JPH1084978A - 改良されたリボフラビン生産 - Google Patents
改良されたリボフラビン生産Info
- Publication number
- JPH1084978A JPH1084978A JP9184843A JP18484397A JPH1084978A JP H1084978 A JPH1084978 A JP H1084978A JP 9184843 A JP9184843 A JP 9184843A JP 18484397 A JP18484397 A JP 18484397A JP H1084978 A JPH1084978 A JP H1084978A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna sequence
- riboflavin
- vectors
- riba
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 改良されたリボフラビン生産方法を提供する
こと。 【解決手段】 ３つのベクターもしくはＤＮＡ配列によ
り形質転換された細菌を包含する組換え細菌であって、
該３つのベクターもしくはＤＮＡ配列のうち２つは各々
Bacillus subtilis のリボフラビン合成酵素活性をコー
ドするＤＮＡ配列もしくは実質的にそれと相同なＤＮＡ
配列および１以上の転写エレメントを含み、そしてBaci
llus subtilis のribA遺伝子産物をコードするＤＮＡ配
列もしくは実質的にそれと相同なＤＮＡ配列を包含する
第３のベクターもしくはＤＮＡ配列、ならびに任意にさ
らに転写エレメントを含み、この転写エレメントによ
り、これらベクターの各々の１個または複数のコピーが
その染色体中の３つの異なる部位に組込まれた、組換え
細菌。
こと。 【解決手段】 ３つのベクターもしくはＤＮＡ配列によ
り形質転換された細菌を包含する組換え細菌であって、
該３つのベクターもしくはＤＮＡ配列のうち２つは各々
Bacillus subtilis のリボフラビン合成酵素活性をコー
ドするＤＮＡ配列もしくは実質的にそれと相同なＤＮＡ
配列および１以上の転写エレメントを含み、そしてBaci
llus subtilis のribA遺伝子産物をコードするＤＮＡ配
列もしくは実質的にそれと相同なＤＮＡ配列を包含する
第３のベクターもしくはＤＮＡ配列、ならびに任意にさ
らに転写エレメントを含み、この転写エレメントによ
り、これらベクターの各々の１個または複数のコピーが
その染色体中の３つの異なる部位に組込まれた、組換え
細菌。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え細菌、それ
によるリボフラビンの生産方法、および食物、飼料用組
成物の調製方法に関する。
によるリボフラビンの生産方法、および食物、飼料用組
成物の調製方法に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】組換え細菌によるリボ
フラビンの生産は、当該分野の現状として公知であり、
例えば、欧州特許出願公開第（ＥＰ）４０５，３７０号
を参照されたい。しかし、改良されたリボフラビン生産
方法に対する必要性は今もある。
フラビンの生産は、当該分野の現状として公知であり、
例えば、欧州特許出願公開第（ＥＰ）４０５，３７０号
を参照されたい。しかし、改良されたリボフラビン生産
方法に対する必要性は今もある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】したがって、３つまたは
４つのベクターによって形質転換された細菌を含む組換
え細菌を提供することが本発明の目的である。それらの
ベクターのうちの２つは各々Bacillus subtilis のリボ
フラビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配列もしくは
実質的に相同なＤＮＡ配列および１以上の転写エレメン
トを含み、ならびに第３および／または第４のベクター
は、Bacillus subtilis のribA遺伝子産物をコードする
ＤＮＡ配列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列、そして
任意に、さらに転写エレメントを含み、この転写エレメ
ントによりこれらベクターの各々の１個または複数個の
コピーが細菌の染色体中の３つまたは４つの異なる部位
に組み込まれている。より好ましくは、Bacillus subti
lis のリボフラビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配
列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列を含む２つのベク
ターが、さらに各ベクターのための２つの転写エレメン
ト、好ましくはプロモーターを含み、そして第３および
／または第４のベクターがBacillus subtilis のribA遺
伝子産物をコードするＤＮＡ配列もしくは実質的に相同
なＤＮＡ配列および転写エレメント、好ましくはプロモ
ーターを含む、ことにより上記の組換え細菌を提供する
ことが本発明の目的である。あるいは、Bacillus subti
lis のリボフラビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配
列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列を含む２つのベク
ターもしくはＤＮＡ配列が、さらに各ベクターのための
２つの転写エレメント、好ましくはプロモーターを含
み、そして第３のベクターもしくはＤＮＡ配列がBacill
us subtilis のribA遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列
もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列および転写エレメン
ト、好ましくはプロモーターを含む、ことにより上記の
組換え細菌を提供する。
４つのベクターによって形質転換された細菌を含む組換
え細菌を提供することが本発明の目的である。それらの
ベクターのうちの２つは各々Bacillus subtilis のリボ
フラビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配列もしくは
実質的に相同なＤＮＡ配列および１以上の転写エレメン
トを含み、ならびに第３および／または第４のベクター
は、Bacillus subtilis のribA遺伝子産物をコードする
ＤＮＡ配列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列、そして
任意に、さらに転写エレメントを含み、この転写エレメ
ントによりこれらベクターの各々の１個または複数個の
コピーが細菌の染色体中の３つまたは４つの異なる部位
に組み込まれている。より好ましくは、Bacillus subti
lis のリボフラビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配
列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列を含む２つのベク
ターが、さらに各ベクターのための２つの転写エレメン
ト、好ましくはプロモーターを含み、そして第３および
／または第４のベクターがBacillus subtilis のribA遺
伝子産物をコードするＤＮＡ配列もしくは実質的に相同
なＤＮＡ配列および転写エレメント、好ましくはプロモ
ーターを含む、ことにより上記の組換え細菌を提供する
ことが本発明の目的である。あるいは、Bacillus subti
lis のリボフラビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配
列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列を含む２つのベク
ターもしくはＤＮＡ配列が、さらに各ベクターのための
２つの転写エレメント、好ましくはプロモーターを含
み、そして第３のベクターもしくはＤＮＡ配列がBacill
us subtilis のribA遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列
もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列および転写エレメン
ト、好ましくはプロモーターを含む、ことにより上記の
組換え細菌を提供する。
【０００４】さらに、Bacillus subtilis のリボフラビ
ン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配列もしくは実質的
に相同なＤＮＡを含む２つのベクターが、染色体中の２
つの異なる部位に複数のコピーとして組み込まれ、そし
て第３および／または第４のベクターが単一のコピーと
して第３および／または第４の部位に組み込まれている
ことにより上記の組換え細菌を提供することが本発明の
目的である。あるいは、Bacillus subtilis のリボフラ
ビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配列もしくは実質
的に相同なＤＮＡを含む２つのベクターもしくはＤＮＡ
配列が、染色体中の２つの異なる部位に複数のコピーと
して組み込まれ、そして第３のベクターもしくはＤＮＡ
配列が単一のコピーとして第３の部位に組み込まれてい
ることにより上記の組換え細菌を提供する。
ン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配列もしくは実質的
に相同なＤＮＡを含む２つのベクターが、染色体中の２
つの異なる部位に複数のコピーとして組み込まれ、そし
て第３および／または第４のベクターが単一のコピーと
して第３および／または第４の部位に組み込まれている
ことにより上記の組換え細菌を提供することが本発明の
目的である。あるいは、Bacillus subtilis のリボフラ
ビン合成酵素活性をコードするＤＮＡ配列もしくは実質
的に相同なＤＮＡを含む２つのベクターもしくはＤＮＡ
配列が、染色体中の２つの異なる部位に複数のコピーと
して組み込まれ、そして第３のベクターもしくはＤＮＡ
配列が単一のコピーとして第３の部位に組み込まれてい
ることにより上記の組換え細菌を提供する。
【０００５】さらに、Bacillus subtilis のribA遺伝子
産物をコードするさらなるＤＮＡ配列もしくは実質的に
相同なＤＮＡ配列が、染色体中の第３および／または第
４のさらなる部位に組み込まれないで、２つのベクター
のうちの一つと同じ部位にリボフラビン合成酵素活性を
コードするＤＮＡ配列と一緒に組み込まれて、このベク
ターと一緒にこの部位で増幅されることを特徴とする組
換え細菌を提供することが本発明の目的である。そのよ
うな構築物は当業者によりその一般的な知識および、例
えば、ＥＰ４０５，３７０に与えられた詳細な教示に基
づいて作成することができる。
産物をコードするさらなるＤＮＡ配列もしくは実質的に
相同なＤＮＡ配列が、染色体中の第３および／または第
４のさらなる部位に組み込まれないで、２つのベクター
のうちの一つと同じ部位にリボフラビン合成酵素活性を
コードするＤＮＡ配列と一緒に組み込まれて、このベク
ターと一緒にこの部位で増幅されることを特徴とする組
換え細菌を提供することが本発明の目的である。そのよ
うな構築物は当業者によりその一般的な知識および、例
えば、ＥＰ４０５，３７０に与えられた詳細な教示に基
づいて作成することができる。
【０００６】さらに、形質転換のために用いられるＤＮ
Ａ配列は必ずしもベクターの形態でなければならないと
いうことはないが、さらなるベクターＤＮＡなしでも用
いられ得るということは当業者により理解される。
Ａ配列は必ずしもベクターの形態でなければならないと
いうことはないが、さらなるベクターＤＮＡなしでも用
いられ得るということは当業者により理解される。
【０００７】さらに、E.coliもしくはBacillus、好まし
くはBacillus subtilis 、Cyanobacter もしくはCoryne
bacteriaである上記の組換え細菌を提供することが本発
明の目的である。
くはBacillus subtilis 、Cyanobacter もしくはCoryne
bacteriaである上記の組換え細菌を提供することが本発
明の目的である。
【０００８】さらに、上記の組換え細菌を適切な成長条
件下で成長させ、培地中に分泌されたリボフラビンを当
該分野で公知の方法により単離することを特徴とするリ
ボフラビンの生産方法を提供することが本発明の目的で
ある。そのような方法を行い、それによって得られたリ
ボフラビンを当該分野で公知の方法により食物もしくは
飼料用組成物(feed composition)にすることを特徴とす
る食物もしくは飼料用組成物を調製する方法を提供する
ことも本発明の目的である。
件下で成長させ、培地中に分泌されたリボフラビンを当
該分野で公知の方法により単離することを特徴とするリ
ボフラビンの生産方法を提供することが本発明の目的で
ある。そのような方法を行い、それによって得られたリ
ボフラビンを当該分野で公知の方法により食物もしくは
飼料用組成物(feed composition)にすることを特徴とす
る食物もしくは飼料用組成物を調製する方法を提供する
ことも本発明の目的である。
【０００９】
【発明の実施の形態】「実質的に相同なＤＮＡ配列」と
いう表現は、本発明の文脈においては、それが引用する
ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列と比較し
た場合６０％より高く、好ましくは７０％より高く、よ
り好ましくは８０％より高く、そして最も好ましくは９
０％より高く同一のアミノ酸を示し、かつ同じもしくは
異なる生物由来の同じ酵素をコードするアミノ酸配列を
コードするか、部分的にもしくは完全に合成起源である
ＤＮＡ配列を意味する。
いう表現は、本発明の文脈においては、それが引用する
ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列と比較し
た場合６０％より高く、好ましくは７０％より高く、よ
り好ましくは８０％より高く、そして最も好ましくは９
０％より高く同一のアミノ酸を示し、かつ同じもしくは
異なる生物由来の同じ酵素をコードするアミノ酸配列を
コードするか、部分的にもしくは完全に合成起源である
ＤＮＡ配列を意味する。
【００１０】本発明の目的にとって有用なＤＮＡ配列
は、上記のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質
と同じタイプの酵素活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列であって、以下のＤＮＡ配列から選択され
るＤＮＡ配列を含む： （ａ）上で定義した配列と標準的な条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡ配列； （ｂ）遺伝コードの縮重により配列（ａ）とハイブリダ
イズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコードされ
るポリペプチドと全く同じアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列；および （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）において特定したＤＮＡ配
列のフラグメントであるＤＮＡ配列。
は、上記のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質
と同じタイプの酵素活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列であって、以下のＤＮＡ配列から選択され
るＤＮＡ配列を含む： （ａ）上で定義した配列と標準的な条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡ配列； （ｂ）遺伝コードの縮重により配列（ａ）とハイブリダ
イズしないが、これらのＤＮＡ配列によってコードされ
るポリペプチドと全く同じアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列；および （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）において特定したＤＮＡ配
列のフラグメントであるＤＮＡ配列。
【００１１】ここでハイブリダイゼーションの「標準的
な条件」とは、特定のハイブリダイゼーションシグナル
を検出するために当業者によって一般的に用いられる条
件であって、例えば、Sambrook et al, "Molecular Clo
ning" second edition, ColdSpring Harbor Laboratory
Press 1989, New Yorkにより記載されている条件、ま
たは好ましくは、当業者が熟知している、いわゆるスト
リンジェントハイブリダイゼーション条件および非スト
リンジェント洗浄条件、またはより好ましくはいわゆる
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件およびス
トリンジェント洗浄条件であり、それらは例えば、Samb
rook et al（前出）に記載されている。「ＤＮＡ配列の
フラグメント」は、ここでは、上で特定したような酵素
活性を依然として有しているポリペプチドをコードする
フラグメントを意味する。
な条件」とは、特定のハイブリダイゼーションシグナル
を検出するために当業者によって一般的に用いられる条
件であって、例えば、Sambrook et al, "Molecular Clo
ning" second edition, ColdSpring Harbor Laboratory
Press 1989, New Yorkにより記載されている条件、ま
たは好ましくは、当業者が熟知している、いわゆるスト
リンジェントハイブリダイゼーション条件および非スト
リンジェント洗浄条件、またはより好ましくはいわゆる
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件およびス
トリンジェント洗浄条件であり、それらは例えば、Samb
rook et al（前出）に記載されている。「ＤＮＡ配列の
フラグメント」は、ここでは、上で特定したような酵素
活性を依然として有しているポリペプチドをコードする
フラグメントを意味する。
【００１２】本発明の目的のために用いられ得るＤＮＡ
配列は、例えば、ＥＰ４０５，３７０に開示されてい
る。そのような配列に関する配列情報もまた任意の公知
の配列データバンク、例えば、European Bioinformatic
s Institute (Hinxton Hall, Cambridge, GB）から入手
し得る。そして、ＤＮＡ配列は、そのような配列情報を
基にして、例えば、現状で公知であり、例えば実施例に
記載されたＰＣＲ法および当該分野で公知の他の分子ク
ローニング法で、例えばＥＰ４０５，３７０に記載され
た方法を用いて調製され得る。
配列は、例えば、ＥＰ４０５，３７０に開示されてい
る。そのような配列に関する配列情報もまた任意の公知
の配列データバンク、例えば、European Bioinformatic
s Institute (Hinxton Hall, Cambridge, GB）から入手
し得る。そして、ＤＮＡ配列は、そのような配列情報を
基にして、例えば、現状で公知であり、例えば実施例に
記載されたＰＣＲ法および当該分野で公知の他の分子ク
ローニング法で、例えばＥＰ４０５，３７０に記載され
た方法を用いて調製され得る。
【００１３】一旦そのようなＤＮＡ配列が得られると、
それらはさらなる操作のため、当該分野で公知であり、
例えばＥＰ４０５，３７０の実施例に記載された適切な
ベクターに組み込まれ得る。好ましくはBacillusであ
り、そしてより好ましくはBacillus subtilis である宿
主の染色体への組込みと、所望ならば続く増幅のための
ようなベクターが好ましい。そのようなベクターは、例
えば実施例に記載され、公知であり、例えば、ＥＰ４０
５，３７０を参照されたい。そのようなベクターは、さ
らに、エンハンサーのようないわゆる転写エレメント、
および／またはveg プロモーターのようなプロモータ
ー、および／または天然のもしくは合成のリボゾーム結
合部位、および／または例えば公知の（例えば、ＥＰ４
０５，３７０を参照されたい）cryT−ターミネーターの
ようなターミネーターを有することもできる。次いで、
所望の宿主細胞はそのようなベクターにより、例えば、
実施例に記載された方法もしくは当該分野では公知の方
法（例えば、ＥＰ４０５，３７０を参照されたい）によ
り形質転換され、適切な培地中で成長させることがで
き、そしてそのような培地中に分泌されたリボフラビン
は、実施例に記載されたようにもしくは当該分野で知ら
れているように単離され得る。
それらはさらなる操作のため、当該分野で公知であり、
例えばＥＰ４０５，３７０の実施例に記載された適切な
ベクターに組み込まれ得る。好ましくはBacillusであ
り、そしてより好ましくはBacillus subtilis である宿
主の染色体への組込みと、所望ならば続く増幅のための
ようなベクターが好ましい。そのようなベクターは、例
えば実施例に記載され、公知であり、例えば、ＥＰ４０
５，３７０を参照されたい。そのようなベクターは、さ
らに、エンハンサーのようないわゆる転写エレメント、
および／またはveg プロモーターのようなプロモータ
ー、および／または天然のもしくは合成のリボゾーム結
合部位、および／または例えば公知の（例えば、ＥＰ４
０５，３７０を参照されたい）cryT−ターミネーターの
ようなターミネーターを有することもできる。次いで、
所望の宿主細胞はそのようなベクターにより、例えば、
実施例に記載された方法もしくは当該分野では公知の方
法（例えば、ＥＰ４０５，３７０を参照されたい）によ
り形質転換され、適切な培地中で成長させることがで
き、そしてそのような培地中に分泌されたリボフラビン
は、実施例に記載されたようにもしくは当該分野で知ら
れているように単離され得る。
【００１４】本発明がこれまで一般的に記載されてきた
後の、以下の図および実施例は、それにより本発明をい
かなるものにも限定することなく、本発明の詳細を例示
するものである。
後の、以下の図および実施例は、それにより本発明をい
かなるものにも限定することなく、本発明の詳細を例示
するものである。
【００１５】図１：発現ベクターpDSNdeHis 。Ａ：親ベ
クターpDS/RBSII 、6xHis(-2) からのpDSNdeHis の構
築。存在するNdeI部位を、切断、付着末端の充填および
再連結により除去した。得られたプラスミドをBamHI お
よびHindIII で切断し、制限部位ClaI、NdeI、SalI、Ba
mHI 、およびHindIII を有する合成ポリリンカーを導入
した。Ｂ：シャインーダルガルノ配列(S/D box) から多
重クローニング部位までのpDSNdeHis の配列および組換
えタンパク質の精製のための連続したヒスチジン残基を
有するペプチドを示す。
クターpDS/RBSII 、6xHis(-2) からのpDSNdeHis の構
築。存在するNdeI部位を、切断、付着末端の充填および
再連結により除去した。得られたプラスミドをBamHI お
よびHindIII で切断し、制限部位ClaI、NdeI、SalI、Ba
mHI 、およびHindIII を有する合成ポリリンカーを導入
した。Ｂ：シャインーダルガルノ配列(S/D box) から多
重クローニング部位までのpDSNdeHis の配列および組換
えタンパク質の精製のための連続したヒスチジン残基を
有するペプチドを示す。
【００１６】図２：プラスミドpXI12 およびpXI16 。プ
ラスミドpXI12 を円によって示す。いくつかの制限酵素
のための認識部位を標準的な略語によって示す。ベクタ
ーの重要なエレメントは次のように名称を付けている：
PvegI ：中程度の強度、B.subtilis由来の構造プロモー
ター；ＲＢＳ：合成リボゾーム結合部位；cryT：B.thur
ingiensis 由来の転写ターミネーター；ermAM ：構造的
に発現されるエリスロマイシン耐性遺伝子；sacB-3' お
よびsacB-5' ：相同組換えによる組込みのための相同領
域で、B.subtilisのレバンスクラーゼ(levansucrase)遺
伝子から誘導されている；amp ：pBR322由来のアンピシ
リン耐性遺伝子；ori ：pBR322由来の複製の起点；rop
：pBR322由来のrop 遺伝子。いくつかのエレメントの
方向を矢印によって示す。プラスミドの上に、−３５領
域および−１０領域を有するプロモーターを示す。矢印
は、pXI16 中にApaI部位（中間の線中の下線部）を作り
出すために導入されたＴからＣへの変異を指す。一番上
の線は、pXI16 のプロモーターが割り込んだ配列および
導入された制限部位を示す。
ラスミドpXI12 を円によって示す。いくつかの制限酵素
のための認識部位を標準的な略語によって示す。ベクタ
ーの重要なエレメントは次のように名称を付けている：
PvegI ：中程度の強度、B.subtilis由来の構造プロモー
ター；ＲＢＳ：合成リボゾーム結合部位；cryT：B.thur
ingiensis 由来の転写ターミネーター；ermAM ：構造的
に発現されるエリスロマイシン耐性遺伝子；sacB-3' お
よびsacB-5' ：相同組換えによる組込みのための相同領
域で、B.subtilisのレバンスクラーゼ(levansucrase)遺
伝子から誘導されている；amp ：pBR322由来のアンピシ
リン耐性遺伝子；ori ：pBR322由来の複製の起点；rop
：pBR322由来のrop 遺伝子。いくつかのエレメントの
方向を矢印によって示す。プラスミドの上に、−３５領
域および−１０領域を有するプロモーターを示す。矢印
は、pXI16 中にApaI部位（中間の線中の下線部）を作り
出すために導入されたＴからＣへの変異を指す。一番上
の線は、pXI16 のプロモーターが割り込んだ配列および
導入された制限部位を示す。
【００１７】図３：B.subtilisのsacB遺伝子座へのribA
遺伝子の組込み。上部にsacB遺伝子座を略図的に示す。
制限エンドヌクレアーゼEcoRI およびEcoRV のための部
位を示す。pXI クローン中に存在する相同な領域を、黒
く塗った部分として表す。下部はpBR322から誘導した部
分のない直線状にしたpXI プラスミド、およびNdeI部位
とBamHI 部位との間にクローン化されているribA遺伝子
を示す。二重交換(double cross-over) によるpXI 誘導
ＤＮＡの組込みを示す。
遺伝子の組込み。上部にsacB遺伝子座を略図的に示す。
制限エンドヌクレアーゼEcoRI およびEcoRV のための部
位を示す。pXI クローン中に存在する相同な領域を、黒
く塗った部分として表す。下部はpBR322から誘導した部
分のない直線状にしたpXI プラスミド、およびNdeI部位
とBamHI 部位との間にクローン化されているribA遺伝子
を示す。二重交換(double cross-over) によるpXI 誘導
ＤＮＡの組込みを示す。
【００１８】図４：ribA、ribA-MもしくはribA-C遺伝子
のRB50::(pRF69)n::(pRF93)mのsacB遺伝子座への組込み
が細胞成長およびリボフラビン生産に及ぼす影響。RB5
0::(pRF69)n::(pRF93)m、またはsacB遺伝子座にムター
ゼをコードするribAの半分(ribA-M)、シクロヒドロラー
ゼIIをコードするribAの半分(ribA-C)もしくは全ribAが
挿入されたRB50::(pRF69)n::(pRF93)mの誘導体を用いて
発酵を行った。全ての株の改変されたオペロンpRF69 お
よびpRF93 が増幅された。パネルＡは、発酵中に採取し
たサンプルのＯＤ540 値を示し、そして対応するリボフ
ラビン力価をパネルＢにプロットする。
のRB50::(pRF69)n::(pRF93)mのsacB遺伝子座への組込み
が細胞成長およびリボフラビン生産に及ぼす影響。RB5
0::(pRF69)n::(pRF93)m、またはsacB遺伝子座にムター
ゼをコードするribAの半分(ribA-M)、シクロヒドロラー
ゼIIをコードするribAの半分(ribA-C)もしくは全ribAが
挿入されたRB50::(pRF69)n::(pRF93)mの誘導体を用いて
発酵を行った。全ての株の改変されたオペロンpRF69 お
よびpRF93 が増幅された。パネルＡは、発酵中に採取し
たサンプルのＯＤ540 値を示し、そして対応するリボフ
ラビン力価をパネルＢにプロットする。
【００１９】
【実施例】実施例１ B.subtilis RB50::[pRF69]::[pRF93] 株の構築 リボフラビン生産株RB50::[pRF69] は、B.subtilisの遺
伝的に改変された株である。RB50は、宿主株B.subtilis
を表し、それはヌクレオチドとリボフラビンの生産を改
善するために導入されたいくつかの変異を有する。pRF6
9 は、pRF50 のrib 遺伝子座に導入された強力なファー
ジプロモーターの導入によって改変されたrib オペロン
を表す。この改変されたオペロンpRF69 は、高コピー数
にまで増幅し得る。RB50::[pRF69] 株の詳細な説明は、
ＥＰ０４０５３７０に提供されている。rib オペロン数
をさらに増加させるため、改変されたrib オペロンおよ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を有する第２のプラスミ
ドをbpr 遺伝子座（ＥＰ０４０５３７０、実施例８、第
２の部位の組込みに実質的に記載されている）に導入し
た。この第２のプラスミドpRF93 は、pRF89 （ＥＰ０４
０５３７０、図１４）から、クロラムフェニコール耐性
遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子によって置き換え
ることにより構築した（ＥＰ０４０５３７０、実施例
８、第２の部位の組込み）。得られた株が、RB50::[pRF
69]n::[pRF93]m（ｎおよびｍは、改変されたオペロンの
コピー数を表す）である。
伝的に改変された株である。RB50は、宿主株B.subtilis
を表し、それはヌクレオチドとリボフラビンの生産を改
善するために導入されたいくつかの変異を有する。pRF6
9 は、pRF50 のrib 遺伝子座に導入された強力なファー
ジプロモーターの導入によって改変されたrib オペロン
を表す。この改変されたオペロンpRF69 は、高コピー数
にまで増幅し得る。RB50::[pRF69] 株の詳細な説明は、
ＥＰ０４０５３７０に提供されている。rib オペロン数
をさらに増加させるため、改変されたrib オペロンおよ
びテトラサイクリン耐性遺伝子を有する第２のプラスミ
ドをbpr 遺伝子座（ＥＰ０４０５３７０、実施例８、第
２の部位の組込みに実質的に記載されている）に導入し
た。この第２のプラスミドpRF93 は、pRF89 （ＥＰ０４
０５３７０、図１４）から、クロラムフェニコール耐性
遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子によって置き換え
ることにより構築した（ＥＰ０４０５３７０、実施例
８、第２の部位の組込み）。得られた株が、RB50::[pRF
69]n::[pRF93]m（ｎおよびｍは、改変されたオペロンの
コピー数を表す）である。
【００２０】実施例２ クローニングベクターpDSNdeHis 、pXI12 およびpXI16 NdeIは、ＡＴＧで終わる６ｂｐの認識部位を有する制限
酵素である。したがって、それは、一般的に翻訳開始コ
ドンＡＴＧで始まるオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）のクローニングのために選択される酵素である。
ベクターpDSNdeHis 、pXI12 およびpXI16 は全てNdeIク
ローニング部位を有している。pXI ベクター内にはNdeI
部位のＡＴＧが存在し、その結果それが翻訳開始コドン
に相当し、一方pDSNdeHis では発現されたタンパク質の
アミノ末端にヒスチジンタグが付加されている（下記参
照）。
酵素である。したがって、それは、一般的に翻訳開始コ
ドンＡＴＧで始まるオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）のクローニングのために選択される酵素である。
ベクターpDSNdeHis 、pXI12 およびpXI16 は全てNdeIク
ローニング部位を有している。pXI ベクター内にはNdeI
部位のＡＴＧが存在し、その結果それが翻訳開始コドン
に相当し、一方pDSNdeHis では発現されたタンパク質の
アミノ末端にヒスチジンタグが付加されている（下記参
照）。
【００２１】pDSNdeHis の構築 発現ベクターpDS/RBSII 、6xHis(-2)(Steuber, D., Mat
ile, H. and Garotta,G., 1990. System for high-leve
l production in Escherichia coli and rapidpurifica
tion of recombinant proteins: application to epito
pe mapping, preparation of antibodies and structur
e-function analysis. Immunol. Meth.vol.IV, p.121-1
52)を親プラスミドとしてpDSNdeHis の構築に用いた。p
DS/RBSII 、6xHis(-2) は、pDS/RBSII、6His(Steuber et
al.1990;受託番号第ＤＳＭ５２９８号も参照) と、Bam
HI 部位の前のさらなるＧヌクレオチドを除いて同一で
ある。プラスミドの非必須領域内に存在するNdeI部位を
切断、付着末端の充填および再連結により除去した。得
られたプラスミドをBamHI およびHindIII で切断し、制
限エンドヌクレアーゼClaI、NdeI、SalI、BamHI 、およ
びHindIII のための部位を有するポリリンカーを導入し
た（図１）。このベクターから発現されるタンパク質
は、１段階精製を可能にする６個の連続したヒスチジン
残基を有するＮ末端伸長部を有している(Steuber et a
l.,1990) 。
ile, H. and Garotta,G., 1990. System for high-leve
l production in Escherichia coli and rapidpurifica
tion of recombinant proteins: application to epito
pe mapping, preparation of antibodies and structur
e-function analysis. Immunol. Meth.vol.IV, p.121-1
52)を親プラスミドとしてpDSNdeHis の構築に用いた。p
DS/RBSII 、6xHis(-2) は、pDS/RBSII、6His(Steuber et
al.1990;受託番号第ＤＳＭ５２９８号も参照) と、Bam
HI 部位の前のさらなるＧヌクレオチドを除いて同一で
ある。プラスミドの非必須領域内に存在するNdeI部位を
切断、付着末端の充填および再連結により除去した。得
られたプラスミドをBamHI およびHindIII で切断し、制
限エンドヌクレアーゼClaI、NdeI、SalI、BamHI 、およ
びHindIII のための部位を有するポリリンカーを導入し
た（図１）。このベクターから発現されるタンパク質
は、１段階精製を可能にする６個の連続したヒスチジン
残基を有するＮ末端伸長部を有している(Steuber et a
l.,1990) 。
【００２２】pXI12 の構築（図２） ベクターの土台は、アンピシリン耐性遺伝子、複製起点
およびrop 遺伝子を有するpBR322のEagI-AatIIフラグメ
ントである(Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene,
P.J., Betlach, M.C., Heynecker, H.L., Boyer, H.W.,
Crosa, J.H. and Falkow, S., 1977. Construction an
d characterization of new cloning vehicles. II. A
multipurpose cloning system. Gene 2, 95-113）。pBR
322配列は、ポリメラーゼ連鎖反応( ＰＣＲ) によって
得られたB.subtilisのレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)由
来の２つの配列によって近接されている。制限エンドヌ
クレアーゼAatII 、EagIおよびNheI（図４）のための認
識部位を、ＰＣＲプライマーにより導入した。sacB-5'
配列は、レバンスクラーゼ配列（Genebankデータベース
もしくはEuropean Bioinformatics Institute, Hinxton
Hall, Cambridge, GBのデータベースのデータベース受
け入れ番号Ｘ０２７３０）の７２９位で開始し１２６６
位で終止する。sacB-3' フラグメントは１３３６位と１
７９４位との間の配列を含む。選択マーカーとしてプラ
スミドpAM β1 （GenebankデータベースもしくはEurope
an Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Cambrid
ge, GBのデータベースのデータベース受け入れ番号Ｙ０
０１１６）由来のエリスロマイシン耐性遺伝子ermAM を
導入した。この配列はまたＰＣＲによっても得られ、受
け入れ番号Ｙ００１１６を有する配列の１０７位で開始
し、１０９１位で終止する。近接するAatII 部位および
PmeI部位は、ＰＣＲプライマーから生じる。クローン化
された遺伝子の転写を駆動するプロモーターは、中程度
の強度のB.subtilis由来の構造vegIプロモーターで、公
開された配列の３０位から１０１位に相当する（Geneba
nkデータベースもしくはEuropean Bioinformatics Inst
itute, Hinxton Hall, Cambridge, GBのデータベースの
受け入れ番号Ｊ０１５５２）。このプロモーターに近接
する制限部位EagIおよびXhoIは、ＰＣＲプライマーから
生じる。cryT転写ターミネーターはB.thuringiensis 由
来であり、GenebankデータベースもしくはEuropean Bio
informatics Institute, Hinxton Hall, Cambridge, GB
のデータベースの受け入れ番号Ｍ１３２０１の配列の２
６８位から３８０位に相当する。やはり近接するPmeI部
位およびSmaI部位はプライマーから誘導されたものであ
る。リボソーム結合部位（下線を付した）およびNdeI
（太字）部位内に翻訳開始部位を含むポリリンカー伸長
部を、配列：
およびrop 遺伝子を有するpBR322のEagI-AatIIフラグメ
ントである(Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene,
P.J., Betlach, M.C., Heynecker, H.L., Boyer, H.W.,
Crosa, J.H. and Falkow, S., 1977. Construction an
d characterization of new cloning vehicles. II. A
multipurpose cloning system. Gene 2, 95-113）。pBR
322配列は、ポリメラーゼ連鎖反応( ＰＣＲ) によって
得られたB.subtilisのレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)由
来の２つの配列によって近接されている。制限エンドヌ
クレアーゼAatII 、EagIおよびNheI（図４）のための認
識部位を、ＰＣＲプライマーにより導入した。sacB-5'
配列は、レバンスクラーゼ配列（Genebankデータベース
もしくはEuropean Bioinformatics Institute, Hinxton
Hall, Cambridge, GBのデータベースのデータベース受
け入れ番号Ｘ０２７３０）の７２９位で開始し１２６６
位で終止する。sacB-3' フラグメントは１３３６位と１
７９４位との間の配列を含む。選択マーカーとしてプラ
スミドpAM β1 （GenebankデータベースもしくはEurope
an Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Cambrid
ge, GBのデータベースのデータベース受け入れ番号Ｙ０
０１１６）由来のエリスロマイシン耐性遺伝子ermAM を
導入した。この配列はまたＰＣＲによっても得られ、受
け入れ番号Ｙ００１１６を有する配列の１０７位で開始
し、１０９１位で終止する。近接するAatII 部位および
PmeI部位は、ＰＣＲプライマーから生じる。クローン化
された遺伝子の転写を駆動するプロモーターは、中程度
の強度のB.subtilis由来の構造vegIプロモーターで、公
開された配列の３０位から１０１位に相当する（Geneba
nkデータベースもしくはEuropean Bioinformatics Inst
itute, Hinxton Hall, Cambridge, GBのデータベースの
受け入れ番号Ｊ０１５５２）。このプロモーターに近接
する制限部位EagIおよびXhoIは、ＰＣＲプライマーから
生じる。cryT転写ターミネーターはB.thuringiensis 由
来であり、GenebankデータベースもしくはEuropean Bio
informatics Institute, Hinxton Hall, Cambridge, GB
のデータベースの受け入れ番号Ｍ１３２０１の配列の２
６８位から３８０位に相当する。やはり近接するPmeI部
位およびSmaI部位はプライマーから誘導されたものであ
る。リボソーム結合部位（下線を付した）およびNdeI
（太字）部位内に翻訳開始部位を含むポリリンカー伸長
部を、配列：
【００２３】
【表１】
【００２４】を有する合成ＤＮＡとして導入した。種々
のエレメントの接合部分の配列を表１に示す。
のエレメントの接合部分の配列を表１に示す。
【００２５】pXI16 の構築 pXI12 中にクローン化された遺伝子の発現はE.coli内で
許容されないかもしれなかった。潜在的な問題を回避す
るため、内部でveg プロモーターが短い配列によって中
断されているpXI12 の変種を作り出した。pXI16 と名付
けたこの改変ベクターを構築するため、そのveg プロモ
ーターの−３５領域と−１０領域との間に点変異を導入
してApaI部位を作り出し、次いで３０bpのポリリンカー
を導入した（図２）。
許容されないかもしれなかった。潜在的な問題を回避す
るため、内部でveg プロモーターが短い配列によって中
断されているpXI12 の変種を作り出した。pXI16 と名付
けたこの改変ベクターを構築するため、そのveg プロモ
ーターの−３５領域と−１０領域との間に点変異を導入
してApaI部位を作り出し、次いで３０bpのポリリンカー
を導入した（図２）。
【００２６】実施例３ ribA遺伝子のクローニング ribA遺伝子を、プラスミドpRF2（ＥＰ０４０５３７０、
図６) からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりプラ
イマーribA5 およびribA3 を用いて単離した。この方法
は遺伝子の開始コドンでのNdeI制限エンドヌクレアーゼ
部位の、および終止コドンの後ろのBamHI 部位の挿入を
可能にした。プライマーは以下の配列を有していた：
図６) からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりプラ
イマーribA5 およびribA3 を用いて単離した。この方法
は遺伝子の開始コドンでのNdeI制限エンドヌクレアーゼ
部位の、および終止コドンの後ろのBamHI 部位の挿入を
可能にした。プライマーは以下の配列を有していた：
【００２７】
【表２】
【００２８】下線を付した配列は制限エンドヌクレアー
ゼ部位NdeI（ＣＡＴＡＴＧ）およびBamHI （ＧＧＡＴＣ
Ｃ）に対応し、小文字はB.subtilisのrib オペロンの配
列と比較して変化したヌクレオチドを示し、そして太字
配列は翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドンの逆
相補物（ＴＴＡ）を記す。
ゼ部位NdeI（ＣＡＴＡＴＧ）およびBamHI （ＧＧＡＴＣ
Ｃ）に対応し、小文字はB.subtilisのrib オペロンの配
列と比較して変化したヌクレオチドを示し、そして太字
配列は翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドンの逆
相補物（ＴＴＡ）を記す。
【００２９】Perkin Elmer CetusのGeneAmp ＤＮＡ増幅
試薬キットを、製造者の指示に従ってＰＣＲ反応に用い
た。反応条件は：１分間９４℃、１分間４５℃および２
分間７２℃で２５サイクルであった。各プライマー濃度
は１μM であり、鋳型ＤＮＡを約１pMの濃度で添加し
た。ＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動によりプ
ライマーから分離し、ribAを含むＰＣＲフラグメントを
単離し(Heery, D.M., Gannon, F. and Powell, R., 199
0. A simple method for subcloning ＤＮＡ fragments
from gel slices. Trends in Genetics 6, 173; Vaux,
D.L., 1992 Rapid recovery of ＤＮＡ from agarose
gels. Trends in Genetics 8, 81）、NdeIおよびBamHI
で切断してベクターpDSNdeHis にクローン化し、プラス
ミドpDSribA を得た。
試薬キットを、製造者の指示に従ってＰＣＲ反応に用い
た。反応条件は：１分間９４℃、１分間４５℃および２
分間７２℃で２５サイクルであった。各プライマー濃度
は１μM であり、鋳型ＤＮＡを約１pMの濃度で添加し
た。ＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動によりプ
ライマーから分離し、ribAを含むＰＣＲフラグメントを
単離し(Heery, D.M., Gannon, F. and Powell, R., 199
0. A simple method for subcloning ＤＮＡ fragments
from gel slices. Trends in Genetics 6, 173; Vaux,
D.L., 1992 Rapid recovery of ＤＮＡ from agarose
gels. Trends in Genetics 8, 81）、NdeIおよびBamHI
で切断してベクターpDSNdeHis にクローン化し、プラス
ミドpDSribA を得た。
【００３０】実施例４ VB2XL1株の構築 ribA遺伝子をpDSribA からNdeIおよびBamHI を用いて切
り出し、NdeI−BamHI開裂したpXI16 にサブクローニン
グした。E.coliからこのプラスミドを単離した後、この
ＤＮＡをApaIで切断し、３０bpの挿入物を欠失させてve
g プロモーターを連結により再構築した。次いで、この
プラスミドをpBR322誘導配列内のみ開裂するFspIで切断
することにより線状化し（図２）、そしてクローン化し
た遺伝子を、形質転換受容能のあるB.subtilis細胞に、
記載された２段階の手法に従って導入した(Cutting, S.
M. and Vander Horn, P.B., 1990. In:Molecular biolo
gical methods for Bacillus(Harwood and Cutting, ed
s.), p.67-71, John Wiley& Sons Ltd., Chichester, E
ngland)。生産株RB50::[pRF69]::[pRF93]は形質転換用
に受容能を持たせるようにできないので、B.subtilis 1
012 株(Saito, H.,Shibata, T and Ando, T., 1979. Ma
pping of genes determining nonpermissiveness and h
ost-specific restriction to bacteriophages in Baci
llus subtilis Marburg. Mol. Gen. Genet. 170, 117-1
22)を中間体宿主として選択した。エリスロマイシン耐
性クローンは、相同領域sacB-3' およびsacB-5' におい
てsacB遺伝子座に二重交換によって挿入されたribA遺伝
子およびエリスロマイシン耐性遺伝子ermAM 有していた
（図３）。次いで、改変されたsacB遺伝子座を、記載さ
れたように(Cutting and Vander Horn, 1990) 液体培養
法に従ってファージＰＢＳ１を用いる形質導入によりRB
50::[pRF69]::[pRF93]に導入した。
り出し、NdeI−BamHI開裂したpXI16 にサブクローニン
グした。E.coliからこのプラスミドを単離した後、この
ＤＮＡをApaIで切断し、３０bpの挿入物を欠失させてve
g プロモーターを連結により再構築した。次いで、この
プラスミドをpBR322誘導配列内のみ開裂するFspIで切断
することにより線状化し（図２）、そしてクローン化し
た遺伝子を、形質転換受容能のあるB.subtilis細胞に、
記載された２段階の手法に従って導入した(Cutting, S.
M. and Vander Horn, P.B., 1990. In:Molecular biolo
gical methods for Bacillus(Harwood and Cutting, ed
s.), p.67-71, John Wiley& Sons Ltd., Chichester, E
ngland)。生産株RB50::[pRF69]::[pRF93]は形質転換用
に受容能を持たせるようにできないので、B.subtilis 1
012 株(Saito, H.,Shibata, T and Ando, T., 1979. Ma
pping of genes determining nonpermissiveness and h
ost-specific restriction to bacteriophages in Baci
llus subtilis Marburg. Mol. Gen. Genet. 170, 117-1
22)を中間体宿主として選択した。エリスロマイシン耐
性クローンは、相同領域sacB-3' およびsacB-5' におい
てsacB遺伝子座に二重交換によって挿入されたribA遺伝
子およびエリスロマイシン耐性遺伝子ermAM 有していた
（図３）。次いで、改変されたsacB遺伝子座を、記載さ
れたように(Cutting and Vander Horn, 1990) 液体培養
法に従ってファージＰＢＳ１を用いる形質導入によりRB
50::[pRF69]::[pRF93]に導入した。
【００３１】実施例５ ribA-MもしくはribA-CをsacB遺伝子座に有するRB50::[p
RF69]::[pRF93]の構築 RibAは、２つの酵素活性、ＧＴＰシクロヒドロラーゼII
およびムターゼ（３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
４−ホスフェートシンターゼ) をコードし、それらはE.
coli内で２つの別々の遺伝子によってコードされている
(Richter, G.,Ritz, H., Katzenmeier, G., Volk, R.,
Kohnle, A., Lottspeich, F., Allendorf, D. and Bach
er, A., 1993. Biosynthesis of riboflavin: cloning
sequencing, mapping and expression of the gene co
ding for GTP cyclohydrolase II of Escherichia col
i. J. Bact. 175, 4045-4051）。ムターゼ活性はB.subt
ilis ribA のアミノ末端半分に位置し、そしてＧＴＰシ
クロヒドロラーゼII活性は、カルボキシ末端半分に存在
する。ribAのムターゼをコードしている部分を、ribA-M
と名付け、pDSribA からNdeIおよびHincIIにより切り出
し、NdeIおよびSmaI開裂したpXI16 ベクターにクローン
化した。ただ１つのHincII部位は都合のよいことにribA
の真ん中に位置し、そして遺伝子の２つの活性をコード
している半分を分離している２つのコドンの間で開裂が
起きる。RB50::[pRF69]::[pRF93]のsacB遺伝子座へのri
bA-Mの導入を上記のように行った。ribAのＧＴＰシクロ
ヒドロラーゼをコードする部分を、ribA-Cと名付け、pD
SribA からHincIIおよびBamHIで切り出し、HincII-BamH
I開裂pDSNdeHis に導入した。pDSNdeHis 中のただ一つ
のHincII認識部位は、SalI部位（ＧＴＣＧＡＣ、図１）
と同じであり、そしてHincII開裂は結果として認識部位
の真ん中で切り離された平滑末端になるということに注
意されたい。次いで、得られたプラスミドをNdeIおよび
BamHI で切断してribA-CをNdeIBamHI 切断pXI12 にクロ
ーン化した。RB50::[pRF69]::[pRF93]のsacB遺伝子座へ
のribA-Cの導入を、割り込みのないveg プロモーターを
有するpXI12 を用いたためApaI開裂と再連結工程を省い
た以外は上記のように行った（図２）。
RF69]::[pRF93]の構築 RibAは、２つの酵素活性、ＧＴＰシクロヒドロラーゼII
およびムターゼ（３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン
４−ホスフェートシンターゼ) をコードし、それらはE.
coli内で２つの別々の遺伝子によってコードされている
(Richter, G.,Ritz, H., Katzenmeier, G., Volk, R.,
Kohnle, A., Lottspeich, F., Allendorf, D. and Bach
er, A., 1993. Biosynthesis of riboflavin: cloning
sequencing, mapping and expression of the gene co
ding for GTP cyclohydrolase II of Escherichia col
i. J. Bact. 175, 4045-4051）。ムターゼ活性はB.subt
ilis ribA のアミノ末端半分に位置し、そしてＧＴＰシ
クロヒドロラーゼII活性は、カルボキシ末端半分に存在
する。ribAのムターゼをコードしている部分を、ribA-M
と名付け、pDSribA からNdeIおよびHincIIにより切り出
し、NdeIおよびSmaI開裂したpXI16 ベクターにクローン
化した。ただ１つのHincII部位は都合のよいことにribA
の真ん中に位置し、そして遺伝子の２つの活性をコード
している半分を分離している２つのコドンの間で開裂が
起きる。RB50::[pRF69]::[pRF93]のsacB遺伝子座へのri
bA-Mの導入を上記のように行った。ribAのＧＴＰシクロ
ヒドロラーゼをコードする部分を、ribA-Cと名付け、pD
SribA からHincIIおよびBamHIで切り出し、HincII-BamH
I開裂pDSNdeHis に導入した。pDSNdeHis 中のただ一つ
のHincII認識部位は、SalI部位（ＧＴＣＧＡＣ、図１）
と同じであり、そしてHincII開裂は結果として認識部位
の真ん中で切り離された平滑末端になるということに注
意されたい。次いで、得られたプラスミドをNdeIおよび
BamHI で切断してribA-CをNdeIBamHI 切断pXI12 にクロ
ーン化した。RB50::[pRF69]::[pRF93]のsacB遺伝子座へ
のribA-Cの導入を、割り込みのないveg プロモーターを
有するpXI12 を用いたためApaI開裂と再連結工程を省い
た以外は上記のように行った（図２）。
【００３２】実施例６ 改変されたオペロンpRF69 およびpRF93 の増幅 改変されたオペロンの増幅は、リボフラビン高力価にと
って重要である（ＥＰ０４０５３７０）。以下の増幅ス
キームを用いた：２０μg/mlテトラサイクリンおよび１
０μg/mlクロラムフェニコールを含むＶＹ（２５ｇ/L仔
牛肉混和ブロス(Difco) 、５g/L 酵母エキス、１５g/L
グルコース）中で成長させた一夜培養物３０μl を用い
て、ＶＹ３mlおよびテトラサイクリン３０、６０、もし
くは７５μg/mlの入った３つの試験管に接種した。３７
℃、２００rpm で８〜９時間後、最も高いテトラサイク
リン濃度を有し依然として良好に成長している培養物３
０〜５０μl を用いて、ＶＹ３mlおよびクロラムフェニ
コール３０、４５、もしくは６０μg/mlの入った試験管
に接種した。３７℃、２００rpm で一晩インキュベーシ
ョンした後、最も高いクロラムフェニコール濃度を有し
依然として良好に成長している培養物３０〜５０μl を
用いて、ＶＹ３mlおよびテトラサイクリン６０、７５、
９０もしくは１２０μg/mlの入った試験管に接種した。
同じように、ＶＹとクロラムフェニコール４５、６０、
もしくは８０μg/ml、ＶＹとテトラサイクリン７５、９
０、１２０もしくは１４０μg/ml、ならびにＶＹとクロ
ラムフェニコール６０もしくは８０μg/mlでも成長は続
いた。最後の移植は１５mlのＶＹおよび１２０もしくは
１４０μg/mlのテトラサイクリンの入った２本の試験管
への２００μl であった。細胞をＯＤ600 が約０．８と
なるまで成長させ、次いで１mlのアリコートに分配し
た。グリセロールを最終濃度１５％になるように添加
し、細胞を−７０℃で保存した。VB2XL1株は最大抗生物
質濃度が１４０μg/mlテトラサイクリンおよび８０μg/
mlクロラムフェニコールに達した。
って重要である（ＥＰ０４０５３７０）。以下の増幅ス
キームを用いた：２０μg/mlテトラサイクリンおよび１
０μg/mlクロラムフェニコールを含むＶＹ（２５ｇ/L仔
牛肉混和ブロス(Difco) 、５g/L 酵母エキス、１５g/L
グルコース）中で成長させた一夜培養物３０μl を用い
て、ＶＹ３mlおよびテトラサイクリン３０、６０、もし
くは７５μg/mlの入った３つの試験管に接種した。３７
℃、２００rpm で８〜９時間後、最も高いテトラサイク
リン濃度を有し依然として良好に成長している培養物３
０〜５０μl を用いて、ＶＹ３mlおよびクロラムフェニ
コール３０、４５、もしくは６０μg/mlの入った試験管
に接種した。３７℃、２００rpm で一晩インキュベーシ
ョンした後、最も高いクロラムフェニコール濃度を有し
依然として良好に成長している培養物３０〜５０μl を
用いて、ＶＹ３mlおよびテトラサイクリン６０、７５、
９０もしくは１２０μg/mlの入った試験管に接種した。
同じように、ＶＹとクロラムフェニコール４５、６０、
もしくは８０μg/ml、ＶＹとテトラサイクリン７５、９
０、１２０もしくは１４０μg/ml、ならびにＶＹとクロ
ラムフェニコール６０もしくは８０μg/mlでも成長は続
いた。最後の移植は１５mlのＶＹおよび１２０もしくは
１４０μg/mlのテトラサイクリンの入った２本の試験管
への２００μl であった。細胞をＯＤ600 が約０．８と
なるまで成長させ、次いで１mlのアリコートに分配し
た。グリセロールを最終濃度１５％になるように添加
し、細胞を−７０℃で保存した。VB2XL1株は最大抗生物
質濃度が１４０μg/mlテトラサイクリンおよび８０μg/
mlクロラムフェニコールに達した。
【００３３】リボフラビンの発酵生産 リボフラビンの発酵生産を、上記の形質転換したB.subt
ilisを用いることによりＥＰ４０５，３７０に記載され
たようにグルコース制限流加培養内で行った。
ilisを用いることによりＥＰ４０５，３７０に記載され
たようにグルコース制限流加培養内で行った。
【００３４】実施例７ 第４の部位の組込み VB2XL3株は、さらなるribA遺伝子が、ribAレベルをさら
に上昇させるためにamyE遺伝子座に導入されていること
以外は属としてはVB2XL1と同じである。VB2XL3を、基本
的には、VB2XL1について上で記載したように構築した。
簡単に述べると、pXI16 中のエリスロマイシンマーカー
（図２）をネオマイシン耐性遺伝子によって置き換え、
sacB相同領域をamyE相同配列によって置き換え、その結
果ベクターpXI191を生じた。このネオマイシン耐性遺伝
子はプラスミドpBEST501から入手し(M. Itaya et al.,
Nucl. Acids Res., 1989, p.4410）、固有のApaI部位を
サイレント点変異により除去した。amyE相同領域を、Ｐ
ＣＲにより、B.subtilisのゲノムから、公知の配列（受
け入れ番号Ｘ０２１５０）にしたがって設計したプライ
マーを用いて増幅した。次いで、ribA遺伝子を、pXI191
にクローン化し、得られたプラスミドをビヒクルとして
用いて、実質的に上に記載したようにribA遺伝子をVB2X
L1のamyE遺伝子座に導入した。この新しい株をVB2XL3と
名付けた。
に上昇させるためにamyE遺伝子座に導入されていること
以外は属としてはVB2XL1と同じである。VB2XL3を、基本
的には、VB2XL1について上で記載したように構築した。
簡単に述べると、pXI16 中のエリスロマイシンマーカー
（図２）をネオマイシン耐性遺伝子によって置き換え、
sacB相同領域をamyE相同配列によって置き換え、その結
果ベクターpXI191を生じた。このネオマイシン耐性遺伝
子はプラスミドpBEST501から入手し(M. Itaya et al.,
Nucl. Acids Res., 1989, p.4410）、固有のApaI部位を
サイレント点変異により除去した。amyE相同領域を、Ｐ
ＣＲにより、B.subtilisのゲノムから、公知の配列（受
け入れ番号Ｘ０２１５０）にしたがって設計したプライ
マーを用いて増幅した。次いで、ribA遺伝子を、pXI191
にクローン化し、得られたプラスミドをビヒクルとして
用いて、実質的に上に記載したようにribA遺伝子をVB2X
L1のamyE遺伝子座に導入した。この新しい株をVB2XL3と
名付けた。
【００３５】
【表３】
【図１】発現ベクターpDSNdeHis 。
【図２】プラスミドpXI12 およびpXI16 。
【図３】B.subtilisのsacB遺伝子座へのribA遺伝子の組
込み。
込み。
【図４】ribA、ribA-MもしくはribA-C遺伝子のRB50::(p
RF69)n::(pRF93)mのsacB遺伝子座への組込みが細胞成長
およびリボフラビン生産に及ぼす影響。
RF69)n::(pRF93)mのsacB遺伝子座への組込みが細胞成長
およびリボフラビン生産に及ぼす影響。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｐ 25/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 マルクス・ヒュンベリン スイス国、ツェーハー−5079 ツァイエ ン、シュティーグリ １ (72)発明者 アドルフス・ファン・ローン スイス国、ツェーハー−4310 ラインフェ ルデン、バルトシューテルシュトラーセ 17 (72)発明者 ヴァルター・シュルター スイス国、ツェーハー−4059 バーゼル、 プレーディガーホフシュトラーセ 67
Claims (3)
- 【請求項１】 ３つのベクターもしくはＤＮＡ配列によ
り形質転換された細菌を含む組換え細菌であって、該３
つのベクターもしくはＤＮＡ配列のうち２つは各々Baci
llus subtilis のリボフラビン合成酵素活性をコードす
るＤＮＡ配列もしくは実質的に相同なＤＮＡ配列および
１以上の転写エレメントを含み、ならびに第３のベクタ
ーもしくはＤＮＡ配列はBacillus subtilis のribA遺伝
子産物をコードするＤＮＡ配列もしくは実質的に相同な
ＤＮＡ配列を含み、そして任意にさらに転写エレメント
を含み、この転写エレメントにより、これらベクターの
各々の１個または複数個のコピーがその染色体中の３つ
の異なる部位に組み込まれた、組換え細菌。 - 【請求項２】 リボフラビンの生産方法であって、請求
項１に記載の組換え細菌を適切な成長条件下で成長さ
せ、培地中に分泌されたリボフラビンを当該分野で公知
の方法により単離することを特徴とする方法。 - 【請求項３】 食物もしくは飼料用組成物の調製方法で
あって、請求項２に記載の方法を行って、それによって
得られたリボフラビンを当該分野で公知の方法により食
物もしくは飼料用組成物にすることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96111905 | 1996-07-24 | ||
| EP96111905.4 | 1996-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084978A true JPH1084978A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=8223032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9184843A Pending JPH1084978A (ja) | 1996-07-24 | 1997-07-10 | 改良されたリボフラビン生産 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6322995B1 (ja) |
| EP (1) | EP0821063B1 (ja) |
| JP (1) | JPH1084978A (ja) |
| CN (1) | CN1189556C (ja) |
| AT (1) | ATE256188T1 (ja) |
| BR (1) | BR9704067A (ja) |
| DE (1) | DE69726652T2 (ja) |
| DK (1) | DK0821063T3 (ja) |
| ES (1) | ES2210424T3 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078222B2 (en) | 2002-12-05 | 2006-07-18 | Cj Corp. | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same |
| US7166456B2 (en) | 2002-12-05 | 2007-01-23 | Cj Corp. | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same |
| JP2008504833A (ja) * | 2004-07-07 | 2008-02-21 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 改良された酵素 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0926243B1 (en) | 1997-12-04 | 2004-08-25 | DSM IP Assets B.V. | Riboflavin Glucoside |
| DE19823834A1 (de) * | 1998-05-28 | 1999-12-02 | Basf Ag | Genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin |
| US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| DE10209363A1 (de) * | 2002-03-02 | 2003-09-11 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Riboflavin |
| KR100542563B1 (ko) * | 2003-12-05 | 2006-01-11 | 씨제이 주식회사 | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법 |
| US7182739B2 (en) * | 2005-05-12 | 2007-02-27 | S.C. Johnson & Son, Inc. | Therapy patch |
| EP1731617A1 (de) * | 2005-06-06 | 2006-12-13 | DSM IP Assets B.V. | Rückführung lysierter Biomasse als Nährmedium bei der fermentativen Herstellung von Riboflavin |
| DE102008063234B4 (de) * | 2008-12-15 | 2011-06-22 | Insilico Biotechnology AG, 70569 | Biotechnologische Herstellung von Riboflavin mit hoher Ausbeute |
| KR101335853B1 (ko) | 2011-12-01 | 2013-12-02 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 |
| KR102561864B1 (ko) * | 2014-11-19 | 2023-08-01 | 바스프 에스이 | Rib７ 프로모터를 사용하여 유전자 발현을 하향조절하기 위한 에레모테시움의 유전적 변형 |
| CN108277189A (zh) * | 2017-01-05 | 2018-07-13 | 上海创诺医药集团有限公司 | 一种生产核黄素的工程菌株及其应用 |
| CN113186091B (zh) * | 2019-09-20 | 2022-10-21 | 河北圣雪大成制药有限责任公司 | 一种利用氧载体提高核黄素产量的发酵装置 |
| CN113025550B (zh) * | 2021-05-24 | 2021-09-10 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 高产维生素b2枯草芽孢杆菌工程菌株、其构建及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5310155B2 (ja) | 1972-10-26 | 1978-04-11 | ||
| CN1066486C (zh) * | 1989-06-22 | 2001-05-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 高产核黄素的细菌菌株 |
| JPH06225776A (ja) * | 1992-12-07 | 1994-08-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | リボフラビンの製造法 |
-
1997
- 1997-07-10 JP JP9184843A patent/JPH1084978A/ja active Pending
- 1997-07-15 ES ES97111984T patent/ES2210424T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-15 DE DE69726652T patent/DE69726652T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-15 AT AT97111984T patent/ATE256188T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-07-15 EP EP97111984A patent/EP0821063B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-15 DK DK97111984T patent/DK0821063T3/da active
- 1997-07-23 CN CNB971171637A patent/CN1189556C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-23 US US08/899,241 patent/US6322995B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-24 BR BR9704067A patent/BR9704067A/pt not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078222B2 (en) | 2002-12-05 | 2006-07-18 | Cj Corp. | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same |
| US7166456B2 (en) | 2002-12-05 | 2007-01-23 | Cj Corp. | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same |
| JP2008504833A (ja) * | 2004-07-07 | 2008-02-21 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 改良された酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69726652T2 (de) | 2004-10-07 |
| EP0821063A2 (en) | 1998-01-28 |
| CN1189556C (zh) | 2005-02-16 |
| DK0821063T3 (da) | 2004-04-13 |
| EP0821063A3 (en) | 1999-05-06 |
| US6322995B1 (en) | 2001-11-27 |
| BR9704067A (pt) | 1999-01-05 |
| ES2210424T3 (es) | 2004-07-01 |
| EP0821063B1 (en) | 2003-12-10 |
| DE69726652D1 (de) | 2004-01-22 |
| CN1177004A (zh) | 1998-03-25 |
| ATE256188T1 (de) | 2003-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0035384B1 (en) | Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence | |
| US6808896B2 (en) | Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes | |
| US4769326A (en) | Expression linkers | |
| JPH1084978A (ja) | 改良されたリボフラビン生産 | |
| JPH0691827B2 (ja) | 新規ベクタ−プラスミド | |
| LV10307B (en) | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes | |
| JP2001503249A (ja) | 選択された生物のための人工プロモーターライブラリー及び該ライブラリー由来のプロモーター | |
| WO1992014819A1 (en) | A positive selection vector for the bacteriophage p1 cloning system | |
| US5726039A (en) | Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures | |
| EP0540074A1 (en) | Cloning and sequencing of that chromosomal DNA region of bacillus subtilis comprising the SRFA operon which encodes the multienzymatic complex surfactin synthetase | |
| JPH02265490A (ja) | 組み換え遺伝子の発現法、発現ベクター及び発現補助ベクター | |
| AU6277490A (en) | Promoter probe vectors, able to replicate in e.coli, b.subtilis, lactococci and lactobacillus as well as uses thereof | |
| US5281531A (en) | Host and vector for producing D-ribose | |
| AU630387B2 (en) | A method of site-specific mutagenesis of dna and development of plasmid vectors | |
| JP3148262B2 (ja) | トランスポゾン、テストベクター、グラム陽性菌の突然変異生成法及びグラム陽性菌 | |
| EP0228726B1 (en) | Method for preparing proteins using transformed lactic acid bacteria | |
| US5654169A (en) | Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures | |
| EP0182562B1 (en) | Process for a thermo-inducible gene expression in gram positive bacteria, bacillus subtilis strains containing plasmids which induce such an expression and portable vector systems | |
| AU761093B2 (en) | Construction of production strains for producing substituted phenols by specifically inactivating genes of the eugenol and ferulic acid catabolism | |
| JP2774989B2 (ja) | 組換えｄｎａ、その製法、表現ベクター、その製法及びフラグメントの誘導可能で抑制可能な表現法 | |
| IE860800L (en) | Dedicated ribosomes | |
| HU205626B (en) | Process for producing recombinant exprassive dns-vectors coding isopenicillin-n synthetase enzyme of aspergillus nidulans or for producing dns-molekules | |
| AU779939B2 (en) | Compartmentalization of recombinant polypeptides in host cells | |
| NO173452B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter | |
| CN111662903B (zh) | 对数期特异性启动子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040319 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040615 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061003 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20061130 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20061204 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070104 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070104 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070213 |