WO2006053929A1 - Procedimiento para producir la enzima penicilina v acilasa de streptomyces lavendulae en microorganismos recombinantes. - Google Patents

Procedimiento para producir la enzima penicilina v acilasa de streptomyces lavendulae en microorganismos recombinantes. Download PDF

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WO2006053929A1
WO2006053929A1 PCT/ES2005/070027 ES2005070027W WO2006053929A1 WO 2006053929 A1 WO2006053929 A1 WO 2006053929A1 ES 2005070027 W ES2005070027 W ES 2005070027W WO 2006053929 A1 WO2006053929 A1 WO 2006053929A1
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pva
enzyme
penicillin
gene
dna
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PCT/ES2005/070027
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English (en)
French (fr)
Inventor
Carmen Acebal Sarabia
Isabel De La Mata Riesco
Jesús TORRES BACETE
José Luis BARREDO FUENTE
José Luis GARCÍA LOPEZ
Juan Francisco LOPEZ ORTÍZ
María Pilar CASTILLÓN BORREGUERO
Marta RODRÍGUEZ SÁIZ
Miguel Ángel MORENO VALLE
Miguel ARROYO SÁNCHEZ
Raquel Torres Guzman
Walter Cabri
Original Assignee
Antibióticos, S.A.U.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase

Definitions

  • Penicillins G and V are produced industrially by fermentation processes in which other natural aliphatic penicillins (penicillins K, F and dihydro F) are also synthesized, which represent about 1-2% of the total penicillin in the broths.
  • the PGAs used industrially are not able to hydrolyse these aliphatic penicillins whose presence hinders the crystallization of 6-APA, both of which imply a lower yield in obtaining 6-APA, which causes significant economic losses.
  • Streptomyces lavendulae ATCC 13664 PVA is the only penicillin acylase capable of hydrolyzing these aliphatic penicillins effectively (Hamilton-Miller J.M.T., (1966)
  • this enzyme has a number of properties that make it more suitable for industrial use (Shewale JG and Sudhakaran VK, (1997) Enzyme Microb. Technol. 20, 402-410; Arroyo M. et al. (2000) Biotechnol. Prog. 16, 368-371; Arroyo M. et al. (2002) Biocatal. Biotransform. 20, 53-56; Arroyo M. et al. (2003) Appl. Microbiol Biotechnol 60, 507-514).
  • this enzyme is a heterodimer (Torres-Guzmán R. et al. (2000) XXIII Congress of the Spanish Society of Biochemistry and Molecular Biology), being able to be a protein belonging to the heterodimeric penicillin acylases family that have two different subunits.
  • This protein contains a small subunit of 20 kDa (hereafter subunit ⁇ ) and a large subunit of 60 kDa (hereafter subunit ⁇ ).
  • the ⁇ subunit suffers the loss of a fragment of about 100 amino acids at its amino terminal end, yielding a polypeptide chain of about 50 kDa (hereinafter truncated ⁇ subunit) (Torres- Guzmán R. et al. (2000) XXIII Congress of the Spanish Society of Biochemistry and Molecular Biology).
  • This type of heterodimeric structure differentiates the PVA of 5. lavendulae from the PVA of B. sphaericus, the only PVA whose structure has been fully characterized and is formed by four identical subunits (Suresh CG. et al. (1999) Nature Structural Biology 6, 414-415).
  • prokaryotic 5 lavendulae ATCC 13664 has been used as a donor of deoxyribonucleic acid (hereinafter referred to as
  • DNA producer of the PVA enzyme, which has a heterodimeric structure with an ⁇ subunit and a ⁇ subunit that, under certain circumstances, can suffer a loss of a fragment at its amino terminal end yielding a truncated ⁇ subunit.
  • These characteristics will be used in the design of the strategy to achieve isolation and cloning of the gene encoding the PVA of 5.
  • lavendulae ATCC 13664 hereinafter referred to as the pva gene).
  • the amino terminal sequences of the ⁇ and ⁇ subunits as well as the truncated ⁇ subunit were determined by automatic sequencing.
  • degenerate synthetic oligonucleotides were designed to amplify the pva gene by the amplification process known as the polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR), using the genomic DNA as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • S. lavendulae ATCC 13664 As amplification products of the PCR process two DNA fragments of 630 and 300 pairs were obtained - A - of bases (bp) respectively, which were isolated and introduced into plasmid vectors. Recombinant vectors were used to obtain, by automatic sequencing, the sequences of the DNA fragments that contained part of the pva gene.
  • the S. lavendulae ATCC 13664 DNA was digested with the restriction endonuclease SacII.
  • SacII restriction endonuclease The choice of this enzyme was made after conducting a Southern analysis with several restriction endonucleases, using as a probe the 630 bp fragment previously obtained by PCR.
  • the fragments resulting from the digestion of DNA with SacII were circularized by means of a ligation performed in high dilution and were used as a template for reverse PCR amplification, using synthetic oligonucleotide primers designed based on the sequence previously obtained, so as to amplify towards the outside of the fragment.
  • the DNA fragment product of the reverse PCR amplification was isolated and cloned into a plasmid vector obtained from a strain of E. coli, and subsequently sequenced. Nucleotide sequence analysis revealed that the fragment possessed 1362 bp, verifying that it contained part of the gene that encodes the PVA of 5.
  • lavendulae including the promoter region, the possible ribosome binding site (hereinafter referred to as RBS) , the translation initiation codon and a gene sequence encoding the secretion signal peptide, the translation termination codon and the transcription terminating region being absent.
  • lavendulae comprising the promoter region, the gene sequence encoding the signal peptide, the ⁇ subunit and part of the gene sequence encoding the ⁇ subunit of the protein.
  • the genomic DNA was again digested with another restriction endonuclease, circularized the resulting fragments by means of a ligation performed in high dilution and used as a template for reverse PCR amplification.
  • restriction endonuclease was carried out after examining the DNA sequence already determined, choosing HincII, an enzyme that provides fragments of approximately 900 bp in the determined sequence and from which there is a cut site located at about 300 bp of the sequence until that moment determined from the 3 'end of the pva gene.
  • the primers used for reverse PCR were synthetic oligonucleotides designed from the previously determined sequence that amplified outside the fragment.
  • a DNA fragment product of the reverse PCR amplification was obtained that was isolated, cloned and sequenced, verifying that it contained both the pva gene sequence encoding the carboxyl terminus of the ⁇ subunit and the translation termination codon and the transcription terminator region.
  • the complete sequence of the pva gene was obtained, from the promoter region to the transcription terminator region, determining the existence of an open reading frame (hereinafter ORF) where a TTG triplet is located that can act as a possible codon of initiation (the TTG triplet is unusual as an initiation codon since in Streptomyces it concurs with a frequency 3% (Kieser T. et al. (2000) Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England).
  • ORF open reading frame
  • the ORF contains the region that encodes the ⁇ and ⁇ subunits of the PVA, also presenting a gene sequence encoding a signal peptide of 39 amino acids, with a typical structure for protein secretion in Streptomyces (Lammertyn E. and Anné J. (1998) FEMS Microbiol. Lett. 160, 1-10).
  • the pva gene was expressed in heterologous organisms.
  • the construction of a 5. lavendulae ATCC 13664 library was carried out.
  • the 5. lavendulae genomic DNA was partially digested with the 5au3AI restriction endonuclease and with the resulting fragments a library was constructed using the phage lambda-GEM12 (Promega) as a vector.
  • the library was screened using as a probe a 900 bp DNA fragment obtained by PCR amplification from the previously determined sequence.
  • the gene was subcloned into E. coli plasmid vectors. Subsequent sequencing of the cloned fragment showed that the gene was not complete, lacking both 1000 bp corresponding to the 3 'end of the gene and the terminator region. It was then reconstructed in order to obtain the complete pva gene to express it in heterologous organisms.
  • the pva gene was amplified by PCR using synthetic oligonucleotide primers designed based on the nucleotide sequences of its 5 'and 3' ends. In these oligonucleó- Synthetic tidos included E.
  • the plasmid carrying the DNA fragment obtained from the library, which contained part of the pva gene was digested with the restriction enzymes EcoRI (with restriction target in the gene sequence of the plasmid after the 3 'region of the pva gene) and Bst ⁇ PI (with a unique restriction target in the complete sequence of the pva gene and absent in the plasmid), obtaining an EcoRI-BstAPI DNA fragment that contains the gene sequence from the promoter region of the pva gene to the nucleotide sequence which encodes the amino terminal end of the ⁇ subunit.
  • EcoRI restriction target in the gene sequence of the plasmid after the 3 'region of the pva gene
  • Bst ⁇ PI with a unique restriction target in the complete sequence of the pva gene and absent in the plasmid
  • the organism is cultured in a medium containing carbon source, nitrogen source and mineral salts. Also, the temperature and pH of the culture medium must be adequately controlled.
  • the stability of the recombinant microorganism is achieved by adding thiostreptone to the culture medium, an antibiotic for which the vector containing the pva gene confers resistance. The presence of the antibiotic, in addition to conferring production stability, prevents contamination of the culture medium with other undesirable microorganisms.
  • the PVA produced by CECT 3365 is extracellular, obtained from the culture broth by separation of the cells by centrifugation.
  • the cell-free extract has a high purity PVA, and the PVA enzyme can be purified to homogeneity by conventional chromatographic techniques.
  • the novelty of this invention lies in the isolation and characterization of the gene encoding the PVA of S. lavendu- la ATCC 13664, so far not described, and in its expression in a heterologous organism. Likewise, the primary structure of the PVA enzyme of 5. lavendulae ATCC 13664 is determined for the first time. The possibility of synthesizing PVA in 5. lividans allows both to increase its production and to modify its substrate specificity and catalytic efficiency, which will facilitate the use of this enzyme on an industrial scale.
  • Example 1 Production and purification of the PVA of S. lavendulae ATCC 13664
  • the PVA enzyme of S. lavendulae ATCC 13664 was produced according to the protocol previously described (Torres R. et al.
  • the PVA activity test was performed using penicillin V (30 mM) as a substrate, according to a previously described protocol (Torres et al, (1998) Progess in Biotechnology 15: Stability and Stabilization of Biocatalysts, A. Ballesteros, FJ Plou , JL Iborra and PI Halling Eds., Elservier, Amsterdam, pp 719-724).
  • the incubation is carried out in 100 mM potassium phosphate buffer pH 8 for 20 minutes at 40 0 C.
  • the reaction is stopped by adding 400 ⁇ l of 50 mM sodium acetate pH 4.5 and, after centrifugation, the release of 6-APA is titres spectrophotometrically by reaction with fluorescamine
  • Example 2 Obtaining the amino terminal sequences of the ⁇ and ⁇ subunits and the truncated ⁇ subunit of the PVA of S. lavendulae ATCC 13664
  • the detection of the polypeptides was carried out by electrophoresis in 12.5% polyacrylamide gels - li ⁇ under denaturing conditions (SDS-PAGE) of both the newly obtained pure protein and an aliquot maintained for 2 weeks at 4 ° C. After staining with Coomassie blue, 2 bands with molecular weights of 20 and 60 kDa are observed in the case of the newly obtained pure protein,
  • Example 3 PCR cloning of the pva gene determining its sequence. 1. Preparation of vectors and competent E. coll cells for cloning and analysis of fragments of
  • Plasmid vector pUC18 which contains the ampicillin resistance gene as a transformation marker, was prepared according to previously described protocols.
  • the E. coli strains carrying the said plasmid were seeded in flasks with 50 ml of LB medium and incubated for 16 hours at 250 rpm. and 37 ° C. After this time, the cells were centrifuged, washed, used and plasmids were isolated following the alkaline lysis method (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA ). The strain used for cloning and fragment analysis was E. coli DH5 ⁇ . The RbCl procedure was used to obtain the competent cells (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA).
  • the S. lavendulae ATCC 13664 strain was grown in a YEME medium (yeast extract (0.3%), bactopeptone
  • PCR amplification reactions were carried out by mixing 0.5 ⁇ g of the 5. lavendulae genomic DNA with 16 ⁇ l (5 ⁇ M) of each of the degenerate oligonucleotides, combining in each reaction
  • the two DNA fragments obtained by PCR (600 bp with STREPTOP2 / STREPTOG3 and 300 bp with STREPTOG1 / STREPTOD2), were purified by extraction of the agarose gel by GeneClean (BiolOl Inc.) following the recommended protocol.
  • Each of the resulting ligation mixtures with each fragment was used to transform competent E. coli DH5 ⁇ cells.
  • the transformants were isolated in the LB-ampicillin solid culture medium (100 ⁇ g / ml).
  • the selected E. coli DH5 ⁇ colonies were grown in liquid LB medium at 37 ° C and 250 rpm. for 16 hours Plasmids were then extracted and purified by the High Puré Plasmid Isolation Kit (Roche) procedure following the protocol provided by the supplier.
  • One of these clones contained the recombinant plasmid pIJLl, which has the 630 bp DNA fragment resulting from the PCR amplification inserted into the coRI site of plasmid pUC18.
  • Another of the clones contained the recombinant plasmid pIJL21, which possesses the 300 bp DNA fragment.
  • nucleotide sequence of the fragments contained in these plasmids was determined by automatic sequencing in an ABI PRISM 3700 device. Applied Biosystems, Perkin-Elmer
  • Example 4 Cloning by the pva gene reverse PCR amplification procedure and sequence determination 1. Obtaining by reverse PCR of a DNA fragment containing the S. lavendulae pva gene
  • Samples of 8 ⁇ g of genomic DNA from S. lavendulae were digested with the restriction endonucleases Acel, PstI, Sal ⁇ , Stul, Avrll, BcII, BgIII, Dral, Ncol, Nhel and SacII (Pharmacia), and the sizes of the fragments generated that could contain the pva gene by the Southern method (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, New York, USA). The agarose gels in which the fragments of digested DNA were separated based on their molecular size were irradiated with UV light for 10 minutes.
  • the gels were then immersed in denaturing solution (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) for 30 minutes with gentle stirring and at room temperature. Then after washing in distilled water, the gels were incubated another 30 minutes at room temperature and gentle stirring in neutralization solution (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl, pH 7). After washing the gels again with distilled water, the DNA fragments were transferred to Immobilon-S (0.45 ⁇ m) nylon filters (Millipore) by vacuum application by means of Transblot (BIO-RAD).
  • denaturing solution 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH
  • neutralization solution 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl, pH 7
  • the filters were incubated for 16 hours at 65 ° C and, after removing the hybridization buffer, washed twice for 10 minutes at 65 ° C with a 2 x SSC solution preheated to the incubation temperature. Then they were washed twice more for 10 minutes at the same temperature with 2 x SSC-O, 1% SDS and twice more under the same conditions with 0, IxSSC-O, 1% SDS. Finally, the filters were developed using the chemiluminescence detection procedure with "DIG Luminescent Detection Kit" (Boehringer Mannheim), following the supplier's instructions.
  • the digested and circularized DNA was used as a template for the PCR amplification reaction, using as primers two oligonucleotides designed from the known nucleotide sequences of the 5 'ends (oligonucleotide N, represented as SEQ ID NO: 8) and 3 '(oligogonucleotide C, represented as SEQ ID NO: 9) of the pva gene fragment cloned and sequenced previously
  • PCR amplification reactions were carried out by mixing 16 ⁇ l (5 ⁇ M) of each of the oligonucleotides with 5 ⁇ l of the circularized DNA sample after digestion with SacII, then adding 2.5 units of the AmpliTaq DNA enzyme Polymerase (Perkin-Elmer) as described in section 3 of Example 3.
  • the amplification conditions were: 95 ° C (5 minutes), 70 0 C (4 minutes), 72 ° C (5 minutes) and then 30 cycles, each cycle being 95 ° C (1 minute), 70 0 C (4 minutes) and 72 ° C (5 minutes).
  • the result of each amplification was visualized by ethidium bromide staining after electrophoresis in 1% agarose gel.
  • the approximately 1300 bp DNA fragment obtained by PCR was purified by extraction of the agarose gel by GeneClean (BiolOl Inc.) following the recommended protocol.
  • the ligation mixture obtained was used to transform competent E. coli DH5 ⁇ cells, transformants being isolated in solid culture medium (2% agar) as described above (section 4 of example 3).
  • the obtained clones were analyzed according to the previously described, isolating and purifying plasmids from recombinant E. coli DH5 ⁇ cells.
  • plasmids pIJLNsac and pIJLCsac were obtained, which contain the reverse PCR fragment in both orientations. Both plasmids were sequenced at both ends of the fragment, as indicated in section 4 of example 3. 3.
  • the circularized DNA was precipitated and resuspended in 25 ⁇ l of TE buffer, using 5 ⁇ l of this sample as a template for the PCR amplification reaction, using as primers the synthetic oligonucleotides FC ⁇ I 2 (represented as SEQ ID NO : 10) and FC ⁇ D 2 (SEQ ID N0: ll), designed from the sequence previously determined (section 2 of example 4) so that they amplify towards the outside of the fragment.
  • FC ⁇ I 2 represented as SEQ ID NO : 10
  • FC ⁇ D 2 SEQ ID N0: ll
  • the PCR amplification reaction was carried out as described above (section 3 of example 3), the amplification conditions in this case being 96 ° C (5 minutes), 68 0 C (10 minutes), 72 ° C (2 minutes) and then 40 cycles, each cycle being 96 ° C (1 minute), 68 ° C (5 minutes) and 72 ° C (3 minutes).
  • the result of each amplification was visualized by ethidium bromide staining after 1% agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment obtained with a size of approximately 900 bp was purified by extraction of the agarose gel by the GeneClean method. 4. Sequencing of the 3 'fragment of the pva gene
  • the DNA fragment obtained and purified was sequenced at both ends (section 4 of example 3). Sequence analysis revealed that the fragment contained the 3 'region of the pva gene that encodes the terminal carboxyl sequence of the PVA, as well as the terminator region that includes the translation termination codon.
  • a total of 200 .mu.g of DNA of S. lavendulae ATCC 13664 was partially digested with 10, 5 or 2.5 units will restriction endonuclease Sau3AI (New England Biolabs) in a reaction volume of 1.2 mi at 37 0 C , stopping the digestion in each case by adding cold 35 mM EDTA. After checking the 0.7% agarose gel digestions, they were extracted with a 1: 1 mixture of neutral phenol and CIA (chloroform: isoamyl alcohol 24: 1), and subsequently tea with 1 volume of CIA and precipitated with ethanol at
  • the DNA recovered by centrifugation was resuspended in a total volume of 600 ⁇ l, heated at 68 ° C for 10 minutes and allowed to cool slowly to room temperature before being placed on a sucrose gradient
  • the DNA of the bacteriophage Iambda-GEM12 was prepared essentially by means of a previously described protocol (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA). For this, E. coli LE392 strain was incubated for 10 hours in NZCYM-O, 2% maltose and its OD was measured at 600 nm.
  • the culture volume corresponding to 3 x 10 9 cells was centrifuged at 1,000 xg for 10 minutes at 4 ° C and resuspended in 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 0.1 M NaCl, 2 g / 1 MgSO 4 .7H 2 O and 0.01% gelatin (SM buffer). To these cells, 3 x 10 7 plate-forming units (pfu) of phage Iambda-GEM12 were added and the mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C without shaking.
  • each of flasks 500 ml with 100 ml of NZCYM-0, 2% maltose medium preheated to 37 0 C. These flasks were incubated at 37 ° C until the culture appeared lysed (5-6 hours). Those used were treated with DNase (1 ⁇ g / ml) and RNase (2 ⁇ g / ml) for 45 minutes at room temperature. Then 5.8 g of NaCl was added per 100 ml of lysate and the mixture was kept for 60 minutes on ice. After this time, it was filtered to remove cell debris, adding 20 ml of 50% PEG-6,000 to the filtrate per 100 ml of lysate.
  • Bacteriophage DNA 50 ug was digested with EcoRI and Bam ⁇ l (Amersham) at 37 0 C endonucleases for 2 hours. The double digestion was extracted with phenol-CIA and CIA, precipitated with ethanol and resuspended in 50 ⁇ l of TE. After collecting a 2 ⁇ l aliquot, the remainder was added MgCl 2 at a final concentration of 10 mM and incubated at 42 ° C for 1 hour in order to favor the resuscitation of the vector arms at their cohesive ends. Again, another 2 ⁇ l aliquot was taken and analyzed next to the previous one by 0.5% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • the mixture was placed on a large tooth (10% -40%) of 10 ml agarose, preventing the DNA from heating to 68 ° C, since this will lead to the separation of the cohesive ends of the phage.
  • the gradient was centrifuged at 26,000 rpm for 15 hours at 28 ° C, then collected in 0.5 ml fractions. After analyzing 15 ⁇ l aliquots of each of them by 0.5% agarose gel electrophoresis, the preparations lacking the dispensable central fragment or "stuffer" were mixed and diluted with distilled water until the sucrose concentration reached Approximately 10%.
  • the DNA was then precipitated with ethanol, resuspended in 50 ⁇ l of TE, analyzing 2 ⁇ l of this sample in 0.5% agarose gel in order to confirm the absence of a central fragment and to calculate its concentration that was approximately 100 ng / ⁇ l.
  • E. coli NM539 is a lysogenic strain of phage P2 and only causes lysis plaques when the phage that infects it lacks the central dispensable region.
  • the phage titer was 950,000 total pfu in E. coli LE392 and 650,000 pfu in E. coli NM539, indicating that 70% of the phages included an exogenous DNA fragment.
  • E. coli NM539 was then infected and the entire library was spread on 10 150 mm diameter Petri dishes, then collected in 50 ml of SM. Of these 50 ml, 40 ml were taken and 2.5 ml of chloroform was added before storage at 4 ° C. To the remaining 10 ml, 7% DMSO was added and stored at - 80 0 C.
  • the E. coli LE392 strain was used for infection since the size of the lysis plaques was larger and more uniform than that obtained with E. coli NM539. Approximately 4,000 pfu were spread over 12 Petri dishes 90 mm in diameter (about 300 pfu / Petri dish) and transferred to nylon membranes (Roche).
  • the positive phage selection process was carried out in accordance with the previously hybridization procedure. described (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA).
  • the nylon membranes with the phages were first subjected to denaturation solution (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl), then to neutralization solution (1.5 M NaCl, 1 M Tris-HCl, pH 7, 5) and finally a 2 x SSC solution, for 15 minutes each at room temperature.
  • the DNA was fixed by incubating the membranes at 80 0 C for 1 hour, after which it proceeded to the treatment of the membranes with proteinase K (2 mg / ml) in 2 x SSC at 37 ° C for 1 hour.
  • the membranes were washed in distilled water and boiling with a solution of 0.2% SDS, whereafter first rinsed with water at 50 0 C and then water at room temperature. After this last step the membranes were ready for the hybridization process, which was carried out as in the Southern method, described in section 1 of example 4.
  • Pasteur and each of them was resuspended in 1 ml of SM at that 50 ⁇ l of chloroform was added. Then the phages present in these solutions were titled. For this purpose, dilutions were made 1/100, 1/1000 and 1/5000 of each of them, using 100 ⁇ l of each dilution to carry out the infections so that the number of lysis plates per Petri dish ranged between 100 and 300. Next, the content of each Petri dish was transferred to its corresponding nylon membrane, which were subjected to hybridization with the same probe. Each of the 26 purified lysis plates was resuspended in 1 ml of SM with 50 ⁇ l of chloroform and phage amplification was carried out in liquid medium.
  • phage solution 100 ul of phage solution (about June 10 pfu) were used to infect 1 ml of an E. coli LE392 in LB incubated at 37 0 C for 16 hours with vigorous stirring. The mixture was incubated at 47 ° C for 15 minutes, after which was added 4 ml of LB and incubated at 37 0 C for 12 hours. After this time 50 ⁇ l of chloroform was added, it was incubated 15 minutes at 37 ° C and centrifuged at 4,000 xg for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected and 20 ⁇ l of chloroform was added, constituting the phage solution with a titer of approximately 10 7 pfu / ⁇ l for each of the positive phages.
  • PCR amplification reactions were performed with 5 ⁇ l of each of the positive phage solutions, previously denatured by heating at 9O 0 C for 15 minutes and subsequent rapid cooling on ice.
  • the synthetic oligonucleotides used for this PCR were NCSACI (SEQ ID NO: 14) and NCSAC4 (SEQ ID NO: 15), the same with which the DNA probe was obtained, and the reaction conditions were similar to those described in section 3 of example 4. Of the phage analyzed only 3 yielded a 900 bp fragment by PCR amplification.
  • coli DH5 ⁇ cells The transformants were selected in solid LB medium to which chloramphenicol (30 ⁇ g / ml), X-gal (40 ⁇ g / ⁇ l) and 0.2 ⁇ iM IPTG were added. Among the clones that presented the white selection phenotype, the one carrying the pva gene fragment was identified as pALSL ⁇ . Analysis of the fragments generated after digestion with Sacl revealed that the insert size was approximately 2 kb, 1.3 kb smaller than expected if it contained the entire pva gene sequence including the terminator region.
  • the preparation was subjected to an amplification process in an Eppendorf Mastercycler Gradient thermal cycler under the following conditions: 96 ° C (2 minutes); then 5 cycles, each cycle being 96 ° C (1 minute), 70 0 C (2 minutes) and 72 ° C (8 minutes). cough) ; then another 5 cycles, each cycle being 96 0 C (1 minute), 68 0 C (2 minutes) and 72 ° C (8 minutes); 5 cycles, each cycle being 96 ° C (1 minute), 63 ° C (2 minutes) and 72 ° C (8 minutes); and finally 20 cycles, each cycle being 96 0 C (1 minute), 60 0 C (2 minutes) and 72 ° C (8 minutes).
  • the result of the amplification was analyzed on 1% agarose gel.
  • the DNA fragment amplified by PCR was purified by extraction of the agarose gel by GeneClean (BiolOl Inc.) following the recommended protocol.
  • a total of 0.2 ⁇ g of the fragment amplified by PCR were ligated to the plasmid vector pGEM-T Easy vector (Promega) following the recommendations of the supplier.
  • the resulting ligation mixture was used to transform competent E. coli DH5 ⁇ cells.
  • the transformants were selected in solid LB medium to which ampicillin (100 ⁇ g / ml), X-gal (40 ⁇ g / ⁇ l) and 0.2 mM IPTG were added.
  • the plasmids purified from the clones presenting the white selection phenotype were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis according to the protocol described in section 4 of example 3.
  • One of these clones carrying the pva gene fragment is identified as pPVAT (see figure 1).
  • nucleotide sequence analysis of the ends of the DNA fragment contained in the plasmid pPVAT found that the cloned DNA fragment contained the pva gene from the gene sequence encoding the signal peptide to the translation termination codon.
  • Plasmid pALSL ⁇ was purified from a pure culture of a recombinant strain of E. coli DH5 ⁇ by the High Puré Plasmid Isolation Kit (Roche) procedure, following the protocol provided by the supplier. 2 ug of the purified plasmid pALSL ⁇ sequentially digested with the restriction endonucleases EcoRI (Pharmacia) for 3 hours at 37 0 C and JBstAPI (Pharmacia) for 3 hours at 60 0 C in a buffer compatible for both enzymes. After this second digestion, the reaction was stopped by heating the mixture at 80 0 C for 10 minutes.
  • the result of double digestion was visualized by staining ethidium bromide after electrophoresis in a 1% agarose gel.
  • the DNA fragment with an approximate size of 4.8 kb was purified by extraction of the agarose gel by the GeneClean method described above.
  • the 4.8 kb (1 ⁇ g) DNA fragment corresponding to EcoRI-BstAPI digested pALSL ⁇ was mixed with 1 ⁇ g of the 1 kb DNA fragment resulting from the double Bst ⁇ PI-EcoRI digestion of plasmid pPVAT.
  • the enzyme T4 DNA ligase was added in the presence of ATP in the buffer recommended by the suppliers, and incubated for 16 hours at 4 ° C. Then 10 ⁇ l of the resulting ligation mixture was used to transform competent E. coli DH5 ⁇ cells.
  • the transformants were selected in solid LB medium to which chloramphenicol (30 ⁇ g / ml), X-gal (40 ⁇ g / ⁇ l) and 0.2 mM IPTG were added.
  • the plasmids corresponding to the clones presenting the white selection phenotype were purified according to the protocol described in section 4 of example 3 and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis.
  • One of these clones that carries the DNA fragment that contains the pva gene under the control of its own promoter was identified as pBCPVASlO.l.
  • the DNA fragment contained in the plasmid pBCPVASlO.ly encoding the S. lavendulae pva gene was sequenced as indicated in section 4 of example 3, using as a primer several of the synthetic oligonucleotides designed for the amplification reactions by PCR.
  • the sequence obtained is shown as SEQ ID NO: 12 and the amino acid sequence deduced as SEQ ID NO: 13.
  • the pHJL401 bifunctional plasmid with origin of replication for E. coli and S. lividans, contains resistance markers for ampicillin and thiostreptone for selection in E. coli and S. lividans, respectively.
  • Said vector was prepared according to the conditions described in section 1 of example 3.
  • DNA carrying the pva gene expressed under the control of its own promoter was 5.
  • lividans 1326 The introduction of pBCPVASlO.l in S. lividans 1326 was carried out by transforming protoplasts, which were obtained following the procedure described ( Hopwood DA et al.
  • Plasmid pBCPVASlO.l which carries the pva gene under the control of its own promoter, was purified from a pure culture of a recombinant strain of E. coli DH5 ⁇ , as already described above. 10 ⁇ g of plasmid pBCPVASlO.l were digested with the restriction endonucleases Sacl and EcoRI for 3 hours at 37 ° C.
  • the mixture was digested with a third restriction endonuclease with targets present in the plasmid pBC KS (+) and absent in the nucleotide sequence of the pva gene, the restriction enzyme Dral (Pharmacia) being chosen for it. Digestion with this enzyme was carried out for 90 minutes at 65 ° C in the buffer recommended by the suppliers. After this third digestion, the reaction was stopped by heating the mixture at 80 0 C for 10 minutes , and then to display the result of digestion by electrophoresis in agarose gel 1%.
  • the ligation reaction was performed by mixing 1 ⁇ g of the 3 kb DNA fragment with 2 ⁇ g of the plasmid pHJL401 digested with the Sacl and EcoRI restriction donucleases under the same conditions described above for plasmid pBCPVASlO.l. Then, the enzyme T4-DNA ligase was added to the mixture and incubated for 16 hours at 4 ° C in the buffer recommended by the suppliers. 10 ⁇ l of the ligation mixture was used to transform competent E.
  • plasmid pPVASlO.l (see Figure 2A-C) was selected, which included the 3 kb DNA fragment with the pva gene of S. lavendulae under its own promoter. Said plasmid was purified and sequenced as previously described.
  • Plasmid pPVASlO.l (2 ⁇ g) was used to transform S. lividans 1326 protoplasts following a described method (Hopwood DA. Et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England ). Transformants were plated on R2YE solid medium (Kieser T. et to the. (2000) Practical Streptomyces Genetics, The John Innes, Norwich, UK) and incubated at 30 0 C for 24 hours. After this time, thiostreptone (5 ⁇ g / ml) was added in order to select the recombinant cells that carry the plasmid pPVASlO.l.
  • S. lividans pPVASlO.l which contains the pva gene of 5. lavendulae, and which has been deposited in the Type Culture Collection (CECT) located at the University of Valencia , Research Building, Burjassot Campus, 46100 Burjassot, Valencia, Spain, with n ° 3365, on 02.22.2003.
  • CECT Type Culture Collection
  • the S. lividans CECT 3365 strain was fermented in different media: skim milk (S. lavendulae PVA production medium), TSB without glucose (TSB) and TSB with glucose
  • TSBG TSBG
  • the fermentations were carried out for 140 hours at 30 0 C and 250 rpm Every 24 hours aliquots of the culture broths were taken and, after centrifugation at 3000 xg for 30 minutes at 4 ° C, the activity was determined PVA in both the supernatant (cell-free extract) and the precipitate (cell extract). In the latter case, a previous rupture of the cells was performed by sonication.
  • the activity test was carried out as described in section 2 of example 1. The PVA activity was only detected in the supernatant, obtaining greater production in the culture broths from the fermentations in TSB medium without glucose, where the maximum occurs at 72 hours of cultivation (see table 1).
  • Example 9 Production of 6-aminopenicillanic acid (6-APA) from penicillins V, K, F and dihydro F.
  • lividans strain CECT 3365 was fermented in TSB medium for 72 hours at 30 0 C and 250 rpm agitation. The culture broths were then centrifuged at 3000 xg for 30 minutes at 4 0 C. With the cell-free supernatant obtained, the production of 6-APA was determined from penicillins V, K, F and dihydro F For this purpose, activity tests were carried out using penicillin V (30 mM), penicillin K (3 mM), penicillin F (10 mM) or penicillin dihydro F (10 mM) as substrate. The concentrations used were saturants under the conditions tested according to the protocol previously described (Torres el al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Com. 291, 593-597).
  • Fig. 1 Construction of plasmid pPVAT Fig. 2 (AC): Construction of plasmid pPVASlO.l Fig. 3: AC phases for obtaining 6-APA from penicillins V, K, F and dihydroF by PVA produced by S lividans CECT 3365. Abscissa: Type of starting penicillin used. Ordered: ⁇ moles / min / ml of 6-APA produced.

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Abstract

Procedimiento para producir la enzima penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae en microorganismos recombinantes . El procedimiento de producción de la enzima comprende: (1) identificación del ADN correspondiente al gen pva, el cual codifica la enzima penicilina V acilasa de 5. lavendulae ATCC 13664, (2) clonación del citado gen en un vector apropiado para la célula hospedadora utilizada, (3) cultivo de las células hospedadoras recombinantes portadoras del gen pva y (4) recuperación de la enzima a partir del cultivo de las células. La enzima PVA obtenida se utiliza en la producción individual de antibióticos β-lactámicos, particularmente del ácido 6-aminopenicilánico (6 -APA) a partir de penicilina V, pero también puede utilizar otras penicilinas (K, F, y dihidro F) como sustrato.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR LA ENZIMA PENICILINA V ACILASA DE STREPTOMYCES LAVENDULAE EN MICROORGANISMOS
RECOMBINANTES. ESTADO DE LA TÉCNICA Las enzimas con actividad penicilina G acilasa y penicilina V acilasa (en lo sucesivo PGA y PVA, respectivamente) son utilizadas industrialmente para hidrolizar respectivamente las penicilinas G y V, y obtener ácido 6 aminopenicilánico (en lo sucesivo 6-APA) , producto de partida para la producción industrial de penicilinas semisintéticas . El 85% de la producción mundial de 6-APA se obtiene mediante la hidrólisis de penicilina G mediante PGA (Shewale JG and Sudhakaran VK, (1997) Enzyme Microb. Technol. 20, 402-410) . Las penicilinas G y V se producen industrialmente mediante procesos fermentativos en los que también se sintetizan otras penicilinas alifáticas naturales (penicilinas K, F y dihidro F) , las cuales representan alrededor del 1-2 % de la penicilina total en los caldos. Las PGAs utilizadas industrialmente no son capaces de hidrolizar estas penicilinas alifáticas cuya presencia dificulta la cristalización del 6-APA, implicando ambos hechos un menor rendimiento en la obtención del 6- APA, lo que ocasiona pérdidas económicas significativas. La PVA de Streptomyces lavendulae ATCC 13664 es la única penicilina acilasa capaz de hidrolizar estas penicilinas alifáticas eficazmente (Hamilton-Miller J.M.T., (1966)
Bacteriol. Rev. 30, 761-771; Torres R. et al. (1999) Appl.
Microbiol. Biotechnol. 53, 81-84; Torres-Guzmán R. et al.
(2002), Biochem. Biophys . Res. Comm. 291, 593-597) . Además, esta enzima presenta una serie de propiedades que la hacen más adecuada para su utilización industrial (Shewale JG and Sudhakaran VK, (1997) Enzyme Microb. Technol. 20, 402-410; Arroyo M. et al. (2000) Biotechnol. Prog. 16, 368-371; Arroyo M. et al. (2002) Biocatal. Biotransform. 20, 53-56; Arroyo M. et al. (2003) Appl . Microbiol. Biotechnol. 60, 507-514) .
Por otra parte, son conocidos los procedimientos adecuados para el aislamiento y expresión de los genes que codifican las PGAs de distintos microorganismos, asi como del gen que codifica la PVA de Bacillus sphaericus, única penicilina V acilasa de la que se conoce la secuencia génica que la codifica asi como su secuencia de aminoácidos (Deshpande B.S. et al. (1994) World J. Microbiol. Biotechnol. 10, 129-138) . Sin embargo, no existen referencias relativas al aislamiento del gen que codifica la PVA de S. lavendulae ni a su expresión, ya sea en la bacteria E. coli o en cualquier otro organismo. Asimismo, los únicos datos de que se dispone sobre la estructura de esta enzima revelan que es un heterodimero (Torres-Guzmán R. et al. (2000) XXIII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular) , pudiendo tratarse de una proteina perteneciente a la familia de las penicilina acilasas heterodiméricas que poseen dos subunidades diferentes. Esta proteina contiene una subunidad pequeña de 20 kDa (en lo sucesivo subunidad α) y una subunidad grande de 60 kDa (en lo sucesivo subunidad β) . Además se ha observado que, en determinadas circunstancias, la subunidad β sufre la pérdida de un fragmento de alrededor de 100 aminoácidos en su extremo amino terminal, rindiendo una cadena polipeptidica de alrededor de 50 kDa (en lo sucesivo subunidad β truncada) (Torres-Guzmán R. et al. (2000) XXIII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular) . Este tipo de estructura heterodimérica diferenciarla la PVA de 5. lavendulae de la PVA de B. sphaericus, única PVA cuya estructura ha sido caracterizada completamente y que está formada por cuatro subunidades idénticas (Suresh CG. et al. (1999) Nature Structural Biology 6, 414-415) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Para la realización de esta invención se ha utilizado el procariota 5. lavendulae ATCC 13664 como donador del ácido desoxirribonucléico (en lo sucesivo referido como
ADN) productor de la enzima PVA, la cual presenta una estructura heterodimérica con una subunidad α y una subunidad β que, en determinadas circunstancias, puede sufrir una pérdida de un fragmento en su extremo amino terminal rindiendo una subunidad β truncada. Estas características van a ser utilizadas en el diseño de la estrategia para conseguir el aislamiento y clonación del gen que codifica la PVA de 5. lavendulae ATCC 13664 (en lo sucesivo denominado como gen pva) .
Una vez purificada la enzima PVA a partir de caldos de cultivo de S. lavendulae ATCC 13664 se determinaron mediante secuenciación automática las secuencias amino terminales de las subunidades α y β asi como de la subunidad β truncada. Seguidamente, y en base a estas secuencias, se diseñaron oligonucleótidos sintéticos degenerados a fin de amplificar el gen pva mediante el proceso de amplificación conocido como reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo referido como PCR) , utilizando como molde el ADN genómico de S. lavendulae ATCC 13664. Como productos de la amplificación del proceso de PCR se obtuvieron dos fragmentos de ADN de 630 y 300 pares - A - de bases (pb) respectivamente, los cuales se aislaron y se introdujeron en vectores plasmidicos . Los vectores recombinantes se utilizaron para obtener, mediante secuenciación automática, las secuencias de los fragmentos de ADN que contenían parte del gen pva.
A continuación, se digirió el ADN de S. lavendulae ATCC 13664 con la endonucleasa de restricción SacII . La elección de esta enzima se realizó tras llevar a cabo un análisis de Southern con varias endonucleasas de restricción, utilizando como sonda el fragmento de 630 pb anteriormente obtenido por PCR. Los fragmentos resultantes de la digestión del ADN con SacII se circularizaron mediante una ligación realizada en alta dilución y se utilizaron como molde para la amplificación por PCR inversa, utilizando como cebadores oligonucleótidos sintéticos diseñados en base a la secuencia anteriormente obtenida, a fin de que amplificaran hacia el exterior del fragmento. El fragmento de ADN producto de la amplificación por PCR inversa se aisló y se clonó en un vector plasmidico obtenido de una cepa de E. coli, y posteriormente se secuenció. El análisis de la secuencia de nucleótidos reveló que el fragmento poseía 1362 pb, comprobándose que contenia parte del gen que codifica la PVA de 5. lavendulae, incluyendo la región promotora, el posible sitio de unión al ribosoma (en lo sucesivo denominado como RBS), el codón de iniciación de la traducción y una secuencia génica que codifica el péptido señal de secreción, estando ausente el codón de terminación de la traducción y la región terminadora de la transcripción.
Los vectores recombinantes obtenidos hasta ese momento permitieron, por tanto, determinar parte de la secuencia del gen pva de 5. lavendulae que comprendía la región promotora, la secuencia génica que codifica el péptido señal, la subunidad α y parte de la secuencia génica que codifica la subunidad β de la proteína. Con el fin de completar la secuencia del gen pva se procedió de nuevo a digerir el ADN genómico con otra endonucleasa de restricción, circularizar los fragmentos resultantes mediante una ligación realizada en alta dilución y utilizarlos como molde para la amplificación por PCR inversa. En este caso, la elección de la endonucleasa de restricción se llevó a cabo tras examinar la secuencia de ADN ya determinada, eligiéndose HincII, enzima que proporciona fragmentos de aproximadamente 900 pb en la secuencia determinada y de la que existe un sitio de corte situado a unas 300 pb de la secuencia hasta ese momento determinada del extremo 3' del gen pva. Los cebadores utilizados para la PCR inversa fueron oligonucleótidos sintéticos diseñados a partir de la secuencia previamente determinada que amplificasen hacia el exterior del fragmento. Se obtuvo un fragmento de ADN producto de la amplificación por PCR inversa que se aisló, clonó y se secuenció, comprobándose que contenía tanto la secuencia del gen pva que codifica para el extremo carboxilo terminal de la subunidad β como el codón de terminación de la traducción y la región terminadora de la transcripción.
Se obtuvo así la secuencia completa del gen pva, desde la región promotora hasta la región terminadora de la transcripción, determinándose la existencia de un marco de lectura abierto (en lo sucesivo ORF) donde se localiza un triplete TTG que puede actuar como un posible codón de iniciación (el triplete TTG es poco habitual como codón de iniciación ya que en Streptomyces concurre con una frecuen- cía del 3 % (Kieser T. et al. (2000) Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England) . Considerada de esta forma, la ORF contiene la región que codifica las subunidades α y β de la PVA, presentando además una secuencia génica que codifica un péptido señal de 39 aminoácidos, con una estructura típica para la secreción de proteínas en Streptomyces (Lammertyn E. and Anné J. (1998) FEMS Microbiol . Lett. 160, 1-10) .
Seguidamente, se procedió a la expresión del gen pva en organismos heterólogos. Para ello, con el fin de tener el gen pva completo se llevó a cabo la construcción de una genoteca de 5. lavendulae ATCC 13664. En primer lugar se digirió parcialmente el ADN genómico de 5. lavendulae con la endonucleasa de restricción 5au3AI y con los fragmentos resultantes se construyó una genoteca utilizando como vector el fago lambda-GEM12 (Promega) . Con el fin de aislar los fagos recombinantes que contenían el gen pva se rastreó la genoteca utilizando como sonda un fragmento de ADN de 900 pb obtenido mediante amplificación por PCR a partir de la secuencia previamente determinada. Tras la identificación y purificación de un fago positivo que contenia el gen pva se procedió a la subclonación de dicho gen en vectores plasmidicos de E. coli. La posterior secuenciación del fragmento clonado mostró que el gen no estaba completo, careciendo tanto de 1000 pb correspondientes al extremo 3' del gen como de la región terminadora. Se procedió entonces a su reconstrucción con el fin de obtener el gen pva completo para expresarlo en organismos heterólogos. Para ello, se amplificó mediante PCR el gen pva utilizando como cebadores oligonucleótidos sintéticos diseñados en función de las secuencias de nucleótidos de sus extremos 5' y 3' . En estos oligonucleó- tidos sintéticos se incluyeron las secuencias de unión al ribosoma de E. coli (RBS), un codón de iniciación de la traducción y un codón de terminación de la traducción, asi como distintos sitios de restricción útiles para posteriores clonaciones. Se obtuvo asi un fragmento de ADN con la secuencia génica que codifica la PVA, el cual fue clonado en un vector plasmidico de E. coli.
A continuación, el plásmido que portaba el fragmento de ADN obtenido de la genoteca, el cual contenia parte del gen pva, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI (con diana de restricción en la secuencia génica del plásmido posterior a la región 3' del gen pva) y BstΑPI (con diana de restricción única en la secuencia completa del gen pva y ausente en el plásmido) , obteniendo un fragmento de ADN EcoRI-BstAPI que contiene la secuencia génica desde la región promotora del gen pva hasta la secuencia de nucleótidos que codifica el extremo amino terminal de la subunidad β. Paralelamente, el fragmento de ADN con el gen pva obtenido mediante PCR (clonado en un vector plasmidico de E. coli) se digirió con las endonucleasas de restricción BstKPI y EcoRI, obteniéndose un fragmento de ADN BstAPI- E1CoRI del gen pva que contiene la secuencia génica que codifica el extremo carboxilo terminal de la subunidad β de la PVA y el codón de terminación de la traducción. Seguidamente los citados fragmentos de ADN EcoRI-BstAPI y BStAPI-E1CoRI se ligaron y se obtuvo un fragmento de ADN portador de la secuencia de nucleótidos completa del gen pva, desde la secuencia promotora hasta el codón de terminación de la traducción, en un vector plasmidico de E. coli.
Utilizando las dianas de restricción Sacl y EcoRI, pre- sentes en las secuencias plasmidicas flanqueantes a ambos lados del fragmento de ADN que contiene el gen pva, se purificó dicho fragmento y se subclonó en un vector plasmidico bifuncional de E. coli y S. lividans. Tras comprobar dicha construcción mediante secuenciación, se transformó la cepa S. lividans 1326 y se obtuvieron clones recombinantes que expresaban el gen pva bajo el control de su propio promotor. Uno de dichos clones de 5. lividans que contenía el vector plasmidico portador del gen pva y que producía la PVA de S. lavendulae activa se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el n° 3365.
Para la producción de la PVA utilizando el clon recombinante CECT 3365 previamente seleccionado, se cultiva el organismo en un medio que contenga fuente de carbono, fuente de nitrógeno y sales minerales. Asimismo, la temperatura y el pH del medio de cultivo deben ser controlados adecuadamente. La estabilidad del microorganismo recombinante se consigue mediante la adición de tiostreptona al medio de cultivo, antibiótico para el que confiere resistencia el vector que contiene el gen pva. La presencia del antibiótico, además de conferir estabilidad a la producción, evita la contaminación del medio de cultivo con otros microorganismos indeseables. La PVA producida por CECT 3365 es extracelular, obteniéndose a partir del caldo de cultivo mediante separación de las células por centrifugación. El extracto libre de células presenta una PVA con grado de pureza elevado, pudiendo purificarse la enzima PVA a homogeneidad mediante técnicas convencionales cromatográficas .
La novedad de esta invención radica en el aislamiento y caracterización del gen que codifica la PVA de S. lavendu- lae ATCC 13664, hasta ahora no descrito, y en su expresión en un organismo heterólogo. Asimismo, se determina por primera vez la estructura primaria de la enzima PVA de 5. lavendulae ATCC 13664. La posibilidad de sintetizar PVA en 5. lividans permite tanto incrementar su producción como modificar su especificidad de sustrato y eficacia catalítica, lo cual facilitarla el empleo de esta enzima a escala industrial.
La presente invención será ilustrada con más detalle en los ejemplos que siguen:
Ejemplo 1: Producción y purificación de la PVA de S. lavendulae ATCC 13664
1. Producción y purificación de la PVA de S. lavendulae ATCC 13664
La enzima PVA de S. lavendulae ATCC 13664 fue producida según el protocolo previamente descrito (Torres R. et al.
(1999) Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 81-84) . La purificación de la PVA se llevó a cabo de acuerdo con un procedimiento parcialmente modificado del descrito por Torres et al. (1998), donde el último paso cromatográfico tras el que se obtiene la enzima pura a homogeneidad consiste en una cromatografía de adsorción en hidroxiapatito, en lugar de una cromatografía de penetrabilidad en Ultrogel AcA44 como estaba descrito (Torres R. et al. (1998) Progess in Biotechnology 15: Stability and Stabilization of Biocatalysts, A. Ballesteros, FJ Plou, JL Iborra and PI Halling Eds . , Elservier, Amsterdam, pp 719-724) .
2. Ensayo de la actividad PVA
El ensayo de la actividad PVA se realizó utilizando penicilina V (30 mM) como sustrato, de acuerdo a un protocolo previamente descrito (Torres et al, (1998) Progess in Biotechnology 15: Stability and Stabilization of Biocatalysts, A. Ballesteros, FJ Plou, JL Iborra and PI Halling Eds . , Elservier, Amsterdam, pp 719-724) . La incubación se lleva a cabo en tampón fosfato potásico 100 mM pH 8 durante 20 minutos a 400C. La reacción se detiene añadiendo 400 μl de acetato sódico 50 mM pH 4,5 y, tras centrifugación, la liberación de 6-APA se valora espectrofotométricamente por reacción con fluorescamina
(método de la fluorescamina) según las especificaciones de
Udenfriend et al. (1972) modificado por Reyes et al. (1989)
(Udenfriend S. et al. (1972) Science, 178, 871-872; Reyes F. et al. (1989) J. Pharma. Pharmacol., 41, 136-137) .
Ejemplo 2: Obtención de las secuencias amino terminales de las subunidades α y β y de la subunidad β truncada de la PVA de S. lavendulae ATCC 13664
1. Determinación de las secuencias amino terminal de las subunidades α, β y las subunidad β truncada de S. lavendulae ATCC 13664
La detección de los polipéptidos se llevó a cabo mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12,5% - li ¬ en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) tanto de la proteina pura recién obtenida como de una alícuota mantenida durante 2 semanas a 4°C. Tras la tinción con azul de Coomassie se observan 2 bandas con pesos moleculares de 20 y 60 kDa en el caso de la proteina pura recién obtenida,
(correspondientes a las subunidades α y β, respectivamente), mientras que la proteina conservada a 4°C rindió 3 bandas de pesos moleculares 20, 60 y 50 kDa
(correspondientes a las subunidades α, β y β truncada, respectivamente) .
A continuación, se procedió a la determinación de las secuencias amino terminales de las subunidades α, β y β truncada, de acuerdo con un procedimiento previamente descrito (Speicher DW. (1994) Methods Enzymol. 6, 262-273) .
Para ello, una alícuota de 60 μg de la proteina conservada durante 2 semanas a 40C se sometió a electroforesis SDS- PAGE al 12,5 % en presencia de β-mercaptoetanol . Una vez separadas, las tres bandas se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-PSQ de Millipore) . Tras teñir la membrana con negro amido, las bandas de proteina se recortaron y fragmentaron para su secuenciación en un secuenciador de proteínas Applied Biosystems, rindiendo las secuencias representadas como SEQ ID NO: 1 (Subunidad α) , SEQ ID NO:2 (Subunidad β) y SEQ ID NO: 3 (Subunidad β truncada) .
Ejemplo 3: Clonación mediante PCR del gen pva determinación de su secuencia. 1. Preparación de los vectores y de las células competentes de E. coll para la clonación y análisis de fragmentos de
ADN
El vector plasmídico pUC18, que contiene el gen de resistencia a ampicilina como marcador de transformación, se preparó de acuerdo con protocolos previamente descritos
(Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory
Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA) . Las cepas de E. coli portadoras del citado plásmido se sembraron en matraces con 50 mi de medio LB y se incubaron durante 16 horas a 250 r.p.m. y 37°C. Transcurrido dicho tiempo, las células se centrifugaron, se lavaron, se usaron y los plásmidos se aislaron siguiendo el método de lisis alcalina (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA) . La cepa utilizada para la clonación y análisis de fragmentos fue E. coli DH5α. Para obtener las células competentes se utilizó el procedimiento del RbCl (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA) .
2. Preparación del ADN de S. lavendulae ATCC 13664
La cepa de S. lavendulae ATCC 13664 se cultivó en un medio YEME (extracto de levadura (0,3%), bactopeptona
(0,5%) , extracto de malta (0,3%), glucosa (1%), MgCl2 5mM) , suplementado con sacarosa (34%) y glicina (0,5%) . La incubación se realizó durante 18 horas a 300 r.p.m. y 300C. Seguidamente, se recogió el micelio por centrifugación a 3000 x g durante 15 minutos, se lavó con sacarosa al 10% y, a continuación, se procedió a la lisis celular mediante tratamiento con lisozima. Por último, se purificó el ADN siguiendo un procedimiento previamente descrito (Hopwood D.A. et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England) . Para conseguir una mayor pureza del ADN, éste se trató con ARNasa, se extrajo varias veces con fenol neutro y cloroformo-alcohol isoamilico 24:1 (CIA) y posteriormente se precipitó con isopropanol. Tras realizar lavados con etanol al 70% y etanol al 100%, el ADN se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) .
3. Obtención mediante PCR de fragmentos de ADN que contienen el gen pva de S. lavendulae
A partir de las secuencias amino terminales obtenidas, y teniendo en cuenta el uso de codones en Streptomyces, se diseñaron los siguientes oligonucleótidos degenerados, con dianas EcoRI en ambos extremos: (i) STREPTOP2, representado en SEQ ID NO: 4, que codifica la secuencia de aminoácidos TEAGIPH de la subunidad α, (ii) STREPTOG3, representado en SEQ ID NO: 5, que codifica la secuencia de aminoácidos NAVAFRG de la subunidad β, (iii) STREPTOGl, representado en SEQ ID NO: 6, que codifica la secuencia de aminoácidos RGLLLGNPHY de la subunidad β y (iv) STREPTOD2, representado en SEQ ID NO: 7, que codifica la secuencia de aminoácidos QWWTRYGP de la subunidad β truncada.
Las reacciones de amplificación mediante PCR se llevaron a cabo mezclando 0,5 μg del ADN genómico de 5. lavendulae con 16 μl (5 μM) de cada uno de los oligonucleótidos degenerados, combinando en cada reacción
STREPTOP2 con STREPTOG3 y STREPTOGl con STREPTOD2. A cada mezcla se adicionaron 2,5 unidades de la enzima AmpliTaq
DNA polimerasa (Perkin-Elmer) junto con el tampón adecuado recomendado por los suministradores. El volumen final de cada reacción fue de 100 μl, conteniendo dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%. El preparado se sometió a un proceso de amplificación por PCR en un termociclador Eppendorf modelo
Mastercycler Gradient en las siguientes condiciones: 95°C
(5 minutos), 55°C (10 minutos), 72°C (2 minutos) y a continuación 30 ciclos, siendo cada ciclo de 95°C (1 minuto), 55°C (2 minutos) y 72°C (2 minutos) . El resultado de cada amplificación se visualizó mediante tinción de bromuro de etidio después de una electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
Los dos fragmentos de ADN obtenidos por PCR (600 pb con STREPTOP2/STREPTOG3 y 300 pb con STREPTOG1/STREPTOD2) , se purificaron mediante extracción del gel de agarosa por GeneClean (BiolOl Inc.) siguiendo el protocolo recomendado.
4. Clonación y secuenciación de los fragmentos obtenidos por PCR que contienen el gen pva
Muestras de 0,2 μg de cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR fueron digeridos por separado con la endonucleasa de restricción EcoRI (Roche) , puesto que los oligonucleótidos se diseñaron con dianas JϊcoRI . Las digestiones se llevaron a cabo en un tampón recomendado por los suministradores a 37°C durante 1 hora, tras lo cual se detuvieron las reacciones calentando las mezclas a 85°C durante 10 minutos. Cada uno de los fragmentos digeridos se incubó por separado con una muestra de 0, 1 μg del plásmido pUC18 (previamente digerido con EcoRI) , en presencia de la enzima T4 ADN ligasa (USB) y ATP usando un tampón recomendado por los suministradores.
Cada una de las mezclas de ligación resultantes con cada fragmento se utilizaron para transformar células competentes de E. coli DH5α. Los transformantes se aislaron en el medio de cultivo sólido LB-ampicilina (100 μg/ml) .
Mediante este procedimiento se obtuvieron varios clones de cada transformación que fueron posteriormente analizados.
Para ello, las colonias de E. coli DH5α seleccionadas se cultivaron en medio LB liquido a 37°C y 250 r.p.m. durante 16 horas. A continuación se extrajeron y purificaron los plásmidos mediante el procedimiento High Puré Plasmid Isolation Kit (Roche) siguiendo el protocolo proporcionado por el suministrador. Uno de estos clones contenia el plásmido recombinante pIJLl, el cual posee el fragmento de ADN de 630 pb resultante de la amplificación por PCR insertado en el sitio £coRI del plásmido pUC18. Otro de los clones contenia el plásmido recombinante pIJL21, el cual posee el fragmento de ADN de 300 pb.
La secuencia de nucleótidos de los fragmentos contenidos en estos plásmidos se determinó mediante secuenciación automática en un equipo ABI PRISM 3700. Applied Biosystems, Perkin-Elmer
Ejemplo 4 : Clonación mediante el procedimiento de amplificación por PCR inversa del gen pva y determinación de su secuencia 1. Obtención mediante PCR inversa de un fragmento de ADN que contiene el gen pva de S. lavendulae
Muestras de 8 μg de ADN genómico de S. lavendulae se digirieron con las endonucleasas de restricción Acel, PstI, Salí, Stul, Avrll, BcII, BgIII, Dral, Ncol, Nhel y SacII (Pharmacia), y se determinaron los tamaños de los fragmentos generados que podrían contener el gen pva mediante el método de Southern (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, New York, USA) . Los geles de agarosa en los que se separaron los fragmentos de ADN digerido en base a su tamaño molecular se irradiaron con luz UV durante 10 minutos. A continuación los geles se sumergieron en solución desnaturalizante (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) durante 30 minutos con agitación suave y a temperatura ambiente. Seguidamente tras lavar en agua destilada, los geles se incubaron otros 30 minutos a temperatura ambiente y agitación suave en solución de neutralización (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7) . Tras lavar de nuevo los geles con agua destilada se procedió a la transferencia de los fragmentos de ADN a filtros de nylon Immobilon-S (0,45 μm) (Millipore) por aplicación de vacio mediante Transblot (BIO-RAD) . Para ello, en cada caso se colocó en el Transblot una lámina de papel Whatman 31*1 de las dimensiones del gel empapada en solución 2 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM) . Sobre ella se colocó un filtro con las dimensiones del gel y empapado también en solución 2 x SSC y sobre éste el gel de agarosa, evitando en todo el proceso la formación de burbujas. A continuación se aplica el vacio de tal forma que los fragmentos de ADN se transfieren al filtro intercalado. Una vez transferido el ADN, los filtros se irradiaron con luz UV durante 10 minutos por cada lado. Seguidamente se procedió a su prehibridación e hibridación utilizando como sonda el fragmento de 630 pb anteriormente obtenido por PCR, marcado con el sistema de digoxigenina (DIG DNA Labelling Kit, Boehringer Mannhein GmbH) . La prehibridación de los filtros se llevó a cabo mediante su incubación durante 2 horas a 65°C con tampón de prehibridación (Sambrook J., Fritsch EF. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, New York, USA) . La hibridación se realizó retirando el tampón utilizado en la prehibridación e introduciendo nuevo tampón de hibridación junto con 250 ng del fragmento de ADN marcado con digoxigenina previamente desnaturalizado. Los filtros se incubaron durante 16 horas a 65°C y, tras retirar el tampón de hibridación, se lavaron dos veces durante 10 minutos a 65°C con una solución 2 x SSC precalentada a la temperatura de incubación. Seguidamente se lavaron otras dos veces durante 10 minutos a la misma temperatura con 2 x SSC-O, 1% SDS y dos veces más en las mismas condiciones con 0, IxSSC-O, 1% SDS. Por último se procedió al revelado de los filtros mediante el procedimiento de detección por quimioluminiscencia con "DIG Luminescent Detection Kit" (Boehringer Mannheim) , siguiendo las instrucciones del proveedor.
El resultado de las autorradiografias mostró la aparición de bandas especificas de hibridación para las digestiones con Accl, Salí, BcII, Ncol y SacII, presentando esta última un tamaño de 3,6 kb, muy adecuado para llevar a cabo su clonación mediante PCR inversa. Para ello, 8 μg de ADN genómico de 5. lavendulae se digirieron con la endonucleasa SacII en un tampón recomendado por los suministradores a 370C durante 1 hora y en un volumen de reacción de 30 μl . A continuación, y tras parar la reacción de digestión calentando la mezcla de reacción a 800C durante 10 minutos, la circularización de los fragmentos generados se llevó a cabo mediante la adición de la enzima T4 ADN ligasa (USB) en presencia de ATP usando un tampón recomendado por los suministradores, en un volumen de 300 μl, incubándose la mezcla durante 16 horas a 4°C. Seguidamente se procedió a la precipitación del ADN con isopropanol y posterior lavado con etanol al 100%. El precipitado resultante se resuspendió en 25 μl de TE.
El ADN digerido y circularizado se utilizó como molde para la reacción de amplificación mediante PCR, utilizando como cebadores dos oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias de nucleótidos conocidas de los extremos 5' (oligonucleótido N, representado como SEQ ID NO: 8) y 3' (oligogonucleótido C, representado como SEQ ID NO: 9) del fragmento del gen pva clonado y secuenciado anteriormente
(apartado 4 del ejemplo 3), de forma que amplifiquen hacia el exterior del fragmento. Las reacciones de amplificación mediante PCR se llevaron a cabo mezclando 16 μl (5 μM) de cada uno de los oligonucleótidos con 5 μl de la muestra del ADN circularizado tras la digestión con SacII, añadiendo a continuación 2,5 unidades de la enzima AmpliTaq DNA polimerasa (Perkin-Elmer) como se ha descrito en el apartado 3 del ejemplo 3. Las condiciones de amplificación fueron: 95°C (5 minutos), 700C (4 minutos), 72°C (5 minutos) y a continuación 30 ciclos, siendo cada ciclo de 95°C (1 minuto), 700C (4 minutos) y 72°C (5 minutos) . El resultado de cada amplificación se visualizó mediante tinción de bromuro de etidio después de su electroforesis en gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN de aproximadamente 1300 pb obtenido por PCR se purificó mediante extracción del gel de agarosa por GeneClean (BiolOl Inc.) siguiendo el protocolo recomendado.
2. Clonación y secuenciación del fragmento obtenido por PCR inversa que contiene el gen pva
Una muestra de 0,1 μg de ADN del plásmido pUClδ se digirió con la endonucleasa de restricción HincII
(Pharmacia) durante 1 hora a 37°C en el tampón recomendado por el suministrador y posteriormente se calentó durante 10 minutos a 800C para detener la reacción. El plásmido digerido se mezcló con 0,2 μg del fragmento de ADN resultante de la PCR inversa purificado anteriormente y ambos ADNs se ligaron con la enzima T4 ADN ligasa (USB) en presencia de ATP usando un tampón recomendado por el suministrador, durante 16 horas a 4°C.
La mezcla de ligación obtenida se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH5α, aislándose transformantes en medio de cultivo sólido (agar 2%) como ha sido descrito anteriormente (apartado 4 del ejemplo 3) . Los clones obtenidos se analizaron de acuerdo a lo previamente descrito, aislando y purificando los plásmidos de las células recombinantes de E. coli DH5α. Se obtuvieron asi los plásmidos pIJLNsac y pIJLCsac, que contienen el fragmento de la PCR inversa en ambas orientaciones. Ambos plásmidos se secuenciaron por ambos extremos del fragmento, tal y como se indica en el apartado 4 del ejemplo 3. 3. Obtención mediante PCR inversa de la región 3' del gen pva
Siguiendo el protocolo anteriormente descrito para la PCR inversa (apartado 1 del ejemplo A), se digirieron 8 μg de una muestra de ADN genómico de 5. lavendulae con la endonucleasa HincII, durante 1 hora a 37°C en el tampón recomendado por los suministradores, en un volumen de 30 μl . Tras detener la reacción calentando la muestra durante 10 minutos a 8O0C, se procedió a la circularización de los fragmentos obtenidos mediante la reacción de ligación a alta dilución, como ya ha sido descrito. Igualmente, se procedió a la precipitación del ADN circularizado y se resuspendió en 25 μl de tampón TE, utilizándose 5 μl de esta muestra como molde para la reacción de amplificación por PCR, utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos FCβI2 (representado como SEQ ID NO: 10) y FCβD2 (SEQ ID N0:ll), diseñados a partir de la secuencia determinada previamente (apartado 2 del ejemplo 4) para que amplifiquen hacia el exterior del fragmento.
La reacción de amplificación mediante PCR se llevó a cabo de acuerdo a lo descrito anteriormente (apartado 3 del ejemplo 3), siendo las condiciones de amplificación en este caso de 96°C (5 minutos), 680C (10 minutos), 72°C (2 minutos) y a continuación 40 ciclos, siendo cada ciclo de 96°C (1 minuto), 68°C (5 minutos) y 72°C (3 minutos) . El resultado de cada amplificación se visualizó mediante tinción de bromuro de etidio después de electroforesis en gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN obtenido con un tamaño de aproximadamente 900 pb se purificó mediante extracción del gel de agarosa por el método de GeneClean. 4. Secuenciación del fragmento 3' del gen pva
El fragmento de ADN obtenido y purificado se secuenció por ambos extremos (apartado 4 del ejemplo 3) . El análisis de la secuencia reveló que el fragmento contenia la región 3' del gen pva que codifica para la secuencia del carboxilo terminal de la PVA, asi como la región terminadora que incluye el codón de terminación de la traducción.
5. Determinación de la secuencia del gen pva
Con todos los datos anteriormente obtenidos se estableció la secuencia completa del gen pva, la cual se muestra como SEQ ID NO: 12. Asimismo, la secuencia de aminoácidos deducida se representa como SEQ ID NO: 13.
Ejemplo 5. Clonación de un fragmento del gen pva a partir de una genoteca de S. lavendulae ATCC 13664 construida en el fago lambda-GEM12
1. Construcción de la genoteca
Un total de 200 μg de ADN de S. lavendulae ATCC 13664 se digirieron parcialmente con 10, 5 ó 2,5 unidades de la endonucleasa de restricción Sau3AI (New England Biolabs) en un volumen de reacción de 1,2 mi a 370C, deteniéndose la digestión en cada caso mediante la adición de EDTA 35 mM frió. Tras comprobar las digestiones en gel al 0,7% de agarosa, se extrajeron con una mezcla 1:1 de fenol neutro y CIA (cloroformo: alcohol isoamilico 24:1), y posteriormen- te con 1 volumen de CIA y se precipitaron con etanol a
-200C. El ADN recuperado por centrifugación se resuspendió en un volumen total de 600 μl, se calentó a 68°C durante 10 minutos y se dejó enfriar lentamente hasta temperatura ambiente antes de colocarse sobre un gradiente de sacarosa
(10-40%) de 10 mi. Dicho gradiente se centrifugó a 26.000 r.p.m. durante 18 horas a 25°C, recogiéndose alícuotas de
0,25 mi, de las cuales se analizaron 10 μl en gel al 0,5% de agarosa. Las alícuotas cuyo ADN poseía un tamaño entre 15 y 20 kb se mezclaron y se diluyeron con tampón TE hasta aproximadamente el 10% de sacarosa. Seguidamente se precipitó el ADN con etanol y se resuspendió en 25 μl de tampón TE. El análisis de 1 μl de esta solución en gel al 0,4% de agarosa confirmó que el tamaño de los fragmentos de ADN era correcto y que su concentración era de aproximadamente 50 ng/μl.
Paralelamente se preparó el ADN del bacteriófago Iambda-GEM12 (Promega) esencialmente mediante un protocolo previamente descrito (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA) . Para ello, la cepa E. coli LE392 se incubó durante 10 horas en NZCYM-O, 2% maltosa y se midió su D.O. a 600 nm. El volumen de cultivo correspondiente a 3 x 109 células se centrifugó a 1.000 x g durante 10 minutos a 4°C y se resuspendió en 1,2 mi de tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,5 conteniendo 0,1 M NaCl, 2 g/1 MgSO4.7H2O y 0,01% gelatina (tampón SM) . A estas células se añadieron 3 x 107 unidades formadoras de placas (ufp) del fago Iambda-GEM12 y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 37°C sin agitación. Con 200 μl de las células infectadas se inoculó cada uno de los matraces (de 500 mi con 100 mi de medio NZCYM-0, 2% maltosa) precalentados a 370C. Dichos matraces se incubaron a 37°C hasta que el cultivo apareció lisado (5-6 horas) . Los Usados se trataron con ADNasa (1 μg/ml) y ARNsa (2 μg/ml) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se adicionaron 5,8 g de NaCl por cada 100 mi de lisado y la mezcla se mantuvo durante 60 minutos en hielo. Transcurrido este tiempo se filtró para eliminar los restos celulares, añadiendo al filtrado 20 mi de PEG-6.000 al 50 % por cada 100 mi de lisado. Esta mezcla se mantuvo 60 minutos en hielo y se centrifugó a 10.000 x g durante 20 minutos a 4°C. El precipitado se resuspendió en 1 mi de TM y se extrajo dos veces con CIA para eliminar los restos de PEG-6.000 sin destruir el fago. Posteriormente se extrajo dos veces con fenol neutro, una con fenol-CIA y una con CIA. A la fase acuosa se le añadió NaCl hasta 0,5 M y el ADN se precipitó con dos volúmenes de etanol 100%, se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 50 μl de TE.
El ADN del bacteriófago (50 μg) se digirió con las endonucleasas Bamñl y EcoRI (Amersham) a 370C durante 2 horas. La doble digestión se extrajo con fenol-CIA y CIA, se precipitó con etanol y se resuspendió en 50 μl de TE. Tras recoger una alícuota de 2 μl, al resto se le añadió MgCl2 a concentración final 10 mM y se incubó a 42°C durante 1 hora con el fin de favorecer el reanillamiento de los brazos del vector por sus extremos cohesivos. De nuevo se tomó otra alícuota de 2 μl que se analizó junto a la anterior mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,5 % y tinción con bromuro de etidio. Una vez comprobado el correcto reanillamiento, la mezcla se dispuso sobre un gra- diente (10%-40%) de agarosa de 10 mi, evitando que el ADN se calentara a 68°C, puesto que esto conducirla a la separación de los extremos cohesivos del fago. El gradiente se centrifugó a 26.000 r.p.m. durante 15 horas a 28°C, recogiéndose seguidamente en fracciones de 0,5 mi. Tras analizar alícuotas de 15 μl de cada una de ellas mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,5%, se mezclaron las preparaciones que carecían del fragmento central dispensable o "stuffer" y se diluyeron con agua destilada hasta que la concentración de sacarosa alcanzó aproximada¬ mente un 10%. A continuación el ADN se precipitó con etanol, se resuspendió en 50 μl de TE, analizándose 2 μl de esta muestra en gel de agarosa al 0,5% con el fin de confirmar la ausencia de fragmento central y poder calcular su concentración que fue de aproximadamente 100 ng/μl.
Posteriormente se realizaron una serie de ligaciones utilizando 0,25 μg de ADN de lambda-GEM12 BamEI-EcoRI
(vector) y cantidades entre 0, 1 y 0,75 μg de los fragmentos de ADN Sau3AI de 5. lavendulae ATCC 13664 (inserto), variando la relación inserto/vector. Las reacciones se incubaron a 12-14°C durante 16 horas con la enzima T4 ADN ligasa en el tampón recomendado por los suministradores. Tras comprobar en un gel al 0,4% de agarosa la aparición de fragmentos de ADN de tamaño superior al del vector y al del inserto, originados por ligación, se mezclaron todas las reacciones de ligación, se precipitaron con etanol y se resuspendieron en 5 μl de tampón de ligación.
La encapsidación del ADN fágico recombinante originado tras la ligación se realizó con el sistema de empaqueta- miento in vitro Packagene (Promega) . Con el resultado de la reacción de encapsidación resuspendida en 500 μl de SM se realizaron infecciones de E. coli LE392 (Promega) para la titulación de la genoteca y de E. coli NM539 (Promega) con la finalidad de determinar el porcentaje de fagos recombinantes . E. coli NM539 es una cepa lisógena del fago P2 y sólo origina placas de lisis cuando el fago que la infecta carece de la región central dispensable. El titulo fágico resultó ser de 950.000 ufp totales en E. coli LE392 y 650.000 ufp en E. coli NM539, indicando que el 70% de los fagos incluían un fragmento de ADN exógeno.
A continuación se infectó E. coli NM539 y se extendió la genoteca completa sobre 10 placas Petri de 150 mm de diámetro, recogiéndose seguidamente en 50 mi de SM. De estos 50 mi, se tomaron 40 mi y se les añadió 2,5 mi de cloroformo antes de almacenarlos a 4°C. A los 10 mi restantes se les añadió DMSO al 7% y se almacenaron a - 800C.
2. Identificación de los clones que contienen el gen pva
La cepa E. coli LE392 fue utilizada para la infección ya que el tamaño de las placas de lisis era mayor y más uniforme que el obtenido con E. coli NM539. Aproximadamente 4.000 ufp se extendieron sobre 12 placas Petri de 90 mm de diámetro (alrededor de 300 ufp/placa Petri) y se transfirieron a membranas de nylon (Roche) .
El proceso de selección de fagos positivos se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento de hibridación previamente descrito (Sambrook J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, CoId Spring Harbor, New York, USA) . Las membranas de nylon con los fagos se sometieron primero a solución de desnaturalización (NaOH 0,5 N, NaCl 1,5 M), a continuación a solución de neutralización (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 1 M, pH 7,5) y por último a solución 2 x SSC, durante 15 minutos en cada una a temperatura ambiente. Seguidamente se fijó el ADN mediante la incubación de las membranas a 800C durante 1 hora, tras la cual se procedió al tratamiento de las membranas con proteinasa K (2 mg/ml) en 2 x SSC a 37°C durante 1 hora. A continuación se lavaron las membranas en agua destilada hirviendo y con una solución de SDS 0,2%, tras lo cual se aclararon primero con agua a 500C y después con agua a temperatura ambiente. Tras este último paso las membranas estuvieron listas para el proceso de hibridación, el cual se realizó al igual que en el método de Southern, descrito en el apartado 1 del ejemplo 4. En este caso se utilizó como sonda para la identificación de los clones portadores del gen pva un fragmento de ADN de 900 pb obtenido mediante PCR con los oligonucleótidos sintéticos NCSACI (SEQ ID NO: 14) y NCSAC4 (SEQ ID NO: 15) . El fragmento amplificado, que comprende la secuencia génica intermedia del gen pva que codifica para las subunidades α y β, fue marcado con digoxigenina siguiendo el mismo protocolo descrito en el apartado 1 del ejemplo 4, tanto para el mareaje como para la detección.
Una vez completados los procesos de prehibridación, hibridación, lavados y autorradiografia se seleccionaron un total de 18 clones positivos. Las placas de lisis positivas se recogieron individualmente con la ayuda de una pipeta
Pasteur y cada una de ellas se resuspendió en 1 mi de SM al que se le añadió 50 μl de cloroformo. Seguidamente se titularon los fagos presentes en dichas soluciones. Para ello se realizaron diluciones 1/100, 1/1000 y 1/5000 de cada una de ellas, utilizando 100 μl de cada dilución para realizar las infecciones con el fin de que el número de placas de lisis por placa Petri oscilara entre 100 y 300. A continuación, el contenido de cada placa Petri se transfirió a su correspondiente membrana de nylon, las cuales se sometieron a hibridación con la misma sonda. Cada una de las 26 placas de lisis purificadas se resuspendió en 1 mi de SM con 50 μl de cloroformo y se procedió a la amplificación de los fagos en medio liquido. Para ello, 100 μl de solución de fago (aproximadamente 106 ufp) se utilizaron para infectar 1 mi de un cultivo de E. coli LE392 en LB incubado a 370C durante 16 horas con agitación vigorosa. La mezcla se dejó incubar a 47°C durante 15 minutos, tras lo cual se añadieron 4 mi de LB y se incubó a 370C durante 12 horas. Transcurrido este tiempo se añadieron 50 μl de cloroformo, se incubó 15 minutos a 37°C y se centrifugó a 4.000 x g durante 10 minutos a 4°C. Se recogió el sobrenadante y se adicionaron 20 μl de cloroformo, constituyendo ésta la solución de fago con un titulo de aproximadamente 107 ufp/μl para cada uno de los fagos positivos.
Con el fin de descartar falsos positivos, se realizaron reacciones de amplificación por PCR con 5 μl de cada una de las soluciones de fagos positivos, previamente desnaturalizada mediante calentamiento a 9O0C durante 15 minutos y posterior enfriamiento rápido en hielo. Los oligonucleótidos sintéticos utilizados para esta PCR fueron NCSACI (SEQ ID NO: 14) y NCSAC4 (SEQ ID NO: 15), los mismos con los que se obtuvo la sonda de ADN, y las condiciones de reacción fueron similares a las descritas en el apartado 3 del ejemplo 4. De los fagos analizados sólo 3 rindieron un fragmento de 900 pb mediante amplificación por PCR.
Con la finalidad de subclonar y secuenciar los fragmentos de ADN del gen pva de los 3 fagos positivos, 5 μg de cada uno de ellos se digirieron con la enzima de restricción Sacl, (Pharmacia) durante 1 hora a 37°C, en el tampón recomendado por los suministradores. Los resultados de cada digestión se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,5%. Los fragmentos deseados se purificaron por el método de GeneClean (BIO 101, Inc.) y se ligaron utilizando T4 ADN ligasa, en presencia de ATP y en el tampón adecuado, con el plásmido pBC KS (+) (Stratagene) digerido con Sacl. La mezcla de ligación resultante se incubó durante 5 horas a 12°C y se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH5α. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se le habla adicionado cloranfenicol (30 μg/ml) , X-gal (40 μg/μl) e IPTG 0,2 πiM. Entre los clones que presentaban el fenotipo blanco de selección se identificó como pALSLβ el que portaba el fragmento del gen pva. El análisis de los fragmentos generados tras digestión con Sacl reveló que el tamaño del inserto era de aproximadamente 2 kb, 1,3 kb inferior al esperado si contuviera toda la secuencia del gen pva incluida la región terminadora.
3. Secuenciación del fragmento que contiene parte del gen pva El fragmento de ADN contenido en el plásmido pALSLδ y que contiene parte del gen pva se secuenció por ambos extremos del fragmento (siguiendo el mismo procedimiento descrito en el apartado 4 del ejemplo 3) . El análisis de secuencia del plásmido constató que el fragmento de ADN clonado contenia el gen pva incompleto, careciendo de 1,3 kb de la secuencia que codifica para el extremo carboxilo terminal de la subunidad β, del codón de terminación de la traducción y de la zona terminadora de la transcripción.
Ejemplo 6. Clonación del gen pva completo
1. Obtención mediante PCR del fragmento de ADN que contienen el gen pva
A partir de la secuencia del gen pva determinada con anterioridad se diseñaron los oligonucleótidos sintéticos PVAl (SEQ ID NO: 16) con diana Xbal y PVAF (SEQ ID NO: 17) con diana EcoRI . Para llevar a cabo la reacción de amplificación mediante PCR se mezclaron 16 μl (5 μM) de cada uno de los oligonucleótidos con 0, 5 μg del ADN genómico de 5. lavendulae, obtenido como se describe en el apartado 2 del ejemplo 3. A la mezcla se le adicionaron 2,5 unidades de la enzima Pfu DNA polimerasa (Promega) junto con el tampón adecuado recomendado por los suministradores. El volumen final de cada reacción fue de 0,1 mi conteniendo dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%. El preparado se sometió a un proceso de amplificación en un termociclador Eppendorf modelo Mastercycler Gradient en las siguientes condiciones: 96°C (2 minutos); a continuación 5 ciclos, siendo cada ciclo de 96°C (1 minuto), 700C (2 minutos) y 72°C (8 minu- tos) ; a continuación otros 5 ciclos, siendo cada ciclo de 960C (1 minuto), 680C (2 minutos) y 72°C (8 minutos); 5 ciclos, siendo cada ciclo de 96°C (1 minuto), 63°C (2 minutos) y 72°C (8 minutos); y por último 20 ciclos, siendo cada ciclo de 960C (1 minuto), 600C (2 minutos) y 72°C (8 minutos) . El resultado de la amplificación se analizó en gel de agarosa al 1%.
El fragmento de ADN amplificado por PCR, con un tamaño aproximado de 2,5 kb, se purificó mediante extracción del gel de agarosa por GeneClean (BiolOl Inc.) siguiendo el protocolo recomendado.
2. Clonación y secuenciación del fragmento obtenido por PCR que contienen el gen pva
Un total de 0,2 μg del fragmento amplificado por PCR se ligaron al vector plasmidico pGEM-T Easy vector (Promega) siguiendo las recomendaciones del suministrador. La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH5α. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se le habla adicionado ampicilina (100 μg/ml) , X-gal (40 μg/μl) e IPTG 0,2 mM. Los plásmidos purificados a partir de los clones que presentaban el fenotipo blanco de selección se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% según el protocolo descrito en el apartado 4 del ejemplo 3. Uno de estos clones que porta el fragmento del gen pva se identificó como pPVAT (ver figura 1) .
El análisis de la secuencia nucleotidica de los extremos del fragmento de ADN contenido en el plásmido pPVAT constató que el fragmento de ADN clonado contenía el gen pva desde la secuencia génica que codifica el péptido señal hasta el codón de terminación de la traducción.
Ejemplo 7. Clonación del gen pva para su expresión en S. liv±dans
1. Obtención del fragmento de ADN que contiene el promotor del gen pva de S. lavendulae a partir del plásmído pALSL6
El plásmido pALSLβ se purificó a partir de un cultivo puro de una cepa recombinante de E. colí DH5α mediante el procedimiento High Puré Plasmid Isolation Kit (Roche) , siguiendo el protocolo proporcionado por el suministrador. 2 μg del plásmido pALSLβ purificado se digirieron secuencialmente con las endonucleasas de restricción EcoRI (Pharmacia) durante 3 horas a 370C y JBstAPI (Pharmacia) durante otras 3 horas a 600C, en un tampón compatible para ambas enzimas. Tras esta segunda digestión, la reacción se paró mediante el calentamiento de la mezcla a 800C durante 10 minutos. El resultado de la doble digestión se visualizó mediante tinción de bromuro de etidio después de una electroforesis en un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN con un tamaño aproximado de 4,8 kb se purificó mediante extracción del gel de agarosa por el método de GeneClean ya descrito con anterioridad.
2. Obtención del fragmento de ADN que contiene la región 3' del gen pva a partir del plásmido pPVAT El plásmido pPVAT (2 μg) purificado se digirió con las endonucleasas de restricción BstAPI y EcoRI siguiendo el mismo protocolo descrito en el apartado 1 del ejemplo 7. Tras visualizar el resultado en gel de agarosa se procedió a la extracción y purificación del fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 1 kb mediante el método ya descrito de GeneClean.
3. Construcción de un fragmento de ADN que contiene el gen pva bajo el control de su propio promotor
El fragmento de ADN de 4,8 kb (1 μg) correspondiente a pALSLβ digerido EcoRI- BstAPI, se mezcló con 1 μg del fragmento de ADN de 1 kb resultante de la doble digestión BstΑPI-EcoRI del plásmido pPVAT. A la mezcla se le adicionó la enzima T4 DNA ligasa en presencia de ATP en el tampón recomendado por los suministradores, y se incubó durante 16 horas a 4°C. A continuación 10 μl de la mezcla de ligación resultantes se utilizaron para transformar células competentes de E. coli DH5α. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se le habla adicionado cloranfenicol (30 μg/ml) , X-gal (40 μg/μl) e IPTG 0,2 mM. Los plásmidos correspondientes a los clones que presentaban el fenotipo blanco de selección se purificaron según el protocolo descrito en el apartado 4 del ejemplo 3 y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Uno de estos clones que porta el fragmento de ADN que contiene el gen pva bajo el control de su propio promotor se identificó como pBCPVASlO.l.
4 . S ecuenciaci ón del fragmento que conti ene el gen pva baj o el control de su propio promotor
El fragmento de ADN contenido en el plásmido pBCPVASlO.l y que codifica para el gen pva de S. lavendulae se secuenció tal y como se indica en el apartado 4 del ejemplo 3, utilizando como cebadores varios de los oligonucleótidos sintéticos diseñados para la reacciones de amplificación mediante PCR. La secuencia obtenida se muestra como SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos deducida como SEQ ID NO: 13.
Ejemplo 8. Producción de la PVA de S. lavendulae en S. l±v±dans 1326
1. Preparación del vector bifuncional pHJL401 y células competentes de S. lividans 1326 para la expresión del gen pva
El plásmido bifuncional pHJL401, con origen de replicación para E. coli y S. lividans, contiene marcadores de resistencia para ampicilina y tiostreptona para su selección en E. coli y S. lividans, respectivamente. Dicho vector se preparó de acuerdo a las condiciones descritas en el apartado 1 del ejemplo 3.
La cepa utilizada para la expresión del fragmento de
ADN que porta el gen pva expresado bajo el control de su propio promotor fue 5. lividans 1326. La introducción de pBCPVASlO.l en S. lividans 1326 se llevó a cabo mediante la transformación de protoplastos, los cuales se obtuvieron siguiendo el procedimiento descrito (Hopwood DA. et al.
(1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England) .
2. Clonación del gen pva de S. lavendulae bajo el control de su propio promotor en el vector bifuncíonal pHJL401
El plásmido pBCPVASlO.l, el cual porta el gen pva bajo el control de su propio promotor, se purificó a partir de un cultivo puro de una cepa recombinante de E. coli DH5α, como ya se ha descrito anteriormente. 10 μg del plásmido pBCPVASlO.l se digirieron con las endonucleasas de restricción Sacl y EcoRI durante 3 horas a 37°C. Debido a que los dos fragmentos de ADN generados tras la doble digestión tienen un tamaño similar, y con el fin de aislar y clonar el fragmento de ADN con el gen pva, se procedió a digerir la mezcla con una tercera endonucleasa de restricción con dianas presentes en el plásmido pBC KS (+) y ausentes en la secuencia de nucleótidos del gen pva, eligiéndose para ello la enzima de restricción Dral (Pharmacia) . La digestión con esta enzima se llevó a cabo durante 90 minutos a 65°C en el tampón recomendado por los suministradores. Tras esta tercera digestión, la reacción se detuvo mediante el calentamiento de la mezcla a 800C durante 10 minutos y se procedió a la visualización del resultado de las digestiones mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN con un tamaño aproximado de 3 kb, conteniendo el gen pva junto con su región promotora, se purificó mediante extracción del gel de agarosa por el método de GeneClean ya descrito con anterioridad, y se ligó al plásmido pHJL401. La reacción de ligación se realizó mezclando 1 μg del fragmento de ADN de 3 kb con 2 μg del plásmido pHJL401 digerido con las en- donucleasas de restricción Sacl y EcoRI en las mismas condiciones descritas con anterioridad para el plásmido pBCPVASlO.l. A continuación, se añadió la enzima T4-ADN ligasa a la mezcla y se incubó durante 16 horas a 4°C en el tampón recomendado por los suministradores. 10 μl de la mezcla de ligación se utilizaron para transformar células competentes de E. coli DH5α. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se le habla adicionado ampicilina (100 μg/ml) . Tras el análisis mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% de numerosos plásmidos purificados a partir de clones recombinantes se seleccionó el plásmido pPVASlO.l (ver figura 2A-C) , el cual incluía el fragmento de ADN de 3 kb con el gen pva de S. lavendulae bajo su propio promotor. Dicho plásmido se purificó y secuenció como ya se ha descrito con anterioridad.
3. Obtención de una cepa recombinante de S. lividans productora de la PVA de S. lavendulae
El plásmido pPVASlO.l (2 μg) se utilizó para transformar protoplastos de S. lividans 1326 siguiendo un método descrito (Hopwood DA. et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England) . Los transformantes se sembraron en medio R2YE sólido (Kieser T. et al. (2000) Practical Streptomyces genetics, The John Innes, Norwich, U.K.) y se incubaron a 300C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo se adicionó tiostreptona (5 μg/ml) con el fin de seleccionar las células recombinantes que portan el plásmido pPVASlO.l. Tras el análisis genético de numerosos transformantes se seleccionó uno de ellos, denominado S. lividans pPVASlO.l, que contiene el gen pva de 5. lavendulae, y que ha sido depositado en la Colección de Cultivos Tipo (CECT) sita en Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España, con el n° 3365, el dia 26.02.2003.
4. Producción de la PVA de S. lavendulae en S. lividans CECT 3365
La cepa S. lividans CECT 3365 se fermentó en distintos medios: leche desnatada (medio de producción de PVA de S. lavendulae) , TSB sin glucosa (TSB) y TSB con glucosa
(TSBG) . Las fermentaciones se llevaron a cabo durante 140 horas a 300C y 250 r.p.m. Cada 24 horas se tomaron alícuotas de los caldos de cultivo y, tras centrifugación a 3000 x g durante 30 minutos a 4°C, se procedió a la determinación de la actividad PVA tanto en el sobrenadante (extracto libre de células) como en el precipitado (extracto celular) . En este último caso, se realizó una ruptura previa de las células por sonicación. El ensayo de actividad se llevó a cabo tal y como se describe en el apartado 2 del ejemplo 1. La actividad PVA solo fue detectada en el sobrenadante, obteniéndose mayor producción en los caldos de cultivo procedentes de las fermentaciones en medio TSB sin glucosa, donde el máximo se produce a las 72 horas de cultivo (ver tabla 1) . Tabla :L
PVA producida a lo largo de la
Cepa Medio fermentación (Ul/ml) *
0 48 72 96 140 horas horas horas horas horas
Leche 0 0 0 0 0
S lividans TSBG 0 0 0 0 0 1326
TSB 0 0 0 0 0
Leche 0 0 0 0 0
S. lividans TSBG 0 0 0 0 0 pHJL401 TSB 0 0 0 0 0
Leche 0 0 0.0115 0.0114 0.0110
S lividans TSBG 0 0 0.0006 0.0027 0.0054 CECT 3365 TSB 0 0 0.0200 0.0200 0.0200
UI : micromoles de 6-APA producidos por minuto en las condiciones de ensayo
Ejemplo 9: Producción de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de las penicilinas V, K, F y dihidro F.
La cepa 5. lividans CECT 3365 se fermentó en medio TSB durante 72 horas a 30 0C y 250 r.p.m. de agitación. Seguidamente se centrifugaron los caldos de cultivo a 3000 x g durante 30 minutos a 4 0C. Con el sobrenadante libre de células obtenido se procedió a la determinación de la producción de 6-APA a partir de las penicilinas V, K, F y dihidro F. Para ello se llevaron a cabo ensayos de actividad utilizando como sustrato penicilina V (30 mM) , penicilina K (3 mM) , penicilina F (10 mM) o penicilina dihidro F (10 mM) . Las concentraciones utilizadas fueron saturantes en las condiciones ensayadas de acuerdo al protocolo previamente descrito (Torres el al. (2002) Biochem. Biophys . Res. Com. 291, 593-597) . Las incubaciones de los extractos libres de células con cada una de las penicilinas se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado 2 del ejemplo 1. Asimismo, como se describe en dicho apartado, la liberación de 6-APA se valoró espectrofotométricamente por el método de la fluorescamina. Como se describe en la figura 3, la PVA clonada y expresada en 5. lividans es capaz de generar 6-APA a partir de penicilinas V, K, F y dihidro F.
Descripción de las figuras
Fig. 1: Construcción del plásmido pPVAT Fig. 2(A-C) : Construcción del plásmido pPVASlO.l Fig. 3: Fases A-C de obtención de 6-APA a partir de las penicilinas V, K, F y dihidroF por la PVA producida por S lividans CECT 3365. Abscisas: Tipo de penicilina de partida utilizada. Ordenadas: μmoles/min/ml de 6-APA producido.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir la enzima penicilina V acilasa (PVA) , caracterizado por las operaciones siguientes:
a) Aislar el fragmento de ADN que incluye el gen pva que codifica la penicilina V acilasa y la región promotora que controla su expresión a partir de cualquier cepa de Streptomyces lavendulae ATCC 13664 productora de dicha enzima;
b) Insertar el fragmento de ADN en un plásmido apropiado que sea capaz de replicarse en células hospedadoras;
c) Transformar las células hospedadoras con dicho plásmido;
d) Cultivar las células hospedadoras transformadas en un medio de cultivo adecuado y en condiciones que permiten la producción de PVA;
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que el microorganismo hospedador es Streptomyces lividans.
3. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque las células hospedadoras transfor¬ madas productoras de PVA se cultivan en medio definido TSB, durante al menos 96 horas a 300C.
4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque las células hospedadoras transformadas productoras de PVA consisten en una cepa pura de Streptomyces lividans CECT 3365, sus imitantes o sus derivados transformados.
5. El gen pva de Streptomyces lavendulae caracterizado por la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO:
12 que codifica para una enzima con actividad de penicilina V acilasa (PVA) .
6. Secuencias nucleotidicas caracterizadas por ser capa- ees de hibridar con SEQ ID NO: 12 y codificar para una enzima con actividad de penicilina V acilasa (PVA) .
7. La enzima PVA de Streptomyces lavendulae obtenible según el procedimiento de la reivindicación 1, caracterizada por presentar la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 13.
8. Vectores caracterizados por contener, total o parcial¬ mente, la secuencia de nucleótidos de las reivindicaciones 5 ó 6.
9. Células hospedadoras caracterizadas por ser transfor¬ madas por los vectores de la reivindicación 8 y expresar la enzima PVA.
10. Uso de la enzima PVA de Streptomuyces lavendulae de la reivindicación 7 en la síntesis de antibióticos β- lactámicos .
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en la síntesis de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de penicili¬ na V.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en la síntesis de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de penicili¬ na K.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en la síntesis de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de penicili¬ na F.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 en la síntesis de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) a partir de penicili¬ na dihidro F.
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