JP2003250586A - 新規タンパク質分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規タンパク質分解酵素及びそれをコードす
るDNA、及び該タンパク質分解酵素の製造方法を提供す
ることを課題とする。 【解決手段】 本発明者らは、麹菌の一種であるアスペ
ルギルス・オリゼのRIB40株の染色体ゲノムを解析する
ことに成功した。更に、本発明者らは、解析した染色体
ゲノムのDNA配列の中から新規タンパク質分解酵素をコ
ードする遺伝子を単離し、該遺伝子を宿主で発現させ、
発現されたタンパク質がタンパク質分解活性を有するこ
とを確認し、この新規タンパク質分解酵素をNPIIIと命
名し、本発明を完成させた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規タンパク質分
解酵素NPIII及びそれをコードするDNA、及びNPIIIの製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糸状菌の中でも、特にアスペルギルス・
オリゼ（Aspergillus oryzae）等を含む麹菌は、清酒、
みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国におけ
る醸造産業において古くから利用され、直接に食されて
きた菌類であり、米国のFDA（食品医薬局）によりGRAS
（Generally Recognized as Safe）にリストアップされ
ている安全な遺伝子及び酵素源である。

【０００３】従って、微生物由来の遺伝子及び酵素を食
品などに利用する際に必要な慢性毒性検査等の安全審査
において、微生物由来の遺伝子及び酵素の場合には約10
億円要するのに対して、上記のGRASグレードである遺伝
子及び酵素の場合にはその約3分の1程度の経費で済む
し、更に、該審査に要する時間もより短いというメリッ
トがある。

【０００４】このように、糸状菌、特に麹菌は、安全性
及び経済性の点から極めて利用価値の高い遺伝子及び酵
素の宝庫と言える。

【０００５】一方、様々な産業分野において盛んに利用
されている酵素の１つとしてタンパク質分解酵素があ
る。糸状菌、特に麹菌由来のタンパク質分解酵素につい
ても様々なものが知られている。例えば、麹菌由来のタ
ンパク質分解酵素として、アスペルギルス・オリゼ由来
のアルカリプロテアーゼ（特許文献１）、ロイシンアミ
ノペプチダーゼ（特許文献２）、アスペルギルス・ニガ
ー由来のカルボキシルペプチダーゼ（特許文献３）など
を挙げることができる。

【０００６】尚、本出願の発明に関連する先行技術文献
情報を以下に示す。

【特許文献１】 特許2901387号

【特許文献２】 特開平11-346777

【特許文献３】 特許3236862号

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、麹菌の
ゲノムDNA情報を利用して産業上利用価値の高い遺伝子
を単離することにある。より詳細には、新規タンパク質
分解酵素NPIII及びそれをコードするDNA、及びNPIIIの
製造方法を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】麹菌のゲノムDNA情報を
明らかにし、それにコードされる遺伝子等の機能を明ら
かにすることによって、バイオテクノロジーを利用した
物質生産等のような、食品産業において安全な遺伝子資
源の有効な活用法を提供するとともに、農薬及び医薬分
野における各種遺伝子スクリーニングの為の有用な情報
を提供することが出来る。更に、麹菌のゲノムDNA情報
を明らかにし、それにコードされる遺伝子等の機能を明
らかにすることは、近縁種であるアスペルギルス・フラ
バス(Aspergillus flavus) 、アスペルギルス・フミガ
タス(Aspergillus fumigatus)等のように穀物汚染菌、
ヒト感染菌のゲノム情報を解析する有用なツールともな
り得るものである。

【０００９】本発明者らは、麹菌の一種であるアスペル
ギルス・オリゼのRIB40株の染色体ゲノムを解析するこ
とに成功した。更に、本発明者らは、解析した染色体ゲ
ノムのDNA配列の中から新規タンパク質分解酵素をコー
ドする遺伝子を単離し、該遺伝子を宿主で発現させ、発
現されたタンパク質がタンパク質分解活性を有すること
を確認し、この新規タンパク質分解酵素をNPIIIと命名
し、本発明を完成させた。

【００１０】すなわち、本発明者らは、アスペルギルス
・オリゼのゲノムの塩基配列とゲノムの塩基配列から予
想されたcds（cording sequence）にコードされている
タンパク質のアミノ配列に対してBlastによる相同性検
索を行った結果、それらの配列の中から公知のアスペル
ギルス属のメタロプロテアーゼと相同性を有し、新規タ
ンパク質分解酵素であると推定されるタンパク質、及
び、その遺伝子配列を発見した。そこで、ゲノム配列や
予想されたcDNAの塩基配列を参考に設計したプライマー
を用いて、アスペルギルス・オリゼの染色体DNAを鋳型
としたPCRを行い、アスペルギルス・オリゼの染色体DNA
に含まれる該遺伝子の全塩基配列を増幅し、次いで、該
遺伝子の全塩基配列を決定した。更に、RT-PCRによっ
て、該遺伝子のcDNAを増幅し、その塩基配列を決定し
た。

【００１１】次いで、本発明者らは、本発明のタンパク
質分解酵素遺伝子を強発現させることにより本発明の新
規タンパク質がタンパク質分解活性を有することを確認
した。強発現株の作製は、アスペルギルス・オリゼのα
-アミラーゼ遺伝子のプロモーター（以下、TAAプロモー
ター）の下流に本発明の遺伝子のcDNAを連結したプラス
ミドを構築し、そのプラスミドをアスペルギルス・オリ
ゼに導入することにより行った。次いで、本発明者ら
は、本発明の遺伝子のcDNAの強発現株と本発明の遺伝子
を強発現しない株（コントロール株）を様々な培地で培
養し、アルカリ性タンパク質分解酵素阻害剤存在下でタ
ンパク質分解活性を測定した。その結果、強発現株のタ
ンパク質分解活性値は、コントロール株のタンパク質分
解活性と比較して3倍上昇していた。

【００１２】本発明らは、この結果から、本発明の新規
タンパク質分解酵素NPIIIがタンパク質分解活性を有す
ることを確認し、本発明を完成させた。

【００１３】即ち、本発明は、NPIII及びそれをコード
するDNA、及びNPIIIの製造方法に関し、以下の〔１〕〜
〔７〕を提供するものである。 〔１〕 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のタンパ
ク質分解活性を有するタンパク質をコードするDNA。 （ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード
領域を含むDNA。 （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／ま
たは付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
するDNA。 （ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列を含むDN
Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDN
A。 〔２〕 〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパ
ク質。 〔３〕 〔１〕に記載のDNAが挿入されたベクター。 〔４〕 〔１〕に記載のDNAまたは〔３〕に記載のベク
ターを保持する形質転換細胞。 〔５〕 〔４〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質
転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質
を回収する工程を含む、〔２〕に記載のタンパク質の製
造方法。 〔６〕 〔２〕に記載のタンパク質に結合する抗体。 〔７〕 〔１〕に記載のDNAまたはその相補鎖に相補的
な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチ
ド。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明者らは、麹菌の一種である
アスペルギルス・オリゼのRIB40株から新規タンパク質
分解酵素NPIIIをコードする遺伝子を単離した。さら
に、該遺伝子を宿主で発現させ、発現されたタンパク質
がタンパク質分解活性を有することを確認し、本発明を
完成させた。アスペルギルス・オリゼのRIB40株由来のN
PIIIをコードするゲノムDNA配列を配列番号：１に、cDN
Aの塩基配列を配列番号：２に、該cDNAによりコードさ
れるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。

【００１５】配列番号：３に例示する本発明のタンパク
質NPIIIのアミノ酸配列において、426〜435残基（Ile V
al Ile His Glu Tyr Thr His Gly Leu）に亜鉛結合領域
（アミノ酸配列を一文字表記した場合: [GSTALIVN]-x
(2)-H-E-[LIVMFYW]-{DEHRKP}-H-x-[LIVMFYWGSPQ]）が存
在している。亜鉛結合領域はメタロプロテアーゼを特徴
づける配列として知られている。また、配列番号：３の
1〜18残基の領域（Met His Met Leu Leu Phe Ile Gly A
la Leu Ala Leu Pro Val Phe Val Cys Thr）は、その構
造からシグナルペプチドであると推定される。したがっ
て、本発明のタンパク質NPIIIは菌体外に分泌され、機
能していると考えられる。

【００１６】本発明は、上記知見に基づき、タンパク質
分解活性を有するNPIIIタンパク質をコードするDNAを提
供する。本発明の新規タンパク質NPIIIは、タンパク質
分解活性を有するため、タンパク質分解酵素が利用され
ている様々な産業分野で産業用酵素などとして利用可能
である。本発明のDNAを使用することで、該NPIIIを大量
に製造することができる。また、本発明のDNAは、米国
のFDA（食品医薬局）によりGRASグレードの微生物に由
来するものであるので、安全性及び経済性の点から極め
て利用価値の高いものである。また、本発明のDNAは、G
RASグレードの糸状菌DNAの増幅用プライマー及びGRASグ
レードの糸状菌DNA検出用プローブとしての機能を有す
るものである。

【００１７】本発明のDNAとしては、配列番号：１また
は２に記載の塩基配列のコード領域を含むDNAが例示で
きる。

【００１８】また、本発明のDNAとしては、配列番号：
３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同
等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。ここで
「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、NPII
Iと同等の生物学的機能、生化学的機能（生化学的活
性）を有することを指す。生化学的機能としては、好ま
しくはタンパク質分解活性が挙げられるが、これに限定
されるものではない。

【００１９】配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む
タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDN
Aには、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を
含むタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモロ
グ等をコードするDNA、配列番号：３に記載のアミノ酸
配列を含むタンパク質の変異体、アレル、バリアント、
ホモログ等であって、亜鉛結合領域やシグナルペプチド
を有するタンパク質をコードするDNA、配列番号：３に
記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、アレ
ル、バリアント、ホモログ等であって、分泌型のタンパ
ク質分解酵素をコードするDNAが含まれる。

【００２０】あるタンパク質と機能的に同等なタンパク
質をコードするDNAを調製する当業者によく知られた他
の方法としては、ハイブリダイゼーション技術を利用す
る方法が挙げられる。例えば、カレント・プロトコール
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current prot
ocols in molecular biology（edited by FrederickM.
Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公
知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうこと
ができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、
添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことがで
きる。

【００２１】本発明のDNAには、NPIIIをコードするDNA
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、NPII
Iと機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが含まれ
る。このようなDNAとしては、例えば、動物、植物、微
生物由来のホモログが挙げられるが、好適には、糸状菌
に由来するものである。糸状菌の例として、アスペルギ
ルス(Aspergillus)属、ペニシリウム (Penicillium)
属、フミコーラ (Humicola) 属、トリコデルマ (Tricho
derma)属、ムコール (Mucor) 属、又は、フザリウム (F
usarium) 属のいずれかに属する微生物を挙げることが
出来るが、好ましくはアスペルギルス属に属する微生物
に由来するものである。

【００２２】アスペルギルス属に属する微生物として
は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae)、
アスペルギルス・フミガタス (Aspergillus fumigatu
s)、アスペルギルス・フラバス (Aspergillus flavu
s)、アスペルギルス・ソーヤ (Aspergillus sojae) 、
アスペルギルス・パラシティクス (Aspergillus paraci
ticus)、アスペルギルス・ノミウス (Aspergillus nomi
us)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ア
スペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamoi) 、アス
ペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペル
ギルス・ニドランス (Aspergillus nidulans 又は Emer
icella nidulans)を挙げることが出来る。その中でも、
特に、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソー
ヤ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス
・フラバス、アスペルギルス・ノミウスのいずれかに由
来するものが好ましい。

【００２３】NPIIIと機能的に同等なタンパク質をコー
ドするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの
条件は、当業者であれば適宜選択することができる。本
明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、
各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で
約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約
95％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間
のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件
を意味する。具体的には、例えば、温度60℃〜68℃にお
いて、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900
mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。
但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに
影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考
えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択すること
で同様のストリンジェンシーを実現することが可能であ
る。

【００２４】また、NPIIIをコードするDNA（配列番号：
１または２）の配列情報を基に合成したプライマーを用
いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）法を利用して、NPIIIと機能的に同等なタンパク質を
コードするDNAを単離することも可能である。

【００２５】これらハイブリダイゼーション技術や遺伝
子増幅技術により単離されるDNAがコードする、NPIIIと
機能的に同等なタンパク質は、通常、NPIIIとアミノ酸
配列において高い相同性を有する。本発明のタンパク質
には、NPIIIと機能的に同等であり、かつ該タンパク質
のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質も含ま
れる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通
常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上
の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに
好ましくは95％以上の同一性を指す。

【００２６】アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karl
in and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定す
ることができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTN
やBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altsc
hul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLAST
に基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合に
は、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength
= 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってア
ミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえ
ばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped
BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデ
フォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具
体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.go
v.)。

【００２７】また、NPIIIのアミノ酸配列において1もし
くは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、
該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明
に含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界におい
ても生じうる。変異するアミノ酸数は、通常、30アミノ
酸以内であり、好ましくは、1〜20個程度、より好まし
くは1〜10個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸で
ある。

【００２８】あるアミノ酸配列に対する１又は複数個の
アミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸によ
る置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク
質がその生物学的活性を維持することはすでに知られて
いる（Mark, D. F. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. US
A (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith,M.
Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wan
g, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-Mc
Farland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19
82) 79, 6409-6413）。

【００２９】また、あるタンパク質と機能的に同等なタ
ンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法
としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られて
いる。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法
（Gotoh, T. et al. (1995)Gene 152, 271-275、Zolle
r, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100,46
8-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res.
12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Metho
ds. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Na
tl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Method
s Enzymol. 85, 2763-2766）、遺伝子相同組換え法、プ
ライマー伸長法、及びPCR法等の当業者に周知の方法を
用いて、NPIIIのアミノ酸に適宜変異を導入することに
より、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製
することができる。また、あるタンパク質と機能的に同
等なタンパク質を調製するためには、当該タンパク質を
構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性
アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電ア
ミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が考えられ
る。又、機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが
望ましい。

【００３０】NPIIIのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸
残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を
含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、こ
れらタンパク質と他のタンパク質とが融合したものであ
り、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製するに
は、例えば、NPIIIをコードするDNAと他のタンパク質を
コードするDNAをフレームが一致するように連結してこ
れを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。
本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質
としては、特に限定されない。

【００３１】本発明のタンパク質との融合に付される他
のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et a
l., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis
（ヒスチジン）残基からなる6ＸHis、10ＸHis、インフ
ルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断
片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T
抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Pr
otein C の断片等の公知のペプチドを使用することがで
きる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他
のタンパク質としては、例えば、GST（グルタチオン−S
−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集
素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダー
ゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられ
る。市販されているこれらタンパク質をコードするDNA
を本発明のタンパク質をコードするDNAと融合させ、こ
れにより調製された融合DNAを発現させることにより、
融合タンパク質を調製することができる。

【００３２】本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコ
ードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、
mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAである
か、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発
明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に
基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。

【００３３】本発明のDNAは、当業者に公知の方法によ
り調製することができる。例えば、本明細書において配
列番号：３で示された本発明のタンパク質NPIIIをコー
ドするDNAは、アスペルギルス・オリゼRIB40株の染色体
DNAを鋳型とし、配列番号：１または２で表される塩基
配列を参考に設計したDNA断片をプライマーとして用い
るPCR法により調製することができる。または、その塩
基配列を元に、当業者に公知の核酸化学合成法などによ
り、本発明のタンパク質NPIIIをコードするDNAを得るこ
ともできるが、これらに限定されない。なお、アスペル
ギルス・オリゼRIB40株は、独立行政法人産業技術総合
研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目
１番地１）に受託番号FERM BP-7935として平成13年3月2
8日付で寄託されている。

【００３４】また、本発明のDNAにおいては、発現に使
用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率
の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R.
etal., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74
）。また、本発明のDNAは、市販のキットや公知の方法
によって改変することができる。改変としては、例え
ば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適
当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コ
ドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTA
G）の挿入等が挙げられる。

【００３５】本発明は、上記本発明のDNAがコードする
タンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、後述す
るそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、
アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態な
どが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質
が、NPIIIと同等の機能を有している限り、本発明に含
まれる。例えば、本発明のタンパク質を原核細胞、例え
ば大腸菌で発現させた場合、本来のタンパク質のアミノ
酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明
のタンパク質はこのようなタンパク質も包含する。

【００３６】本発明のタンパク質は、当業者に公知の方
法により、組み換えタンパク質として、また天然のタン
パク質として調製することが可能である。天然のタンパ
ク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、細胞の抽
出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗
体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製す
ることにより単離することができる。抗体はポリクロー
ナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよ
い。

【００３７】また、本発明は、本発明のDNAを含むベク
ター、および、本発明のDNAまたは上記ベクターを保持
する形質転換細胞を提供する。本発明のベクターは、宿
主細胞内において本発明のDNAを保持したり、所望の遺
伝子やタンパク質を発現させるために有用である。ま
た、本発明の形質転換細胞は、例えば、所望のタンパク
質の製造や発現のための産生系として使用することがで
きる。

【００３８】本発明のDNAをベクターに挿入するには、
当業者に公知の方法を適宜選択することにより行うこと
ができる。例えば、本発明のDNAを適当な制限酵素で切
断し、適当な発現ベクターの制限酵素部位に挿入する方
法などを用いることができるが、これに限定されない。

【００３９】本発明におけるベクターとしては、特に制
限されず、当業者によって一般的に公知のベクターを使
用することが可能であるが、好ましくは、選択マーカー
を有するベクターである。該選択マーカーとしては、ア
ルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトア
ミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシ
ン耐性などの薬剤耐性遭伝子等が例示できるが、これら
に制限されない。ベクターの例としては、pSal23 (Agri
c. Biol. Chem., 1987, 51, 2549-2555)やpNU1(Biosci.
Biotech. Biochem., 1997, 61, 1367-1369)等が挙げら
れる。また、ベクターには、ポリペプチド分泌のための
シグナル配列が含まれていてもよい。

【００４０】また、上記宿主としては、各種糸状菌、酵
母、昆虫あるいは動植物細胞等の真核細胞、あるいは、
大腸菌、ブレビバチルス・チョウシネンシス等の原核細
胞などのいずれであっても利用可能であるが、好ましく
は糸状菌であり、より好ましくはアスペルギルス属に属
する微生物であり、特に好ましくは、アスペルギルス・
オリゼである。

【００４１】本発明のベクターによる宿主の形質転換
は、当業者においては、一般的に周知の方法、例えば塩
化カルシウム法、エレクトロポレーション法等により行
うことができる。また、アスペルギルス属に属する微生
物を宿主とする場合には、好ましい形質転換方法とし
て、実施例で用いたBallanceとTurnerの方法（Gene,36,
321(1985)）を例示することできる。本発明のDNAまたは
ベクターを導入した形質転換細胞は、例えば、使用した
選択マーカーの種類に従って、適当な選択用薬剤を含む
公知の選択用培地を用いて培養を行う。これにより本発
明のDNAまたはベクターを保持する形質転換細胞を取得
することができる。

【００４２】また、該形質転換体の培養も当業者に公知
の方法に従い、培地、培養条件を適宜選択することによ
り可能であるが、アスペルギルス属に属する微生物を宿
主とする場合には、好ましい培養条件として、実施例に
示したグルコースまたはデンプンを炭素源とした天然培
地（Polypeptone 1g、KH₂PO₄ 0.5g、NaNO₃ 0.1g、MgSO₄
・7H₂O 0.05g/100ml：炭素源は最終濃度2％になるよう
に適宜添加）、pH6.5を例示することができる。

【００４３】また、本発明は、本発明のタンパク質の製
造方法を提供する。該製造方法としては、当業者に公知
の方法を適宜選択することにより行うことができる。例
えば、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離
し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製するこ
とができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパ
ク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すれ
ばよく、何ら限定されるものではない。例えば、硫酸ア
ンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー等を適宜、単独または組み合わせて用いることにより
タンパク質を分離、精製することができる。

【００４４】また、タンパク質をグルタチオン S-トラ
ンスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、
あるいはヒスチジンを複数付加させた組換えタンパク質
として宿主細胞内で発現させた場合には、発現させた組
換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケル
カラムを用いて精製することができる。融合タンパク質
の精製後、必要に応じて、融合タンパク質のうち目的の
タンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクター
Xaなどにより切断し、除去することも可能である。

【００４５】上記のクロマトグラフィーとしては、例え
ばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
等が挙げられる（Strategies for Protein Purificatio
n and Characterization: A Laboratory Course Manua
l. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフ
ィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等
の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
上記アフィニティークロマトグラフィーとしては、製造
したいタンパク質と親和性を有する抗体が結合したアフ
ィニティーカラムを例示することができる。この場合、
抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗
体であってもよい。

【００４６】また、タンパク質を精製前又は精製後に適
当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意
に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもで
きる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロ
テインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。本
発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタ
ンパク質も包含する。

【００４７】また、本発明は、本発明のタンパク質と結
合する抗体を提供する。本発明の抗体としては、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの断片等が
例示できる。

【００４８】これらの抗体は、当業者に公知の方法によ
り調製することが可能である。ポリクローナル抗体であ
れば、例えば、次のようにして取得することができる。
本発明のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質
として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナ
ントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の
小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈
殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換
クロマトグラフィー、本発明のタンパク質や合成ペプチ
ドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精
製することにより調製する。また、モノクローナル抗体
であれば、例えば、本発明のタンパク質またはその部分
ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスよ
り脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該
細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコー
ル等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細
胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に
結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、
得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マ
ウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体
を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラ
ム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタン
パク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティ
ーカラム等により精製することで、調製することが可能
である。

【００４９】本発明はまた、本発明のDNAまたはその相
補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴ
ヌクレオチドを提供する。

【００５０】ここで「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの
場合はU）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖
に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少な
くとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配
列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは
少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましく
は95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同
性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載した
ものを使用すればよい。また、「オリゴヌクレオチド」
にはポリヌクレオチドも含まれる。

【００５１】本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の
タンパク質をコードするDNAの検出や増幅に用いるプロ
ーブやプライマー、該DNAの発現を検出するためのプロ
ーブやプライマーとして使用することができる。また、
本発明のオリゴヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形
態で使用することができる。

【００５２】該オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好
ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDN
Aまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるもの
であれば、特に制限されない。また、プライマーとして
用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵
素認識配列やタグなどを付加することができる。

【００５３】また、上記オリゴヌクレオチドをプローブ
として使用する場合、該プローブは、本発明のDNAまた
はその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイ
ズするものであれば、特に制限されない。該プローブ
は、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少な
くとも15bp以上の鎖長を有する。

【００５４】本発明のオリゴヌクレオチドをプローブと
して用いる場合は、適宜標識して用いることが好まし
い。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を³²Pでリン酸
化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等
のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴ
ヌクレオチド等をプライマーとして³²P等のアイソトー
プ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基
質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を
例示することができる。

【００５５】本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市
販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することがで
きる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される
二本鎖DNA断片として作製することもできる。

【００５６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 〔実施例１〕 染色体上のアスペルギルス・オリゼの新
規タンパク質分解酵素（NPIII）遺伝子のクローニング
と塩基配列決定 アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149 ;FERM BP
-7935)の胞子をYPD（Bacto peptone 2%、Bacto yeast e
xtract 1%、Glucose 2%） 100ml に植菌し、30℃で一晩
振とう培養した。その後、飯村の方法（Agric. Biol. C
hem. 323-328,51(1987)）に従って、菌体から染色体DNA
を抽出した。この染色体DNAを鋳型として、アスペルギ
ルス・オリゼのゲノム配列を参考に合成したプライマー
gNPIII-M（配列番号：４）とプライマーgNPIII-R（配列
番号：５）を用いてPCRを行った。その結果、増幅した
約3520bpをpT7Blue-Tにクローニングし塩基配列を決定
した。DNA塩基配列の決定は、Sangerらの方法(Proc Nat
l Acad Sci USA. 5463-5467, 74（1977）)に従った。

【００５７】次いで、決定した塩基配列に対してBlast
による相同性検索を行った結果、GenBankに登録されて
いる亜鉛結合型のタンパク質分解酵素（メタロプロテア
ーゼ）と一部相同性を有していた。そのため、この遺伝
子はタンパク質分解活性を有する新規タンパク質をコー
ドしていると推定した。本発明者らは、この遺伝子がコ
ードするアスペルギルス・オリゼの新規タンパク質分解
酵素をNPIIIと命名した。染色体上のNPIII遺伝子の塩基
配列を配列番号：１に記した。

【００５８】〔実施例２〕 NPIII cDNAの増幅と塩基配
列決定 本タンパク質遺伝子のcDNAの塩基配列を決定するために
RT-PCRによりcDNAの増幅した。グルコースを炭素源とし
た天然培地 (pH6.5)（Polypeptone 1g、KH₂PO₄ 0.5g、N
aNO₃ 0.1g、MgSO₄・7H₂O 0.05g/100ml：炭素源は最終濃
度2%になるように適宜添加した。）で生育させたアスペ
ルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149 ;FERM BP-7935)
の菌体から、Chigwinらの方法（Biochemistry 18 5294-
5299, (1979)）に従ってtotal RNAを得た。NPIII cDNA
の増幅は、3' RACE core kit (宝酒造社製) と ExTaq
(宝酒造社製)を用いて行った。1st strand cDNAの合成
はtotalRNAを鋳型にし、キットに付属のOligo dT-3site
s Adaptor primerとAMV逆転写酵素で行った。合成した1
st strand cDNA を鋳型に配列番号：６（NPIIIcDNA-M）
と配列番号：７（NPIIIcDNA-R）のプライマーを用い
て、NPIII cDNAの増幅を試みた。その結果、 約2000bp
のDNA断片が増幅され、この断片をpT7Blue-Tベクターに
クローニング後、全塩基配列を決定した。このようにし
て決定されたNPIIIをコードするcDNAの塩基配列を配列
番号：２に示す。また、NPIIIをコードするcDNAの塩基
配列から予測されるNPIIIのアミノ酸配列を配列番号：
３に示す。

【００５９】NPIII cDNAと染色体由来NPIIIの塩基配列
を比較した結果、NPIIIは1920bp（ATG〜TAA）のcdsより
翻訳され、639アミノ酸、約71kDaのタンパク質であると
推定した。

【００６０】〔実施例３〕 NPIII遺伝子の強発現株の
作製 本遺伝子がコードするタンパク質が実際に機能するか検
証するために、アスペルギルス・オリゼのα-アミラー
ゼのプロモーター（TAAプロモーター）を用いたNPIII強
発現株を作製した。TAAプロモーターを用いた強発現株
の作製に当たり、まず、プラスミドpNIA-NPIIIの構築を
行った。プラスミドpNIA-NPIIIの構築のために、まず、
プラスミドpNIAを構築した。pNIAは以下の手順により構
築した。まず、すでにGenBank等に登録されているアス
ペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子（niaD）
の塩基配列を基にプライマーniaD-M1（配列番号：８）
とプライマーniaD-RV（配列番号：９）を作製し、アス
ペルギルス・オリゼRIB40株の染色体DNAを鋳型としてPC
Rを行い、niaD（約5.2kbp）を取得した。次いで、得ら
れたniaDをHindIIIで処理し、pUC18のHindIIIサイトに
サブクローニングし、pNIAを構築した。プラスミドpNIA
の構造を図１に示す。

【００６１】次いで、TAAプロモーターの下流にNPIII c
DNAが連結されており、さらに転写を終結させるためのT
AAターミネーターをその下流に有するDNA断片を挿入し
たプラスミドであるpTAA-NPIIIを構築した。pTAA-NPIII
は以下の手順により構築した。まず、アスペルギルス・
オリゼRIB40株の染色体DNAを鋳型にプライマーtaaG2Pro
-M（配列番号：１０）とプライマーtaaG2Pro-R（配列番
号：１１）を用いてPCRを行い、TAAのプロモーターを増
幅した。また、同じくアスペルギルス・オリゼRIB40の
染色体DNAを鋳型に、プライマーtaaG2Ter-M（配列番
号：１２）とプライマーtaaG2Ter-R（配列番号：１３）
を用いてPCRを行い、TAAターミネーターを増幅した。PC
Rで増幅したそれぞれの断片をEcoT22IとSse8387Iで切断
後、両断片をpUC18のPstIサイトに導入し、プラスミドp
TAAを構築した。次いで、pTAAをEcoT22Iで切断後、EcoT
22I処理したNPIII cDNAのRT-PCR産物を導入し、pTAA-NP
IIIを構築した。プラスミドpTAA-NPIIIの構造を図２に
示す。

【００６２】更に、上記で構築したpNIAをPstIで処理し
たものとpTAA-NPIIIをSse8387I処理して得られるTAAプ
ロモーター-NPIII cDNA-TAAターミネーター（約3kbp）
とを連結し、プラスミドpNIA-NPIIIを構築した。プラス
ミドpNIA-NPIIIの構造を図３に示す。

【００６３】次いで、構築したpNIA-NPIIIをアスペルギ
ルス・オリゼHSCC F-429（FERM P-18998）に導入した。
なお、アスペルギルス・オリゼ HSCC F-429株は、独立
行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨
城県つくば市東１丁目１番地１）に平成14年9月5日付で
寄託されている。

【００６４】pNIA-NPIIIを効率よくアスペルギルス・オ
リゼHSCC F-429に導入するために、まずUnkleらの方法
（Mol. Gen. Genet. 218, 99-1041(1989)）を用いて、
硝酸還元酵素遺伝子（以下、niaD）の変異によって、亜
硝酸要求性を示すアスペルギルス・オリゼ HSCC-F429を
作製した。BallanceとTurnerの方法（Gene,36,321(198
5)）でpNIA-NPIIIをアスペルギルス・オリゼ HSCC-F429
へ導入し、NPIII強発現株を作製した。同時にpNIAをア
スペルギルス・オリゼ HSCC-F429に導入した株を作製
し、コントロール株とした。また、導入したプラスミド
がNPIII強発現株とコントロール株のniaD領域に1コピー
で導入されていることをサザンハイブリダイゼーション
で確認した。

【００６５】〔実施例４〕 NPIII強発現株とコントロ
ール株のタンパク質分解活性の測定と評価 NPIII強発現株とコントロール株の胞子をグルコースあ
るいはデンプンを炭素源とした天然培地100mlに最終胞
子濃度10⁶個/mlになるように添加し、30℃で3日間振盪
培養を行った。次いで、培養上清のタンパク質分解活性
を測定した。培養上清のタンパク質分解活性は、中性付
近で培養上清とカゼインを反応させた際に生じるチロシ
ン量を測定した。また、宿主の生産するアルカリ性タン
パク質分解酵素の影響を除外するために、活性測定の際
にアルカリタンパク質分解酵素の阻害剤であるPMSF（フ
ェニルメチルスルホニルフルオリド）を培養上清に最終
濃度2mM加えた。タンパク質分解活性1unitは、1分間に1
μgのチロシンを生成する酵素量とし、培養上清1ml当た
りで表した。その結果を、表１に示す。

【００６６】

【表１】 ＊1：単位unit/ml ＊2：コントロール株と強発現株それぞれ10株のタンパ
ク質分解活性を測定した平均値を記した。

【００６７】TAA遺伝子は、炭素源としてデンプンやマ
ルトースを使用した際に誘導発現することが知られてい
る。したがって、デンプンを炭素源とした場合のNPIII
強発現株の高タンパク質分解活性は、TAAプロモーター
の発現誘導効果によりNPIII cDNAの転写量が上昇したた
めであると考えられる。

【００６８】以上の結果から本発明者らは、本遺伝子に
コードされているタンパク質は、アスペルギルス・オリ
ゼ由来の新規タンパク質分解酵素であることを確認し
た。

【００６９】

【発明の効果】本発明により、アスペルギルス・オリゼ
由来の新規タンパク質分解酵素及びそれをコードする遺
伝子、及び該タンパク質分解酵素の製造方法が提供され
る。また、本発明の新規タンパク質NPIIIは、タンパク
質分解活性を有するため、タンパク質分解酵素が利用さ
れている様々な産業分野で産業用酵素などとして利用可
能である。

【００７０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology National Institute of Technology and Evaluation National Research Institute of Brewing <120> Novel protease <130> H5-A0201Y1 <150> JP 2001-403261 <151> 2001-12-27 <160> 13 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3524 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 1 ggttgaattc accaaggatt gacattcgag gaccgactat atctcgtcca cgagacgagg 60 gaatatgata tgtgaaggtt ttcggtgata ctggagtcct tacaaatcat tgtttaatgc 120 acgaagacca ccgataagac tgacgtgtga gctttgtaag gcgtgacgcg attcatagtg 180 catgtagcat cagcctgtat cagtcccgtt aggctgtcat gtgatgattg cactgaactc 240 cttcaatcca aatagactgc tctggactgc atatgactcc tggtgtattc tatttttttg 300 accattcggt cagccagaga tgttattgaa cagatagtca acagtgaaga tttgtggtga 360 ccttcagcca ggtggacata ttctgtagtg tccagcatcc attttcaaaa ttgcgcaact 420 tcaacgcttc accgagcagc tctaagttag tattgtggct tagagagtgc tatagaaggt 480 gtgatctacc ttctgaatgt cctcagccgg ggtgaagtgg tgaatgtagt ggcaagttca 540 gatatgtgcc agtgcaccaa tggcgaactg tgtgaagtga acaagtgaat cagatgaaaa 600 gacacccaag gcaccgacaa atgcagtata gataaatatt ggattatccc cctatgtctt 660 ataacttctc ctctcctctc ctcccaacct cccccaattt gtcaatcctt tccatttccc 720 cttttctccc tcgttgtcaa catgcatatg ctcttattta tcggggccct ggctctacct 780 gtttttgtct gcactcaatc ttgtgagccc gcttctctat cgcctcgcct cgctggtgtc 840 gatctggaaa agtttcggtt gactcccaac gcagaatacg tcgattccga ccagcagatc 900 cccatctcga ctacgaatgt tggcctgatt gagcaaagct acgttgaggc ggccattaaa 960 ctggtcagag aaacattccc taacgcaacc tttcgactcc gagaggatca ctacgttggg 1020 gataatggtg tggcacacgt tcactttcgt cagacagtgc acaacgtaga tgtcgataac 1080 ggggatttca atgtcaacgt atgtgttgat atccttactt agatgatcca ccaagctaac 1140 tgagtgtagg tcggtcgcga cggcagcgtc ttctcctatg gaaactcctt ctacaccggc 1200 cctgttccca gcatcaccca gttgacaaag cgtgacttca ccgaccctgt ggcggcattg 1260 aaattcgcat tgacacatct tcaacttcct atcacagcgg aggatgtgtc tgtggaatca 1320 acgaagcatc ctcataagta tgttctcaga ggcacgtccg gggctgtcac gaacccgaag 1380 gcacgtcttg tctacttcgt gaagcctgac gggacactat gcttggtgtg gagagtagaa 1440 accgatgtag atgataactg gctcttgacc tatgtggatg cgaaaaccgc cgaggaaatt 1500 catggcgtcg tcgactatgt ttccgaggcc accttccaag tctagtgagt agtatccggt 1560 tgctattaag aacactgtga tgactgaccc cagtaatcca tgacagtggc tggggaatca 1620 atgaccctgg tcaagtggac agccgtgccg ttcttactga cccgtgggat ctgaaggagt 1680 ctccactgac atggttcagg gatggacaaa agaactggac tacaacacgg gggaacaatg 1740 gcattgccca ggaaaatatc aataacctac caacctacct taataatttc cgacctgaca 1800 gccctactca gaatttctct tatgagtatc cggccggtgg atctccaaag gactacatta 1860 atgcttccat tacacaacta ttctacacag ccaacgcata ccatgatctc ctgtacacac 1920 tgggctttaa tgaaaaggca ggcaacttcc aatggaacaa cagcgggctg ggaggcaagg 1980 agaaggacta tgtgattcta aacgcgcagg atggagcgag taggaataac gccgatttcg 2040 ctactccccc agacggatcc cccgcccgca tgcgcatgta tctcttcacg cataccacgc 2100 cacctcggga tggagtattt gagtctggga ttgtcattca tgaatatacc catggctgta 2160 agtctagccg tacttatacc caacattctg tattttgttc gccttaacat ttgtaccatc 2220 tagtatcaat gcgacttacc 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Phe Arg Leu Thr Pro Asn Ala Glu Tyr Val Asp 35 40 45 tcc gac cag cag atc ccc atc tcg act acg aat gtt ggc ctg att gag 192 Ser Asp Gln Gln Ile Pro Ile Ser Thr Thr Asn Val Gly Leu Ile Glu 50 55 60 caa agc tac gtt gag gcg gcc att aaa ctg gtc aga gaa aca ttc cct 240 Gln Ser Tyr Val Glu Ala Ala Ile Lys Leu Val Arg Glu Thr Phe Pro 65 70 75 80 aac gca acc ttt cga ctc cga gag gat cac tac gtt ggg gat aat ggt 288 Asn Ala Thr Phe Arg Leu Arg Glu Asp His Tyr Val Gly Asp Asn Gly 85 90 95 gtg gca cac gtt cac ttt cgt cag aca gtg cac aac gta gat gtc gat 336 Val Ala His Val His Phe Arg Gln Thr Val His Asn Val Asp Val Asp 100 105 110 aac ggg gat ttc aat gtc aac gtc ggt cgc gac ggc agc gtc ttc tcc 384 Asn Gly Asp Phe Asn Val Asn Val Gly Arg Asp Gly Ser Val Phe Ser 115 120 125 tat gga aac tcc ttc tac acc ggc cct gtt ccc agc atc acc cag ttg 432 Tyr Gly Asn Ser Phe Tyr Thr Gly Pro Val Pro Ser Ile Thr Gln Leu 130 135 140 aca aag cgt gac ttc acc gac cct gtg gcg gca ttg aaa ttc gca ttg 480 Thr Lys Arg Asp Phe Thr Asp Pro Val Ala Ala Leu Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160 aca cat ctt caa ctt cct atc aca gcg gag gat gtg tct gtg gaa tca 528 Thr His Leu Gln Leu Pro Ile Thr Ala Glu Asp Val Ser Val Glu Ser 165 170 175 acg aag cat cct cat aag tat gtt ctc aga ggc acg tcc ggg gct gtc 576 Thr Lys His Pro His Lys Tyr Val Leu Arg Gly Thr Ser Gly Ala Val 180 185 190 acg aac ccg aag gca cgt ctt gtc tac ttc gtg aag cct gac ggg aca 624 Thr Asn Pro Lys Ala Arg Leu Val Tyr Phe Val Lys Pro Asp Gly Thr 195 200 205 cta tgc ttg gtg tgg aga gta gaa acc gat gta gat gat aac tgg ctc 672 Leu Cys Leu Val Trp Arg Val Glu Thr Asp Val Asp Asp Asn Trp Leu 210 215 220 ttg acc tat gtg gat gcg aaa acc gcc gag gaa att cat ggc gtc gtc 720 Leu Thr Tyr Val Asp Ala Lys Thr Ala Glu Glu Ile His Gly Val Val 225 230 235 240 gac tat gtt tcc gag gcc acc ttc caa gtc tat ggc tgg gga atc aat 768 Asp Tyr Val Ser Glu Ala Thr Phe Gln Val Tyr Gly Trp Gly Ile Asn 245 250 255 gac cct ggt caa gtg gac agc cgt gcc gtt ctt act gac ccg tgg gat 816 Asp Pro Gly Gln Val Asp Ser Arg Ala Val Leu Thr Asp Pro Trp Asp 260 265 270 ctg aag gag tct cca ctg aca tgg ttc agg gat gga caa aag aac tgg 864 Leu Lys Glu Ser Pro Leu Thr Trp Phe Arg Asp Gly Gln Lys Asn Trp 275 280 285 act aca aca cgg ggg aac aat ggc att gcc cag gaa aat atc aat aac 912 Thr Thr Thr Arg Gly Asn Asn Gly Ile Ala Gln Glu Asn Ile Asn Asn 290 295 300 cta cca acc tac ctt aat aat ttc cga cct gac agc cct act cag aat 960 Leu Pro Thr Tyr Leu Asn Asn Phe Arg Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn 305 310 315 320 ttc tct tat gag tat ccg gcc ggt gga tct cca aag gac tac att aat 1008 Phe Ser Tyr Glu Tyr Pro Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Tyr Ile Asn 325 330 335 gct tcc att aca caa cta ttc tac aca gcc aac gca tac cat gat ctc 1056 Ala Ser Ile Thr Gln Leu Phe Tyr Thr Ala Asn Ala Tyr His Asp Leu 340 345 350 ctg tac aca ctg ggc ttt aat gaa aag gca ggc aac ttc caa tgg aac 1104 Leu Tyr Thr Leu Gly Phe Asn Glu Lys Ala Gly Asn Phe Gln Trp Asn 355 360 365 aac agc ggg ctg gga ggc aag gag aag gac tat gtg att cta aac gcg 1152 Asn Ser Gly Leu Gly Gly Lys Glu Lys Asp Tyr Val Ile Leu Asn Ala 370 375 380 cag gat gga gcg agt agg aat aac gcc gat ttc gct act ccc cca gac 1200 Gln Asp Gly Ala Ser Arg Asn Asn Ala Asp Phe Ala Thr Pro Pro Asp 385 390 395 400 gga tcc ccc gcc cgc atg cgc atg tat ctc ttc acg cat acc acg cca 1248 Gly Ser Pro Ala Arg Met Arg Met Tyr Leu Phe Thr His Thr Thr Pro 405 410 415 cct cgg gat gga gta ttt gag tct ggg att gtc att cat gaa tat acc 1296 Pro Arg Asp Gly Val Phe Glu Ser Gly Ile Val Ile His Glu Tyr Thr 420 425 430 cat ggc tta tca atg cga ctt acc ggt ggc ccc gac aac tcc cgg tgc 1344 His Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser Arg Cys 435 440 445 ttg agt gct ttc gag tcg gct agc atg gga gaa ggc tgg ggt gac ttc 1392 Leu Ser Ala Phe Glu Ser Ala Ser Met Gly Glu Gly Trp Gly Asp Phe 450 455 460 atg gcg act gcg atc cgt ctc aag ccc agt gac aca cgt gca acg gat 1440 Met Ala Thr Ala Ile Arg Leu Lys Pro Ser Asp Thr Arg Ala Thr Asp 465 470 475 480 tac gga atg gga atg tgg gtt tat aat aat gag aag ggt att cga cag 1488 Tyr Gly Met Gly Met Trp Val Tyr Asn Asn Glu Lys Gly Ile Arg Gln 485 490 495 tat cta tat tca act tcg atg gaa act aac cca ctg aac tac aca tcc 1536 Tyr Leu Tyr Ser Thr Ser Met Glu Thr Asn Pro Leu Asn Tyr Thr Ser 500 505 510 ctg aac aga atg tgg gag gcc cat gca ggt ggg acc gtc tgg gct tcg 1584 Leu Asn Arg Met Trp Glu Ala His Ala Gly Gly Thr Val Trp Ala Ser 515 520 525 atg ctg tac gaa gtg cta tgg aac ttg att gac agg cac ggc aag aac 1632 Met Leu Tyr Glu Val Leu Trp Asn Leu Ile Asp Arg His Gly Lys Asn 530 535 540 gac ggc cca cgg ccc acg ttt gat gaa agg ggc gtg ccc aag gat ggt 1680 Asp Gly Pro Arg Pro Thr Phe Asp Glu Arg Gly Val Pro Lys Asp Gly 545 550 555 560 aaa tac ttg gca atg aag ata gta att gat gct atg gct tta caa ccc 1728 Lys Tyr Leu Ala Met Lys Ile Val Ile Asp Ala Met Ala Leu Gln Pro 565 570 575 tgc aat cct gac ttt gtt cag gcc cgc aat gcc atc ctg gac gcg gat 1776 Cys Asn Pro Asp Phe Val Gln Ala Arg Asn Ala Ile Leu Asp Ala Asp 580 585 590 cag gct ctt aca gga ggc cag aat aaa tgt gag atc tgg act ggg ttt 1824 Gln Ala Leu Thr Gly Gly Gln Asn Lys Cys Glu Ile Trp Thr Gly Phe 595 600 605 gcc aag cgt ggt ttg gga cag ggg gct gaa tat gga cgt ggt agg cgc 1872 Ala Lys Arg Gly Leu Gly Gln Gly Ala Glu Tyr Gly Arg Gly Arg Arg 610 615 620 gtg ggc agc tac gat att ccc ggt gat gtg tgc cag aag aag atc taa 1920 Val Gly Ser Tyr Asp Ile Pro Gly Asp Val Cys Gln Lys Lys Ile 625 630 635 <210> 3 <211> 639 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 3 Met His Met Leu Leu Phe Ile Gly Ala Leu Ala Leu Pro Val Phe Val 1 5 10 15 Cys Thr Gln Ser Cys Glu Pro Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Ala Gly 20 25 30 Val Asp Leu Glu Lys Phe Arg Leu Thr Pro Asn Ala Glu Tyr Val Asp 35 40 45 Ser Asp Gln Gln Ile Pro Ile Ser Thr Thr Asn Val Gly Leu Ile Glu 50 55 60 Gln Ser Tyr Val Glu Ala Ala Ile Lys Leu Val Arg Glu Thr Phe Pro 65 70 75 80 Asn Ala Thr Phe Arg Leu Arg Glu Asp His Tyr Val Gly Asp Asn Gly 85 90 95 Val Ala His Val His Phe Arg Gln Thr Val His Asn Val Asp Val Asp 100 105 110 Asn Gly Asp Phe Asn Val Asn Val Gly Arg Asp Gly Ser Val Phe Ser 115 120 125 Tyr Gly Asn Ser Phe Tyr Thr Gly Pro Val Pro Ser Ile Thr Gln Leu 130 135 140 Thr Lys Arg Asp Phe Thr Asp Pro Val Ala Ala Leu Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160 Thr His Leu Gln Leu Pro Ile Thr Ala Glu Asp Val Ser Val Glu Ser 165 170 175 Thr Lys His Pro His Lys Tyr Val Leu Arg Gly Thr Ser Gly Ala Val 180 185 190 Thr Asn Pro Lys Ala Arg Leu Val Tyr Phe Val Lys Pro Asp Gly Thr 195 200 205 Leu Cys Leu Val Trp Arg Val Glu Thr Asp Val Asp Asp Asn Trp Leu 210 215 220 Leu Thr Tyr Val Asp Ala Lys Thr Ala Glu Glu Ile His Gly Val Val 225 230 235 240 Asp Tyr Val Ser Glu Ala Thr Phe Gln Val Tyr Gly Trp Gly Ile Asn 245 250 255 Asp Pro Gly Gln Val Asp Ser Arg Ala Val Leu Thr Asp Pro Trp Asp 260 265 270 Leu Lys Glu Ser Pro Leu Thr Trp Phe Arg Asp Gly Gln Lys Asn Trp 275 280 285 Thr Thr Thr Arg Gly Asn Asn Gly Ile Ala Gln Glu Asn Ile Asn Asn 290 295 300 Leu Pro Thr Tyr Leu Asn Asn Phe Arg Pro Asp Ser Pro Thr Gln Asn 305 310 315 320 Phe Ser Tyr Glu Tyr Pro Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Tyr Ile Asn 325 330 335 Ala Ser Ile Thr Gln Leu Phe Tyr Thr Ala Asn Ala Tyr His Asp Leu 340 345 350 Leu Tyr Thr Leu Gly Phe Asn Glu Lys Ala Gly Asn Phe Gln Trp Asn 355 360 365 Asn Ser Gly Leu Gly Gly Lys Glu Lys Asp Tyr Val Ile Leu Asn Ala 370 375 380 Gln Asp Gly Ala Ser Arg Asn Asn Ala Asp Phe Ala Thr Pro Pro Asp 385 390 395 400 Gly Ser Pro Ala Arg Met Arg Met Tyr Leu Phe Thr His Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Arg Asp Gly Val Phe Glu Ser Gly Ile Val Ile His Glu Tyr Thr 420 425 430 His Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser Arg Cys 435 440 445 Leu Ser Ala Phe Glu Ser Ala Ser Met Gly Glu Gly Trp Gly Asp Phe 450 455 460 Met Ala Thr Ala Ile Arg Leu Lys Pro Ser Asp Thr Arg Ala Thr Asp 465 470 475 480 Tyr Gly Met Gly Met Trp Val Tyr Asn Asn Glu Lys Gly Ile Arg Gln 485 490 495 Tyr Leu Tyr Ser Thr Ser Met Glu Thr Asn Pro Leu Asn Tyr Thr Ser 500 505 510 Leu Asn Arg Met Trp Glu Ala His Ala Gly Gly Thr Val Trp Ala Ser 515 520 525 Met Leu Tyr Glu Val Leu Trp Asn Leu Ile Asp Arg His Gly Lys Asn 530 535 540 Asp Gly Pro Arg Pro Thr Phe Asp Glu Arg Gly Val Pro Lys Asp Gly 545 550 555 560 Lys Tyr Leu Ala Met Lys Ile Val Ile Asp Ala Met Ala Leu Gln Pro 565 570 575 Cys Asn Pro Asp Phe Val Gln Ala Arg Asn Ala Ile Leu Asp Ala Asp 580 585 590 Gln Ala Leu Thr Gly Gly Gln Asn Lys Cys Glu Ile Trp Thr Gly Phe 595 600 605 Ala Lys Arg Gly Leu Gly Gln Gly Ala Glu Tyr Gly Arg Gly Arg Arg 610 615 620 Val Gly Ser Tyr Asp Ile Pro Gly Asp Val Cys Gln Lys Lys Ile 625 630 635 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 4 ggttgaattc accaaggatt gacattcgag 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 5 gaagaattca aatatgttcc agttagggtt 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 6 atgatgcata tgctcttatt tatcggggcc ct 32 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 7 gggatgcatt agatcttctt ctggcacaca tcac 34 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 8 gggaagctta acaggcccca aattcaatta 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 9 gggaagcttt ggatttccta cgtcttcaat 30 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 10 gggcctgcag gaattcatgg tgttttgatc attttaaatt 40 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 11 cccaagctta aaatgcatca taaatgcctt ctgtgg 36 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 12 ctgaagcttt gaagggtgga gagtatatg 29 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 13 ccccctgcag gtacctagtg gtttgaacac 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpNIAの構造を示す図である。

【図２】 プラスミドpTAA-NPIIIの構造を示す図であ
る。

【図３】 プラスミドpNIA-NPIIIの構造を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者 町田 雅之 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 阿部 敬悦 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 五味 勝也 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 浅井 潔 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所臨海副都心センター 内 (72)発明者 佐野 元昭 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 金 大心 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所臨海副都心センター 内 (72)発明者 長崎 英樹 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所臨海副都心センター 内 (72)発明者 細山 哲 東京都渋谷区西原２−49−10 独立行政法 人製品評価技術基盤機構内 (72)発明者 秋田 修 広島県東広島市鏡山三丁目７番１号 独立 行政法人酒類総合研究所内 (72)発明者 小笠原 直毅 奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科 学技術大学大学院バイオサイエンス研究科 内 (72)発明者 久原 哲 福岡県福岡市東区箱崎６−10−１ 九州大 学農学研究院遺伝子資源工学部門内 (72)発明者 田中 昭光 千葉県銚子市中央町２−８ ヒゲタ醤油株 式会社研究開発部内 Ｆターム(参考） 4B024 BA14 CA01 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD03 FF09 FF11 FF12 FF14 4B063 QA01 QA18 QQ36 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA60Y AA90X AB01 AB02 BA01 BA08 CA33 4H045 AA11 BA10 CA15 DA75 FA72 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の
   タンパク質分解活性を有するタンパク質をコードするDN
   A。 （ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタン
   パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード
   領域を含むDNA。 （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若
   しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／ま
   たは付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
   するDNA。 （ｄ）配列番号：１または２に記載の塩基配列を含むDN
   Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDN
   A。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のDNAによりコードされ
   るタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のDNAが挿入されたベク
   ター。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のDNAまたは請求項３に
   記載のベクターを保持する形質転換細胞。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の形質転換細胞を培養
   し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた
   タンパク質を回収する工程を含む、請求項２に記載のタ
   ンパク質の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項２に記載のタンパク質に結合する
   抗体。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のDNAまたはその相補鎖
   に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌク
   レオチド。