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部 に対するＤＮＡ配列コードの存在を、ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いるこ とでＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する ことが可能である。 ２番目のアプローチでは、組換え発現宿主ベクター系を特定のマーカー遺伝子 機能（例えば、アセトアミドの利用、抗体に対する耐性、殺真菌薬に対する耐性 、ウラシルプロトトロピー等）の存在有無に基づいて同定および選別することが 可能である。マーカー遺伝子は、セファロスポリンエステラーゼ コード配列を 調節するのに用いる同種もしくは異種のプロモーターの調節下、セファロスポリ ンエステラーゼの全部もしくは一部をコード化するするＤＮＡ配列として同種の プラスミド内に存在可能となる。導入もしくは選別に対する応答におけるマーカ ー遺伝子の発現は、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部をコード 化するＤＮＡ配列を運搬する完全な組換え発現ベクターが存在していることを示 す。 ３番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼｍＲＮＡ転写物の産 出をハイブリダイゼーションアッセイにより評価可能である。例えば、ポリアデ ニル化ＲＮＡは、ノーザンブロッティング（Northern blotting）またはＲＮＡ 配列に相補的なプローブを用いたヌクレアーゼ保護アッセイにより単離および分 析可能である。別法として、宿主細胞の全核酸を抽出し、該プローブに対するハ イブリダイゼーションアッセイが可能である。 ４番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部 の発現を免疫学的に、例えばウエスタンブロッティング（Western blotting）に より評価可能である。 ５番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼタンパク質の発現は 相補分析により評価可能である。例えば、本酵素中で欠損していることが公知の 細胞において、培地プレート上で無色の基質p-ニトロフェニルアセテートを、黄 色に着色したp−ニトロフェニレートへ酵素的加水分解することで、セファロス ポリンエステラーゼ活性の発現を検出することが可能である。 ６番目のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの発現を、公知の方 法を用いたセファロスポリンエステラーゼ酵素活性に対するアッセイにより測定 可能である。例えば、本明細書の実施例項に記載のアッセイを使用可能である。 本発明の発現ベクター、プラスミドもしくはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列を、当該 技術分野で公知の様々な方法により決定可能である。例えば、サンガーら（Proc ．Natl．Acad．Sci．USA ７４，５４６３−５４６７（１９７７）に記載）によ るジデオキシ・チェーンターミネーション法、またはマクサム−ギルバート（Ma xam-Gilbert）法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA ７４，５６０−５６４（１９７ ７）に記載）を使用可能である。 当然、全ての発現ベクターおよびＤＮＡ調節配列が本発明のＤＮＡ配列を発現 するのと同じ位十分機能を果たすとは限らないであろう。全宿主細胞が同一の発 現システムを持って同じ位十分機能を果たすとは限らないであろう。しかしなが ら、当業者であれば、本明細書で供するガイダンスを用いて過度の実験をするこ となくかつ本発明の技術的範囲から逸脱することなく、発現ベクター、ＤＮＡ調 節配列および宿主細胞を選別することが可能となる。 本発明はさらに、セファロスポリンエステラーゼを発現することが可能な発現 ベクターを含有する宿主細胞を培養することからなるセファロスポリンエステラ ーゼを産出する方法に関する。 本発明はさらにまた、セファロスポリンエステラーゼの全部もしくは一部から なるポリペプチド分子にも関し、該ポリペプチド分子は好ましくは、実質的に図 ５に示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を有する。ポリペプチド分子がセ ファロスポリンエステラーゼの一部からなる場合、ポリペプチド分子は長さが少 なくとも約１０個のアミノ酸であることが好ましい。 本明細書で同定したアミノ酸残基の全ては、天然のＬ−立体配置である。標準 ポリペプチド命名法、J．Biol．Chem．２４３、３５５７−３５５９（１９６９ ）を遵守する際、アミノ酸残基に対する略号は以下の対応表に示すとおりである 。 対応表 記号 アミノ酸 １-文字表記 ３-文字表記 Ｙ Ｔｙｒ Ｌ−チロシン Ｇ Ｇｌｙ Ｌ−グリシン Ｆ Ｐｈｅ Ｌ−フェニルアラニン Ｍ Ｍｅｔ Ｌ−メチオニン Ａ Ａｌａ Ｌ−アラニン Ｓ Ｓｅｒ Ｌ−セリン Ｉ Ｉｌｅ Ｌ−イソロイシン Ｌ Ｌｅｕ Ｌ−ロイシン Ｔ Ｔｈｒ Ｌ−トレオニン Ｖ Ｖａｌ Ｌ−バリン Ｐ Ｐｒｏ Ｌ−プロリン Ｋ Ｌｙｓ Ｌ−リシン Ｈ Ｈｉｓ Ｌ−ヒスチジン Ｑ Ｇｌｎ Ｌ−グルタミン Ｅ Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸 Ｗ Ｔｒｐ Ｌ−トリプトファン Ｒ Ａｒｇ Ｌ−アルギニン Ｄ Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸 Ｎ Ａｓｎ Ｌ−アスパラギン Ｃ Ｃｙｓ Ｌ−システイン アミノ酸配列の全てを本明細書中、式（ここで、左から右の配向はアミノ末端 からカルボキシ末端への従来の方向）で表す。 本発明のポリペプチドは、合成手段、すなわち当業者に公知の方法によるアミ ノ酸成分からのポリペプチドの化学合成により得ることが可能である。例えば、 Houghtonら（Proc．Natl．Acad．Sci．８２，５１３１−５１３５（１９８５） ）に記載の固相法を使用可能である。該ポリペプチドはセファロスポリンエステ ラーゼの全部もしくは一部をコード化するＤＮＡ配列を発現する原核もしくは真 核宿主細胞中での産出によって、またはセファロスポリンエステラーゼの全部も しくは一部をコード化するＤＮＡ配列コードによりコード化されたｍＲＮＡのイ ンビトロでの翻訳によって、得られることが好ましい。例えば、図６もしくは７ のＤＮＡ配列は、上述の如くＰＣＲを用いて合成され、および適当な発現ベクタ ーに挿入され、順次これを用いて宿主細胞を形質転換することができる。次いで 、組換え宿主細胞を培養し、セファロスポリンエステラーゼを産出することが可 能である。これらの手段によるポリペプチド産出における技法は該技術分野で公 知であり、また本明細書で記載の通りである。 次いで、この方法で産出したポリペプチドを単離、かつ様々なたんぱく質精製 技法を用いてある程度に精製可能である。例えば、イオン交換クロマトグラフイ ー、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラフィ ーといったクロマトグラフィー精製法を使用可能である。 ３'−アセチル基の加水分解反応に加えて、本発明のポリペプチドは他の多種 にわたる方法で使用可能である。例えば、ポリペプチドを公知の方法で、該ポリ ペプチドに結合可能なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を製造す るのに使用可能である。これらの抗体は順次試料、例えば細胞試料中の本発明の ポリペプチドをイムノアッセイ技法、例えばラジオイムノアッセイもしくは酵素 イムノアッセイを用いて検出するのに使用可能である。該抗体はまた、本発明の ポリペプチドを精製およびそれらを様々な源から単離するアフィニティークロマ トグラフィーで使用することも可能である。 本発明のポリペプチドは、決定済みのＤＮＡおよび演繹したアミノ酸配列によ って規定した。遺伝子コードの変性質は、ほとんどのアミノ酸残基および停止シ グナルに対して１個以上のコドンが存在することから生じるものであるが、この 性質に基づいて、図５で示す同一のアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列 を、本発明のポリペプチドの産出に対して使用可能となる。加えて、対立遺伝子 的に多様なこれらのＤＮＡおよびアミノ酸配列が天然に存在し、または当該技術 分野で公知の方法を用いて計画的に導入することが可能であることもわかる。こ れらの多様性は、総配列における１個以上のアミノ酸の差異によって、または前 述の配列における１個以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、反転もしくは付加に よって証明することが可能である。該アミノ酸置換は、残基に内因する、例えば 極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性上の類似点に基づ いて成すことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸 およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としてはリシンおよびア ルギニンが挙げられ；非荷電性極性ヘッド基（head group）もしくは同様の親水 性値を有する非極性ヘッド基としてはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシ ン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラ ニン、チロシンが挙げられる。他に予想される変種としては、上記のポリペプチ ドの塩もしくはエステル、並びに上記のポリペプチドの前駆体、例えばメチオニ ン、使用したＮ−ホルミルメチオニンおよびリーダー配列などのＮ−末端置換基 を有する前駆体が挙げられる。かかる変種のすべては、本発明の技術的範囲内に 含まれる。 以下の実施例はさらに本発明を例示するものである。これらの実施例は本発明 の技術的範囲を限定するものではなく、本発明の一層の理解を供するものである 。以下の実施例においては、数種の作用物質、プラスミド、制限酵素および他の 物質を商業源から手に入れ、供給者による指示にしたがって使用した。精製およ び特性決定やＤＮＡのクローニングなどに使用した操作は、当該技術分野でよく 知られたもの、または文献から脚色可能なものである。実施例１ セファロスポリンエステラーゼの精製 １．１ 微生物の培養 ロドスポリジウム・トルロイド（ＡＴＣＣ １０６５７）シード培養株を、培 地（２％グルコース、１％酵母エキス、１％バクト−ペプトン（Bacto−peptone ）、０.５％ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ６.０、１００ｍｌ）を入れた三角フラスコ(５０ ０ｍｌ)中、２％の凍結保存培養の接種から開始した。シードフラスコ を２４時間、２８℃および２５０ｒｐｍで培養し；２％接種物量を増殖段階（pr oduction stage）での発酵を開始するのに使用した。増殖段階での培地は、８％ コーン浸し液(steep liquor)、１％ＫＨ₂ＰＯ₄、３％グルコース、ｐＨ６.２か らなる。該培地を２時間オートクレーブに入れた。これにより、通常のオートク レーブ時間(３０分)と比べて、力価が増加した。発酵槽のブイヨンを高い通気性 を保ちながら、３もしくは４日間、１６〜２１℃で培養した。ブイヨン全体の特 異的活性は、典型的に２０〜３７ＩＵ／ｍｌの範囲内であった。１．２ ロドスポリジウム・トルロイドからの酵素の精製 エステラーゼをロドスポリジウム・トルロイド細胞から、発酵槽ブイヨンをＥ ＤＴＡ(１００ｍＭ、ｐＨ４.０)で８時間処理することによって遊離させた。酵 素活性の約５０％をこの様式で細胞から遊離させることができた。該ブイヨンを 細胞とコーン浸し固体を除去するために５０００ｇ遠心分離した。上澄み液を、 分子量３０,０００のカット−オフ能を有する超粒子中空ファイバーカートリッ ジを通して限外ろ過し、もとの容量の１０％とした。該酵素に脱イオン水を加え て、もとの容量にもどした。２Ｍ水酸化アンモニウムを加えることでｐＨを７. ０とし、また該酵素溶液にトリスアクリルＤＥＡＥ（１００ｇ樹脂／５０ｍｌ酵 素溶液）を加え、カリウムホスフェイト緩衝溶液（５０ｍＭ、７.０）で洗浄し た。該酵素はＤＥＡＥに結合せず、ろ液中に得られ、次いでこのろ液を１.０Ｍ 酢酸を用いてｐＨ４.５とした。次いで溶液をカルボメチルセファロースカラム （１８×３ｃｍ）上部に置き、酢酸アンモニウム(５０ｍＭ、ｐＨ４.５）で、２ ８０ｎｍでの吸光度が０.１以下（約４倍のカラム容量）になるまで洗浄した。 エステラーゼを酢酸アンモニウム（直線勾配５０〜５００ｍＭ、ｐＨ６.５、流 速１.０ｍｌ／分）で溶出した。フラクション(７.０ｍｌ)を集め、該エステラー ゼ含有フラクションをプールし、分子量５０,０００でのカットオフ能を有する セントリコン（Centricon）で濃縮した。 実施例２ セファロスポリンエステラーゼの特性決定 ２.１ 酵素の特異的活性 セファロスポリン（２５−４００ｍＭ）のカリウム塩、カリウムホスフェイト (１００ｍＭ、ｐＨ６.５）を含有した反応混合物に酵素を加え、最終容量を０. ５ｍｌとした。該混合物を３０℃で（特に記載がない場合）インキュベートし、 ５０％アセトニトリル(２.０ｍｌ)を加えて、反応を停止した。反応はＨＰＬＣ （５ミクロンＣ１８カラム、５０×４ｍｍ；移動相２５ｍＭオクタンスルホン酸 、０.１％リン酸、１２％メタノール；ｐＨ２.５；２５４ｎｍ）で追跡した。タ ンパク質を、標準溶液としてウシ型血清アルブミンを用いた、バイオ−ラッドタ ンパク質アッセイキット(Bio-Rad Co.，USA)によりアッセイした。該酵素はセフ ァロスポリンＣとのミカエリス−メンテン速度論を示した。二重逆数プロットか ら、セファロスポリンＣの加水分解反応に対するＫ_mはＶ_maxが７７.０μモル／ 分／ｍｇに相当する５１.８ｍＭであることが分かった。セファロスポリンＣの １.０％溶液は３０℃、３０分内で加水分解反応が完結し、ＨＰＬＣ分析により 全く副生物は観察されなかった。２．２ 基質のファイル エステラーゼ活性について、p-ニトロフェニルエステル基質をセファロスポリ ン誘導体と併せて用いて測定した。該酵素を３０℃（特に記載のない場合）で、 p-ニトロフェニルアセテート／カリウムホスフェイト緩衝溶液（ｐＨ６.５）（ １０.０ｍＭ／１００ｍＭ）または、炭素鎖がＣ：２〜Ｃ：１８の範囲のp-ニト ロフェニルエステル／カリウムホスフェイト緩衝溶液（ｐＨ６.５）＋２％アセ トニトリル（１０.０ｍＭ／１００ｍＭ）を用いてインキュベートした。酵素活 性を、p-ニトロフェニレートイオンの形成による４０５ｎｍでの吸光度の増加を 測定することによって分光光学的に追跡した。セファロスポリン誘導体のアッセ イを実施例２．１に記載する。該結果を、p-ニトロフェニルエステル基質に関し ては表１に記載し、セファロスポリン誘導体に関しては表２に記載する。 表１．エステラーゼ活性におけるエステル鎖長の増大による影響 表２：セフェム基質に対するエステラーゼ活性の相対速度 ２．３ 温度の影響 Ａ．至適温度 酵素をｐ−ニトロフェニルアセテート（１０.０ｍＭ）／カリウムホスフェイ ト緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６.５）でインキュベートした。反応混合物をシエ イクした（３００ｒｐｍ）水浴中、温度（１０〜６５℃）で１０分間インキュベ ートした。該反応の至適温度は２５℃であった。結果を図１に示す。 Ｂ．熱安定性 酵素を、実施例２.３Ａに記載したｐ−ニトロフェニルアセテートでインキュ ベートした。酵素を様々な温度で１５分間インキュベートし、次いですぐに氷上 に置いた。該酵素は、温度が約２５℃でインキュベートした場合不安定であり、 ３０〜４５℃間で急激に失活した。結果を図２に示す。２．４ pH の影響 酵素を、実施例２.３Ａに記載したp-ニトロフェニルアセテートでインキュベ ートした。トリス−マレイン酸万能緩衝液（１００ｍＭ）をｐＨ４〜８の範囲で 使用した。該エステラーゼはｐＨ４．５〜７の範囲で活性であり、またp-ニトロ フェニルアセテートとセファロスポリンＣとを用いたときｐＨ６.０で至適活性 を示すことが分かった。p-ニトロフェニルアセテートとの結果を図３に示す。２．５ 様々な酵素モデュレーターの影響 酵素を試薬（１０ｍＭ）の存在下、１５分間、２５℃でインキュベートした。 次いで、反応混合物をアッセイ混合液に１００倍に希釈し、p-ニトロフェニルア セテートと共にアッセイした。結果を表３にまとめた。結果より、ロドスポリジ ウム酵素に対するセリン活性部位の存在が強く示唆される。フッ化フェニルメチ ルスルホニル（ＰＭＳＦ）、３,４−ジクロロイソクマリン（ＤＣｌ）およびジ メチルホスファイト全て、該酵素を阻害した。ヒスチジン−修飾作用物質である ジエチルピロカルボネートは特に、該酵素を失活した。β−メルカプトメタノー ルおよびジチオスレイトールを用いた場合わずかな活性化が観察されたが、スル フヒドリル作用物質であるヨードアセトアミドおよびＮ−エチルマレイミドは、 該酵素の活性においてはほとんどまたは全く影響がなかった。また、ＥＤＴＡを 用いた場合わずかな阻害性が観察されたが、金属イオンの存在有無による影響は ほとんどまたは全くなかった。２.６ 等電点（ｐｌ）の決定 等電電気泳動ゲルを、パーマシアバイオテック（Pharmacia Biotech、スウェ ーデン）により開発されたアンホリン(Ampholine)ＰＡＧプレートを用いてｐＨ ３〜４の範囲で行なった。ｐＩはまた、広範囲にわたる（ｐＨ３〜９）両性電解 質混合物を用いて、ライニン（Rainin Co.、USA）会社によって開発されたＭｉ ｎｐＨｏｒシステムを用いて決定した。該タンパク質の等電点を約５.６と決定 した。２.７ 分子量の決定 分子量をゲル浸透クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動により決定した。Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（勾配８〜２５％）を、ラエムリ（Laemmli）の方法（ラエ ムリ、U.K.１９７０.による、Cleavage of structural proteins during the as sembly of the head of bacteriophage T4．Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）２２７： ６８０-６８５）にしたがって行なった。たんぱく質はクーマシーブリリアント ブルー（Coomassie brilliant blue）で染色した。ゲル浸透クロマトグラフイー を、ＨＰＬＣ(トーソーハース（Toso Haas）ＴＳＫ−ＧｅＬ ＧＳ３０００ＳＷ ＸＬカラム、７５×３００ｍｍ；移動相カリウムホスフェイト（２００ｍＭ、ｐ Ｈ６.８）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）により行なった。バイオ−ラッドゲ ルろ過標準混合物（ＭＷ ６７０,０００−１,３５０）を指示薬として用いた。 流速を１.０ｍｌ／分とし、溶出液を２８０ｎｍで追跡した。フラクションを集 め、エステラーゼ活性をアッセイした。８０,０００ドルトン（Ｄａ）でのシン グルバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察し；酵素のゲルろ過クロマトグラフィーを 行なったところ、該酵素が天然の状態でモノマーであることが示された。２.８ 酵素のカルボハイドレート成分の決定 カルボハイドレートの除去を、組換えペプチドＮ−グリコシダーゼにより行な う場合はエルダー（Elder）らによる記載の通りに行ない、エンドグリコシダー ゼＨにより行なう場合はトリンブル（Trimble）らによる記載の通りに行なった 。次いで、天然および脱グリコシル化酵素を実施例２.７に記載のＳＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析し、カルボハイドレートの損失率を決定した。酵素をエンドグリ コシダーゼにより処理したところ、分子量の減少（１５〜２０％）を生じており 、約６２,０００ダルトンであった。２.９ Ｎ−末端アミノ酸配列の決定 アミノ酸末端配列は、コーネル大学のバイオテクノロジー分析施設（Cornell University Biotechnology Analytical Facility）での自動エドマン分解により 決定した。純粋な酵素から得られたアミノ酸末端配列は、H₂N-Thr-Asn-Pro-Asn- Glu-Pro-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Gly-Tyr-Alaであった。３.０ Ｒ．トルロイドの染色体ＤＮＡの製造 シード培地培養株を、ロドスポリジウム・トルロイド（ＡＴＣＣ １０６５７ ）の凍結培養で４％接種した。該培養株を２％グルコース、１％酵母エキス、１ ％バクト−ペプトン、０.５％ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ６.０下、２８℃で２４時間成長 させた。細胞を遠心分離により集菌し、緩衝液（１Ｍソルビトール、５０ｍＭク エン酸ナトリウム、ｐＨ５.４含有）で一度洗浄した。細胞を再度遠心分離し、 ０.５％溶解酵素（シグマ社、ＵＳＡ）含有緩衝液中に３７℃で３時間再度懸濁 した。スフェロプラストを遠心分離により集め、ＮａＣｌ(１００ｍＭ)、トリス ＨＣｌ(１０ｍＭ、ｐＨ８.０)、ＥＤＴＡ(２５ｍＭ)、０.１％ＳＤＳおよびプロ テイナーゼＫ(１００μｇ／ｍｌ)中消化した。該溶液を５０℃で、１６時間イン キュベートした。混合物を２回、１回目はフェノール：クロロホルム：イソアミ ルアルコール（２４：２４：１）で、２回目はクロロホルム：イソアミルアルコ ール（２４：１）で抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈降させた(７０％)。該ＤＮ Ａを遠心分離で回収し、７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットを ＴＥ(１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ)およびＲＮアー ゼ(１００μｇ／ｍｌ)に溶解し、３７℃で１６時間インキュベートした。有機抽 出およびエタノール沈殿を繰り返し、ＤＮＡをＴＥに溶解した。ＤＮＡ濃度を分 光光度的に決定した。３.１ Ｒ．トルロイドのゲノムＤＮＡライブラリの構成 Ｎ−末端アミノ酸配列（２.９項）から、４つの１７-マー（mer）オリゴヌク レオチドプローブを製造し（図４）、[γ−３２Ｐ］ＡＴＰで終末（end）ラベル し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１およびＰｓｔ１で消化したＲ．トルロイ ド染色体ＤＮＡのサザンブロットをプローブするのに用いた。ハイブリダイゼー ションをＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム、シグマ化学社）緩衝液中、 ４６．８℃で４８時間コンダクトした。３ｋｂ ＢａｍＨ１フラグメントをプロ ーブの一つにハイブリダイズした。３ｋｂ ＢａｍＨ１フラグメントを単離し、 ｐブルースクリプトＫＳ(pBluescript)+ＢａｍＨ１で切断したファージミドベク ター（ストラタジェーン、USA）にライゲーションし、バクテリア性アルカリホ スホターゼで処理した。該ライゲーション混合物は、エレクトロポレーション( ２.５キロボルト、２００オーム、２５μＦｄ)により大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞 に形質転換するのに用いた。該形質転換体はアンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)を 含有するＬＢ寒天上で選別した。３.２ セファロスポリンエステラーゼ遺伝子を含有したクローンの選別 ゲノムライブラリのコロニーブロットを作り、Ｎ−末端オリゴヌクレオチドプ ローブを用いてスクリーニングした。まず、１２個のクローンをさらに評価する ために選別した。プラスミドＤＮＡをＴＥＬＴミニプレップ方法（Ｈｅらによる 、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８：１６６０（１９９０））を用いて各形 質転換体から単離した。これらのクローンのサザンブロット分析をプローブにハ イブリダイズした二つについて同定した。近傍ＤＮＡ配列の翻訳により、Ｎ−末 端たんぱく質配列に同一であるアミノ酸配列を産出する。さらに、プライマー伸 張による３ｋｂ ＢａｍＨ１フラグメントの分析およびサザンブロットにより、 該フ ラグメント中のエスタラーゼ遺伝子の位置および配向を決定した。３.３ ｃＤＮＡクローニング ｃＤＮＡクローンを、３'ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡエンドの急激な増幅（rapid amp lification of cDNA ends）、ＢＲＬ社、ＵＳＡ）により産出した。Ｒ．トルロ イド由来の総ＲＮＡをトリゾール試薬（ＢＲＬ社、ＵＳＡ）を用いて単離し、さ らに塩化リチウム製剤を用いて精製した。一番目のｃＤＮＡ鎖をアダプタープラ イマーから逆転写することにより製造した。該ＲＮＡ鋳型を、ＲＮアーゼＨを用 いて消化し、ｃＤＮＡを遺伝子−特異的プライマーおよびアダプタープライマー を用いてＰＣＲにより増幅した。コード領域を増幅し、また内部遺伝子−特異的 プライマーを用いたＰＣＲの２ラウンド目によって突然変異を起こしたが、該プ ライマーは推定上の翻訳出発部位および、該翻訳出発部位に制限ベクター内に連 続クローニングするためのＮｃｏ１制限部位を含有していた。この突然変異によ り、精製されたゲルである１.９ｋｂフラグメントを産出した。本フラグメント の制限分析およびヌクレオチドのシークエンシングによって、エステラーゼ遺伝 子を含んでいることを確認した。制限ベクターへのクローニングをさらに促進す るために、成熟したペプチドの開始部分にはＢｓｐＨ１部位を、該遺伝子の３- 終末にはＢａｍＨ１部位を含むよう別のｃＤＮＡクローンを伸長させた。３.４ ヌクレオチド配列の決定 ヌクレオチド配列を、ＴａｑトラックフェントモルＤＮＡシークエンシングシ ステムを用いたジデオキシチェーンターミネーター法（サンガーらによる、１９ ７７ Proc．Natl．Acad．Sci．USA ７４:５４６３−５４６７）により決定した 。Ｔ３、Ｔ７および合成開始プライマーを両鎖由来の完全な遺伝子を配列決定す るのに用いた。電気泳動を、ＴＢＥ緩衝液中に７Ｍウレアを含有した７％広範（ Long Ranger；バイオケミストリー社、ＵＳＡ）ポリアクリルアミドゲル上２７ ００ボルトで行なった。完全ヌクレオチド配列を図５に示す。コードｃＤＮＡ領 域は、長さ１７１６ｂｐであり、また分子量６１.３ｋＤの５７２アミノ酸たん ぱく質のコードであった。このことは該酵素の脱グリコシレート体と一致する（ ２. ８項）。ＤＮＡ配列から決定したＮ−末端たんぱく質配列は、２.９項で同定し たタンパク質配列と同一であった。本配列は推定ＡＴＧ翻訳出発部位から始まる ２８残基である。ｃＤＮＡクローンをまた、ゲノムクローンと対比して配列決定 した。該遺伝子は、また図７に同定する５個のイントロンを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アッシャー，ジョン・ジェイ アメリカ合衆国13066ニューヨーク州イー スト・シラキュース、サマーヘイブン・ド ライブ486番 (72)発明者 バーネット，ウィリアム・ブイ アメリカ合衆国13066ニューヨーク州フェ イエットビル、リンドン・ロード49番 (72)発明者 ロマンシック，グナ アメリカ合衆国13078ニューヨーク州ジェ イムズビル、サンダーヘッド・レイン6103 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２もしくは４に対する配列コードを有する単離核酸 分子。 ２．アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２もしくは４に対する核酸配列コードに相補的な配 列を有する単離核酸分子。 ３．アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２もしくは４に対する核酸配列コードに相補的な配 列を有する核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な配列を有する単離核 酸分子。 ４．ＤＮＡ分子である請求項１に記載の核酸分子。 ５．ＤＮＡ分子である請求項２に記載の核酸分子。 ６．ＤＮＡ分子である請求項３に記載の核酸分子。 ７．ヌクレオチド配列SEQ.ID.NO:１を有する単離ＤＮＡ分子。 ８．ヌクレオチド配列SEQ.ID.NO:３を有する単離ＤＮＡ分子。 ９．ヌクレオチド配列SEQ.ID.NO:５を有する単離ＤＮＡ分子。 １０．ヌクレオチド配列SEQ.ID.NO:６を有する単離ＤＮＡ分子。 １１．ヌクレオチド配列SEQ.ID.NO:７を有する単離ＤＮＡ分子。 １２．ヌクレオチド配列SEQ.ID.NO:８を有する単離ＤＮＡ分子。 １３．アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２を有する単離ポリペプチド。 １４．アミノ酸配列SEQ.ID.NO:４を有する単離ポリペプチド。 １５．a. アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２もしくは４に対する配列コードを有する核 酸分子； b. アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２もしくは４に対する配列コードを有する核 酸分子に相補的な配列を有する核酸分子；または c. アミノ酸配列SEQ.ID.NO:２もしくは４に対する配列コードを有する核 酸分子に相補的な配列を有する核酸分子に、厳密な条件下でハイブリダイズ可能 な配列を有する核酸分子 から成る発現ベクター。 １６．さらに、複製起点、プロモーターおよび転写ターミネーション配列を包含 する請求項１５に記載の発現ベクター。 １７．さらに、選別可能なマーカー配列を包含する請求項１６に記載の発現ベク ター。 １８．真菌染色体中に組み込むことが可能な請求項１６に記載の発現ベクター。 １９．ＤＮＡ配列SEQ.ID.NO:１もしくは３を有する請求項１５に記載の発現ベク ター。 ２０．プラスミドである請求項１５に記載の発現ベクター。 ２１．請求項１５に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。 ２２．請求項１８に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。 ２３．請求項１９に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。 ２４．真核である、請求項２１に記載の宿主細胞。 ２５．真核である、請求項２２に記載の宿主細胞。 ２６．セファロスポリンエステラーゼ活性を有するポリペプチドを産出する方法 であって、ポリペプチドの発現を起こす条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を 培養することから成る方法。 ２７．大腸菌、ロドスポリジウム・トルロイド、セファロスポリン・アクレモニ ウムおよびペニシリウム・クリソゲナムの各種からなる群から選ばれる請求項２ １に記載の宿主細胞。 ２８．セファロスポリン・アクレモニウム種である請求項２１に記載の宿主細胞 。