ES2210424T3 - Produccion mejorada de riboflavina. - Google Patents
Produccion mejorada de riboflavina.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE DIRIGE A UNA BACTERIA RECOMBINANTE QUE COMPRENDE UNA BACTERIA QUE HA SIDO TRANSFORMADA CON TRES VECTORES, DOS DE LOS CUALES COMPRENDEN CADA UNO UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA PARA LAS ACTIVIDADES ENZIMATICAS SINTETIZADORAS DE RIBOFLAVINA DE BACILLUS SUBTILIS O UNA SECUENCIA DE DNA QUE ES SUSTANCIALMENTE HOMOLOGA Y UNO O MAS ELEMENTOS DE TRANSCRIPCION Y UN TERCER VECTOR QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA PARA EL PRODUCTO DEL GEN RIBA DE BACILLUS SUBTILIS O UNA SECUENCIA DE DNA QUE ES SUSTANCIALMENTE HOMOLOGA Y QUE COMPRENDE ADICIONALMENTE OPCIONALMENTE UN ELEMENTO DE TRANSCRIPCION MEDIANTE EL CUAL UNA O UNA PLURALIDAD DE COPIAS DE CADA UNO DE ESTOS VECTORES SE HA/HAN INTEGRADO EN TRES SITIOS DIFERENTES DENTRO DE SU CROMOSOMA; Y UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE RIBOFLAVINA MEDIANTE DICHA BACTERIA RECOMBINANTE.
Description
Producción mejorada de riboflavina.
La producción de riboflavina por una bacteria
recombinante es conocida en el entorno de la materia, ver por
ejemplo Solicitud de Publicación de Patente Europea No. (PE)
405,370. Sin embargo hay una necesidad de progreso para conseguir un
proceso de producción de riboflavina mejorado.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es proporcionar una bacteria recombinante, comprendiendo
una bacteria que ha sido transformada por tres o cuatro vectores,
dos de ellos que comprenden una secuencia codificante de DNA para
las actividades enzimáticas de síntesis de la riboflavina de
Bacillus subtilis o una secuencia de DNA que es
sustancialmente homóloga y uno o más elementos de transcripción y un
tercer y/o cuarto vector que comprende una secuencia de DNA
codificante para el producto del gen ribA de Bacillus
subtilis o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga
y, opcionalmente, además que comprenda el elemento de transcripción
donde una o una pluralidad de copias de cada uno de estos vectores
ha/han sido integradas en tres o cuatro sitios diferentes dentro de
su cromosoma. Más preferiblemente es un objeto de la presente
invención proporcionar una bacteria recombinante como se describió
anteriormente por lo cual los dos vectores que comprenden la
secuencia de DNA codificante para actividades enzimáticas de la
síntesis de la riboflavina de Bacillus subtilis o una
secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga y que comprende
además dos elementos de transcripción para cada vector,
preferiblemente promotores y el tercer y/o cuarto vector comprende
la secuencia de DNA que codifica para el producto del gen ribA de
Bacillus subtilis o una secuencia de DNA que es
sustancialmente homóloga y un elemento de transcripción,
preferiblemente un promotor.
Además es un objeto de la presente invención
proporcionar una bacteria recombinante, como se describió
anteriormente en donde los dos vectores que comprenden las
actividades enzimáticas de la síntesis de la riboflavina de
Bacillus subtilis o una secuencia de DNA que es
sustancialmente homóloga han sido integrados en dos sitios
diferentes del cromosoma en una pluralidad de copias y el tercer y/o
cuarto vector, ha/han sido integrados en el tercer y/o cuarto sitio
como una copia individual.
Además es un objeto de la presente invención
proporcionar una bacteria recombinante caracterizada dentro de la
secuencia codificante de DNA adicional para el producto del gen ribA
de Bacillus subtilis o una secuencia de DNA que es
sustancialmente homóloga que no se integra en un tercer y/o cuarto
sitio adicional en el cromosoma sino que se integra en el mismo
sitio que uno de los dos vectores con secuencias de DNA que
codifican para las actividades enzimáticas de la síntesis de la
riboflavina y que son amplificadas junto con este vector en este
sitio. Tales realizaciones pueden ser llevadas a cabo por una
persona experimentada en la materia en que esta basado este
conocimiento general y con instrucciones detalladas como las dadas
por ejemplo, en PE 405370.
Además una persona experimentada en esta materia
entiende que para la transformación de las secuencias de DNA usadas
no debe estar necesariamente en la forma de vectores, sino que
también pueden ser usadas sin un vector de DNA adicional.
Además es un objeto de la presente invención el
de proporcionar una bacteria recombinante tal como se ha descrito
anteriormente que es E. coli o Bacillus,
preferiblemente Bacillus subtilis, Cyanobacter o
Corynebacteria.
Además es un objeto de la presente invención
proporcionar un proceso para la producción de riboflavina
caracterizando que una bacteria recombinante tal como se describió
anteriormente crece bajo condiciones adecuadas de crecimiento y la
riboflavina secretada en el medio es aislada por métodos conocidos
en la materia. Es también objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la preparación de alimento o
composición alimentaria caracterizando por esa razón que tal
procedimiento ha sido efectuado y que consecuentemente la
riboflavina obtenida se convierte en alimento o composición
alimentaria por métodos conocidos en esta materia.
La expresión "una secuencia de DNA que es
sustancialmente homóloga" significa en el contexto de la presente
invención una secuencia de DNA que codifica una secuencia de
aminoácido que muestra más del 60%, preferiblemente más del 70%, más
preferiblemente más del 80% y más preferiblemente más del 90% de
aminoácidos idénticos cuando se comparan a la secuencia aminoacídica
codificada por la secuencia de DNA, a la cual se refiere y codifica
el mismo enzima o enzimas del mismo o diferentes organismos o es de
origen parcial o completamente sintético.
Las secuencias de DNA que son útiles para el
propósito de la presente invención comprenden secuencias de DNA que
codifican para proteínas que tienen el mismo tipo de actividad
enzimática que las proteínas codificadas por las secuencias de DNA
descritas arriba y que son seleccionadas de las siguientes
secuencias de DNA:
- (a)
- Una secuencia de DNA que se hibrida bajo condiciones estándar con las secuencias definidas anteriormente.
- (b)
- Una secuencia de DNA que, a causa de la degeneración del código genético, no se hibrida con la secuencia (a), pero que codifica para polipéptidos que tengan exactamente las mismas secuencias aminoacídicas como los polipéptidos codificados por estas secuencias de DNA; y
- (c)
- Una secuencia de DNA que es un fragmento de las secuencias de DNA especificadas en (a) o (b).
"Las condiciones estándares" en este
contexto para la hibridación son las condiciones usadas generalmente
por una persona experimentada en la materia para detectar signos de
hibridación específicos y que son descritos, por ejemplo por
Sambrook et al., "Molecular Cloning" segunda edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, o preferiblemente
también llamada hibridación astringente y condiciones no
astringentes de lavado o más preferiblemente también llamada
hibridación astringente y condiciones de lavado astringente por una
persona experimentada en la materia está familiarizada con y lo que
se describe, por ejemplo en Sambrook et al.(s.a). "El fragmento de
las secuencias de DNA" se refiere en este contexto a un fragmento
que codifica para un polipéptido que todavía tiene la actividad
enzimática tal como se especificó anteriormente.
Las secuencias de DNA que pueden ser usadas para
el propósito de la presente invención están exhibidas por ejemplo en
la PE 405370. La secuencia de información para tales secuencias
puede también obtenerse de cualquier base de datos de secuencias
conocida, como por ejemplo European bioinformatics Institute
(Hinxton Hall, Cambridge, GB). Las secuencias de DNA pueden ser
preparadas sobre la bases de tal información sobre secuencias usando
por ejemplo, el método de PCR conocido en el entorno de la materia y
descrito, por ejemplo en los ejemplos u otros métodos de clonación
molecular conocidos en el campo y descrito, por ejemplo en PE
405370.
Una vez que tales secuencias de DNA están
disponibles éstas pueden ser integradas para más manipulaciones en
vectores adecuados conocidos en el entorno de la materia y descrito,
por ejemplo en los ejemplos de PE 405370. Son preferidos tales
vectores para la integración dentro de los cromosomas del huésped
que es preferiblemente Bacillus y más preferiblemente un Bacillus
subtilis y subsiguientes amplificaciones, si se desea. Tales
vectores son descritos, por ejemplo en los Ejemplos o conocidos en
el entorno de la materia, ver por ejemplo, PE 405,370. Tales
vectores además pueden transportar los también llamados elementos de
transcripción, como los potenciadores y/o promotores, como el
promotor veg y/o sitios de unión a los ribosomas sintéticos y/o
naturales, y/o terminadores, como por ejemplo el terminador cryT que
son conocidos en el entorno de la materia, ver por ejemplo PE
405370. Las células huésped deseadas pueden ser entonces
transformadas por tales vectores mediante métodos descritos por
ejemplo, en los ejemplos o los que son conocidos en el entorno de la
materia, ver por ejemplo PE 405370 y crecidos en un medio adecuado y
la riboflavina secretada dentro de tal medio puede ser aislada tal
como se describe en los ejemplos o como es conocido en el entorno de
la materia.
Después de que la invención ha sido descrita en
general más arriba, las siguientes figuras y ejemplos pretenden
ilustrar detalles de la invención, sin por esta razón limitar a ésta
de ninguna manera.
El vector de expresión pDSNdeHis. A: Una
construcción de pDSNdeHis del vector parenteral pDS/RBSII, 6xHis
(-2). El sitio existente de NdeI se eliminó cortando, completando
los extremos cohesivos y religándolos. El plásmido resultante se
cortó con BamHI y HindIII y se introdujo un polienlazante sintético
que contiene los sitios de restricción ClaI, NdeI, SaII, BamHI y
HindIII. B: Se muestran la secuencia de pDSNdeHis de la secuencia de
Shine-Delgarno (caja S/D) a los sitios de clonación
múltiples y el péptido con los residuos de histidina consecutivos
para la purificación de proteínas recombinantes.
Los plásmidos pXI12 y pXI16. El plásmido pXI12 se
representa por un círculo. Los sitios de reconocimiento para algunos
enzimas de restricción están indicados por abreviaciones estándar.
Los elementos importantes de los vectores están designados como a
continuación: PvegI: promotor constitutivo de fuerza media de B.
subtilis; RBS: Sitio de unión al ribosoma sintético; cryT:
terminador transcripcional de B. thuringiensis, ermAM: un gen
que expresa constitutivamente la resistencia a eritromicina;
sacB-3' y sacB-5': regiones
homólogas para la integración por recombinación homóloga, derivado
del gen levansacarasa de B. subtilis; amp: gen de resistencia
a la ampicilina de pBR322; ori: origen de replicación de pBR322;
rop: gen rop de pBR322. La dirección de alguno de los elementos se
indican por las flechas. Sobre el plásmido, se muestra el promotor
con las regiones -35 y -10. Las flechas indican la mutación de T a
la C que se introducen para crear el sitio ApaI (caja en la línea
media) en pXI16. La línea superior muestra la secuencia de
interrupción del promotor de pXI16 y los sitios de restricción
introducidos.
La integración del gen ribA en el locus
sacB de B. subtilis. El locus sacB es
esquemáticamente mostrado en la parte superior. Se indican los
sitios para las endonucleasas de restricción EcoRI y EcoRV. Las
regiones de homología presentes en los clones pXI se representan en
las cajas sombreadas. La parte inferior muestra el plásmido pXI
linearizado sin la sección pBR322 derivada y el gen ribA
clonado entre los sitios NdeI y BamHI. Está indicada la integración
del pXI derivada del DNA por doble cruz.
El efecto de la introducción de un gen
ribA, ribA-M o un gen
ribA-C dentro del locus SacB de
RB50::
(pRF69)_{n}::(pRF93)_{m} en el crecimiento celular y la producción de riboflavina. Las fermentaciones se llevan a cabo con RB50::(pRF69)_{n}::(pRF93)_{m} o sus derivados con la mutasa codificando la mitad de ribA (ribA-M), la ciclohidrolasa II codificando la mitad de ribA (ribA-C) o el ribA entero insertado en el locus sacB. Se amplificaron los operones modificados pRF69 y pRF93 de todas las cepas. El panel A muestra los valores DO_{540} de las muestras recogidas durante las fermentaciones y se representan los correspondientes títulos de riboflavina en el panel B.
(pRF69)_{n}::(pRF93)_{m} en el crecimiento celular y la producción de riboflavina. Las fermentaciones se llevan a cabo con RB50::(pRF69)_{n}::(pRF93)_{m} o sus derivados con la mutasa codificando la mitad de ribA (ribA-M), la ciclohidrolasa II codificando la mitad de ribA (ribA-C) o el ribA entero insertado en el locus sacB. Se amplificaron los operones modificados pRF69 y pRF93 de todas las cepas. El panel A muestra los valores DO_{540} de las muestras recogidas durante las fermentaciones y se representan los correspondientes títulos de riboflavina en el panel B.
La cepa productora de riboflavina RB50::[pRF69]
es una cepa modificada genéticamente de B. subtilis. RB50 se
refiere a la cepa huésped de B. subtilis, que contiene varias
mutaciones introducidas para mejorar la producción de nucleótidos y
riboflavina. pRF69 se refiere al operón rib modificado por la
introducción de promotores de fago fuertes que se introdujo en el
locus rib de pRF50. El operón modificado pRF69 se puede
amplificar a un número elevado de copias. Una descripción detallada
de la cepa RB50::[pRF69] se presenta en PE 0405370. Para aumentar
además el número de operones rib, un segundo plásmido con un
operón rib modificado y un gen de resistencia a las
tetraciclinas se introdujo en el locus bpr (esencialmente tal
como se describe en PE 0405370, ejemplo 8, segundo sitio de
integración). Este segundo plásmido, pRF93, se construyó a partir de
pRF89 (PE 0405370, fig.14) por sustitución del gen de resistencia al
cloramfenicol por un gen de resistencia a las tetraciclinas (PE
0405370, ejemplo 8, segundo sitio de integración). La cepa
resultante es RB50::[pRF69]_{n}::[pRF93]_{m} (n y
m se refieren al número de copias de los operones modificados).
NdeI es una enzima de restricción con un sitio de
reconocimiento de 6 pb acabando en ATG. Es por lo tanto el enzima de
elección para la clonación de los marcos de lectura abiertos (ORFs)
que generalmente empiezan con el codón de inicio de la traducción
ATG. Los vectores pDSNdeHis, pXI12 y pXI16 todos contienen el sitio
de clonación NdeI. En los vectores pXI, el ATG del sitio NdeI se
posicionó de tal modo que éste correspondía al codón de inicio de
traducción, mientras que en pDSNdeHis, se añade una marca histidina
en el extremo amino terminal de la proteína expresada (véase más
abajo).
El vector de expresión pDS/RBSII,
6xHis(-2)(Stüber, D., Matile, H. y Garotta, G., 1990. Un sistema de
elevado nivel de producción para Escherichia coli y rápida
purificación de proteínas recombinantes: aplicación al trazado de un
mapa de epítopos, preparación de anticuerpos y análisis de función
de estructura. Immunol.Meth. vol. IV, p., 121-152)
se usó como plásmido progenitor para la construcción de
pDSNdeHis.pDS/RBSII, 6xHis(-2) es idéntico a pDS/RBSII, 6 His
(Stüber et al. 1990; vea también el número de acceso 5298) excepto
por un nucleótido G adicional enfrente del sitio BamHI. Un sitio
NdeI existente en una región no esencial del plásmido se eliminó por
corte, completando los extremos cohesivos y religándolos. El
plásmido resultante se cortó con BamHI e Hindi y se introdujo un
polienlazante llevando sitios para las endonucleasas de restricción
ClaI, NdeI, SalI, BamHI y HindIII (Fig.1). Las proteínas expresadas
a partir de este vector poseen una extensión
N-terminal que contiene seis residuos de histidina
consecutivos que permiten un paso de purificación (Stüver et al.,
1990).
El esqueleto del vector es el fragmento
Eag-AatII de pBR322 que contiene el gen de
resistencia a la ampicilina, el origen de replicación y el gen rop
(Bolivar, F., Rodríguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C.,
Heynecker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. y Falwok, S., 1977.
La construcción y caracterización de los nuevos
vehículos de clonación. II. Un sistema de clonación multiusos. Gene
2, 95-113). La secuencia pBR322 está flanqueada por
dos secuencias derivadas del gen levansacarasa (sacB) de B.
subtilis que se obtuvo por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Los sitios de reconocimiento para las
endonucleasas de restricción AatII, EagI y NheI (Fig.4) se
introdujeron a través de los cebadores de PCR. La secuencia
sacB-5' parte de la posición 729 de la secuencia de
la levansacarasa (número de acceso a la base de datos X02730 de la
base de datos de Genebank o de las bases de datos del European
Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Cambridge, GB) y finaliza en
la posición 1266. El fragmento sacB-3' incluye la
secuencia entre las posiciones 1336 y 1794. Como marcador
seleccionable se introdujo el gen de resistencia a la eritromicina
ermAM del plásmido pAM\beta1 (número de acceso Y00116 de la base
de datos Genebank o de la base de datos del European Bioinformatics
Institute, Hinxton Hall, Cambridge, GB). La secuencia, también
obtenida por PCR, parte de la posición 107 de la secuencia con el
número de acceso Y00116 y finaliza en la posición 1091. Los sitios
que flanquean AatII y PmeI originados a partir de los cebadores de
PCR. El promotor que conduce la transcripción del gen clonado es la
fuerza del medio, el promotor constitutivo vegI de B.
subtilis y corresponde a las posiciones 30 a 101 de la secuencia
publicada (número de acceso J01552 de la base de datos Genebank o la
base de datos del European Bioinformatics Institute, Hinxton may,
Cambridge, GB). Los sitios de restricción EagI y XhoI que flanquean
al promotor se originan de los cebadores de PCR. El terminador
transcripcional cryT es de B. thuringensis y
corresponde a las posiciones 268 a 380 de la secuencia con el número
de acceso M13201 de la base de datos de Genebank o la base de datos
del European Bioinformatics Institute, Hinxton may, Cambridge, GB.
Otra vez, los sitios flanqueantes PmeI y SmaI son derivados de
cebador. El sitio de unión al ribosoma (subrayado) y el tramo de
polienlazante incluye el sitio de inicio traduccional en el sitio
NdeI (negrita) se introdujo como DNA sintético con la secuencia
CTCGAGAATTAAAGGAGGGTTTCATATGAATTCGGATCCCGGG. Las
secuencias en las uniones de varios elementos se muestran en la
tabla 1.
La expresión de los genes clonados en pXI12 puede
no ser tolerada en E. coli. Para evitar problemas
potenciales, se creó una variante de pXI12 en que el promotor
veg está interrumpido por una secuencia corta. Para construir
este vector modificado, llamado pXI16, se introdujo una mutación
puntual entre las regiones -35 y -10 del promotor veg para
crear un sitio ApaI y entonces se introdujo un polienlazante de 30
pb.
El gen ribA se aisló del plásmido pRF2 (PE
0405370, fig.6) con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
usando los cebadores ribA5 y ribA3. Este logro permitió la
introducción de un sitio de la endonucleasa de restricción NdeI
situado en el codón de inicio del gen y un sitio BamHI tras el codón
de stop. Los cebadores tenían la siguiente secuencia:
| ribA5 | 5' GAAGATTcat ATG TTTCATC |
| ribA3 | 5' TATggaTcc TTAGAAATGAA |
Las secuencias subrayadas corresponden a los
sitios de la endonucleasa de restricción NdeI (CATATG) y BamHI
(GGATCC), las letras minúsculas indican nucleótidos cambiados en
comparación con la secuencia del operón rib de B.
subtilis y las secuencias en negrita marcan el codón de inicio
traduccional (ATG) y el complemento reverso del codón stop
(TTA).
El equipo de reactivos de amplificación de DNA
GeneAmp de Perkin Elmer CETUR se usó para las reacciones de PCR
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las condiciones de
reacción fueron: 1 min 94ºC, 1 min 45ºC y 2 min 72ºC durante 25
ciclos. La concentración de cada cebador fue 1 \muM y el DNA molde
se añadió a una concentración de alrededor 1 pM. El producto de
reacción de la PCR se separó de los cebadores mediante
electroforesis en gel de agarosa y se aisló el fragmento de PCR que
contiene el ribA (Heery, D.M., Gannon, F. y Powell, R., 1990.
A simple method for subcloning DNA fragments from gel slices. Trends
in Genetics 6, 173; Vaux, D.L., 1992, Rapid recovery of DNA
from agarose gels. Trends in Genetics 8, 81), cortado con
NdeI y BamHI y se clonó en el vector pDSNdeHis, resultando en el
plásmido pDSribA.
El gen ribA se escindió de pDSribA con
NdeI y BamHI y se subclonó en el pXI16 cortado con
NdeI-BamHI. Después del aislamiento del plásmido de
E. coli el DNA se cortó con ApaI, el inserto de 30 pb se
eliminó y el promotor veg se reconstituyó por ligación. El
plásmido entonces se linealizó cortando con FOPI que escinde sólo en
la secuencia derivada de pBR322 (Fig.2) y el gen clonado se
introdujo en las células de B. subtilis competentes para la
transformación siguiendo el procedimiento descrito de dos pasos
(Cutting, S.M. y Vander Horn, P.B., 1990. En: Molecular biological
methods for Bacillus (Harwood and Cutting, eds.),
p.67-71, John Wiley & Sons Ltd., Chichester,
England). Desde que la producción de la cepa RB50::[pRF69]::[pRF93]
no puede ser competente para la transformación de la cepa de B.
subtilis 1012 (Saito, H., Shibata, T. y Ando, T., 1979, Mapping
of genes determining nonpermesiveness and
host-specific restriction to bacteriophages in
Bacillus subtilis Marburg. Mol. Gen. Genet. 170,
117-122) se escogió como un huésped intermediario.
Los clones resistentes a la eritromicina tienen el gen ribA y
el gen resistente a la eritromicina ermAM insertado en el
locus sacB mediante doble cruzado sobre las regiones con
homologia sacB-3' y sacB-5' (Fig.3). El locus
sacB modificado entonces se introdujo en RB50::[pRF69]::[pRF93]
por transducción con el fago PBS1 de acuerdo con el método de
cultivo líquido tal como se describe (Cutting and Vander Horn,
1990).
RibA codifica dos actividades enzimáticas,
la ciclohidrolasa GTP II y la mutasa
(3,4-dihidroxi-2-butanona
4-fosfato sintasa), que están codificadas por dos
genes separados en E. coli (Richter, G., Ritz, H.,
Katzenmeier, G., Volk, R., Kohnle, A., Lottspeich, F., Allendorf, D.
and Bacher, A., 1993. Biosynthesis of riboflavin: cloning,
sequencing, mapping and expression of the gene coding for GTP
cyclohydrolase II of Escherichia coli. J.Bact. 175,
4045-4051). La actividad mutasa se localiza en la
mitad amino terminal del ribA de B. subtilis y la GTP
ciclohidrolasa II reside en la mitad carboxiterminal. La porción
codificante de mutasasa de ribA, llamada
ribA-M, se escindió de pDSribA con NdeI y
HincII y se clonó en el vector pXI16 escindido con SmaI y NdeI. El
sitio HincII simple se localiza convenientemente en el medio de
ribA y la escisión ocurre entre dos codones separando las dos
mitades que codifican las actividades del gen. La introducción de
ribA-M en el locus sacB de
RB50::[pRF69]::[pRF93] se realizó tal como se describe
anteriormente. La porción codificante para la GTP ciclohidrolasa de
ribA, llamada ribA-C, se escindió de
pDSribA con HincII y BamHI y se introdujo en el pDSNdeHis escindido
con HincII-BamHI. Apuntar que el sitio de
reconocimiento de HincII simple en pDSNdeHis es el mismo que el
sitio SalI (GTCGAC, Fig.1) y la escisión HincII resulta en un corte
de un extremo romo hecho en medio del sitio de reconocimiento. El
plásmido resultante entonces se cortó con NdeI y BamHI y
ribA-C se clonó en el pXI12 cortado con NdeI
BamHI. La introducción de ribA-C en el
locus sacB de RB50::[pRF69]::[pRF93] se realizó tal como se
describe anteriormente excepto que el paso de escisión ApaI y
religación se omitieron, porque se usó pXI12 con un promotor veg
interrumpido (Fig. 2.).
La amplificación de los operones modificados es
importante para los títulos de riboflavina elevada (PE 0405370). Se
usó el esquema de amplificación siguiente: 30 \mul de un cultivo
que ha crecido durante toda la noche en VY (25 g/L de caldo de
infusión de ternera (Difco), 5 g/L de extracto de levadura, 15 g/L
de glucosa) con 20 \mug/ml de tetraciclina y 10 \mug/ml de
cloramfenicol que se usaron para inocular tres tubos que contenían 3
ml VY y 30, 60, p 75 \mug/ml de tetraciclina. Después de
8-9 horas a 37ºC y 200 rpm, 30-50
\mul del cultivo con la concentración más elevada de tetraciclina
aún resultando en un buen crecimiento, se usó para inocular tubos
conteniendo 3 ml VY 30, 45 y 60 \mug/ml de cloramfenicol. Después
de incubar durante toda la noche a 37ºC y 200 rpm,
30-50 \mul del cultivo con la concentración más
elevada de cloramfenicol aún resultando en un buen crecimiento se
usó para inocular tubos conteniendo 3 ml VY y 60, 75, 90 ó 120
\mug/ml de tetraciclina. Del mismo modo el crecimiento continuó en
VY en 45, 60 ó 80 \mug/ml de cloramfenicol, VY con 75, 90, 120 ó
140 \mug/ml de tetraciclina y VY con 60 ó 80 \mug/ml de
cloramfenicol. La última transferencia se hizo con 200 \mul en dos
tubos conteniendo 15 ml VY y 120 ó 140 \mul de tetraciclina. Las
células crecieron en una DO_{600} sobre 0,8 y entonces se
distribuyó en alícuotas de 1 ml. El glicerol se añadió a una
concentración final de 15% y las células se conservaron a -70ºC. La
cepa VB2XL1 alcanzó las máximas concentraciones de antibiótico de
140 \mug/ml de tetraciclina y 80 \mug/ml de cloramfenicol.
La producción fermentativa de la riboflavina se
hizo usando las cepas formadas de B. subtilis como está
descrito anteriormente en una cantidad limitada de glucosa tal como
está descrito en PE 405370.
La cepa VB2XL3 es genéricamente idéntica a VB2XL1
excepto en que un gen ribA adicional es introducido en el
locus amyE para incrementar más el nivel de ribA. VB2XL3 se
construyó básicamente tal con se describió anteriormente para
VB2XL1. En breve, el marcador de eritromicina en pXI6 (Fig. 2) se
reemplazó por un gen de resistencia a la neomincina y las regiones
homólogas sacB se reemplazaron por secuencias homólogas amyE que
resultan en un vector pXI191. El gen de resistencia a la neomicina
se obtuvo del plásmido pBEST501 (M. Itaya et al., Nucl. Acids Res.,
1989, p. 4410) y el sitio ApaI inherente fue eliminado por una
mutación puntual silente. Las regiones amyE de homología se
amplificaron por PCR del genoma de B. subtilis con cebadores
que fueron diseñados de acuerdo con la secuencia conocida (Número de
acceso X02150). El gen ribA fue entonces clonado en pXI191 y el
plásmido resultante se usó como un vehículo para introducir el gen
ribA en el locus de VB2XL1 esencialmente tal como se
describió anteriormente. La nueva cepa se denominó VB2XL3.
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Claims (6)
1. Una bacteria recombinante que ha sido
transformada por tres vectores o secuencias de DNA, dos de ellas
comprendiendo una secuencia de DNA que codifica por las actividades
enzimáticas de síntesis de la riboflavina de Bacillus
subtilis o una secuencia de DNA que codifica una secuencia de
aminoácidos que muestra más del 60% de aminoácidos idénticos cuando
se compara con la secuencia de aminoácidos codificada por la
secuencia de DNA a la que se refiere y codifica el mismo enzima o
enzimas del mismo o diferente organismo, y uno o más elementos de
transcripción, y un tercer vector o secuencia de DNA que consiste en
una secuencia de DNA que codifica para el producto del gen ribA de
Bacillus subtillis mostrando actividad GTP ciclohidroxilasa
II y
3,4-dihidroxi-2-butanona
4-fosfato sintasa, o una secuencia de DNA que
codifica un enzima que muestra actividad GTP ciclohidroxilasa II y
3,4-dihidroxi-2-butanona
4-fosfato sintasa con una secuencia de aminoácidos
que muestra más del 60% de aminoácidos idénticos cuando se compara
con la secuencia de aminoácido del enzima codificado por ribA, y
opcionalmente comprendiendo además elementos de transcripción por lo
cual uno o una pluralidad de copias de cada uno de estos vectores
ha/han sido integradas a tres sitos diferentes en su cromosoma.
2. Una bacteria recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1 por la que los dos vectores o secuencias de DNA que
comprende la secuencia de DNA que codifica para las actividades
enzimáticas de la síntesis de la riboflavina de Bacillus
subtilis o una secuencia de DNA que codifica una secuencia de
aminoácidos que muestra más del 60% de aminoácidos idénticos cuando
se compara con la secuencia de aminoácidos codificados por la
secuencia de DNA a la que se refiere y codifica el mismo enzima o
enzimas del mismo o diferente organismo, además comprende dos
elementos de transcripción para cada vector, preferiblemente
promotores, y el tercer vector o secuencia de DNA que consiste de
una secuencia de DNA codificando para el producto del gen ribA de
Bacillus subtilis mostrando actividad GTP ciclohidroxilasa II
y
3,4-dihidroxi-2-butanona
4-fosfato sintasa, o una secuencia de DNA que
codifica un enzima que muestra actividad GTP ciclohidroxilasa II y
3,4-dihidroxi-2-butanona
4-fosfato sintasa con una secuencia de aminoácidos
que muestra más del 60% de aminoácidos idénticos cuando se compara
con la secuencia de aminoácido del enzima codificado por ribA, y un
elemento de transcripción, preferiblemente un promotor.
3. Una bacteria recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 donde los dos vectores o secuencias de DNA que
comprenden la secuencia de DNA que codifica para las actividades
enzimáticas de la síntesis de la riboflavina de Bacillus
subtilis o una secuencia de DNA que codifica una secuencia de
aminoácidos que muestra más del 60% de aminoácidos idénticos cuando
se compara con la secuencia de aminoácidos codificados por la
secuencia de DNA a la que se refiere y codifica el mismo enzima o
enzimas del mismo o diferente organismo, han sido integradas en dos
sitios diferentes del cromosoma en una pluralidad de copias y el
tercer vector o secuencia de DNA ha sido integrada en el tercer sito
como una única copia.
4. Una bacteria recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es E. coli o
Bacillus, preferiblemente Bacillus subtilis.
5. Un procedimiento para la producción de
riboflavina caracterizado en que una bacteria recombinante de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 crece bajo
condiciones adecuadas de crecimiento y la riboflavina secretada en
el medio se aisla mediante métodos conocidos en la materia.
6. Un proceso para la preparación de un alimento
o composición alimentaria caracterizada en que un
procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 ha sido efectuado y
por lo cual la riboflavina obtenida se convierte en comida o
composición alimentaria mediante métodos conocidos en la
materia.
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