HU218265B - V-penicillin amidohidrolázt kódoló izolált nukleinsav-szekvenciák Fusarium oxysporumból, ezeket tartalmazó expressziós vektorok és gazdasejtek, és eljárás az általuk kódolt polipeptidek előállítására - Google Patents

V-penicillin amidohidrolázt kódoló izolált nukleinsav-szekvenciák Fusarium oxysporumból, ezeket tartalmazó expressziós vektorok és gazdasejtek, és eljárás az általuk kódolt polipeptidek előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU218265B
HU218265B HU9503656A HU9503656A HU218265B HU 218265 B HU218265 B HU 218265B HU 9503656 A HU9503656 A HU 9503656A HU 9503656 A HU9503656 A HU 9503656A HU 218265 B HU218265 B HU 218265B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
sequence
gly
dna
pva
Prior art date
Application number
HU9503656A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9503656D0 (en
HUT74834A (en
Inventor
William V. Burnett
Shu-Jen Chiang
Sean M. Tonzi
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of HU9503656D0 publication Critical patent/HU9503656D0/hu
Publication of HUT74834A publication Critical patent/HUT74834A/hu
Publication of HU218265B publication Critical patent/HU218265B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12Y104/03003—D-Amino-acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát Fusarium oxysporum-ból származó, V-penicillinamidohidroláz (PVA) enzimet kódoló nukleinsavszekvenciák, a Fusariumoxysporum 435 törzsből származó új promoter, a teljes PVA-gént vagyannak egy részét és/vagy az új promotert tartalmazó expressziósvektorok, az expressziós vektorokat tartalmazó gazdasejtek és ezekfelhasználásával PVA- aktivitású polipeptidek előállítására szolgálóeljárás képezik. A PVA-aktivitással rendelkező polipeptid előállításáttranszformált Escherichia coli gazdasejtekben valósítják meg, arekombináns gén kifejeződését elősegítő fenoxi-acetát-prekurzornak atápoldatba történő adagolásával. ŕ

Description

A találmány tárgyát képezi egy izolált nukleinsavmolekula, amely a Fusarium oxysporum 435 törzsből származó teljes PVA-t vagy annak egy részét kódolja, továbbá a PVA-gén klónozása, szekvenálása és kifejezése.
Egy másik vonatkozásban a találmány tárgyát a Fusarium oxysporum 435 törzsből származó új promoter, a teljes PVA-gént vagy annak egy részét és/vagy az új promotert tartalmazó expressziós vektorok és az expressziós vektorokat tartalmazó gazdasejtek is képezik. Még további vonatkozásban a találmány tárgyát PVA - különösen fenoxi-acetát-prekurzor jelenlétében történő - előállítása képezi.
A V-penicillin amidohidroláz enzimet a V-penicillin (fenoxi-metil-penicillin) 6-amino-penicillánsavvá (6-APA-vá) történő enzimes hidrolízisére használják. A 6-APA a félszíntetikus penicillinek előállításában felhasznált aktív β-laktámmag. Különböző V-penicillin amidohidroláz (penicillin V amidohydrolase=PVA) enzimeket találtak gomba-, Streptomyces- (fonalas baktérium) és baktériumforrásokban [Lowe et al., Biotechnol. Lett. 8, 151-156 (1986)]. A Fusarium oxysporum törzsből származó PVA-enzim-aktivitást írnak le Lowe és munkatársai, az enzimet azonban nem izolálták vagy tisztították.
Az ábrák magyarázata
1. ábra: Az érintetlen PVA-enzim hat peptidfragmentumának aminosavszekvenciái. Az N-terminális vég aminosavszekvenciája az 1. számú szekvencia; az A peptid aminosavszekvenciája a 2. számú szekvencia; a Bl peptid aminosavszekvenciája a 3. számú szekvencia; a B2 peptid aminosavszekvenciája a 4. számú szekvencia; a C peptid aminosavszekvenciája az 5. számú szekvencia; a D peptid aminosavszekvenciája a 6. számú szekvencia; az E peptid aminosavszekvenciája a 7. számú szekvencia.
2. ábra: Oligonukleotidpróba. Négy oligonukleotidpróbából álló készletet származtattunk a C pepiidről (5. számú szekvencia) hét aminosav reverz transzkripciójával. A hét aminosavból álló szekvencia a 8. számú szekvencia; a 8. számú szekvenciából reverz transzkripcióval kapott DNS-szekvencia a 9. számú szekvencia; a 9. számú szekvenciával komplementer DNS-szekvencia a 10. számú szekvencia; az oligonukleotidpróba all. számú szekvencia.
3. ábra: Különböző DNS- és peptidfragmentumok. A PVA N-terminális aminosavszekvenciája a 12. számú szekvencia; a 2585 transziáit aminosavszekvencia a 13. számú szekvencia; a 2585 DNS-szekvencia a 14. számú szekvencia; a 2585-M DNS-szekvencia a 15. számú szekvencia; a 2585-FL transziáit aminosavszekvencia azonos a 12. számú szekvenciával; a kódolószál 2585-FL DNS-szekvenciája a 16. számú szekvencia; a templátszál 2585-FL DNS-szekvenciája (azaz a kódolószál komplementere) a 17. számú szekvencia. Minden nukleotidszekvenciát (a 17. számú szekvencia kivételével) balról jobbra, az 5 ’-től 3’-irányba mutatunk be.
4. ábra: A 2585-FL vázlatos bemutatása.
5. ábra: A genomiális PVA-gén klónozásának vázlatos bemutatása.
6. ábra: PVA cDNS (18. számú szekvencia) és a megfelelő aminosavszekvencia (19. számú szekvencia). Az aláhúzott DNS-szekvencia (1348-1368. bázispár, 20. számú szekvencia) komplementer egy 20 tagú próbával (11. számú szekvencia). A csillag terminációs kodeint jelez.
7. ábra; PVA genomiális DNS (21. számú szekvencia) és a megfelelő aminosavszekvencia (22. számú szekvencia). Az 1-240. bázispárok alkotják a promotert (23. számú szekvencia). Az első csillag jelzi a transzkripció startját, és a második csillag jelzi a terminéciós kodont.
8. ábra: A pWB19N szerkesztésének vázlatos bemutatása.
9. ábra: A pSJC62 szerkesztésének vázlatos bemutatása.
10. ábra: A pBMFXPVA6 szerkesztésének vázlatos bemutatása.
11. ábra: A pBMFXPVA7 szerkesztésének vázlatos bemutatása.
12. ábra: A pF020 szerkesztésének vázlatos bemutatása.
13. ábra: A pF020-P szerkesztésének vázlatos bemutatása.
14. ábra: A pBMPVA-P szerkesztésének vázlatos bemutatása.
15. ábra: A pF020-M szerkesztésének vázlatos bemutatása.
16. ábra: A pBMPVA-M szerkesztésének vázlatos bemutatása.
17. ábra: A pBMPVA-P/DAA02 szerkesztésének vázlatos bemutatása.
18. ábra: A pBMPVA-M/DAA04 szerkesztésének vázlatos bemutatása.
A találmány tárgyát olyan izolált nukleinsavmolekula képezi, amely tartalmazza a Fusarium oxysporum-ból származó PVA egészét vagy annak egy részét kódoló nukleinsavszekvenciát. A nukleinsavmolekula előnyösen DNS-molekula, és a nukleinsavszekvencia DNS-szekvencia. Minden DNS-szekvenciát olyan, formában mutatunk be, amelyben a balról jobbra a megszokott 5’-től 3’-irányba haladunk (egyedüli kivétel a 17. számú szekvencia, ahogyan azt a 3. ábrán bemutatjuk). Továbbá előnyben részesítjük az olyan DNS-szekvenciát, amely lényegében a 6. és 7. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia (különösen a 18. és 21. számú szekvencia) egészét vagy egy részét tartalmazza; vagy olyan DNS-szekvenciát, amely ezen DNS-szekvenciák valamelyikének komplementéi e; vagy olyan DNS-szekvenciát, amely ezen DNSszekvenciák valamelyikének komplementerével hibridizál. Előnyösen a DNS-szekvencia szigorú körülmények között hibridizál. A „szigorú körülmények” nem kevésbé szigorú körülményeket jelent, mint amelyet az „Előnyben részesített kiviteli alakok részletes példái” fejezetben írunk le. A PVA egy részét kódoló nukleotidszekvencia (például DNS-szekvencia) esetébei előnyben részesítjük, hogy a nukleotidszekvencií legalább körülbelül 20 nukleotid hosszúságú legyen.
HU 218 265 Β
Előnyben részesített DNS-fragmentumok all. számú szekvenciával rendelkező próba és a 23. számú szekvenciával rendelkező promoter.
A találmány szerinti PVA-molekuláknak nem elengedhetetlenül szükséges katalitikusán aktívnak lenniük. Katalitikusán inaktív PVA vagy fragmentumai felhasználhatók például a fehérjével szembeni antitestek termelésére.
Szándékaink szerint a találmány oltalmi körébe tartoznak a módosított szekvenciák is. E bejelentésben a „módosított” kifejezés, amennyiben nukleotid- vagy polipeptidszekvenciára utal, olyan nukleotid- vagy polipeptidszekvenciát jelent, amely különbözik a természetben található vad típusú szekvenciától.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák megkaphatok a szakterületen mindennapos gyakorlatként jól ismert különböző módszerek alkalmazásával. Legalább három lehetséges fő módszer alkalmazható:
1) kettős szálú DNS-szekvencia izolálása a genomiális DNS-ből vagy olyan komplemeter DNS-ből (cDNS), amely tartalmazza a szekvenciát;
2) a DNS-szekvencia kémiai szintézise; és
3) a DNS-szekvencia szintézise polimeráz-láncreakcióval (PCR=polymerase chain reaction).
Az első megközelítésben genomiális vagy cDNS-könyvtárat screenelhetünk a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia azonosítása céljából. Például screenelhetjük a Fusarium oxysporum genomiális könyvtárat a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia azonosítása céljából. A genomiális DNS- vagy cDNS-könyvtárak screenelésére különböző technikák használhatók.
Például olyan jelzett egyszálú DNS-próbaszekvenciák - amelyek megkettőzik a cél genomiális DNS-ben vagy cDNS-ben jelen levő, a PVA egészét vagy egy részét kódoló szekvenciát - alkalmazhatók a genomiális DNS vagy cDNS egyszálú formává denaturált, klónozott másolatain elvégzett DNS/DNS hibridizációs eljárásokban.
Genomiális DNS- vagy cDNS-könyvtár screenelhető a PVA egészét vagy egy részét kódoló genomiális DNS-re vagy cDNS-re immunbiot technikák felhasználásával.
Egy tipikus screenelési eljárásnál, amely alkalmas vagy immunbiot, vagy hibridizációs technikákhoz, a genomiális DNS-könyvtárat - amely általában egy vektorban található - vagy a cDNS-könyvtárat először agarlemezekre szélesztjük, és utána a kiónokat szűrőmembránokra visszük át, például nitro-cellulóz-membránokra. A DNS-próbát ezután hibridizálhatjuk, vagy egy antitestet köthetünk a kiónokhoz, hogy azonosítsuk azokat a kiónokat, amelyek a PVA egészét vagy egy részét kódoló genomiális DNS-t vagy cDNS-t tartalmazzák.
A második megközelítésben a találmány szerinti, a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciákat kémiailag szintetizálhatjuk. Például a PVA-t kódoló DNS-szekvenciát szintetizálhatjuk 100 bázisból álló oligonukleotidok sorozataként, amelyeket sorban egymás után ligálhatunk (megfelelő terminális restrikciós helyeken vagy komplementer terminális szekvenciákon keresztül) oly módon, hogy a nukleotid helyes lineáris szekvenciáját kapjuk.
A harmadik megközelítésben a találmány szerinti, a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciákat szintetizálhatjuk PCR alkalmazásával. Röviden, a cél-DNS-szekvencia szemben álló szálaival hibridizáló, legalább 15 bázis hosszúságú szintetikus DNS-oligonukleotid-párokat (PCR-primereket) használunk a célszekvencián levő DNS interveniálórégiójának enzimes megsokszorozására. A templát hődenaturációjának ismételt ciklusai, a primerek annealingje (fokozatos lehűtéssel a DNS-templáthoz kapcsolódása) és a kapcsolódott primerek 3’-végeinek kiterjesztése DNS-polimerá<zal a PCR-primerek 5’-végeivel definiált szegmens megsokszorozását eredményezi [White et al., Trends Génét. 5, 185-189(1989)].
A találmány szerinti DNS-szekvenciák felhasználhatók különböző módokon a találmánynak megfelelően. A DNS-szekvencia legnyilvánvalóbb felhasználása PVA előállítása a V-penicillin 6-APA-vá történő átalakítása céljából. Felhasználhatók azonban DNS-próbákként is, más cDNS-ek és genomiális DNS-könyvtárak se eenelésére, más olyan DNS-szekvenciák hibridizációval történő kiválogatására, amelyek a PVA-val rokon fehérjéket kódolnak. Ezenkívül a találmány szerinti, a ΡλΆ egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciák felhasználhatók mint DNS-próbák más cDNS-ek és genomiális DNS-könyvtárak screenelésére, olyan DNSszekvenciák hibridizációval történő kiválogatására, amelyek a Fusarium oxysporum-tól eltérő szervezetekből szármázó PVA-molekulákat kódolnak.
A találmány szerinti, a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciák módosíthatók is (azaz mutációnak vethetők alá), különböző mutációk előállítására. Az ilyen mutációk lehetnek degeneráltak, azaz a mutációs változások megváltoztatják a mutációt szenvedett kodon által kódolt aminosavszekvenciát, vagy nem degeneráltak, azaz a mutáció nem változtatja meg a mutációt szenvedett kóodon által kódolt aminosavsoirendet. Ezek a módosított DNS-szekvenciák elkészíthetők - például a PVA DNS-szekvencia oly módon történő mutációjával, hogy a mutáció a kódolt polipeptidben egy vagy több aminosav delécióját (kivágását), szubsztitúcióját (helyettesítését), inszercióját (beszúrását), inverzióját (megfordítását) vagy addícióját (betoldását) eredményezi - a szakterületen ismert különböző módszerek felhasználásával. Például alkalmazhaiók a pontra irányított mutagenezis módszerei [Morinaga et al., Bio/Technol. 2, 636-639 (1984); Taylor et al. Nucl. Acids Rés. 73, 8749-8764 (1985) és Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985)]. Ráadásul a pontra irányított mutagenezishez szükséges kitek beszerezhetők a kereskedelemből. Például pontra irányított mutagenezis kivitelezésére szolgáló kit beszerezhető az Amersham Corp.-től (Arlington Heights; IL i. Ezenkívül szétszakításos, kivágásos és csonkolásos módszerek [Sayers et al., Nucl. Acids Rés. 16, 791-802 (1988)] szintén alkalmazhatók. Degenerált és nem degenerált mutációk egyaránt előnyösek lehetnek
HU 218 265 Β a találmány szerinti polipeptidek előállításában vagy felhasználásában. Például ezek a mutációk nagyobb mennyiségben történő előállítást, könnyebb tisztítást tesznek lehetővé, vagy további restrikciósendonukleáz-felismerő helyeket szolgáltatnak. Minden ilyenformán módosított DNS- és polipeptidmolekula a találmány oltalmi körébe tartozik.
A találmány tárgy továbbá a 7. ábrán (23. számú szekvencia) bemutatott új PVA-promoter. A találmány szerinti új promoter használható más hasznos fehéijéket vagy polipeptideket kódoló egyéb ismert DNS-szekvenciával.
A találmány tárgyát képezik továbbá a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciát és/vagy a PVA promotert tartalmazó expressziós vektorok. Az expressziós vektorok előnyösen olyan DNS-szekvenciák egyikének egészét vagy egy részét tartalmazzák, amelyek lényegében a 6. vagy 7. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciákkal rendelkeznek. Továbbá előnyben részesítjük az olyan expressziós vektorokat, amelyek egy vagy több szabályozó DNS-szekvenciát tartalmaznak a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen hozzákötve. Ebben az összefüggésben a „működőképesen hozzákötve” kifejezés azt jelenti, hogy a szabályozó DNS-szekvenciák képesek irányítani a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia replikációját és/vagy expresszióját.
A találmányban hasznosítható expressziós vektorok gyakran „plazmidok” formájában vannak jelen, amelyek olyan cirkuláris kettős szálú DNS-hurkokra utalnak, amelyek vektor formájukban nem kötődnek a kromoszómához. A találmány azonban az expressziós vektorok egyéb olyan formáit is felöleli, amelyek a szakmában ezután válnak ismertté.
A találmányban felhasználható expressziós vektorok tipikusan tartalmaznak egy replikációs origót, egy promotert (előnyösen a 23. számú szekvenciával rendelkező promotert) a DNS-szekvencia előtt (azaz upstream) és ezt követi egy strukturális fehérje egészét vagy annak egy részét - úgymint PVA-t, D-aminosav oxidázt, monoklonális antitesteket, inzulint, interferont, hám eredetű növekedési faktort, növekedési hormont és hasonlókat - kódoló DNS-szekvencia. A strukturális fehéije egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciát transzkripciós terminációs szekvenciák és a maradék vektor követi. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak egyéb, a szakmában ismert DNS-szekvenciákat, például stabilitásvezető szekvenciákat, amelyek gondoskodnak az expressziós tennék stabilitásáról, szekréciós vezetőszekvenciákat, amelyek elősegítik az az expressziós termék kiválasztódását, szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a struktúrgén modulált kifejeződését (például tápanyagok vagy más prekurzorok jelenlétével vagy hiányával a szaporító tápoldatban), markerszekvenciákat, amelyek képesek fenotípusos szelekciót biztosítani a transzformált gazdasejtekben, stabilitáselemeket, úgymint centromérákat, amelyek a plazmidnak mitotikus stabilitást nyújtanak, és olyan szekvenciákat, amelyek a restrikciós endonukleázok hasításához nyújtanak helyeket. Az éppen használt expressziós vektor tulajdonságainak összeegyeztethetőnek kell lennie az alkalmazandó gazdasejttel. Például ha egy gombasejtrendszerbe klónozunk, az expressziós vektornak tartalmaznia kell gombasejtek genomjából izolált promotereket (például a trpC promotert az Aspergillus nidulans-bó\ és a PVA-promotert a Fusarium oxysporum-boí). Bizonyos expressziós vektorok tartalmazhatnak gombából származó, autonóm módon replikálódó szekvenciát (ARS-t; például Fusarium oxysporum-biü és Saccharomyces cerevisiae-bol származó ARS-t), amely elősegíti az önállóan replikálódó plazmidok in vivő termelődését gomba-gazdaszervezetekben. Előnyben részesítjük, ha a találmány szerinti gombi-expressziósvektorok nem rendelkeznek a gomba A kS-szek véne iával, és így beépülnek a gazdasejt kromoszómájába a plazmid gazdasejtbe történő belépésével. Az ilyen beépülést előnyben részesítjük a fokozott genetikai stabilitás miatt. A találmány szándékai szerint egy expressziós vektor képes legalább az Escherichia co/z-ban történő replikálódás és gombasejtekbe történő beépülés, és előnyösen a találmány szerinti PVA DNSszekvenciák kifejeződésének irányítására. E. coli különböző gazdasejtek számára az alkalmas replikációs origók magukban foglalják például a CoIEI plazmid replikációs origót. A megfelelő promoterek felölelik például a trpC promotert az Aspergillus nidulans-bó\, a PVA-promotert a F. oxysporum-bó\ és a neo-r gén promoterét az E. co/z'-ból. A megfelelő terminációs szekvenciák közé tartoznak például a trpC vég az Aspergillus nidulans-ból, a PVA-vég a F. oxysporum-bói és a neo-r gén vége az E. coli-bób Szintén előnyben részesítjük, ha az expressziós vektor szelekciósmarker-szekvenciát tartalmaz. A szelekciós marker előnyösen antibiotikumrezisztencia. Szelekciós markerként phleomicinrezisztencia (gombasejtek számára), ampicillin- és neomicinrezisztencia (baktériumsejtek számára) kényelmesen alkalmazható. Ezen anyagok mindegyike ismert a szakmában, és kereskedelmileg hozzáférhető.
Különösen előnyben részesítjük az - alábbiakban itt leírt és a 10. ábrán bemutatott - PVA-t kódoló DNSszekvenciát tartalmazó pBMFXPVAó jelölésű expreszsziós vektort, vagy a pBMFXPVA6-ot azonosító tulajdonságokkal rendelkező expressziós vektorokat. Szintén elcmyben részesítjük az - alábbiakban itt leírt és a 8., 9., 11., 14. és 16. ábrákon külön-külön bemutatott pWB19N, pSJC62, pBMFXPVA7, pBMPVA-P és pBMPVA-M jelű expressziós vektorokat, vagy a pWB 19N-t, pSJC62-t, pBMFXPVA7-et, pBMPVA-P-t és pBMPVA-M-et azonosító tulajdonságokkal rendelkező expressziós vektorokat.
A pBMFXPVA7, pBMPVA-P és pBMPVA-M expressziós vektorokat külön-külön gazdasejtként tartalmazó Escherichia coli DH5a törzset 1994. december 14-én helyeztük letétbe az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland és a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően az ATCC 69721, 69 722 és 69720 nyilvántartási számok alatt.
A kívánt kódoló- és kontrollszekvenciákat tartalmazó megfelelő expressziós vektorokat összeállíthatjuk a szakmában ismert standard rekombináns DNS-technikák felhasználásával, amelyekből számosat leírnak
HU 218 265 Β
Sambrook és munkatársai [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].
A találmány tárgyát képezik ezenkívül olyan expressziós vektort tartalmazó gazdasejtek, amelyek a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciát és/vagy a 23. számú szekvenciával rendelkező promotert foglalják magukban. A gazdasejtek előnyösen olyan expressziós vektort tartalmaznak, amely magában foglalja a lényegében a 6. és 7. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkező DNS-szekvenciák valamelyikének egészét vagy egy részét. Továbbá előnyben részesítünk olyan gazdasejteket, amelyekben az expressziós vektor a replikáció és/vagy a kifejeződés irányítására képes egy vagy több szabályozó DNS-szekvenciát a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazza. Ezenkívül beletartoznak olyan gazdasejtek, amelyekben az expressziós vektor oly módon módosított (például szétszakított, kivágott vagy csonkolt) DNS-szekvenciát foglal magában, amely katalitikusán nem aktív PVA-molekulát kódol. A megfelelő gazdasejtekbe egyaránt beleértünk eukarióta- és prokarióta-gazdasejteket, például Escherichia coli sejteket. Alkalmas eukarióta-gazdasejtek közé tartoznak például a Cephalosporium acremonium, Fusarium oxysporum és Penicillium chrysogenum sejtek.
Különösen előnyben részesítjük a Fusarium oxysporum törzseket mint gazdasejteket.
Expressziós vektorok bevihetők a gazdasejtekbe a szakmában ismert különböző módszerekkel. Például a gazdasejt transzfekciója expressziós vektorokkal elvégezhető polietilénglikol közvetítette protoplaszttranszformációs módszerrel. Az expressziós vektorok gazdasejtekbe történő bevitelére azonban más módszerek is alkalmazhatók, például elektroporáció, biolisztikus injekció vagy protoplasztfuzió.
Mihelyt bevezettük az expressziós vektort a megfelelő gazdasejtbe, a gazdasejtet tenyészthetjük olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a kívánt polipeptid - előnyben részesített esetben a PVA egészét vagy egy részét tartalmazó polipeptidmolekula nagy mennyiségeinek kifejeződését.
Gazdasejtek, amelyek a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektort foglalnak magukban, azonosíthatók a következő hat általános megközelítés egyikével vagy többjével: a) DNS-DNS hibridizációval; b) markergénfunkciók jelenlétével vagy hiányával; c) a PVA mRNS-transzkriptumok keletkezésének mérése által a transzkripció szintjének megbecsülésével a gazdasejtben; d) a géntermék immunológiai kimutatásával; e) kolorimetriás kimutatással; és f) enzimmeghatározással; az enzimes analízis az azonosítás előnyben részesített módszere.
Az első megközelítésben a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia jelenléte kimutatható DNS-DNS vagy RNS-DNS hibridizációval, a DNSszekvenciával komplementer próbák felhasználásával.
A második megközelítésben a rekombináns expressziós gazdarendszer azonosítható és szelektálható markergén (például acetamid-hasznosítás, antibiotikumrezisztencia, fungicidrezisztencia, uracilprototrófin stb.) jelenléte vagy hiánya alapján. A markergén elhelyezkedhet ugyanabban a plazmidban, amelyben a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia, ugyanazon promoter vagy eltérő promoter szabályozása alatt, mint amelyet a PVA-t kódoló szekvencia szabályozására használunk. A markergén kifejeződése indukcióral vagy szelekcióra adott válaszként jelzi a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciát hordozó, teljes rekombináns expressziós vektor jelenlétét.
A harmadik megközelítésben a PVA mRNS-transzkriptumok keletkezését hibridizációs meghatározásokkal becsülhetjük meg. Például poliadenilált RNS-t izolálhatunk és analizálhatunk Northern biot vagy nukleázprotekciós analízis segítségével, az RNS-szekvenciával komplementer próba felhasználásával. Más lehetőség szerint kivonhatjuk a gazdasejt teljes nukleinsavkészleét, és meghatározhatjuk ilyen próbákkal történő hibridizációval.
A negyedik megközelítésben a PVA egészének vagy egy részének kifejeződését megbecsülhetjük immunológi.űlag, például Western blottal.
Az ötödik megközelítésben a PVA-fehérje kifejeződését megbecsülhetjük komplementációs analízissel. Például olyan sejtekben, amelyekről tudjuk, hogy hiányzik belőlük ez az enzim, a PVA-aktivitás kifejeződését kimutathatjuk egy színtelen szubsztrátnak, fenoxi-acetil-p-nitro-anilinnek sárga színű p-nitro-anilir né történő enzimes hidrolízisével a táptalaj lemezen.
A hatodik megközelítésben a PVA kifejeződése mérhető a PVA-enzim-aktivitás meghatározásával, ismert módszerek alkalmazásával. Például alkalmazhatjuk az „E: őnyben részesített kiviteli alakok részletes példái” fejezetben leírt meghatározást.
A találmány szerinti expressziós vektorok, plazmidok vagy DNS-molekulák DNS-szekvenciáit meghatározhatjuk a szakmában ismert különböző módszerek segítségével. Például alkalmazhatjuk a didezoxilánc-terminációs módszert [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] vagy a MaxamGilbert-módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564(1977)].
Természetesen be kell látnunk, hogy nem minden expressziós vektor és DNS-szabályozószekvencia működik egyformán jól a találmány szerinti DNS-szekvenciák kifejeződésében. Nem működik egyformán jól minden gazdasejt sem ugyanazon expressziós rendszerrel. A mindennapos szakmai gyakorlat azonban szelektálhat az expressziós vektorok, DNS-szabályozószekvenciák és gazdasejtek között az itt nyújtott irányelvek all almazásával, aránytalanul sok kísérlet elvégzése és a tilálmány tárgykörétől való eltérés nélkül.
A találmány tárgyát továbbá PVA előállítására szolgá.ó eljárás képezi, amely magában foglalja egy PVA kifejezésére képes expressziós vektort tartalmazó gazdasejt tenyésztését. Az előnyben részesített expressziós vektor BMFXPVA6 vagy pBMFXPVA7. Meglepő módon azt találtuk, hogy a PVA termelődése lényegesen fokozódott fenoxi-acetát mint prekurzor jelenlétében.
HU 218 265 Β
A találmány tárgyát képezik továbbá a PVA egészét vagy egy részét tartalmazó polipeptidmolekulák, amely nevezett polipeptidmolekulák előnyösen lényegében a
6. vagy 7. ábrán bemutatott aminosavszekvenciák egészével vagy egy részével rendelkeznek. A PVA egy részét tartalmazó polipeptidmolekulák esetében előnyben részesítjük a legalább körülbelül 10 aminosav hosszúságú polipeptidmolekulákat.
Minden itt azonosított aminosavmaradék természetes L-konfigurációjú. A standard polipeptid-nómenklatúrával [J. Bioi. Chem. 243, 3557-3559 (1969)] összhangban az aminosavmaradékok rövidítéseit a következő táblázatban mutatjuk be.
Szimbólum Aminosav
1 betűs 3 betűs
Y Tyr L-tirozin
G Gly L-glicin
F Phe L-fenilalanin
M Met L-metionin
A Alá L-alanin
S Ser L-szerin
I Ile L-izoleucin
L Leu L-leucin
T Thr L-treonin
V Val L-valin
P Pro L-prolin
K Lys L-lizin
H His L-hisztidin
Q Gin L-glutamin
E Glu L-glutaminsav
W Trp L-triptofán
R Arg L-arginin
D Asp L-aszparaginsav
N Asn L-aszparagin
C Cys L-cisztein
A leírásban bemutatott minden aminosavszekvencia balról jobbra haladva szerepel a szokásos, aminoterminálistól a karboxiterminális felé haladó irányban.
A találmány szerinti polipeptideket megkaphatjuk szintetikus úton, azaz a polipeptidet alkotó aminosavak kémiai szintézisével, a szakmában mindennapos gyakorlatként ismert módszerekkel. Például alkalmazhatjuk a Houghton és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5131-5135 (1985)] szilárd fázisú eljárást. Előnyben részesítjük, hogy a polipeptideket a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvenciának prokarióta- vagy eukarióta-gazdasejtekben történő kifejeződésével előállítva, vagy a PVA egészét vagy egy részét kódoló DNS-szekvencia által kódolt mRNS in vitro transzlációjával kapjuk meg. Például a 6. vagy 7. ábra DNS-szekvenciája szintetizálható PCR alkalmazásával
- ahogyan azt fent leírtuk - és inszertálható egy megfelelő expressziós vektorba, amely viszont felhasználható megfelelő gazdasejt transzformálására. A rekombináns gazdasejt azután tenyészthető a PVA előállítása céljából. Polipeptidek ily módon történő előállítására szolgáló technikák ismertek a szakmában, és itt leírjuk azokat.
Az ilyen módon előállított polipeptideket azután izolálhatjuk és tisztíthatjuk valamilyen fokig különböző fehérjetisztítási technikák alkalmazásával. Például alkalmazhatunk kromatográfiás eljárásokat, úgymint ioncserélő kromatográfiát, gélszerű, réses kromatográfiát és iir munaffinitás-kromatográfiát.
A 6-APA előállításán kívül a találmány szerinti polipeptidek felhasználhatók széles körben más területeken. Például a polipeptidek ismert módon felhasználhatók a polipeptidekhez kötődni képes poliklonális vagy monoklonális antitestek előállítására. Ezek az antitestek viszont felhasználhatók a találmány szerinti polipeptidek kimutatására mintában, például sejtmintában, immunoassay-technikák, például radioimmunoassay vagy enzim-immunoassay alkalmazásával. Az antitestek felhasználhatók affinitáskromatográfiában a találmány szerinti polipeptidek tisztítására és ezeknek különböző forrásokból történő izolálására.
A találmány szerinti polipeptideket meghatározott DNS és abból levezetett aminosavszekvenálás segítségével definiáltuk. A genetikai kód degenerációs természete miatt - amely a legtöbb aminosavmaradékra és stC'pszignálra több mint egy kodon létezését eredményezi - más DNS-szekvenciák, amelyek ugyanazt az aminosavszekvenciát kódolják, mint amelyet a 6. és 7. ábrán ábrázoltunk, alkalmazhatók a találmány szerinti polipeptidek előállítására. Ezenkívül érthető, hogy ezekne< a DNS és aminosavszekvenciáknak allélmódosulatai a természetben léteznek, vagy szándékosan előidézhetők a szakmában ismert módszerek felhasználásává . Ezek a változatok megmutathatok az egész szekvencia mentén egy vagy több aminosav eltérésével, vagy a nevezett szekvenciában egy vagy több aminosav kivágásával, helyettesítésével, beszúrásával, megfordításával vagy betoldásával. Ilyen aminosavhelyettesítések megvalósíthatók például a részt vevő aminosavmaradékok polaritásának, töltésének, oldhatóságának, hidrofób vagy hidrofil jellegének és/vagy amfipátiás hasonlósága alapján. Például negatív töltésű aminosavak közé tartoznak az aszparaginsav és glutaminsav; pozitív töltésű aminosavak közé a lizin, és arginin; a töltéssel nem rendelkező poláros főcsoportot tartalmazó és az apoláros főcsoportot tartalmazó, hasonló hidrofil jelleggel rendelkező aminosavak a következők: leucin, izeleucin, valin, glicin, alanin, aszparagin, glutamin, szerin, treonin, fenilalanin, tirozin. Egyéb szemléltető változatok felölelik az említett polipeptidek sóit és észter rit ugyanúgy, mint az említett polipeptidek prekurzorait, például N-terminális szubsztituensekkel - ügymi ít metioninnal, N-formil-metioninnal - rendelkező pre kurzorokat és vezérszekvenciákat. Mindezek a változatok beletartoznak a találmány tárgykörébe.
A következő példák további szemléltetései a találmánynak. Ezek a példák nem jelentik az oltalmi kör
HU 218 265 Β korlátozását, és a találmány további megértését szolgálják.
Előnyben részesített kiviteli alakok részletes példái A példákban a mikrobatörzseket, plazmidokat, puffért, szaporító táptalajokat és szokásos módszereket a következők szerint írjuk le.
Mikrobatörzsek és plazmidok A felhasznált plazmidokat, baktérium- és gombatörzseket az 1. táblázatban soroljuk fel.
1. táblázat
Törzsek cs plazmidok Fontos tulajdonságok Referencia
Escherichia coli DH5a F-<p80d/a<?ZÁM15 A(ZacZYA-orgF)U169 deoVrecAX endAl hsdRAI (rk-mk-) .supE44 λ-Ζ/ίζ-1 gyrA96 relAX Life Technologies Inc.
Fusarium oxysporum 435 törzs V-penicillin amidáz termelő új izolátum
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ATCC törzs ATCC 16322
pBMll/M5 NeoR, 5,6 kb ATCC 67436
pES200 AmpR, HygBR, 6,2 kb (1)
pUC19 AmpR, 2686 bp (2)
pUT715 AmpR, 3337 bp (3)
pUT715//rpC AmpR, PhIR, 4,6 kb *, 9. ábra
pWB19N NeoR, 2,9 kb *, 8. ábra
pSJC62 NeoR, PhIR, 5,3 kb *, 9. ábra
pF020 AmpR, PVA+, 6,3 kb *, 12. ábra
pF020-P AmpR, PVA+, 6,3 kb *, 13. ábra
pF020-M AmpR, PVA+, 6,3 kb *, 15. ábra
pF021 NeoR, PVA+, 15 kb *, 5. ábra
pF023 NeoR, PVA+, 9,2 kb *, 5. ábra
pBMFXPVAó NeoR, PhIR, PVA+, 10,3 kb *, 10. ábra
pBMFXPVA7 NeoR, PhIR, PVA+, 14,6 kb *,11. ábra
pBMPVA-P AmpR, PVA+, 6,3 kb *, 14. ábra
pBMPVA-M AmpR, PVA+, 6,3 kb *, 16. ábra
pBMPVA- P/DA01 AmpR, DAAO+, 6,8 kb *, 17. ábra
pBMPVA- P/DAA02 NeoR, PhIR, DAAO+, 8,7 kb * 17. ábra
pBMPVA- M/DAA03 AmpR, DAAO+, 6,9 kb *, 18. ábra
pBMPVA- M/DAA04 NeoR, PhIR, DAAO+ 8,8 kb *, 18. ábra
(1) Stábén et al., Fungal Génét. Lett. 36, 79-81 (1989) (2) Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119 (1985) (3) Jain ct al., Mól. Gén. Gcnct. 234, 489-493 (1992) * ezután írjuk le
Pufferek és táptalajok
Luria leves: 1% Difco Bacto tripton, 0,5% Difco Bacto élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid.
Luria agar: 1,5% Difco Bacto agarral kiegészített Luria broth.
SOC tápoldat: 2% Difco Bacto tripton, 0,5% Difco Bacto élesztőkivonat, 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1. Autoklávozás után egy századrész térfogat 1 M MgCl2-ot, 1 M MgSO4-ot és 20% glükózt adunk a tápoldathoz.
Fusarium vegetatív szaporító tápoldat: 6% keményítő 4% Pharmamedia (Trader Protein, Memphis, TN), 0,3% (NH4)2SO4, 0,75% KH2PO4, 0,75% K2HPO4, pH-állítás 6,8-ra 10 M NaOH-dal.
PVA-termelő tápoldat: Fusarium vegetatív szaporító tápoldat 0,4% fenoxi-acetáttal kiegészítve.
Tris-acetát elektroforézispuffer (TAE): 40 mM Trisacetát (pH 8,0), 1 mM EDTA.
20xSSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na-citrát, pH-állítás 7,0-re 10 M NaOH-dal.
20xSSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH-állítás 7,0-re 10 M NaOH-dal.
50xDenhardt-oldat: 1% Ficoll, 1% poli(vinil-pirrolidon), 1% marhaszérum-albumin (bovine serum album.n=BSA).
30xNET: 4,5 M NaCl, 0,45 M Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM EDTA.
Módszerek
Általános klónozási technikákat használtunk, DNS-szekvenálást és plazmid DNS-kivonást E. coliból Sambrook és munkatársai leírása szerint [„Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Minden restrikciós enzimet és DNS-módosító enzimet kereskedelmi forrásból szereztünk be. Ezeket a gyártó utasításai szerint használtuk. Egyéb gyakran használt módszereket a következők szerint végeztünk.
1. Az E. coli elektrotranszformációja (elektroporációja)
E. coli DH5a, sejtek friss, egyéjszakás tenyészetének 4 ml-ét inokuláltuk 400 ml Luria levesbe, és szaporítottuk 37 °C-on történő rázatással 0,6 OD6000 értékig. A sejteket 15 percig tartó jégen tartással és hideg rotorra 7000 χ g-vel 10 perces centrifügálással nyertük ki. A sejtpelletet kétszer mostuk 200 ml 0 °C-os vízzel és egyszer 10 ml 0 °C-os 10%-os glicerinnel. A sejtpelletet újra szuszpendáltuk 1 ml végső térfogatra (1-3xlO10) seit/ml) 0 °C-os, 10%-os glicerinben. A sejtszuszpenziot 1,5 ml-es polipropiléncsövekben 40 μΐ-es kis részletekben szárazjégen lefagyasztottuk, és -70 °C-on táró, tűk.
A fagyott sejteket szobahőmérsékleten felengedtük, és azután azonnal jégre tettük. Körülbelül 2-3 pl DNS-t, TE-ben vagy ligációs keverékben adtunk a sejtekhez, gyengéden kevertük, és 1 percre jégre tettük. A keveréket ezután átvittük egy előre lehűtött, 0,2 cm-es elektroporációs küvettába (Bio-Rad catalog #165-2086, Bio-Rad Laboratories, Inc.). A Bio-Rad Gene Pulser berendezést (Bio-Rad catalog #165-2075) 25 pF kapacitásra és 2,50 kV feszültségre állítottuk be. A Pulse Controllert (Bio-Rad catalog #165-2098) 200 ohm el7
HU 218 265 Β lenállásra állítottuk. A küvettát egyszer pulzáltuk ennél a beállításnál. Az elektroporáció után 1 ml SOC tápoldatot adtunk a küvettához. A sejtszuszpenziót Pasteur-pipettával átvittük egy 17x100 mm-es polipropiléncsőbe, és 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk. A sejteket szelektív táptalajra (40 pg/ml neomicint vagy 100 pg/ml ampicillint tartalmazó Luria agarra) szélesztettük.
2. Fusarium protoplaszt-transzformáció
Fusarium oxysporum törzseket tenyésztettünk 20 ml burgonyadextróz levesben (potato dextrose broth=PDB; Difco Laboratories) 24 °C-on. A mikrokonídiumokat átszűrtük egy 30 pm lyukméretű nejlonszűrőn (Spectra/Mesh Nylon N, Spectrum Medical Industries, Inc.). A mikrokonídiumokat szobahőmérsékleten, 1500xg-vel 8 percig történő centrifugálással pelletáltuk. A mikrokonídiumokat kétszer mostuk steril desztillált vízzel. Körülbelül 1 χ 10ιθ mikrokonídiumot csíráztattunk ki 100 ml PDB-ben 24 °C-on 15 órán át történő rázatással. A kicsírázott mikrokonídiumokat szobahőmérsékleten, 1500xg-vel 8 percig történő centrifugálással gyűjtöttük össze steril 50 ml-es kúpos csövekben. A pelletet kétszer mostuk O pufferrel (1,4 M MgSO4, 50 mM nátrium-citrát, pH 5,8). A kicsírázott mikrokonídiumokat 2% Novozyme 234-et (BiosPacific, Inc.) tartalmazó O puffer 20 ml-ével kezeltük 1-2 óráig 24 °C-on. Amikor 90%-nál több protoplaszt képződött, a keveréket két 15 ml-es kúpos csőben 900 χ g-vel 30 percig centrifugáltuk 4 °C-on. A protoplasztokat pipettával óvatosan leszívtuk a szuszpenzió tetejéről, és kétszer mostuk T pufferben (1,2 szorbit, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) 4 °C-on. A protoplasztokat 1 χ 109/ml koncentrációban szuszpendáltuk 6% polietilénglikol-4000-et és 1% dimetil-szulfoxidot tartalmazó T pufferben. A protoplasztokat kis részletekben, 1,5 ml-es polipropiléncsövekben szárazjégen lefagyasztottuk, és -70 °C-on tároltuk.
A protoplasztokat a fagyott szuszpenzió szobahőmérsékleten történő felengedésével és 2 mM végső koncentrációjú aurin-trikarboxilát nukleáz inhibitor hozzáadásával transzformáltuk. 10 μΐ TE-ben 10-20 pg plazmid DNS-t adtunk a protoplasztszuszpenzió 200 pléhez, és 30 percig jégen tartottuk. 60% polietilénglikol—4000/50 mM CaCl2 oldatát adtuk két 200 pl-es és egy 800 pl-es térfogatban gyengéd kevertetés mellett minden hozzáadás között, és 30 percig jégen tartottuk. Azután 1,2 M szorbit/0,5 χ PDB 10 ml-ét adtuk hozzá kíméletes keverés mellett. A protoplasztokat 900 xgvel 8 percig 4 °C-on történő centrifugálással pelletáltuk. A pelletet 1,2 M szorbit/0,5 χ PDB 0,5 ml-ében szuszpendáltuk. A protoplasztszuszpenzió 0,1 ml-ét 1,2 M szorbit/0,5 χ PDB/1,5% agar összetételű - két rétegben frissen kiöntött - lemezre szélesztettük. Az alsó réteg 12,5 ml táptalajt tartalmazott 75 pg/ml phleomicinnel, amely lassan átdiffundált a felső rétegben levő 12,5 ml táptalajba. A lemezeket 24 °C-on inkubáltuk 7 napig. A transzformátumokat a 20 pg/ml phleomicint tartalmazó 1 χ PDA táptalajon történő növekedéssel és a plazmid DNS-próbával végzett DNS dot-blot hibridizációval igazoltuk.
3. A kromoszomális DNS kivonása Fusarium törzsekből
Fusarium protoplasztokat készítettünk, ahogyan azt a fusarium protoplaszt-transzformáció” fejezetben leírtuk. Miután a protoplasztokat összegyűjtöttük a szuszpenzió tetejéről és kétszer mostuk T pufferben 4 °C-on, a protoplasztokat újraszuszpendáltuk 4 ml lízispufferben [0,7 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA és 1% nátrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulfate=SDS)], gyengéden kevertük és 5 percig 37 °Con inkubáltuk. Egy tized térfogat 10%-os hexadecil-trimetil-ammónium-bromidot (CTAB) 0,7 M NaCl-ban adtunk a protoplasztlizátumokhoz, óvatosan kevertük, és 15 percig 65 °C-on inkubáltuk. A kromoszomális DNS-t megegyező térfogatú kloroform: izoamil-alkohol (24:1) keverék hozzáadásával extraháltuk. Összegyűjtöttük a vizes oldatot, és 6/10 térfogat izoamil-alkoholt adtunk hozzá a kromoszomális DNS kicsapása céljából. A DNS-t szobahőmérsékleten 5 percig tartó 1500 χ g centrifugálással gyűjtöttük össze. A DNS-t egyszer mostuk 70%-os etanollal, vákuum alatt szárítottuk. A DNS-t újraszuszpendáltuk 200 pg/ml ribonukleáz A-t (EC 3.1.27.5, Sigma Chemical Co.) tartalmazó 1 ml TE-ben és 37 °C-on 20 percig inkubáltuk. Egy proteináz K oldat (EC 3.4.21.14, Boehringer Mannheim, GmbH) készítményt adtunk hozzá 400 pg/ml végső koncentrációban, és a DNS-oldatot 37 °C-on 20 percig inkubáltuk. 1/10 térfogat 3 M NaCl-oldatot adtunk hozzá, és a DNS-oldatot kétszer extraháltuk megegyező térfogatú fenol: kloroform: izoamil-alkohol (25:24:1) keverékke . A vizes oldatot összegyűjtöttük, és két térfogat etanolt adtunk hozzá a kromoszomális DNS kicsapása céljából. A DNS-t azután szobahőmérsékleten 5 percig tartó 1500xg centrifugálással gyűjtöttük össze. A DNS-t egyszer mostuk 70%-os etanolban, vákuum alatt szárítottuk, és újraszuszpendáltuk 1 ml TE-ben.
4. A DNS megjelölése
DNS-próbákat készítettünk plazmid DNS-ből vagy agarózzal tisztított DNS-fragmentumokból, és megjelöltük a-32P-dCTP-vel (Amersham Corp.) a Nick transzlációs rendszer (Life Technologies, Inc.) felhasználásával. Oligonukleotidpróbákat foszforileztünk γ-32ΡATP-vel (Amersham Corp.) T4 polinukleotid kináz enzim segítségével. A megjelölt próbák bármelyik felhasználása előtt a DNS-próbákat hővel denaturáltuk 100 °Con 5 percig, és gyorsan lehűtöttük jégen 2 percig.
5. DNS dot-blot hibridizáció
DNS-mintákat 0,4 M NaOH, 10 mM EDTA keverékével 0,4 ml teljes térfogatban hővel denaturáltunk 100 °C-on 10 percig, és BioRad Zeta-probe GT membránra (Bio-Rad Laboratories, Inc.) vagy nitro-cellulóz-membránra (Minifold, Schleicher & Schnell, Inc.) vittük fel vákuum alatt egy dot-blot berendezésben (Minifold, Schleicher & Schnell, Inc.). Hibridizációt végeztünk hibridizációs kemencében (Laboratory Products Sales, Inc.). A Zeta-probe GT membránt egy palackba helyeztük, és előhibridizáltuk 5 ml hibridizációs pufferrel (0, 5 M Na2HPO4, pH 7,2, 7% SDS) 65 °C-on 2 crás forgatással. Azután az oldatot 5 ml frissen készíteti hibridizációs pufferrel cseréltük le. Hozzáadtuk a megjelölt DNS-próbát és hibridizációt végeztünk 16-24 órán át 65 °C-on forgatással. A hibridizált
HU 218 265 Β membránt kétszer mostuk 65 °C-on egyenként 30 percig, 40 mM Na2HPO4-et (pH 7,2) és 5% SDS-t tartalmazó pufferben. A membránt ezt követően még kétszer mostuk 65 °C-on 40 mM Na2HPO4-et (pH 7,2) és 1% SDS-t tartalmazó pufferben. Amikor nitro-cellulóz-membránt használtunk, a hibridizációt hasonló körülmények között végeztük el, kivéve a hibridizációs puffer összetételét, amely 6xSSC, 5 χ Denhardt-oldat, 10 mM kálium-foszfát (pH 7,2), 0,1% SDS és ml-enként 250 pg denaturált lazacsperma-DNS volt. A hibridizált membránt kétszer mostuk 65 °C-on egyenként 30 percig, 2 χ SSC, 0,1% SDS keverékével, amelyet két 30 perces, 65 °C-on történő mosás követett 0,1 xSSC, 0,1% SDS keverékével. Ha oligonukleotidpróbát használtunk, a hibridizáció és a mosás hőmérsékletét 50 °C-on tartottuk. Mosás után a membránt Kodak XAR-5X-ray filmre (Eastman Kodak Co.) exponáltuk autoradiográfiához.
6. Southern DNS-hibridizáció
Fusarium kromoszomális DNS-t emésztettünk befejezésül néhány különböző restrikciós enzim mindegyikével, és 0,25 pg/ml etídium-bromidot tartalmazó TAE pufferben 0,8%-os agarózgélen keresztül elektroforetizáltuk. A gélt savas depurinációval, alkalikus denaturációval és neutralizációval kezeltük Sambrook és munkatársai leírása alapján, és Bio-Rad Zeta-probe GT membránra vagy nitro-cellulóz-membránra vittük fel Bio-Rad Model 785 Vacuum Blotter (Bio-Rad catalog #165-5000) alkalmazásával. A DNS-hibridizációt és autoradiográfiát a fent leírtak szerint végeztük el.
7. V-penicillin amidohidroláz enzim meghatározása
Konídiumokat izoláltunk Fusarium oxysporum törzs 1 hetes burgonyadextróz agaros (PDA, Difco Laboratories) lemezeiről a felület 5 ml steril desztillált vízzel való mosásával. A konídiumokat tartalmazó oldat 0,5 ml-ével inokuláltunk 25 ml Fusarium vegetatív szaporító tápoldatot 125 ml-es lombikban. A vegetatív tenyészetet 72 óráig szaporítottuk forgató rázógépen (250 rpm) 24 °C-on, és a vegetatív tenyészet 0, 2 ml-es kis mennyiségét inokuláltuk 25 ml PVA termelő tápoldatba 125 ml-es lombikban. A tenyésztést forgató rázógépen végeztük 24 °C-on 144 órán keresztül.
A termelőtenyészetet először 5 mM kálium-foszfát-pufferben (pH 7,5) hígítottuk. Megfelelően hígított tenyészet 1 ml-ét adtuk 1 ml, 25 mM kálium-foszfátpufferben (pH 7,5) készített 3% os V-penicillin oldathoz. A reakciókeveréket 35 °C-on 15 percig rázattuk, és leállítottuk 1 ml 6%-os (w/v) triklór-ecetsav-oldattal (trichloracetic acid=TCA). A keveréket centrifugáltuk 1500xg-vel 8 percig. A tiszta felülúszó 1 ml-ét adtuk 3 ml p-(dimetil-amino)-benzaldehid (p-DAB) munkaoldathoz, amelyet 1 rész 100-os metanolban oldott 1% pDAB és 6 rész ecetsav: víz: 1 M NaOH (40:19:1) keverékének összeöntésével készítettünk. A keveréket szobahőmérsékleten tartottuk 5 percig, és 415 nm-en optikai denzitást mértünk. Az 1 ml 100 pg/ml 6-APA-t és 3 ml p-DAB munkaoldatot tartalmazó kontrollcső 0,27 optikaidenzitás-értéket eredményezett 415 nm-en. Az enzimaktivitást (NE/ml) a 415 nm-en leolvasott optikaidenzitás-értéknek a hígítási faktorral és 0,34 szorzótényezőnek a szorzatával számítottuk ki. A V-penicillin amidohidroláz-aktivitást nemzetközi egységben (NE) fejeztük ki, egy egység ekvivalens percenként 1 pmol Vpenicillin átalakításával a fenti meghatározási körülmények között.
1. példa
V-penicillin amidáz aminosavszekvenciája
A PVA-enzim szekretált formáját izoláltuk, tisztítottuk és jellemeztük. Ez egy 65 kDa molekulatömegű glikoprotein. A tisztított enzimet bróm-ciánnal emésztettük. A bróm-ciánnal emésztett PVA gélszűréses kromatográfiája Sephadex G-100 oszlopon hat főfragmentum - A, Bl, B2, C, D és E - tisztítását tette lehetővé. Mind a áat peptidffagmentum, mind az érintetlen PVA-molekula N-terminális aminosavszekvenciáját automatizált Edman-degradációs módszerrel [Hunkapiller és Hood, Science 219, 650-659 (1983)] határoztuk meg. A kapott peptidszekvenciákat az 1. ábrán mutatjuk be.
2. példa
V-penicillin amidáz cDNS klónozása
1. Az mRNS kivonása a Fusarium oxysporum 435 törzsből
Fusarium oxysporum 435 törzs sejtjeit szaporítottuk PVA termelő tápoldatban, mostuk és újraszuszpendáltuk guanidin-izotiocianát-pufferben, és szonifikáltuk a sejtek szétroncsolása céljából. Teljes RNS-t izoláltunk CsCl-pámán keresztül történő centrifugálással [Glisin et al., Biochem. 13, 2633-2637 (1974)]. mRNS-t készítettünk oligo(dT) kromatográfiával [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)], amelyet szacharózgradiens frakcionálás követett. Minden frakcióban in vitro transzlációval és immunprecipitációval határoztuk meg a mRNS-t.
2. cDNS szintézise és cDNS-könyvtár készítése
Komplementer DNS-t (cDNS-t) készítettünk mRNSből a Gubler-Hofftnan-féle eljárást követve [Gubler és Hoffrnan, Gene 25, 263-269 (1983)]. Az első szálat 50 pl reakciókeverékben szintetizáltuk, amely 3 pg mRNS-t, 50 mM Tris-HCl-ot (pH 7,5), 65 mM KCl-ot, 3 mM MgCl2-ot, 10 mM DTT-t, 0,5 pg oligo (dT)-t, 2,5 pg actinomicin D-t, 4 dNTP mindegyikéből 1 mM-t és 2 egység Muréna Leukémia Vírus (MLV) reverz transzkriptázt. A reakciót 0 °C-on 3 percig, azután 20 °C-on 5 percig és 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk. 2 pl EDTA-t és 5 pl 3 M NaCl-ot adtunk hozzá a reakció végé a. A keveréket fenol/kloroform elegyével extraháltuk, és kicsaptuk 2 térfogat etanollal. A második szálat repair szmtézises reakcióval készítettük el RN-áz H, DNS-polimeráz és DNS-ligáz felhasználásával. Az első szál szintéziséből kapott DNS-t 100 pl repair pufferben oldottuk, amely 20 mM Tris-HCl-ot (pH 7,5), 5 mM MgCl2-ot, 10 mM ammónium-szulfátot, 100 mM KCl-ot, 150 pM β-NAD-ot, 4 dNTP mindegyikéből 40 uM-t, 5 pg BSA-t, 1 egység E. coli RN-áz H-t, 20 egység DNSpolimeráz I-et és 1 egység E. coli DNS-ligázt tartalmazott. A keveréket 12 °C-on 1 órán át inkubáltuk, és azután még 1 órát 20 °C-on. A reakció végén 10 pl 3 M NaCl-ot adtunk hozzá, és a keveréket fenol/kloroform
HU 218 265 Β elegyével extraháltuk. A DNS-t kicsaptuk 2 térfogat etanol hozzáadásával. A cDNS C-végét terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) és dCTP felhasználásával farkaztuk. A C-farkazott cDNS 1 ng-ját annealingnek vetettük alá, és G-farkazott pUC19 plazmid 25 ng-jával ligáltuk. A ligáit DNS-t felhasználtuk E. coli transzformálására és cDNS-könyvtár elkészítésére.
3. Oligonukleotidpróbák készítése
Négy oligonukleotidpróbából álló sorozatot (2. ábra, 11. számú szekvencia) származtattunk a PVA-enzim karboxilvégéhez közel eső C peptidből (1. ábra, 5. számú szekvencia) származó hét aminosav (8. számú szekvencia) reverz transzlációjával.
4. A PVA cDNS-klón azonosítása és teljes hosszúságú cDNS létrehozása
A cDNS-könyvtár telepeit degenerált oligonukleotidpróbával (2. ábra, 11. számú szekvencia) screeneltük. Kolóniabiotokat screeneltünk a végeken 32P-vel jelölt próbákkal történő hibridizációval, hibridizációs pufferben (6xNET/10xDenhardt/l% SDS) 50 °C-on.
A hibridizált membránt kétszer mostuk szobahőmérsékleten 2xNET/0,l% SDS keverékével egyenként 30 percig, amelyet két 30 perces mosás követett 50 °C-on 0,5 xNET/0,1% SDS keverékével. Egy erősen hibridizáló telepet (#362) kiválasztottunk további vizsgálathoz. Ez egy 500 bp inszertumot tartalmazott, amelyet próbaként használtunk a könyvtár újrascreeneléséhez. A második klón (#2585) egy 1,7 kb inszertumot tartalmazott, és erősen hibridizált a próbával. A PVA N-terminális aminosavszekvenciájának összehasonlítása az inszertum 5’-végének transzlációjával azt jelzi, hogy az érett enzim teljes kódolórégiója öt aminosav kivételével klónozva lett (3. ábra). Pstl restrikciós hasítási helyet hoztunk létre az 5’-végen pontmutációval #2585-M előállítására. Szintetikus linkért adtunk hozzá a #2585-M kiónnak teljes hosszúságú cDNS-klónná, 2585-FL-lé történő átalakítása céljából (3. és 4. ába).
5. A 2585-FL cDNS-klón DNS-szekvencia-analízise
A 2585-FL cDNS-inszertum mindkét szálát szekvenáltuk a Maxam-Gilbert-féle módszer segítségével [Maxam és Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977)]. Az inszertum tartalmaz egy 1521 bp hosszúságú nyílt leolvasási keretet, amely egy 55 000 Da fehérjét kódolhat (6. ábra). Az érintetlen PVA-molekula és a bróm-ciánnal emésztett peptidfragmentumok N-terminálisából az aminosavszekvencia-adatok mindegyike megtalálható ebben a szekvenciában. A régiót (1348-1368. bp, 20. számú szekvencia), amely megfelel a 20 tagú oligonukleotidpróbának (11. számú szekvencia) aláhúztuk a 6. ábrán.
3. példa
V-penicillin amidáz genomiális DNS klónozása
1. A genomiális PVA-génfragmentum azonosítása
Fusarium oxysporum 435 törzsből származó, nagy molekulatömegű kromoszomális DNS-t emésztettünk néhány restrikciós enzimmel, TAE pufferben 0,6%-os agarózgélen keresztül elektroforetizáltuk és nitro-cellulóz-membránra vittük át. A 2585 inszertum DNS-ből készített próbát hibridizáltuk a Southern blotra a PVA-gént tartalmazó fragmentumok méretének meghatározása céljából. A gént egy körülbelül 12 kb EcoRI fragmentumon találtuk meg.
2. A pWB19N plazmid összeállítása
A pBMll/M5 (ATCC 67436) plazmidot a pBMllből (ATCC 67366) származtatjuk, amelyben a neomicinrezisztencia-génben jelen levő Ncol helyet pontmutácioval eltávolítottuk. A pBMll/M5 plazmid DNS-t HindlII-mal és Smal-gyel emésztettük. A HindlII hasításból eredő kiugró 5’-végeket tompa végekké alakítottuk át az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumának felhasználásával. A DNS-keveréket elektroforézisnek vetettük alá 0,8%-os preparatív agarózgélen. A neomicinrezisztencia-gént tartalmazó 1,3 kb fragmentumot kivágtuk a gélből, és elektroeluciónak vetettük alá 100 V mellett 1 órán át szobahőmérsékleten. Az eredményül kapott eluátumot összegyűjtöttük, és 3-szor extraháltuk azonos térfogatú, TE-vel telített fenollal. A DNS-t 0,3 M NaCl jelenlétében etanolos kicsapással visszanyertük a vizes fázisból. A DNS-fragmentum visszanyerését agarózgélelektroforézissel analizáltuk.
A pUC19 plazmid DNS-t [Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119 (1985)] BspHI-gyel hasítottuk, és a kiálló 5’-végeket Klenow-fragmentummal tompa végekké alakítottuk. A polilinkerhelyeket és a replikáció eredetét tartalmazó 1,6 kb fragmentumot (2639-2686. bp és 1-1526. bp) izoláltuk, és ligáltuk az 1,3 kb neomicinrezisztenciagén-fragmentumhoz ligációs puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% polietilénglikol-8000) és T4 DNSligáz jelenlétében.
Az eredményül kapott pWB19N plazmidot elektroporációval E. coli DH5a sejtekbe juttattuk. Neomicinrezisztens telepeket screeneltünk pWB19N plazmid jelenlétére, amely rendelkezik egy helyreállított BspHI he lyel a Klenowval feltöltött HindlII és BspHI helyek elágazási pontjában. A telepeket ampicillinérzékenységre, és X-gal lemezeken β-galaktozidázaktivitás a-komplementációjára is screeneltük. A pWB19N szerkezetét a 8. ábrán szemléltetjük.
3. A genomiális PVA-génfragmentum klónozása
100 pg, Fusarium oxysporum 435 törzsből származó nagy molekulatömegű kromoszomális DNS-t hasítottunk EcoRI-gyel. A DNS-t elektroforézisnek vetettük alá TAE pufferben 0,6%-os agarózgélen keresztül. A 11,5-12 kb méretű DNS-t kivágtuk a gélből, és elektroelúciónak vetettük alá 100 V mellett 1 órán át szobahőmérsékleten. Az eredményül kapott eluátumot összegyűjtöttük, és háromszor extraháltuk megegyező térfogatú, TE-vel telített fenollal. A DNS-t 0,3 M NaCl jelenlétében etanolos kicsapással visszanyertük a vizes fázisból. A körülbelül 12 kb DNS-fragmentumot azután a pWB19N vektorba klónoztuk pF021-et képezve (5. ábra). A pF021 DNS restrikciós analízise feltárta, hogy a klónozott fragmentum tartalmazza a teljes PVA gént, a PVA-t kódoló szekvenciák további 3,7 kb upstream és 6,8 kb downstream szekvenciáival együtt.
4. DNS-szekvencia-analízis
HU 218 265 Β
A genomiális klón kódolórégióját szintén a Maxam-Gilbert-féle módszerrel szekvenáltuk (7. ábra). A cDNS- és genomiális szekvenciák azonosak voltak, kivéve az 5’-végen való kodonhasználatot és azt a helyet, ahol a szintetikus linker beékelődött a cDNS-klónba. A genomiális kiónban további 315 bp szekvenciainformációt szereztünk az 5’-végen. Ez az adat azt sugallja, hogy a PVA mRNS-transzlációja a 7. ábra 241. bázisánál kezdődik, és hogy egy 25 aminosav hoszszúságú szignálszekvenciát tartalmazó „elő-PVA” szintetizálódik és azután elhasad, kialakítva a PVA-enzim szekretált formáját.
A transzkripciós starthelyet SÍ-térképezéssel állapítottuk meg [Berk és Sharp, Cell 12, 721-732 (1977); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)]. Ez a 162. bázisnál vagy annak közelében helyezkedik el. Nem találtunk más potenciális ATG transzlációs startszignálokat ezen hely és a 241. bázisnál elhelyezkedő ATG között.
4. példa
PVA-gén-expresszió heterológ gazdaszervezetekben
1. A pSJC62 plazmid összeállítása
A pES200 plazmid [Stábén et al., Fungal Génét. Lett. 36, 79-81 (1989)] rendelkezik az Aspergillus nidulansAoöl származó trpC promoterszekvenciával a bakteriális hygromicin B rezisztenciagén transzkripciójának irányítására. A pSE200 DNS-t EcoRI és Clal enzimekkel hasítottuk; a kiálló 5’-végeket Klenow-ffagmentummal tompa végekké alakítottuk. Az 1250 bp trpC promoterfragmentumot agarózgél-elektroforézissel izoláltuk, és visszanyertük elektroelúcióval. A pUT715 plazmid [Jain et al., Mól. Gén. Génét. 234, 489-493 (1992)] egy promoter próba vektor, amely hordoz egy promoter nélküli - Streptoalloteichus hindustanus-bó\ származó - phleomicinrezisztencia-gént. A pUT715 DNS-t EcoRV-tel emésztettük, és az 1250 bp trpC promoterffagmentumhoz ligáltuk. A ligációs keveréket E. coli DH5a törzsbe transzformáltuk, és az eredményül kapott plazmidot pUT715!trpC-\c\ jelöltük.
A pUT715/ApC DNS-t BamHI és BglII enzimekkel emésztettük. A trpC promotert és a phleomicinrezisztencia-gént tartalmazó 2,4 kb fragmentumot agarózgélelektroforézist követően izoláltuk. A pWB19N DNS-t hasítottuk BamHI enzimmel, és a 2,4 kb fragmentumhoz ligáltuk. Az eredményül kapott plazmidot pSJC62 jelöléssel láttuk el (9. ábra).
2. A pF023 összeállítása
A pF021 plazmid rendelkezik egy - a Fusarium oxysporum 435 törzs genomiális DNS-éből származó körülbelül 12 kb EcoRI fragmentum-inszertummal A pF021 DNS-t Sáli enzimmel hasítottuk, és újra összekötöttük cirkulárissá T4 DNS-ligáz segítségével. Az eredményül kapott pF023 plazmid a pF021-ből a nemkódoló Fusarium DNS 5,8 kb deléciójával rendelkezik (5. ábra).
3. A pBMFXPVAó összeállítása
A pSJC62 DNS-t EcoRI és Xbal enzimekkel hasítottuk. Az eredményül kapott - az Aspergillus trpC promotert és a phleomicinrezisztencia-gént tartalmazó 2,4 kb fragmentumot izoláltuk. A pF023 DNS-t EcoRI és Xbal enzimekkel emésztettük. A DNS-keveréket agarózgélen szeparáltuk. A PVA-gént tartalmazó 7,9 kb fragmentumot izoláltuk, és az Aspergillus trpC promotert és a phleomicinrezisztencia-gént tartalmazó 2,4 kb fragmentumhoz ligáltuk. Az eredményül kapott plazmidot pBMFXPVAó jelöléssel illettük (10. ábra).
4. A pBMFXPVA7 összeállítása
A 'pBMFXPVAó DNS-t Ncol és Xbal enzimekkel hasítottuk. A ragadós végeket tompa végekké alakítottuk át Klenow-fragmentum segítségével. A DNS-keveréket agarózgélen szeparáltuk, és a PVA-gént tartalmazó 4,3 kb fragmentumot izoláltuk. A pBMFXPVAó DNS-t Xbal enzimmel hasítottuk és Klenow-fragmentummal kezeltük. A linearizált pBMFXPVAó DNS-t a 4,3 kb PVA-génfragmentumhoz ligáltuk pBMFXPVA7 plazmidot képezve (11. ábra).
5. PVA-gén-expresszió heterológ gazdaszervezetben, Rekombináns pBMFXPVAó plazmidot származtattunk pF023-ból (5. ábra) az Aspergillus nidulans trpC promoterének szabályozása alatt álló phleomicinrezisztencia-gén betoldásával (10. ábra). Rekombináns pBMFXPVA7 plazmidot származtattunk pBMFXPVAó-ból a PVA-gén második másolatának betoldásával (11. ábra). Ezeket a rekombináns plazmidokat bevittük az ATCC 16322 törzsbe (F. oxysporum f. sp. lycopersicí) amely a PVA-génnek heterológ gazdaszervezete (azaz a 7. oxysporum-tól eltérő alfaj) - polietilénglikol közvetítette protoplaszttranszformációval [Powell és Kistler, J. Bacteriol. 172, 3163-3171 (1990)]. A phleomicinrezisztens transzformátumok DNS-analízise megerősítette, hojjy a transzformáló DNS-ek beépültek a gazdasejt-kromcszómákba. Ez ideig a Fusarium oxysporum 435 törzset nem tudták transzformálni e polietilénglikol közvetítette protoplaszttranszformációs eljárás alkalmazásával.
A transzformátumokat ezután rázatott lombikokban fermentáltuk, és meghatároztuk a PVA-aktivitást. A F. oxysporum 435 törzs 20 NE/ml-t termelt. A nem transzformáit ATCC 16322 törzs 1,0 NE/ml-t termelt, a pBMFXPVAó plazmidot (egy PVA-gént) tartalmazó transzformátumok 10 NE/ml-t és a pBMFXPVA7 plazmidot (két PVA-gént) tartalmazó transzformátumok 130 NE/ml-t termeltek (2. táblázat). Összegezve, a heterológ gazdaszervezetben kifejezett PV A-akti vitás az eredeti F. oxysporum 435 törzshöz képest 5-szörösére emelkedett.
2. táblázat
V-penicillin amidohidroláz enzimaktivitása
Törzsek Titer rázatott lombikban (NE/ml)
Fusarium oxysporum 435 20
ATCC 16322 1
ATCC 16322 (pBMFXPVAó)· (egy PVA-gén) 10
ATCC 16322 (pBMFXPVA7)+ (két PVA-gén) 130
HU 218 265 3
Továbbá a rekombináns PVA kifejeződése ugyanolyan mértékben indukálható fenoxi-acetát jelenlétében, mint a F. oxysporum 435 törzsnél (3. táblázat).
3. táblázat
A V-penicillin amidohidroláz gén kifejeződésének fenoxi-acetát-indukciója
Törzs Titcr (NE/ml) -fcnoxi-acctát Titcr (NE/ml) +fcnoxi-acctát Induk- ció szintje
F. oxysporum 435 0,49 21,13 43x
ATCC 16322 (pBMFXPVA7)+ 2,73 135,32 50x
5. példa
Gomba-expressziósvektorok összeállítása
A PVA-gén kifejeződése indukálható fenoxi-acetát-adagolással. Úgy tűnik, hogy expressziós vektorok kifejleszthetők a PVA - promotemek nevezett - transzkripciós és transzlációs szabályozórégiójából, idegen gének F. oxysporum-ban történő kifejezéséhez.
A következő összeállításokat az intracelluláris fehérjék kifejezésére szolgáló pBMPVA-P plazmid és a szekretálható fehérjék kifejezésére szolgáló pBMPVA-M plazmid létrehozására használtuk fel.
1. A pF020 összeállítása
A pF023 DNS-t BamHI és Xhol enzimekkel hasítottuk. A DNS-keveréket agarózgélen szeparáltuk A PVA-gén 5’-végétől upstream elhelyezkedő transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákat tartalmazó 2,1 kb fragmentumot izoláltuk A pF023 plazmidot is hasítottuk Xhol és HindlII enzimekkel. A PVA-gén második részét tartalmazó 1,5 kb fragmentumot gélen tisztítottuk. Mindkét fragmentumot ligáltuk a pUCl Síhez a HindlII és BamHI helyeken. Az eredményül kapott plazmidot pF020-ként jelöltük A pF020 szerkezetét a 12. ábra mutatja.
2. A pF020-P összeállítása
Morinaga és munkatársaitól származó pontmutációs eljárást [Bio/Technol. 2, 636-639 (1984)] alkalmaztunk a PVA-gén transzlációs starthelyén történő Miül hely létrehozására (a 21. számú szekvencia 241. számú bázispárja).
ATGCGCGTC (24. számú szekvencia)
J, helyspecifikus mutagenezis
ATACGCGTC (25. számú szekvencia)
Miül hely
A Miül hely létrehozása lehetővé teszi a PVA-gén kódolórégiójának Miül és BamHI enzimes hasítással történő eltávolítását, és helyettesítését egy olyan gén kódolószekvenciájával, amely a PVA-promoter kontrollja alatt fejeződik ki. Egy 15 tagú mutagén oligonukleotidot (GGCACTATACGCGTC, 26. számú szekvencia) szintetizáltunk.
A pF020-P szerkezetét a 13. ábrán rajzoltuk meg. pF020 2 pg-ját emésztettük Xmal enzimmel, amelyet bakteriális alkalikus foszfatázzal (BAP) történő kezelés követett a keletkező I fragmentum önmagával való ligációjának elkerülésére. pF020 2 pg-ját hasítottuk EcoRI és Sphl enzimekkel a mutációs célrégió (például a PVAgén upstream régiója) eltávolítása céljából. Az eredményül kapott 5 kb fragmentumot (II fragmentumot) gélen tisztítottuk. I és II fragmentumok egyenlő moláris mennyiségeit kevertük a 15 tagú mutagén oligonukleotid 200-szoros moláris feleslegével. A keveréket 100 °C-on 3 percig inkubáltuk a keverékben levő DNS-fragmentuinok teljes denaturálása céljából. A denaturáció után a keveréket fokozatosan hűtöttük le lépésről lépésre, lehetővé téve a denaturált DNS-fragmentum újrahajlítását (reannealing). Ez alatt az újrahajlítási eljárás alatt a két eredeti I és II fragmentumon túl két új DNS-species képződött, DNS-a és DNS-b. Ahogyan azt a 13. ábrán bemutatjuk, a 15 tagú mutagén oligonukleotid a két cirkuláris DNS-speciesnek csak egyikével hibridizált a heteroduplexet képezve, mivel az oligonukleotid a célrégió két szála közül csak az egyikkel volt komplementer. A DNSeket Klenow-fragmentummal, T4 DNS-ligázzal és négy dNTP-vel inkubáltuk. Ez a kezelés a nyitott cirkuláris DNS-t zárt cirkuláris DNS-sé alakította. A reakció után a keveréket E. coli DH5a transzformálására használtuk fel. A transzformátumok plazmid DNS-eit Miül hasításos analízissel screeneltük. A pF020-P plazmidot Miül hasítási hely létrejöttével azonosítottuk.
3. A pBMPVA-P összeállítása
Mivel a pF020-P két BamHI hellyel rendelkezik, amely megakadályozza ennek az expressziós vektornak a használatát, a pUC19 vektor régiójából a BamHI helyet el kell távolítani. A pF020-P plazmidot BamHI enzii n korlátozott mennyiségével kezeltük részlegesen hasított állapot létrehozására, és utána EcoRI-gyel hasítottuk. A kiálló 5’-végeket Klenow-fragmentummal töltöttük fel. 6,3 kb fragmentumot tisztítottunk gélen, T4 DNS-ligázzal kapcsoltuk és E. coli DH5cc törzsbe transzfoimáltuk. Az eredményül kapott pBMPVA-P plazmid (14. ábra) felhasználható expressziós vektorként a kívánt gén kódolószekvenciájának beszúrására MluI/BamHI helyeknél a PVA-promoter kontrollja alatt.
4. A pF020-M összeállítása
Smal helyet hoztunk létre a PVA szekréciós szignálszekvenciája és az érett PVA-fehérje elágazásánál (22. számú szekvencia, 24-25. aminosavak).
AACAAA/GGCAAC (27. számú szekvencia)
N KG N (28. számú szekvencia) í helyspecifikus mutagenezis
AACCCC/GGGAAC (29. számú szekvencia)
Smal hely
A Smal helyek létrehozása megengedi egy kódolószekvencia beszúrását a PVA szekréciós szignálszekvencia után, és így lehetővé teszi majd a kifejeződött fehérje szekrécióját. Egy 28 tagú mutagén oligonukleotid ot (GCAGCTCCCAACCCCGGGAACGATGATT, 30. számú szekvencia) szintetizáltunk.
A pF020-M szerkezetét a 15. ábrán mutattuk meg. Az eljárás hasonló volt a pF020-P összeállításához. A pF020 plazmidot hasítottuk Xmal enzimmel, amelyet BAP kezelés követett az I fragmentum előállításába. A pF020-at ezután Sphl és HindlII enzimekkel emésztettük a célrégió eltávolítása céljából, és egy 6 kb
HU 218 265 Β
II fragmentum létrehozására. A heteroduplexképzés és a DNS-kiterjesztés körülményei hasonlóak voltak a pF020-P összeállításához. Transzformátumok plazmid DNS-eit screeneltük egy további Smal hely létrejöttére.
5. A pBMPVA-M összeállítása
A pF020-M plazmid két BamHI és két Smal hellyel rendelkezik, amely megakadályozza ennek a vektornak a használatát. A fölösleges BamHI és Smal helyeket a pUC19 régióból el kell távolítani. A pF020-M plazmidot részlegesen hasítottuk BamHI-gyel, és utána EcoRIgyel hasítottuk. A ragadós végeket feltöltöttük Klenowfragmentummal. 6,3 kb fragmentumot tisztítottunk gélen, ligázzal kapcsoltuk és E. coli DH5a törzsbe transzformáltuk. Az eredményül kapott pBMPVA-M plazmid (16. ábra) felhasználható szekretálható expressziós vektorként a kívánt gén kódolószekvenciájának beszúrására a Smal/BamHI helyeknél a PVA promoter kontrollja alatt.
6. példa
A D-aminosav oxidáz gén kifejezése a PVA expressziós vektorokkal
A D-aminosav oxidáz gént - amelyet a Trigonopsis varia bilis-bői klónoztunk - használtuk a Fusarium PVA expressziós vektorokkal kifejezendő idegen gén példájaként.
1. A D-aminosav oxidáz gén kifejezése pBMPVA-P-vel
A Trigonopsis variábilis D-aminosav oxidáz (DAAO) gént a Bristol-Myers Squibb kutatói klónozták. A DNS-szekvencia analízise jelezte, hogy egy 38 bp intron van a kódolószekvencia 5’-végének közelében. Oligonukleotidra irányított helyspecifikus mutagenezis-módszert alkalmaztunk az intron eltávolítására és Ncol hely létrehozására a DAAO gén transzlációs starthelyén. Ezért a DAAO-t kódoló szekvenciát plusz egy 700 bp 3’ nem transzkripciós régiót tisztíthatjuk egy 2,1 kb NcoI/BamHI fragmentumaként.
A pBMPVA-P plazmid DNS-t Miül hasítással kezeltük, és a ragadós végeket feltöltöttük a Klenow-fragmentummal. A DNS-t ezután BamHI-gyel hasítottuk. A PVA-promoterrégiót tartalmazó 4,7 kb fragmentumot gélen tisztítottuk. A DAAO génfragmentumot ligáltuk a DAAO gén 2,1 kb NcoI-Klenow/BamHI fragmentumával a pBMPVA-P/DAAOl plazmid létrehozása céljából. A pBMPVA-P/DAAOl plazmid Ndel hasításával és Klenow-feltöltésével egy 3,4 kb PVA-promoter/DAAO gén fúziós fragmentumot készítettünk, és gélen tisztítottuk. A fragmentumot pSJC62 DNS-be és a Klenowval feltöltött Xbal helyre inszertáltuk. Az eredményül kapott plazmidot pBMPVA-P/DAAO2 jelzéssel láttuk el. A teljes szerkezeti vázlatot a 17. ábrán mutatjuk be.
A pBMPVA-P/DAAO2 DNS-t ATCC 16322 törzsbe vittük be polietilénglikol közvetítette protoplaszttranszformációval. A transzformátumokat phleomicinrezisztenciájuk alapján válogattuk ki. Néhány transzformátumot PVA-termelő tápközegben szaporítottunk, és megvizsgáltuk D-aminosav oxidáz-aktivitásukat. Az eredmények azt mutatták, hogy a D-aminosav oxidáz gén
0,2-0,8 NE/ml szinten fejeződött ki az ATCC 16322 tra nszformátumokban.
2. A D-aminosav oxidáz gén kifejezése pBMPVA-M-mel
A pBMPVA-M plazmid DNS-t Smal és BamHI enzimekkel hasítottuk. Mind a PVA-promoterrégiót, mind a PVA-t szekréciós szignálszekvenciát tartalmazó 4,8 kb fragmentumot gélen tisztítottuk. A DAAO génfragmentumot Ncol hasítással plusz mungóbabnukleázos kezeléssel preparáltuk az 5’ ragadós végek eltávolítására és a DAAO gén helyes olvasási keretének megtartására, és utána BamHI emésztést végeztünk egy 2,1 kb fragment létrehozására. A 4,8 kb PVA promoter/szignál szekvencia fragmentumot a 2,1 kb DAAO génfragmentumhoz ligáltuk pBMPVA-M/DAAO3 plazmid létrehozása céljából. A pBMPVA-M/DAAO3 plazmidot Ndel enzimmel hasítottuk, és az 5’ ragadós végeket a Klenow-fragmentummal töltöttük fel. A 3,5 kb PVA promoter/szignál szekvencia/DAAO gén íuziós fragmentumot tisztítottuk, és beszúrtuk a pSJC62 DNS-be a Klenowval feltöltött Xbal helyen. Az eredményül kapott plazmidot pBMPVA-M/DAAO4 jelöléssel láttuk el (18. ábra).
A pBMPVA-M/DAAO4 plazmid DNS-t ATCC 16322 törzsbe transzformáltuk. Néhány phleomicinrezisztens transzformátumot analizáltunk D-aminosav oxidáz-aktivitásra. Sajnos egyik transzformátum sem mutatott D-aminosav oxidáz-aktivitást. A D-aminosav oxidáz gén pBMPVA-M vektorral történő kifejeződésének a hibája adódhat a D-aminosav oxidáz enzim intracelluláris természetéből. Széles körben ismert, hogy az intracelluláris fehérjét kódoló gének nem tudnak extracellulárisan kifejeződni és áthelyeződni egy szekréciós expressziós rendszer segítségéve [Model és Russel, Cell 61, 739-741 (1990)]. Még ha a gén ki is fejeződik intrace lulárisan, a hozzá kapcsolódó PVA-szignálszekvencia inaktiválhatja a D-aminosav oxidázt. Ezért a pBMPVA-M vektor még használható más szekretálható fehérjegének kifejezésére.
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1, ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(iii) A szekvenciák száma: 30 (2, AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 29 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (v) FRAGMENSTÍPUS: N-terminális (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Fusarium oxysporum (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 7 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyzés: „Aminosav 7 Alá vagy Lys lehet” (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 22
HU 218 265 Β (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés:
„Aminosav 22 Thr vagy Val lehet”
(xi) AZ 1. SZÁMÚ S. ZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Asn Asp Asp Phe Alá Xaa Ly s Xaa Al a Ser Leu Lys Lys Ser
1 5 10 15
Lys Leu Pro Gly Thr Xaa Val Tyr Phe Thr G1 n Hi s Va 1
20 25
(2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 12 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 4 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés:
„Aminosav 4 Ser vagy Pro lehet” (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 7 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyzés: „Aminosav 7 Alá vagy Leu lehet” (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 12 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés: „Aminosav 12 Tyr vagy Arg lehet” (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Leu Asn Xaa Ser Gin Xaa Xaa Gin Phe Tyr Xaa 1 5 10 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 12aminosa (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Leu Val Lys Thr Gly Pro Alá Xaa 1 5 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Gly Asn Asp Asp Phe Alá Alá Xaa 1 5 (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Gly Xaa Xaa Thr Alá Asp Thr 1 5
Val Glu Glu Gly 20 (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 8 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyzés: „Aminosav 8 Ser vagy Lys lehet”
Xaa Val Ser Ile 10 (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 8 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés: 40 „Aminosav 8 Ser vagy Lys lehet”
Xaa Alá 10 (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 3 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyzés: 50 „Aminosav 3 Ile vagy Arg lehet”
Asn Val Leu Leu Alá Xaa Val Lys Trp 10 15 (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 25 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (ix) JELLEGZETESSÉG:
HU 218 265 Β (A) NEV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 16 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés: „Aminosav 16 Asn vagy Ser lehet” (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 21 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés: „Aminosav 21 Asn vagy His lehet” (ix) JELLEGZETESSÉG:
(xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile 1 Hi s Trp Ser Gly 5 Leu Glu Asp Gly Leu 10 Ile Ser Alá Glu Asn Xaa 1 5
As p Tyr Tyr As n Xaa Va 1 Xa a Ser Xaa
20 25
(A) NEV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 23 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyzés „Aminosav 23 Val vagy Ser lehet” (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: peptid (B) HELYZET: 25 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: megjegyés „Aminosav 25 Thr vagy Arg lehet” (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i)
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Pro Tyr Asn Asp (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Val Lys Trp Val Glu Glu Gly
5 (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTNAARTGGG TNGARGARGG 20 (2i A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HŐS SZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCYTCYTCNA CCCAYTTNAC 20 (21 A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) All. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTYTCYTCNT CGGAYTTNAC 20 (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Asn Asp Asp Phe Alá Alá Lys Cys Alá 1 5 10 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG:
(D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Val Alá Lys Cys Alá
5 (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 bázispár 50 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 55 TTTTTTTTGT AGCGAAATGC GCC 23 (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú
HU 218 265 Β (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTTTCTGC AGCGAAATGC GCC 23 (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris 5 (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CCCGGGAACG ACGACTTTGC AGCGAAATGC GCC (2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 33 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CGCGCATTTC GCTGCAAAGT CGTCGTTCCC GGG (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 1767 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (C) SZÁLASSÁG: egyszálú 20 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCS: cds (B) HELYZET: 1...1521 (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGC AAC GAT GAT Asp Asp TTT Phe 5 GCC GCG AAA TGC GCC AGC CTC AAG AAG Lys TCG Ser 15 CTC Leu 48
Gly 1 Asn Alá Alá Lys Cys Alá 10 Ser Leu Lys
AAA CTC CCC GGC ACC ACC GTA TAC TTC ACC CAG CAT GTC TCG GCT GGT 96
Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Alá Gly
20 25 30
ACC AAC ATC ACT TTC CCC GAT AAT CAC CCG ACC TGC GGT CCT AAC TAT 144
Thr Asn Ile Thr Phe Pro Asp Asn His Pro Thr Cys Gly Pro Asn Tyr
35 40 45
CAG GTT ACG GAC GTT GAG GTC TGC CGC GTG GCC ATG TTA GTC AAG ACG 192
Gin Val Thr Asp Val Glu Val Cys Arg Val Alá Met Leu Val Lys Thr •
50 55 60
GGA CCC GCC TCA AAC GTT AGC ATC GAA GCT TGG CTT CCC TTG AAC TGG 240
Gly Pro Alá Ser Asn Val Ser Ile Glu Alá Trp Leu Pro Leu Α3Π Trp
65 70 75 80
ACA GGT CGG TTC TTA GGA ACT GGC AAT GGT GGA TTA GCT GGC TGT ATG 288
Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr Gly Asn Gly Gly Leu Alá Gly Cys Met
85 90 95
CCC TAC AAC GAT ATG GCG TAC GGC AAC AGT TTC GGC TTC GCC AGC GTT 336
Pro Tyr Asn Asp Met Alá Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Phe Alá Ser Val
100 105 110
GGC ACG AAC AAC GGA CAT AAC GGA ACC TCA GGC CTA CCC ATG TAC CGC 384
Gly Thr Asn Asn Gly His Asn Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg
115 120 125
AAC CCA GGC GTG GTT GAG GAC TTT GCC TAT CGT GCG GTG CAC GCT GGT 432
Asn Pro Gly Val Val Glu Asp Phe Alá Tyr Arg Alá Val His Alá Gly
130 135 140
HU 218 265 Β
GCT GTT ATC GGA AAG AAG ATC ACC CAG GGC TTT TAC GGC AAG AAG Lys TTC Phe 160 480
Alá 145 Val Ile Gly Lys Lys 150 Ile Thr Gin Gly Phe 155 Tyr Gly Lys
AAG TCC TAC TTT CTC GGC TGC TCG ACA GGA GGA CGT CAA GCA ATG AAG 528
Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Arg Gin Alá Met Lys
165 170 175
TTG GCA CAG AGC TTC CCC GAG GAT TAC GAT GGC TAT GTG GCA GGT GCT 576
Leu Alá Gin Ser Phe Pro Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Alá Gly Alá
180 185 190
CCG GCT ATG CGC TGG AAC GGT CTT CAG GCA CGC TCT GGA AGT TTC TGG 624
Pro Alá Met Arg Trp Asn Gly Leu Gin Alá Arg Ser Gly Ser Phe Trp
195 200 205
GGC ATC ACC GGC CCC CCT GGA GCT CCT C-GC CAT GTG ACT CCA GAC GAG 672
Gly Ile Thr Gly Pro Pro Gly Alá Pro Gly His Val Thr Pro Asp Glu
210 215 220
TGG GAA ATG GTG CAC AAG AGC GTC CTG ACT CAG TGC GAC GAG CCC ATT 720
Trp Glu Met Val His Lys Ser Val Leu Thr Gin Cys Asp Glu Pro Ile
225 230 235 240
GAT GGC GTC GAT GAC GGC GTG CTT GAG GAC CCC ACC CTC TGT CAG TAC 768
Asp Gly Val Asp Asp Gly Val Leu Glu Asp Pro Thr Leu Cys Gin Tyr
245 250 255
CGC CCT GAG GCT CTC ATC TGC GGT AAG GGC CAG ACC GAG AAT TGC CTG 816
Arg Pro Glu Alá leu Ile Cys Gly Lys Gly Gin Thr Glu Asn Cys Leu
260 265 270
ACC AAG GCC AAG ATT GAG ACG GTC CGC AAA GTC TTT TCT CCC CTA TAC 864
Thr Lys Alá Lys Ile Glu Thr Val Arg Lys Val Phe Ser Pro Leu Tyr
275 280 285
ACC ACG AAT GAG ACA TAC GTC TAC CCT CGA GCG GTT CCT GGT GCT AAC 912
Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Val Tyr Pro Arg Alá Val Pro Gly Alá Asn
290 295 300
GCT CTC TTT AAC TTT GTT GTC GCC GAG ACA CCA TTC GTT TAC TCC ACA 960
Alá Leu Phe Asn Phe Val Val Alá Glu Thr Pro Phe Val Tyr Ser Thr
305 310 315 320
GAA TGG TAC CAG TAT GTC ATC TGG GAA GAC CCT GAG TGG AAT CCT GAC 1008
Glu Trp Tyr Gin Tyr Val Ile Trp Glu Asp Pro Glu Trp Asn Pro Asp
325 330 335
ACT ATT GGG CCC AAG GAC TAT GAT AGA GGT GCC GAG ATG AAC CCC TAT 1056
Thr Ile Gly Pro Lys Asp Tyr Asp Arg Gly Alá Glu Met Asn Pro Tyr
340 345 350
GAC ATT GAG ACT TGG GAG GGA GAC CTG TCT AAG TTC CGC AAG CGT GGC 1104
Asp Ile Glu Thr Trp Glu Gly Asp Leu Ser Lys Phe Arg Lys Arg Gly
355 360 365
AAC AAG ATG ATT CAC TGG CAC GGC CTT CAG GAC GGA CTC ATC AGC GCC 1152
Asn Lys Met Ile His Trp His Gly Leu Gin Asp Gly Leu Ile Ser Alá
370 375 380
GAG AAC TCA GAC GAT TAT TAT AAT CAC GTG TCT CGA ACA ATG GGC CTC 1200
HU 218 265 Β
Glu Αεη 385 Ser Asp Asp Tyr Tyr Asn His Val 390 Ser Arg Thr 395 Met Gly Leu 400
AAT AGT AGC CAG CTG GAC CAG TTT TAT AGG TTC TTC CGC GTC AGT GGG 1248
Asn Ser Ser Gin Leu Asp Gin Phe Tyr Arg Phe Phe Arg Val Ser Gly
405 410 415
TGT GGC CAT TGC AGC GCC GGA GAC GGG GCT TCT CGC ATT GGA AAC AAC 1296
Cys Gly His Cys Ser Alá Gly Asp Gly Alá Ser Arg Ile Gly Asn Asn
420 425 430
GCC GGA AAC ATG GGC GGC AAG ACG GCA GAT ACT AAT GTG CTT CTG GCT 1344
Alá Gly Asn Met Gly Gly Lys Thr Alá Asp Thr Asn Val Leu Leu Alá
435 440 445
ATT GTG AAA TGG GTC GAG GAA GGC GTT GCG CCA GAA ACG ATT GGG GGC 1392
Ile Val Lys Trp Val Glu Glu Gly Val Alá Pro Glu Thr Ile Gly Gly
450 455 460
TAC AAG AAC GTC GGC GGA ACT GCA GAT GGC GCT TTT GAC TAT GAG CGT 1440
Tyr Lys Asn Val Gly Gly Thr Alá Asp Gly Alá Phe Asp Tyr Glu Arg
465 470 475 480
AGG CAT TGC CGA TAC CCA CAC CGC AAT GTC TGG GAC GGG AAG GGG AAT 1448
Arg His Cys Arg Tyr Pro His Arg Asn Val Trp Asp Gly Lys Gly Asn
485 4 90 495
GTG AAG GAT CCC GAT AGC TGG AAC TGT AAG ATG TGAGGTGTGG 1531
Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp Asn Cys Lys Ile
500 505
CCCTAGGCTT ' rTGTGGCTGT CGTTAGGTGG CATACGTATA TAAGAGGATC 1581
ACTGTGAACA ' rGCTTTATGT TGTGCAAGAA TTGATTGAGA ATCAGATTGA 1.631
GCTTGCAGAG l CCAAGGCAAA TAGACCCAAC TGTTGACGAG ATCTTGGCCG 1681
AAGGTAGAGG ' CAACGGGGAG AGAGACCATG GAAGACAAGG CGTAGAAAAT 1731
GGCCGGGGAA i GACGGAAAAA AAAAACCCCC CCCCCC 1767
A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (B) TÍPUS: aminosav
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA : lineáris
(A) HOSSZ : 507 aminosav (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje
(xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Asn Asp Asp Phe Alá Alá Lys Cys Alá Ser Leu Lys Lys Ser Leu
1 5 10 15
Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Alá Gly
20 25 30
Thr Asn He Thr Phe Pro Asp Asn His Pro Thr Cys Gly Pro Asn Tyr
35 40 45
Gin Val Thr Asp Val Glu Val Cys Arg Val Alá Met Leu Val Lys Thr
50 55 60
Gly Pro Alá Ser Asn Val Ser Ile Glu Alá Trp Leu Pro Leu Asn Trp
65 70 75 80
HU 218 265 Β
Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr Gly Asn Gly Gly Leu Alá Gly Cys Met 85 90 95
Pro Tyr Asn Asp Met Alá Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Phe Alá Ser Val 100 105 110
Gly Thr Asn Asn Gly His Asn Gly Thr Ser 120 Gly Leu Pro 125 Met Tyr Arg
115
Asn Pro Gly Val Val Glu Asp Phe Alá Tyr Arg Alá Val His Alá Gly
130 135 140
Alá Val Ile Gly Lys Lys Ile Thr Gin Gly Phe Tyr Gly Lys Lys Phe
145 150 155 160
Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Arg Gin Alá Met Lys
165 170 175
Leu Alá Gin Ser Phe Pro Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Alá Gly Alá
180 185 190
Pro Alá Met Arg Trp Asn Gly Leu Gin Alá Arg Ser Gly Ser Phe Trp
195 200 205
Gly He Thr Gly Pro Pro Gly Alá Pro Gly His Val Thr Pro Asp Glu
210 215 220
Trp Glu Met Val His Lys Ser Val Leu Thr Gin C ys Asp Glu Pro Ile
225 230 235 240
Asp Gly Val Asp Asp Gly Val Leu Glu Asp Pro Thr Leu Cys Gin Tyr
245 250 255
Arg Pro Glu Alá Leu Ile Cys Gly Lys Gly Gin Thr Glu Asn Cys Leu
260 265 270
Thr Lys Alá Lys Ile Glu Thr Val Arg Lys Val Phe Ser Pro Leu Tyr
275 280 285
Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Val Tyr Pro Arg Alá Val Pro Gly Alá Asn
290 291 300
Alá Leu Phe Asn Phe Val Val Alá Glu Thr Pro Phe Val Tyr Ser Thr
305 310 315 320
Glu Trp Tyr Gin Tyr Val Ile Trp Glu Asp Pro Glu Trp Asn Pro Asp
325 330 335
Thr Ile Gly Pro Lys Asp Tyr Asp Arg Gly Alá Glu Met Asn Pro Tyr
340 345 350
Asp Ile Glu Thr Trp Glu Gly Asp Leu Ser Lys Phe Arg Lys Arg Gly
355 360 365
Asn Lys Met Ile His Trp His Gly Leu Gin Asp Gly Leu Ile Ser Alá
370 375 380
Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Tyr Asn His Val Ser Arg Thr Met Gly Leu
385 390 395 400
HU 218 265 Β
Asn Lys 370 Met lle His Trp His 375 Gly
Glu 385 Asn Ser Asp Asp Tyr 390 Tyr Asn
Asn Ser Ser Gin Leu 405 Asp Gin Phe
Cys Gly His Cys 420 Ser Alá Gly Asp
Alá Gly Asn 435 Met Gly Gly Lys Thr 440
lle Val 450 Lys Trp Val Glu Glu 455 Gly
Tyr 465 Lys Asn Val Gly Gly 470 Thr Alá
Arg His Cys Arg Tyr 485 Pro His Arg
Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp Asn
500 (2) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ : 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Gin Asp Gly Leu He Ser Alá
380
His Val Ser Arg Thr 395 Met Gly Leu 400
Tyr Arg Phe Phe Arg 410 Val Ser 415 Gly
Gly 425 Alá Ser Arg lle Gly 430 Asn Asn
Alá Asp Thr Asn Val 445 Leu Leu Alá
Val Alá Pro Glu Thr 460 lle Gly Gly
Asp Gly Alá Phe Asp 475 Tyr Glu Arg 480
Asn Cys 505 Val Trp Asp Gly 490 Lys lle Lys Gly 495 Asn
CTGAAATGGG TCGAGGAAGG
(2) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2289 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: genomiális DNS
AGGTGTCATA CGCGTGTACC GAGGTATCAC CTCCTTTCTT GGACTATTGG 50
TTGGTTGTTC TATGAAGGAC CATCCGTTCA CCCCGCAGGA ACCAGGACA 100
TCTATGGCAA GAGTTTATCC CGAGGCATGT ATATAATAAA GCTCTTGCCT 150
CTCCTTCTCC TGCACCTTCT CAGCCAGGCT CAGGAGGCTG GCAGTGAGTT 200
GAATATCTAT CTGTCTGATA GTTGTTCGTC ATCAGGCACT 240
ATG CGC Met Arg GTC Val 510 AAC Asn TTC Phe TCG Ser ACC Thr CTG CTG CTT CCC AGC CTC CTC Leu Leu 520 CAA GGG 288
Leu 515 Leu Leu Pro Ser Gin Gly
CTA GGT GCA TGC GCA GCT CCC AAC AAA GGC AAC GAT GAT TTT GCC GCG 336
Leu Gly Alá Cys Alá Alá Pro Asn Lys Gly Asn Asp Asp Phe Alá Alá
525 57Π
AAA TGC GCC AGC CTC AAG AAG TCG CTC AAA CTC CCC GGC ACC ACC GTA 384
Lys Cys Alá Ser Leu Lys Lys Ser Leu Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val
540 545 550 555
TAC TTC ACC CAG CAT GTC TCG GCT GGT ACC AAC ATC ACT TTC CCC GAT 432
Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Alá Gly Thr Asn lle Thr Phe Pro Asp
560 565 570
HU 218 265 Β
AAT Asn CAC CCG ACC TGC GGT CCT AAC TAT CAG GTT ACG GAC Asp GTT Val 585 GAG Glu GTC Val 480
His Pro Thr Cys 575 Gly Pro Asn Tyr 580 Gin Val Thr
TGC CGC GTG GCC ATG TTA GTC AAG ACG GGA CCC GCC TCA AAC GTT AGC 528
Cys Arg Val Alá Met Leu Val Lys Thr Gly Pro Alá Ser Asn Val Ser
590 595 600
ATC GAA GCT TGG CTT CCC TTG AAC TGG ACA GGT CGG TTC TTA GGA ACT 624
Ile Glu Alá Trp Leu Pro Leu Asn Trp Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr
605 610 615
GGC AAC AGT TTC GGC TTC GCC AGC GTT GGC ACG AAC AAC GGA CAT AAC 672
Gly Asn Ser Phe Gly Phe Alá Ser Val Gly Thr Asn Asn Gly HÍ3 Asn
640 645 650
GGA ACC TCA GGC CTA CCC ATG TAC CGC AAC CCA GGC GTG GTT GAG GAC 720
Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg Asn Pro Gly Val Val Glu Asp
655 660 665
TTT GCC TAT CGT GCG GTG CAC GCT GGT GCT GTT ATC GGA AAG AAG ATC 768
Phe Alá Tyr Arg Alá Val His Alá Gly Alá Val Ile Gly Lys Lys Ile
670 675 680
ACC CAG GGC TTT TAC GGC AAG AAG TTC AAG TCC TAC TTT CTC GGC TGC 816
Thr Gin Gly Phe Tyr Gly Lys Lys Phe Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Cys
6Θ5 690 695
TCG ACA GGA GGA CGT CAA GCA ATG AAG TTG GCA CAG AGC TTC CCC GAG 864
Ser Thr Gly Gly Arg Gin Alá met Lys Leu Alá Gin Ser Phe Pro Glu
700 705 710 715
GAT TAC GAT GGC TAT GTG GCA GGT GCT CCG GCT ATG CGC TGG AAC GGT 912
Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Alá Gly Alá Pro Alá Met Arg Trp Asn Gly
720 725 730
CTT CAG GCA CGC TCT GGA AGT TTC TGG GGC ATC ACC GGC CCC CCT GGA 960
Leu Gin Alá Arg Ser Gly Ser Phe Trp Gly Ile Thr Gly Pro Pro Gly
735 740 745
GCT CCT GGC CAT GTG ACT CCA GAC GAG TGG GAA ATG GTG CAC AAG AGC 1008
Alá Pro Gly His Val Thr Pro Asp Glu Trp Glu Met Val His Lys Ser
750 755 760
GTC CTG ACT CAG TGC GAC GAG CCC ATT GAT GGC GTC GAT GAC GGC GTG 1056
Val Leu Thr Gin Cys Asp Glu Pro Ile Asp Gly Val Asp Asp Gly Val
765 770 775
CTT GAG GAC CCC ACC CTC TGT CAG TAC CGC CCT GAG GCT CTC ATC TGC 1104
Leu Glu Asp pro Thr Leu Cys Gin Tyr Arg Pro Glu Alá Leu Ile Cys
780 785 790 795
GGT AAG GGC CAG ACC GAG AAT TGC CTG ACC AAG GCC AAG ATT GAG ACG 1152
Gly Lys Gly Gin Thr Glu Asn Cys Leu Thr Lys Alá Lys Ile Glu Thr
800 805 810
GTC CGC AAA GTC TTT TCT CCC CTA TAC ACC ACG AAT GAG ACA TAC GTC 1200
Val Arg Lys Val Phe Ser Pro Leu Tyr Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Val
815 820 825
TAC CCT CGA GCG GTT CCT GGT GCT AAC GCT CTC TTT AAC TTT GTT GTC 1248
Tyr Pro Arg Alá Val Pro Gly Alá Asn Alá Leu Phe Asn Phe Val Val
830 835 840
HU 218 265 Β
GCC GAG ACA CCA TTC GTT Phe Val TAC TCC ACA GAA TGG TAC CAG TAT GTC ATC Ile 1296
Alá Glu 845 Thr Pro Tyr Ser 850 Thr Glu Trp Tyr 855 Gin Tyr Val
TGG GAA GAC CCT GAG TGG AAT CCT GAC ACT ATT GGG CCC AAG GAC TAT 1344
Trp 860 Glu Asp Pro Glu Trp 865 Asn Pro Asp Thr Ile 870 Gly Pro Lys Asp Tyr 875
GAT AGA GGT GCC GAG ATG AAC CCC TAT GAC ATT GAG ACT TGG GAG GGA 1392
Asp Arg Gly Alá Glu Met 880 Asn Pro Tyr Asp 885 Ile Glu Thr Trp Glu 890 Gly
GAC CTG TCT AAG TTC CGC AAG CGT GGC AAC AAG ATG ATT CAC TGG CAC 1440
Asp Leu Ser Lys 895 Phe Arg Lys Arg Gly Asn 900 Lys Met Ile His 905 Trp His
GGC CTT CAG GAC GGA CTC ATC AGC GCC GAG AAC TCA GAC GAT TAT TAT 1488
Gly Leu Gin 910 Asp Gly Leu Ile Ser 915 Alá Glu Asn Ser Asp 920 Asp Tyr Tyr
AAT CAC GTG TCT CGA ACA ATG GGC CTC AAT AGT AGC CAG CTG GAC CAG 1536
Asn His 925 Val Ser Arg Thr Met Gly 930 Leu Asn Ser Ser 935 Gin Leu Asp Gin
TTT TAT AGG TTC TTC CGC GTC AGT GGG TGT GGC CAT TGC AGC GCC GGA 1584
Phe 940 Tyr Arg Phe Phe Arg 945 Val Ser Gly Cys Gly 950 His Cys Ser Alá Gly 955
GAC GGG GCT TCT CGC ATT GGA AAC AAC GCC GGA AAC ATG GGC GGC AAG 1632
Asp Gly Alá Ser Arg Ile 960 Gly Asn Asn Alá 965 Gly Asn Met Gly Gly 970 Lys
ACG GCA GAT ACT AAT GTG CTT CTG GCT ATT GTG AAA TGG GTC GAG GAA 1680
Thr Alá Asp Thr 975 Asn Val Leu Leu Alá Ile 980 Val Lys Trp Val 985 Glu Glu
GGC GTT GCG CCA GAA ACG ATT GGG GGC TAC AAG AAC GTC GGC GGA ACT 1728
Gly Val Alá 990 Pro Glu Thr Ile Gly 995 Gly Tyr Lys Asn Val Gly 1000 Gly Thr
GCA GAT GGC GCT TTT GAC TAT GAG CGT AGG CAT TGC CGA TAC CCA CAC 1776
Alá Asp L005 Gly Alá Phe Asp Tyr Glu 1010 Arg Arg His Cys 1015 Arg Tyr Pro His
CGC AAT GTC TGG GAC GGG AAG GGG AAT GTG AAG GAT CCC GAT AGC TGG 1824
Arg Asn 1020 Val Trp Asp Gly 1025 Lys Gly Asn Val Lys 1030 Asp Pro Asp Ser Trp 1035
AAC Asn TGT Cys AAG Lys ATC Ile TGAGGTGTGG CCCTAGGCTT TTGTGGCTGT CGTTAGGTGG 1876
CATACGTATA TAAGAGGATC ACTGTGAACA TGCTTTATGT TGTGCAAGAA 1926
TTGATTGAGA ATCAGATTGA GCTTGCAGAG CCAAGGCAAA TAGACCCAAC 1976
TGTTGACGAG ATCTTGGCCG AAGGTAGAGG CAACGGGGAG AGAGACCATG 2026
GAAGACAAGG CGTAGAAAAT GGCCGGGGAA GACGGGCTGT CGGCGATGGA 2076
GTAGCAACAG CTGTCACTGG TGGTCAATGA CTACACTTCT GAGCGGCGAG 2126
AGATTATAGG GACCGCACAC AGGCCATCAT TTCCCGATAA CTAATGGAGA 2176
HU 218 265 Β
CGCAATGGAG CGATGTTTAA ATGCGACAAG ACTGCCATCA TCTAGGTACT
TCATGCGTCG CTAAACGCAC CAATGCTGCG CTGCTCATGA TTGTAAACTT
AGTTTATA (2) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (B) TÍPUS: aminosav (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA: lineáris (A) HOSSZ: 532 aminosav (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
2226
2276
2284
Met Arg Val 1 Asn Phe 5 Ser Thr Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Gin Gly
10 15
Leu Gly Alá Cys Alá Alá Pro Asn Lys Gly Asn Asp Asp Phe Alá Alá
20 25 30
Lys Cys Alá Ser Leu Lys Lys Ser Leu Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val
35 40 45
Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Alá Gly Thr Asn Ile Thr Phe Pro Asp
50 55 60
Asn His Pro Thr Cys Gly Pro Asn Tyr Gin Val Thr Asp Val Glu Val
65 70 75 80
Cys Arg Val Alá Met Leu Val Lys Thr Gly Pro Alá Ser Asn Val Ser
85 90 95
Ile Glu Alá Trp Leu Pro Leu Asn Trp Tnr Gly Arg Phe Leu Gly Thr
100 105 110
Gly Asn Gly Gly Leu Alá Gly Cys Met Pro Tyr Asn Asp Met Alá Tyr
115 120 125
Gly Asn Ser Phe Gly Phe Alá Ser Val Gly Thr Asn Asn Gly His Asn
130 135 140
Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg Asn Pro Gly Val Val Glu Asp
145 150 155 160
Phe Alá Tyr Arg Alá Val His Alá Gly Alá Val Ile Gly Lys Lys Ile
165 170 175
Thr Gin Gly Phe Tyr Gly Lys Lys Phe Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Cys
180 185 190
Ser Thr Gly Gly Arg Gin Alá Met Lys Leu Alá Gin Ser Phe Pro Glu
195 200 205
Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Alá Gly Alá Pro Alá Met Arg Trp Asn Gly
210 215 220
Leu Gin Alá Arg Ser Gly Ser Phe Trp G.Ly He Thr Gly Pro Pro Gly
225 230 235 240
Alá Pro Gly His Val Thr Pro Asp Glu Trp Glu Met Val His Lys Ser
245 250 255
Val Leu Thr Gin Cys Asp Glu Pro Ile Asp Gly Val Asp Asp Gly Val
260 265 270
HU 218 265 Β
Leu Glu Asp 275 Pro Thr Leu Cys Gin Tyr Arg Pro Glu Alá Leu Ile Cys
280 285
Gly Lys Gly Gin Thr Glu Asn Cys Leu Thr Lys Alá Lys Ile Glu Thr
290 295 300
Val Arg Lys Val Phe Ser Pro Leu Tyr Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Val
305 310 315 320
Tyr Pro Arg Alá Val Pro Gly Alá Asn Alá Leu Phe Asn Phe Val Val
325 330 335
Alá Glu Thr Pro Phe Val Tyr Ser Thr Glu Trp Tyr Gin Tyr Val Ile
340 345 350
Trp Glu Asp Pro Glu Trp Asn Pro Asp Thr Ile Gly Pro Lys Asp Tyr
355 360 365
Asp Arg Gly Alá Glu Met Asn Pro Tyr Asp Ile Glu Thr Trp Glu Gly
370 375 380
Asp Leu Ser Lys Phe Arg Lys Arg Gly Asn Lys Met Ile His Trp His
385 390 395 400
Gly Leu Gin Asp Gly Leu Ile Ser Alá Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Tyr
405 410 415
Asn His Val Ser Arg Thr Met Gly Leu Asn Ser Ser Gin Leu Asp Gin
420 425 430
Phe Tyr Arg Phe Phe Arg Val Ser Gly Cys Gly His Cys Ser Alá Gly
435 440 445
Asp Gly Alá Ser Arg He Gly Asn Asn Alá Gly Asn Met Gly Gly Lys
450 455 460
Thr Alá Asp Thr Asn Val Leu Leu Alá Ile Val Lys Trp Val Glu Glu
465 470 475 480
Gly Val Alá Pro Glu Thr Ile Gly Gly Tyr Lys Asn Val Gly Gly Thr
485 490 495
Alá Asp Gly Alá Phe Asp Tyr Glu Arg Arg His Cys Arg Tyr Pro His
500 505 510
Arg Asn Val Trp Asp Gly Lys Gly Asn Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp
515 520 525
Asn Cys Lys Ile
530 (C) SZÁLASSÁG: kettős szálú
(2) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 50
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (D) TOPOLÓGIA: lineáris
(A) HOSSZ: 240 bázispár (ii) MOLEKULATÍPUS: genomiális DNS
(B) TÍPUS: nukleinsav (xi) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGGTGTCATA CGCGTGACC GAGGTATCAC CTCCTTTCTT GGACTATTGG 50
TTGGTTGTTC TATGAAGGAC CATCCGTTCA CCCCGCAGGA ACCAGGGACA 100
TCTATGGCAA GAGTTTATCC CGAGGCATGT ATATAATAAA GCTCTTGCCT 150
HU 218 265 Β
CTCCTTCTCC TGACACTTCT CAGCCAGGCT CAGGAGGCTG GCAGTGAGTT 200
GAATATCTAT CTGTCTGATA GTTGTTCGTC ATCAGGCACT 240 (2) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 5 (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 9 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris 10 (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ATGCGCGTC (2) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 15 (A) HOSSZ: 9 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS 20 (xl) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATACGCGTC (2) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 12 bázispár 25 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 30
GGCACTATAC GCGTC (2) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(1) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav 35 (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii)MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AACAAAGGCA AC 40 (2) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLASSÁG: 45 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asn Lys Gly Asn (2) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 50 (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris 55 (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AACCCCGGGA AC (2) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: θθ (A) HOSSZ: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLASSÁG: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xl) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GCAGCTCCCA ACCCCGGGAA CGATGATT

Claims (43)

1. Izolált nukleinsavmolekula, amely a 19. vagy 22. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciával rendelkezik.
2. Izolált nukleinsavmolekula, amely a 19. vagy 22. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciával komplementer szekvenciával rendelkezik.
3. Izolált nukleinsavmolekula, amely a 19. vagy 22. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszskvenciával komplementer szekvenciával rendelkező nukleinsavval hibridizálni képes szekvenciával rendelkezik.
4. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely DNS-molekula.
5. A 2. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely DNS-molekula.
6. A 3. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely DNS-molekula.
7. Izolált DNS-molekula, amely a 19. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciával rendelkezik.
8. Izolált DNS-molekula, amely a 19. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciával komplementer szekvenciával rendelkező nukleinsavval hibridizálni képes szekvenciával rendelkezik.
9. Izolált DNS-molekula, amely a 22. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciával rendelkezik.
10. Izolált DNS-molekula, amely a 22. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciával komplementer szekvenciával rendelkező nukleinsavval hibridizálni képes szekvenciával rendelkezik.
11. Izolált DNS-molekula, amely a 18. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
12. Izolált DNS-molekula, amely a 21. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
13. Izolált DNS-molekula, amely all. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
14. Izolált DNS-molekula, amely a 23. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
15. Izolált DNS-molekula, amely a 14., 15., 16. vagy 17. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
16. Izolált DNS-molekula, amely a 9. vagy 10. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
17. Izolált DNS-molekula, amely a 26. vagy 30. számú nukleotidszekvenciával rendelkezik.
HU 218 265 Β
18. Izolált polipeptid, amely az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 8. vagy 12. számú aminosavszekvenciával rendelkezik.
19. A 18. igénypont szerinti polipeptid, amely az 1. vagy 12. számú aminosavszekvenciával rendelkezik.
20. Expressziós vektor, amely a 19. vagy 22. számú aminosavszekvenciát kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
21. A 20. igénypont szerinti expressziós vektor, amely a 19. számú aminosavszekvenciát kódoló DNSszekvenciát tartalmazza.
22. A 20. igénypont szerinti expressziós vektor, amely a 22. számú aminosavszekvenciát kódoló DNSszekvenciát tartalmazza.
23. A 20. igénypont szerinti expressziós vektor, amely továbbá replikációs origót, promotert és transzkripciós terminációs szekvenciát tartalmaz.
24. A 23. igénypont szerinti expressziós vektor, amely továbbá szelekciósmarker-szekvenciát tartalmaz.
25. A 24. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben a szelekciós marker phleomicinrezisztencia.
26. A 23. igénypont szerinti expressziós vektor, amely képes beépülni gombakromoszómákba.
27. A 20. igénypont szerinti expressziós vektor, amely a 18. vagy 21. számú DNS-szekvenciával rendelkezik.
28. A 20. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy plazmid.
29. Expressziós vektor, amely a 23. számú DNSszekvenciával rendelkező PVA-promotert tartalmazza.
30. A 29. igénypont szerinti expressziós vektor, amely továbbá replikációs origót, szerkezeti fehérjét kódoló DNS-t és transzkripciós terminációs szekvenciát tartalmaz.
31. A 30. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben a szerkezeti fehérjét kódoló DNS a V-penicillin amidohidrolázt (PVA)-kódolja.
32. A 30. igénypont szerinti expressziós vektor, amely továbbá szelekciósmarker-szekvenciát tartalmaz.
33. A 32. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben a szelekciós marker phleomicinrezisztencia.
34. A 30. igénypont szerinti expressziós vektor, amely képes beépülni gombakromoszómákba.
35. Gazdasejt, amely a 20. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmazza.
36. A 35. igénypont szerinti gazdasejt, amely eukarióta.
37. A 35. igénypont szerinti gazdasejt, amely Fusarium species.
38. A 35. igénypont szerinti gazdasejt, amely Fusariam oxysporum.
39. Escherichia coli ATCC 69720 biológiailag tiszta tenyészete.
40. Escherichia coli ATCC 69721 biológiailag tiszta tenyészete.
41. Escherichia coli ATCC 69722 biológiailag tiszta tenyészete.
42. Eljárás a 19. vagy 22. számú aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 35. igénypont szerinti gazdasejtet a pclipeptid kifejeződését eredményező körülmények között tenyésztjük.
43. A 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a kifejeződést fenoxi-acetát jelenlétében történő tenyésztéssel indukáljuk.
HU9503656A 1994-12-23 1995-12-19 V-penicillin amidohidrolázt kódoló izolált nukleinsav-szekvenciák Fusarium oxysporumból, ezeket tartalmazó expressziós vektorok és gazdasejtek, és eljárás az általuk kódolt polipeptidek előállítására HU218265B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/363,475 US5516679A (en) 1994-12-23 1994-12-23 Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9503656D0 HU9503656D0 (en) 1996-02-28
HUT74834A HUT74834A (en) 1997-02-28
HU218265B true HU218265B (hu) 2000-06-28

Family

ID=23430378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503656A HU218265B (hu) 1994-12-23 1995-12-19 V-penicillin amidohidrolázt kódoló izolált nukleinsav-szekvenciák Fusarium oxysporumból, ezeket tartalmazó expressziós vektorok és gazdasejtek, és eljárás az általuk kódolt polipeptidek előállítására

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5516679A (hu)
EP (1) EP0718402B1 (hu)
JP (1) JPH08266290A (hu)
KR (2) KR100454831B1 (hu)
CN (1) CN1100877C (hu)
AT (1) ATE444369T1 (hu)
AU (1) AU699051B2 (hu)
CA (1) CA2163159A1 (hu)
DE (1) DE69536009D1 (hu)
FI (1) FI956234A (hu)
HU (1) HU218265B (hu)
IL (1) IL116019A (hu)
SG (1) SG34344A1 (hu)
TW (1) TW461919B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0775210B1 (en) * 1994-08-12 2000-02-02 Dsm N.V. Mutated penicillin g acylase genes
HU226348B1 (en) 1996-11-05 2008-09-29 Bristol Myers Squibb Co Mutant penicillin g acylases
WO1999040187A1 (de) * 1998-02-06 1999-08-12 Hinrich Abken Nukleinsäuren zur modulation zellulärer aktivierung
US7091023B2 (en) 2000-08-07 2006-08-15 Novozymes A/S Stereoselective esterase from Aspergillus oryzae
US20050020685A1 (en) * 2003-06-12 2005-01-27 Skonezny Paul M. Process for recovery of 6-aminopenicillanic acid from an aqueous discharge stream
WO2006053929A1 (es) * 2004-03-16 2006-05-26 Antibióticos, S.A.U. Procedimiento para producir la enzima penicilina v acilasa de streptomyces lavendulae en microorganismos recombinantes.
DE102007027825A1 (de) * 2007-06-13 2008-12-18 C-Lecta Gmbh Amidohydrolasen zur Aufbereitung von Nahrungs- oder Genussmitteln
EP2817412B1 (en) * 2012-02-24 2018-12-26 Bristol-Myers Squibb Company Process for resolving cyclopropyl diesters
WO2024010783A1 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Merck Sharp & Dohme Llc Engineered enzyme for preparing a hydroxylated indanone intermediate useful in the synthesis of belzutifan
CN116240198B (zh) * 2023-03-22 2023-08-22 云南师范大学 一种新型单宁酶及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT233739B (de) * 1962-02-14 1964-05-25 Biochemie Gmbh Verfahren zur Heranführung von Fusarien oder Hefen für die enzymatische Spaltung von Phenoxymethylpenicillin
SE8403929L (sv) * 1984-07-31 1986-02-21 Sten Gatenbeck Rekombinant-dna-molekyl, transformerade mikroorganismer och forfarande for framstellning av penicillin v-amidas
FR2569723B1 (fr) * 1984-08-31 1986-09-19 Centre Nat Rech Scient Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique
DE3439843A1 (de) * 1984-10-31 1986-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Plasmide zur erhoehten produktion von penicillin g-amidase
FR2594846B1 (fr) * 1986-02-21 1989-10-20 Genetica Procede de preparation de la serum albumine humaine mature
NZ225599A (en) * 1987-08-04 1991-09-25 Bristol Myers Co Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells
EP0453047B1 (en) * 1990-04-18 1995-07-05 Gist-Brocades N.V. Penicillin G acylase, a gene encoding the same and a method for the production of this enzyme
JPH0880196A (ja) * 1994-07-12 1996-03-26 Kikkoman Corp タンナーゼ遺伝子を含有するｄｎａ断片、新規な組み換え体プラスミド、タンナーゼの製造方法およびプロモーター

Also Published As

Publication number Publication date
DE69536009D1 (de) 2009-11-12
CN1100877C (zh) 2003-02-05
HU9503656D0 (en) 1996-02-28
KR960023056A (ko) 1996-07-18
ATE444369T1 (de) 2009-10-15
TW461919B (en) 2001-11-01
US5516679A (en) 1996-05-14
CA2163159A1 (en) 1996-06-24
KR100469873B1 (ko) 2005-02-03
KR100454831B1 (ko) 2005-01-13
JPH08266290A (ja) 1996-10-15
CN1132251A (zh) 1996-10-02
EP0718402A3 (en) 1997-12-17
FI956234A0 (fi) 1995-12-22
AU699051B2 (en) 1998-11-19
IL116019A0 (en) 1996-01-31
EP0718402B1 (en) 2009-09-30
FI956234A (fi) 1996-06-24
HUT74834A (en) 1997-02-28
EP0718402A2 (en) 1996-06-26
AU4062295A (en) 1996-07-04
SG34344A1 (en) 1996-12-06
IL116019A (en) 2005-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI81379C (fi) Anvaendning av kluyveromyces-jaest saosom vaerd foer transformering och uttryckning av fraemmande gener.
JPH10503083A (ja) 糸状菌類の異種タンパク質生産用の光調節プロモーター
JPH07108221B2 (ja) レンニンの製造方法
JPH10155493A (ja) アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子
JPH11503002A (ja) 酵素的に活性な組換えカルボキシペプチダーゼｂの製造
HU218265B (hu) V-penicillin amidohidrolázt kódoló izolált nukleinsav-szekvenciák Fusarium oxysporumból, ezeket tartalmazó expressziós vektorok és gazdasejtek, és eljárás az általuk kódolt polipeptidek előállítására
US6555657B2 (en) Isolated transcription factor for an alpha-amylase promoter in filamentous fungi
JP2000136199A (ja) シゾサッカロミセス・ポンベで使用可能なシグナルペプチド、分泌型発現ベクター、およびそれらを用いたタンパク質生産方法
JPH02283287A (ja) アスペルギルス・ニゲルからのデオキシリボ核酸、組換え宿主微生物の製造法および機能的デオキシリボ核酸配列
JP2002512529A (ja) 改良されたタンパク質発現菌株
JP3343567B2 (ja) 糸状菌のエンハンサーｄｎａ塩基配列およびその用途
US5869309A (en) Cephalosporin esterase gene from Rhodosporidium toruloides
JP3140488B2 (ja) 融合タンパク質の試験管内プロセシング
JP2002505587A (ja) Ｔ．バリアビリス由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼプロモーター
JPH07231788A (ja) リパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片及びリパーゼの製造法
JPH089977A (ja) 酵母プロモーター
RU2009199C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pccs, кодирующая соматостатин-14, штамм бактерий escherichia coli - продуцент соматостатина-14
JPH0521552B2 (hu)
JPH06256396A (ja) アクレモニウム・クリソゲナムからのβ−チューブリン、その製造および使用
JP2003250586A (ja) 新規タンパク質分解酵素
AU2001240112A1 (en) Direct production of desacetylcephalosporin c
JP2884486B2 (ja) ミトコンドリアリボソームタンパク質遺伝子およびその使用
JP3484954B2 (ja) Ｄｎａジャイレース阻害蛋白質
JPH0851982A (ja) ヒト血清アルブミンをコードする改変された遺伝子
JPH09262089A (ja) ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼのｂ型サブユニットをコードするｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees