JP2774989B2 - 組換えｄｎａ、その製法、表現ベクター、その製法及びフラグメントの誘導可能で抑制可能な表現法 - Google Patents
組換えｄｎａ、その製法、表現ベクター、その製法及びフラグメントの誘導可能で抑制可能な表現法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換えDNA、表現ベクター、そのような組
換えDNA及び表現ベクターの製法並びにそれをフラグメ
ントの誘導可能で抑制可能な表現のために使用すること
に関する。
換えDNA及び表現ベクターの製法並びにそれをフラグメ
ントの誘導可能で抑制可能な表現のために使用すること
に関する。
応用遺伝子工学の最も重要な目的は、組換えDNAから
の蛋白質製造である。このためには、特別な群のベクタ
ーいわゆる表現ベクターが必要である。これは、組換え
DNAのクローニング、転移及び増殖のためのみならず、
蛋白質の表現のための構造的前提をも有する。このため
に、これら組換えDNA分子は、特別な調節配列、DNA配列
をRNA（その翻訳がリボソームにより最終蛋白質をもた
らす）中に転写する作用をするプロモーターを含有す
る。
の蛋白質製造である。このためには、特別な群のベクタ
ーいわゆる表現ベクターが必要である。これは、組換え
DNAのクローニング、転移及び増殖のためのみならず、
蛋白質の表現のための構造的前提をも有する。このため
に、これら組換えDNA分子は、特別な調節配列、DNA配列
をRNA（その翻訳がリボソームにより最終蛋白質をもた
らす）中に転写する作用をするプロモーターを含有す
る。
１個以上の遺伝子を転写するための細菌性RNA−ポリ
メラーゼがそれに結合するDNA−領域をプロモーターと
称する。このようなプロモーターの多くは、特に特定の
蛋白質との相互作用において重要であると推測される構
造的共通性を有する。しかしながら、細胞蛋白質又は他
の分子とのこのような相互作用により、抑制は、プロモ
ーターの活性を誘発する作用をすることもできる。この
例は、λ−プロモーターP1とλ−リプレツサーCIとの相
互作用である。
メラーゼがそれに結合するDNA−領域をプロモーターと
称する。このようなプロモーターの多くは、特に特定の
蛋白質との相互作用において重要であると推測される構
造的共通性を有する。しかしながら、細胞蛋白質又は他
の分子とのこのような相互作用により、抑制は、プロモ
ーターの活性を誘発する作用をすることもできる。この
例は、λ−プロモーターP1とλ−リプレツサーCIとの相
互作用である。
蛋白質の遺伝子工学的製造の際に、表現ベクター中に
存在するプロモーターをリプレツサー又はインダクター
の存在又は添加により調節することができる場合が特に
有利である。
存在するプロモーターをリプレツサー又はインダクター
の存在又は添加により調節することができる場合が特に
有利である。
この調節は、醗酵の当初に、プロモーターの活性を抑
制することにより行ない、その結果細胞の活力の最小悪
影響のもとに高いバイオマスを製造することができる。
引続き、適当な手段によりプロモーターを刺激し、生成
物の合成を行なうことができる。従つて、原則的に、こ
の醗酵法は、生長−及び生産相で異なつていてよい。
制することにより行ない、その結果細胞の活力の最小悪
影響のもとに高いバイオマスを製造することができる。
引続き、適当な手段によりプロモーターを刺激し、生成
物の合成を行なうことができる。従つて、原則的に、こ
の醗酵法は、生長−及び生産相で異なつていてよい。
調節可能な遺伝子表現のために、例えば、バクテリア
フアージλのPL−プロモーター、lac−プロモーター、t
rp−プロモーター、tac−プロモーター、trc−プロモー
ター及びrac−プロモーターが使用される。
フアージλのPL−プロモーター、lac−プロモーター、t
rp−プロモーター、tac−プロモーター、trc−プロモー
ター及びrac−プロモーターが使用される。
しかしながら、これらの表現系は、大工業的使用のた
めには、好適性が限られる。特に、λPL−プロモーター
の誘導のために必要であるような42℃まで温度を高める
と、50lまでの量での工業的使用の際に大きな困難と結
びつく。更に、早期生長相内で、λPL−プロモーターの
誘導を行なうと、大量生産のために必要なバイオマス
は、状況により達成できないことが判明した。
めには、好適性が限られる。特に、λPL−プロモーター
の誘導のために必要であるような42℃まで温度を高める
と、50lまでの量での工業的使用の際に大きな困難と結
びつく。更に、早期生長相内で、λPL−プロモーターの
誘導を行なうと、大量生産のために必要なバイオマス
は、状況により達成できないことが判明した。
表現ベクターを得るためにlac−プロモーターを使用
する際には、PL−プロモーターとは反対に、この系を、
リプレツサー遺伝子のコピーを用いて完全に抑制するこ
とは不可能である。それというのも、lac−オペレータ
のコピー数によりリプレツサーは滴定されるからであ
る。リプレツサー過剰提供体（Repressor−Ueberproduz
ent）の使用により、この抑制は再び得ることができる
が、このような株は部分的に誘導可能であるだけであ
る。相応するリプレツサー遺伝子が表現ベクター上に含
有されていない場合には、λPL、lac及びlac−プロモー
ターの他の誘導体においては、宿主株の選択が制限され
る。更に、醗酵の間にこの系で必要なインダクター（In
ductor）の添加は、高価であるばかりでなく、特に、そ
れが代謝可能なインダクター例えばラクトースである場
合には、原則的な困難をももたらす。
する際には、PL−プロモーターとは反対に、この系を、
リプレツサー遺伝子のコピーを用いて完全に抑制するこ
とは不可能である。それというのも、lac−オペレータ
のコピー数によりリプレツサーは滴定されるからであ
る。リプレツサー過剰提供体（Repressor−Ueberproduz
ent）の使用により、この抑制は再び得ることができる
が、このような株は部分的に誘導可能であるだけであ
る。相応するリプレツサー遺伝子が表現ベクター上に含
有されていない場合には、λPL、lac及びlac−プロモー
ターの他の誘導体においては、宿主株の選択が制限され
る。更に、醗酵の間にこの系で必要なインダクター（In
ductor）の添加は、高価であるばかりでなく、特に、そ
れが代謝可能なインダクター例えばラクトースである場
合には、原則的な困難をももたらす。
trp−プロモーターも、完全には抑制できない系であ
る。インダクターの使用の際と同様に、抑制のためのト
リプトフアンの添加によつても、醗酵は付加的に著るし
く高価になりうる。
る。インダクターの使用の際と同様に、抑制のためのト
リプトフアンの添加によつても、醗酵は付加的に著るし
く高価になりうる。
従つて、従来公知のインダクターは、これらインダク
ターが大抵は非常に高価であり、誘導又は抑制のための
適用方法が複雑であり、蛋白質の表現の調節のためには
限られてのみ好適であるので、工業的使用のためには好
適性が限られている。
ターが大抵は非常に高価であり、誘導又は抑制のための
適用方法が複雑であり、蛋白質の表現の調節のためには
限られてのみ好適であるので、工業的使用のためには好
適性が限られている。
西ドイツ特許（DE−Ａ）第3710633号明細書から、Fdh
F−遺伝子に由来し、ギ酸塩を用いて誘導されうる酸素
抑制可能なプロモーターが公知である。これにより、簡
単ば抑制及び誘導に関する可能性が提供されるが、これ
は、比較的弱いプロモーターである。
F−遺伝子に由来し、ギ酸塩を用いて誘導されうる酸素
抑制可能なプロモーターが公知である。これにより、簡
単ば抑制及び誘導に関する可能性が提供されるが、これ
は、比較的弱いプロモーターである。
従つて、本発明の課題は、簡単な方法で所望の遺伝子
産生物の表現の調節並びに特にこの遺伝子の高い表現率
を可能にする組換えDNA及び表現ベクターを提供するこ
とである。
産生物の表現の調節並びに特にこの遺伝子の高い表現率
を可能にする組換えDNA及び表現ベクターを提供するこ
とである。
この課題は、 （ａ）第10図の配列の部分範囲−969〜−991塩基対及び
／又は−1308〜−1330塩基対からのレギュレーター領域
（Regulatorregion）及び （ｂ）この調節配列の３′−方向に、１個の35/−10−
プロモーターコンセンサス配列（Rosenberg,M.and Cou
r,D.（1979）Ann.Rev.Genet.13:319〜353）を有するプ
ロモーター領域を有し、かつ、このプロモーター領域
が、pf1−遺伝子でない１個の構造遺伝子とオペラティ
ブ（operative）に結合していることを特徴とする組換
えDNAにより解決される。
／又は−1308〜−1330塩基対からのレギュレーター領域
（Regulatorregion）及び （ｂ）この調節配列の３′−方向に、１個の35/−10−
プロモーターコンセンサス配列（Rosenberg,M.and Cou
r,D.（1979）Ann.Rev.Genet.13:319〜353）を有するプ
ロモーター領域を有し、かつ、このプロモーター領域
が、pf1−遺伝子でない１個の構造遺伝子とオペラティ
ブ（operative）に結合していることを特徴とする組換
えDNAにより解決される。
本発明の有利な１実施形では、このレギュレーター領
域の少なくとも65％が第10図の記載配列に対して相同で
ある。
域の少なくとも65％が第10図の記載配列に対して相同で
ある。
ここで塩基の番号は、第10図のpfl−遺伝子の下線を
引いたATG−スタートコドン＋１（アデニン）に対して
数えられている。これの５′−部位の上に存在するヌク
レオチドは、負の番号を有する。
引いたATG−スタートコドン＋１（アデニン）に対して
数えられている。これの５′−部位の上に存在するヌク
レオチドは、負の番号を有する。
本発明のもう１つの有利な実施形では、この組換えDN
Aが付加的に、少なくとも80％が次のコンセンサス配
列： に対して相同である第３配列少なくとも１個を有する。
Aが付加的に、少なくとも80％が次のコンセンサス配
列： に対して相同である第３配列少なくとも１個を有する。
この際、この第３配列は、この組換えDNA中に１個以
上含有されていてよい。
上含有されていてよい。
本発明による組換えDNAのプロモーター領域の好適な
プロモーターは、前記定義のように１個のコンセンサス
配列を−35/−10−領域内に含有するすべてのプロモー
ターである。これらは、例えばlac−プロモーター、λ
−PL−プロモーター、trp−プロモーター、mgl−プロモ
ーター（EPA285152）又は第11図からのプロモーターも
しくはそれらの50％特に65％相同体である。
プロモーターは、前記定義のように１個のコンセンサス
配列を−35/−10−領域内に含有するすべてのプロモー
ターである。これらは、例えばlac−プロモーター、λ
−PL−プロモーター、trp−プロモーター、mgl−プロモ
ーター（EPA285152）又は第11図からのプロモーターも
しくはそれらの50％特に65％相同体である。
プロモーター領域として、50％特に65％が第11図に記
載の配列の１つに対して相同である配列を使用するのが
有利である。
載の配列の１つに対して相同である配列を使用するのが
有利である。
特に有利な実施形では、第11図に記載の配列のトラン
スクリプト６及びトランスクリプト７のプロモーターの
少なくとも１個を使用する。
スクリプト６及びトランスクリプト７のプロモーターの
少なくとも１個を使用する。
本発明のもう１つの目的物は、適当なベクター中に連
結導入された（einligiert）本発明による組換えDNAを
含有する表現ベクターである。
結導入された（einligiert）本発明による組換えDNAを
含有する表現ベクターである。
本発明による組換えDNA−配列のこのDNA−配列は、本
発明の表現ベクター中でこのプロモーターの制御下に表
現すべき遺伝子の転写開始の下流（即ち５′−部位上）
に存在し、この際、プロモーターと表現すべき遺伝子と
の間にはATG−コドン及び有利になおシヤイン−ダルガ
ルノ−配列（Shine−Dalgarno−Sequenz）が存在する。
発明の表現ベクター中でこのプロモーターの制御下に表
現すべき遺伝子の転写開始の下流（即ち５′−部位上）
に存在し、この際、プロモーターと表現すべき遺伝子と
の間にはATG−コドン及び有利になおシヤイン−ダルガ
ルノ−配列（Shine−Dalgarno−Sequenz）が存在する。
本発明の有利な実施形では、本発明による表現ベクタ
ーが、表現すべき異種遺伝子が挿入される位置に、１個
のポリリンカー又は１個の単一制限切断位置即ち、この
表現ベクター中に１個だけ存在する制限切断位置を有す
る。
ーが、表現すべき異種遺伝子が挿入される位置に、１個
のポリリンカー又は１個の単一制限切断位置即ち、この
表現ベクター中に１個だけ存在する制限切断位置を有す
る。
もう１つの有利な実施形では、プロモーター領域と表
現すべき異種遺伝子との間に、PFL−遺伝子もしくはそ
の１部及び場合によつては、PFL−遺伝子の非翻訳上流
帯域（これは例えばATG−コドン及びシヤイン−ダルガ
ルノ−配列を有する）が存在する。特に、第10図に記載
の配列有利に全配列をそのために使用するのが有利であ
る。他の有利な実施形では、この表現ベクターは、本発
明による組換えDNA、第10図のPFL−遺伝子の下流領域か
らの非翻訳配列並びにシヤイン−ダルガルノ−配列及び
この異種遺伝子のATG及び場合によつては既にこの異種
遺伝子そのものを含有する。しかしながら、本発明によ
れば、この異種遺伝子は、もつぱらその開始コドンを本
発明による組換えDNAに直接結合することも可能であ
る。
現すべき異種遺伝子との間に、PFL−遺伝子もしくはそ
の１部及び場合によつては、PFL−遺伝子の非翻訳上流
帯域（これは例えばATG−コドン及びシヤイン−ダルガ
ルノ−配列を有する）が存在する。特に、第10図に記載
の配列有利に全配列をそのために使用するのが有利であ
る。他の有利な実施形では、この表現ベクターは、本発
明による組換えDNA、第10図のPFL−遺伝子の下流領域か
らの非翻訳配列並びにシヤイン−ダルガルノ−配列及び
この異種遺伝子のATG及び場合によつては既にこの異種
遺伝子そのものを含有する。しかしながら、本発明によ
れば、この異種遺伝子は、もつぱらその開始コドンを本
発明による組換えDNAに直接結合することも可能であ
る。
本発明のもう１つの課題は、本発明による組換えDNA
の製法であり、この方法では、PFL−遺伝子を有する微
生物の遺伝子バンクから、その上流領域を有するものを
単離し、場合により、これから不要な部分を、自体公知
方法で除去し、所望の配列をプロモーター領域もしくは
第３配列と結合させる。
の製法であり、この方法では、PFL−遺伝子を有する微
生物の遺伝子バンクから、その上流領域を有するものを
単離し、場合により、これから不要な部分を、自体公知
方法で除去し、所望の配列をプロモーター領域もしくは
第３配列と結合させる。
このために、DNA−配列の連結（Ligation）、制限及
び欠失を慣用方法で実施する。
び欠失を慣用方法で実施する。
本発明による有利な１実施形では、DNA−配列を、大
腸細菌属有利にE.コリーからの微生物の遺伝子バンクか
ら単離する。
腸細菌属有利にE.コリーからの微生物の遺伝子バンクか
ら単離する。
本発明のもう１つの課題は、本発明による表現ベクタ
ーの製法である。このために、本発明による組換えDNA
を、かつ場合によつてはポリリンカー、シヤイン−ダル
ガルノ−配列、開始コドン及び／又は所望の他の配列を
も適当なベクター中に挿入する。このために好適なベク
ター分子は当業者には公知であり、例えばpBR322又はそ
の誘導体である。
ーの製法である。このために、本発明による組換えDNA
を、かつ場合によつてはポリリンカー、シヤイン−ダル
ガルノ−配列、開始コドン及び／又は所望の他の配列を
も適当なベクター中に挿入する。このために好適なベク
ター分子は当業者には公知であり、例えばpBR322又はそ
の誘導体である。
異種遺伝子の誘導可能で抑制可能な表現のために前記
のような組換えDNA又は表現ベクターの本発明による使
用は、嫌気性条件下で、ピルベートによる誘導及び酸素
による抑制により作用させることよりなる。
のような組換えDNA又は表現ベクターの本発明による使
用は、嫌気性条件下で、ピルベートによる誘導及び酸素
による抑制により作用させることよりなる。
ここで、この表現は、大腸細菌属の適当な微生物例え
ばE.コリー及びサルモネラ又は他のグラム陰性菌例えば
シユードモナス又はグラム陽性菌中で行なうことができ
る。
ばE.コリー及びサルモネラ又は他のグラム陰性菌例えば
シユードモナス又はグラム陽性菌中で行なうことができ
る。
FNR−陽性である、即ち機能的FNR遺伝子生産物を形成
する宿主株中での表現を実施するのが有利である。これ
は、有利に西ドイツ微生物寄託局にDSM5312として寄託
されているE.コリーFM420である。
する宿主株中での表現を実施するのが有利である。これ
は、有利に西ドイツ微生物寄託局にDSM5312として寄託
されているE.コリーFM420である。
FNR−陽性微生物から産生されるFNR−蛋白質（Stewar
t,V.Microbiol.Rev.52（1988）、190〜232）は、本発明
によるプロモーターのオペレーターと相互に作用するこ
とができ、その際に表現を活性化するジマー蛋白質であ
る。
t,V.Microbiol.Rev.52（1988）、190〜232）は、本発明
によるプロモーターのオペレーターと相互に作用するこ
とができ、その際に表現を活性化するジマー蛋白質であ
る。
FNR−陰性である宿主株も使用できるが、この場合に
は、活性化を達成するためにFER−蛋白質を細胞に供給
すべきである。このために、このFNR−遺伝子を、所望
の異種遺伝子をも担持する本発明による表現ベクター中
に連結導入することができ、この際、異種遺伝子の表現
と同時にFNR−蛋白質の表現も達成される。同様に、こ
のFNR−遺伝子も宿主細胞中の付加的ベクター上に存在
していてよい。この場合は、FNR−蛋白質の産生は、異
種遺伝子の産生とは無関係であるが、この際、これは、
FNR−蛋白質により誘導される。従つて、これらの実施
形即ち分離ベクター上の少なくとも１個のFNR−遺伝子
の導入は、本発明により有利である。
は、活性化を達成するためにFER−蛋白質を細胞に供給
すべきである。このために、このFNR−遺伝子を、所望
の異種遺伝子をも担持する本発明による表現ベクター中
に連結導入することができ、この際、異種遺伝子の表現
と同時にFNR−蛋白質の表現も達成される。同様に、こ
のFNR−遺伝子も宿主細胞中の付加的ベクター上に存在
していてよい。この場合は、FNR−蛋白質の産生は、異
種遺伝子の産生とは無関係であるが、この際、これは、
FNR−蛋白質により誘導される。従つて、これらの実施
形即ち分離ベクター上の少なくとも１個のFNR−遺伝子
の導入は、本発明により有利である。
本発明による組換えDNA及び本発明による表現ベクタ
ーにより、簡単な方法で、異種遺伝子の表現を調節する
ことができる。例えば、使用微生物の好気性早期生長相
で、この異種遺伝子の障害性表現は抑制される。後の嫌
気性対数生長相への移行の際に、微生物により形成され
たピルベートによりこの表現が誘導され、生長媒体中へ
のプルベートの添加によりこの表現の強化が達成され
る。後の嫌気性対数生長相中で細胞は既に高度生長して
おり、最適密度に達することは異なる簡略化である。こ
の場合に、醗酵技術的になお強化又は調節することので
きる酸素制限が自動的に起こる。この微生物の高い細胞
密度により、異種遺伝子の最適表現を達成することがで
きる。
ーにより、簡単な方法で、異種遺伝子の表現を調節する
ことができる。例えば、使用微生物の好気性早期生長相
で、この異種遺伝子の障害性表現は抑制される。後の嫌
気性対数生長相への移行の際に、微生物により形成され
たピルベートによりこの表現が誘導され、生長媒体中へ
のプルベートの添加によりこの表現の強化が達成され
る。後の嫌気性対数生長相中で細胞は既に高度生長して
おり、最適密度に達することは異なる簡略化である。こ
の場合に、醗酵技術的になお強化又は調節することので
きる酸素制限が自動的に起こる。この微生物の高い細胞
密度により、異種遺伝子の最適表現を達成することがで
きる。
従つて、蛋白質の生産のために本発明による組換えDN
A及び表現ベクターを使用することは、経費節減及び調
節の簡略化可能性を提供する。即ち、高価かつ複雑な誘
導（インダクター添加、温度シフト等）は、もはや不要
である。
A及び表現ベクターを使用することは、経費節減及び調
節の簡略化可能性を提供する。即ち、高価かつ複雑な誘
導（インダクター添加、温度シフト等）は、もはや不要
である。
次の例で、添付図面との関連で本発明を説明する。
第1A図：プラスミドp29からの切片：完全な調節性範囲
及び引続くターミネーターを有するpfl−構造遺伝子。
及び引続くターミネーターを有するpfl−構造遺伝子。
fnr:fnr−遺伝子生成物の結合位置； Tr:転写開始、T:ターミネーター。
第1B図：制限酵素に対して重要な切断位置が書き込まれ
ているプラスミドp29からの切片： 第２図:M13−誘導体M13pec23の構成を示す図。
ているプラスミドp29からの切片： 第２図:M13−誘導体M13pec23の構成を示す図。
第３図:pfl−プロモーターヘクレアチナーゼ遺伝子を結
合するための欠失突然変異誘発を図式的に示している
図;M13pec23Sの例で描出。クレアチナーゼ−配列は斜線
で示されている;EcoK−カセットは黒塗りで示されてい
る。
合するための欠失突然変異誘発を図式的に示している
図;M13pec23Sの例で描出。クレアチナーゼ−配列は斜線
で示されている;EcoK−カセットは黒塗りで示されてい
る。
第４図:pfl−クレアチナーゼ−融合の概観図：それぞれ
プラスミドpPFL23S−Ｃ、pPFL23A−Ｃ及びpPFL39−Ｃか
らの切片が描出されている。
プラスミドpPFL23S−Ｃ、pPFL23A−Ｃ及びpPFL39−Ｃか
らの切片が描出されている。
SD＝シヤイン−ダルガルノ領域 第５図:M13pc23Sの例でのプラスミドpGH−Ｃ中へのM13
からのpfl−クレアチナーゼ−融合の再クローニングを
示す図。
からのpfl−クレアチナーゼ−融合の再クローニングを
示す図。
第6A図:pBTac1のプラスミド地図。
第6B図:pBT2a−１のプラスミド地図。
第6C図:pBTdtacのプラスミド地図。
第6D図:pGH−Ｃのプラスミド地図。
第7A図:pRS552のプラスミド地図。
第7B図:pRS551のプラスミド地図。
第８図：プラスミドpRM23の構成を示す図。
lac Zへの完全pfl−プロモーターフラグメントの翻訳結
合。
合。
B:BamHI;E:EcoRI;S:SalI; H:HindIII;M:MluI;P:PstI; Pv:PvuI。
第９図：醗酵経過の反応速度曲線:FM420（pPFL23S−
Ｃ）。醗酵装置:BiofloII（New Brunswick）； 充填量:4.0l; 攪拌速度:300upmで一定； 4.0l/minで一定通気； 曲線：−生長の経過（logOD600としての細胞密度） −酸素不足増大時のクレアチナーゼ−遺伝子の表現（容
量活性:logU/媒体ml）； −生長過程での溶解酸素含分（％）の減少 第10図:pfl−プロモーター領域の配列。
Ｃ）。醗酵装置:BiofloII（New Brunswick）； 充填量:4.0l; 攪拌速度:300upmで一定； 4.0l/minで一定通気； 曲線：−生長の経過（logOD600としての細胞密度） −酸素不足増大時のクレアチナーゼ−遺伝子の表現（容
量活性:logU/媒体ml）； −生長過程での溶解酸素含分（％）の減少 第10図:pfl−プロモーター領域の配列。
pfl−構造遺伝子のスタートコドンに下線が付されてい
る。第１のヌクレオチドの位置（ATGのＡ）が＋１であ
る。
る。第１のヌクレオチドの位置（ATGのＡ）が＋１であ
る。
第11図：プロモーター領域１〜７を示す図。
この表現プラスミドの構成のための一般論 １）全ての嫌気性醗酵は、Balch及びWolfe（1976）の方
法で血清フラスコ中で実施した。
法で血清フラスコ中で実施した。
嫌気性醗酵をエーレンマイヤーフラスコ中で強力な振
動下に行なつた（このフラスコには、規定容量の最大1/
10を充填）。この培養物を37℃でインキユベートした。
動下に行なつた（このフラスコには、規定容量の最大1/
10を充填）。この培養物を37℃でインキユベートした。
２）培地:TGYEP（pH6.5;グルコース0.4％）（Begg等197
7）。
7）。
３）使用株のプラスミド−DNAによる形質転換は、標準
法（Maniatis1982）により行なつた。
法（Maniatis1982）により行なつた。
４）pfl−酵素活性の測定は、Conradt等による方法（19
84）で行なつた。
84）で行なつた。
５）クレアチナーゼ−酵素活性の測定は、 Schmittの方法（1984）で行なつた。特異活性（U/蛋白
質mg）で表示。
質mg）で表示。
６）β−ガラクトシダーゼ−酵素活性の測定は、Miller
の方法（1972）で行なつた。活性はミラー単位で示す。
の方法（1972）で行なつた。活性はミラー単位で示す。
７）染色体中へのpfl−lacZ−融合の組込みは、Simmons
等による方法（1987）により行なつた。株RM102（fnr
−、DSM5311）から出発し、次の形質転換体を得た:RM13
5、RM136、RM409、RM415、RM412。株FM420（fnr＋、DSM
5312）から出発して、次の形質転換体を得た:RM123、RM
124、RM401、RM404、RM407。
等による方法（1987）により行なつた。株RM102（fnr
−、DSM5311）から出発し、次の形質転換体を得た:RM13
5、RM136、RM409、RM415、RM412。株FM420（fnr＋、DSM
5312）から出発して、次の形質転換体を得た:RM123、RM
124、RM401、RM404、RM407。
出発ベクター:1）M13mp18（Yanisch−Perron等1985）。
２）M13k11RX（Waye等1985）。
３）pBT2a−１（DSM3148p） ４）p29（Christiansen＆Pedersen,1981、DSM5380）。
クレアチナーゼ−構造遺伝子へのプロモーターの融合
は、M13−構造体の１本鎖DNAの所での所望の欠失突然変
異誘発により行なつた。これは、pfl−フラグメント
（構造遺伝子の調節配列及び開始）、突然変異誘発のた
めの選択マーカー（Ecok−カセツト：連続的に、E.コリ
ーからの制限系に関する認識配列４回を有する）及びク
レアチナーゼ−遺伝子のフラグメント（５′−非翻訳配
列の１部を有する構造遺伝子の開始）を含有する。
は、M13−構造体の１本鎖DNAの所での所望の欠失突然変
異誘発により行なつた。これは、pfl−フラグメント
（構造遺伝子の調節配列及び開始）、突然変異誘発のた
めの選択マーカー（Ecok−カセツト：連続的に、E.コリ
ーからの制限系に関する認識配列４回を有する）及びク
レアチナーゼ−遺伝子のフラグメント（５′−非翻訳配
列の１部を有する構造遺伝子の開始）を含有する。
pfl−lacZ−融合（例８〜12）のために、プラスミドp
29（Christiansen＆Pedersen,1981、DSM5380）、pRS551
（DSM5382）、pRS552（DSM5381）（Simons等1989）を使
用した。
29（Christiansen＆Pedersen,1981、DSM5380）、pRS551
（DSM5382）、pRS552（DSM5381）（Simons等1989）を使
用した。
例１ M13mp18中のEcok−カセツト及びクレアチナーゼ−フ
ラグメントのクローニング欠失突然変異誘発の準備のた
めに、個々の成分をM13mp18中でクローニングした。第
１工程で、Ecok−カセツト及びクレアチナーゼ−フラグ
メントをXbaI/SphI−切断ベクター中に挿入した。このE
cok−カセツトを90bpXbaI/BamHI−フラグメントとしてM
13K11RXから単離した（Waye等、1985）。クレアチナー
ゼ−フラグメントを580bp XhoII/SphI−フラグメントと
してpBT2a−１から単離した。これは、構造遺伝子の最
初の460ヌクレオチド及び５′−非翻訳配列のヌクレオ
チド120を含有する。XhoII−切断位置の５′−突出末端
は、BamHI−切断位置の突出末端（Ecok−カセツト）と
相容性である。Ecok−カセツト、クレアチナーゼフラグ
メント及びベクターを一緒にし、相応する切断位置上に
連結させた（第２図）。E.コリーRR1dM15（rk−、mk−;
ATCC35102）を移入した。得られた構成体をM13ecと称し
た。
ラグメントのクローニング欠失突然変異誘発の準備のた
めに、個々の成分をM13mp18中でクローニングした。第
１工程で、Ecok−カセツト及びクレアチナーゼ−フラグ
メントをXbaI/SphI−切断ベクター中に挿入した。このE
cok−カセツトを90bpXbaI/BamHI−フラグメントとしてM
13K11RXから単離した（Waye等、1985）。クレアチナー
ゼ−フラグメントを580bp XhoII/SphI−フラグメントと
してpBT2a−１から単離した。これは、構造遺伝子の最
初の460ヌクレオチド及び５′−非翻訳配列のヌクレオ
チド120を含有する。XhoII−切断位置の５′−突出末端
は、BamHI−切断位置の突出末端（Ecok−カセツト）と
相容性である。Ecok−カセツト、クレアチナーゼフラグ
メント及びベクターを一緒にし、相応する切断位置上に
連結させた（第２図）。E.コリーRR1dM15（rk−、mk−;
ATCC35102）を移入した。得られた構成体をM13ecと称し
た。
例２ M13ec内でのpfl−プロモーターフラグメントのクロー
ニング pfl−遺伝子のプロモーター範囲を1786bp MluI/BamHI
−フラグメントとしてプラスミドp29から単離した（pfl
−配列:pfl−構造遺伝子の第１ヌクレオチド、第10図の
ATGのＡに対して相対的に＋390〜−1396）。p29をMluI
で切断し、５′−突出末端に全ての4dNTP′Ｓの存在でT
7−ポリメラーゼを充填し、BamHIで後切断した。ベクタ
ーM13ecをまずAvaIIで切断し、突出末端を同様に充填
し、次いでBamHIで後切断した。単離されたpfl−フラグ
メントを、調整してM13ec内に挿入し、得られた構成体
をM13pec23と称する（第２図）。E.コリーRR1dM15（rk
−、mk−;ATCC35102）を移入した。M13pec23中のクレア
チナーゼ−フラグメントの配向はpfl−プロモーターの
転写方向に一致する。
ニング pfl−遺伝子のプロモーター範囲を1786bp MluI/BamHI
−フラグメントとしてプラスミドp29から単離した（pfl
−配列:pfl−構造遺伝子の第１ヌクレオチド、第10図の
ATGのＡに対して相対的に＋390〜−1396）。p29をMluI
で切断し、５′−突出末端に全ての4dNTP′Ｓの存在でT
7−ポリメラーゼを充填し、BamHIで後切断した。ベクタ
ーM13ecをまずAvaIIで切断し、突出末端を同様に充填
し、次いでBamHIで後切断した。単離されたpfl−フラグ
メントを、調整してM13ec内に挿入し、得られた構成体
をM13pec23と称する（第２図）。E.コリーRR1dM15（rk
−、mk−;ATCC35102）を移入した。M13pec23中のクレア
チナーゼ−フラグメントの配向はpfl−プロモーターの
転写方向に一致する。
例３ 欠失突然変異誘発 クレアチナーゼ−構造遺伝子をプロモーターに融合す
るために、オリゴヌクレオチドを用いて、２欠失突然変
異誘発を実施した（Waye等の方法1085と同様に）。各々
翻訳融合体（開始コドンの下流でpfl−構造遺伝子をク
レアチナーゼ−構造遺伝子で代える）及び転写融合体
（クレアチナーゼ−遺伝子とシヤイン−ダルガルノ−配
列（SD−配列）とのプロモーターの所での融合）を製造
した。
るために、オリゴヌクレオチドを用いて、２欠失突然変
異誘発を実施した（Waye等の方法1085と同様に）。各々
翻訳融合体（開始コドンの下流でpfl−構造遺伝子をク
レアチナーゼ−構造遺伝子で代える）及び転写融合体
（クレアチナーゼ−遺伝子とシヤイン−ダルガルノ−配
列（SD−配列）とのプロモーターの所での融合）を製造
した。
これらをM13pc23A及びM13pc23Sと称した（第１表参
照）。
照）。
突然変異誘発の実施（第３図参照） ａ）M13−Plus−ストランドの所での突然変異オリゴヌ
クレオチドのハイブリド形成。融合点の間で欠失すべき
DNA−配列は対合しないままである。
クレオチドのハイブリド形成。融合点の間で欠失すべき
DNA−配列は対合しないままである。
ｂ）M13−１本鎖−DNAの残りをクレノフ及びdNTP′ｓを
充填して２本鎖にする。
充填して２本鎖にする。
ｃ）変異しなかつた親ストランドに対する選択を、生体
内で、E.コリーJM83（rk＋、mk＋;ATCC35607）内形質転
換後に行なう。
内で、E.コリーJM83（rk＋、mk＋;ATCC35607）内形質転
換後に行なう。
例４ orf−遺伝子内での所望の突然変異誘発 後の表現ベクター（高コピープラスミド）中での遺伝
子適用作用によるorf−遺伝子生成物の過表現を避ける
ために、クンケルによる所望の突然変異誘発（Kunkel;1
985,Kunkel等、1987）によりorf−遺伝子の読み取り範
囲内に２個の配列性停止コドンを導入した。
子適用作用によるorf−遺伝子生成物の過表現を避ける
ために、クンケルによる所望の突然変異誘発（Kunkel;1
985,Kunkel等、1987）によりorf−遺伝子の読み取り範
囲内に２個の配列性停止コドンを導入した。
塩基交換を、構成体M13pc23SのPlus−ストランド−DN
Aの所で突然変異オルゴヌクレオチドを用いて実施し
た。交換された塩基及びそれらの位置は、次の図から知
ることができる： 中段のストランドは、M13pc23SのPlus−ストランド内
の配列（５′−−＞３′）に、下段のそれ（３′−−＞
５′）は、突然変異オリゴヌクレオチドのそれに相応す
る。上段のストランドは、突然変異誘発後の配列に相応
する；交換された塩基は２重点（：）で示されている。
pfl−構造遺伝子に対する−570の位置に星印を付した。
Aの所で突然変異オルゴヌクレオチドを用いて実施し
た。交換された塩基及びそれらの位置は、次の図から知
ることができる： 中段のストランドは、M13pc23SのPlus−ストランド内
の配列（５′−−＞３′）に、下段のそれ（３′−−＞
５′）は、突然変異オリゴヌクレオチドのそれに相応す
る。上段のストランドは、突然変異誘発後の配列に相応
する；交換された塩基は２重点（：）で示されている。
pfl−構造遺伝子に対する−570の位置に星印を付した。
構成体M13pc23Aの所では、突然変異誘発は実施されな
かつた。ここで、完全orf−遺伝子を含めて、pfl−プロ
モーター範囲を切断位置AvaI及びHindIIを介して除去
し、M13pc23Sのorf−突然変異体からの相応するセグメ
ントで置換した。
かつた。ここで、完全orf−遺伝子を含めて、pfl−プロ
モーター範囲を切断位置AvaI及びHindIIを介して除去
し、M13pc23Sのorf−突然変異体からの相応するセグメ
ントで置換した。
例５ プロモーター不含のクレアチナーゼ−プラスミドpGH
−Ｃの構成 出発ベクター:1）pBTac1（Boehringer Mannheim GmbH,
製造No.1081 365） ２）pBT2a−１ この表現ベクター製造用の基本ベクターとしてpGH−
Ｃを用いる。このプラスミドは完全クレアチナーゼ−構
造遺伝子及び末端配列を有し;pGH−Ｃ中のM13−誘導体
からの融合体のクローニング変換により、表現カセツト
を完全にすることができる。
−Ｃの構成 出発ベクター:1）pBTac1（Boehringer Mannheim GmbH,
製造No.1081 365） ２）pBT2a−１ この表現ベクター製造用の基本ベクターとしてpGH−
Ｃを用いる。このプラスミドは完全クレアチナーゼ−構
造遺伝子及び末端配列を有し;pGH−Ｃ中のM13−誘導体
からの融合体のクローニング変換により、表現カセツト
を完全にすることができる。
ａ）pBTac1からのtac−プロモーターの除去 pBTac1からtac−プロモーターを除去するために、こ
のプラスミドをEcoRIで切断し、５′−突出末端にT7−
ポリメラーゼを充填した。引続き、PvuIIを用いて切断
し、ベクター部分を単離した。平滑末端の連結によりEc
oRI−切断位置を再生させる。得られる構成体をpBTdtac
と称した。
のプラスミドをEcoRIで切断し、５′−突出末端にT7−
ポリメラーゼを充填した。引続き、PvuIIを用いて切断
し、ベクター部分を単離した。平滑末端の連結によりEc
oRI−切断位置を再生させる。得られる構成体をpBTdtac
と称した。
ｂ）pBTdtac内へのクレアチナーゼ遺伝子の挿入 pBT2a−１からクレアチナーゼ遺伝子を単離した。こ
のプラスミドをAvaIで切断し、クレアチナーゼ−遺伝子
を有するこのフラグメント（約1600bp）を単離した。突
出末端を充填させ、BamHI−リンカー（BM）を備えた。
このフラグメントをpBTdtacのBamHI−切断位置内に挿入
した。得られた構成体をpGH−Ｃと称した。
のプラスミドをAvaIで切断し、クレアチナーゼ−遺伝子
を有するこのフラグメント（約1600bp）を単離した。突
出末端を充填させ、BamHI−リンカー（BM）を備えた。
このフラグメントをpBTdtacのBamHI−切断位置内に挿入
した。得られた構成体をpGH−Ｃと称した。
例６ pGH−Ｃ内でのM13からの融合の再クローニング（Umkl
onierung） M13pc23S及びM13pc23Aからの融合フラグメントを切断
部位StuI及びMluI上で単離させた。このプラスミドpGH
−ＣをSmaI及びMluIを用いて切断し、ベクター部分を単
離した。この融合フラグメントを、クレアチナーゼ−遺
伝子の配向のpfl−プロモーターによる転写方向に一致
する方向でベクター中に挿入した（第５図）。
onierung） M13pc23S及びM13pc23Aからの融合フラグメントを切断
部位StuI及びMluI上で単離させた。このプラスミドpGH
−ＣをSmaI及びMluIを用いて切断し、ベクター部分を単
離した。この融合フラグメントを、クレアチナーゼ−遺
伝子の配向のpfl−プロモーターによる転写方向に一致
する方向でベクター中に挿入した（第５図）。
これらの表現プラスミドを、M13−構成に相応して、p
FL23S−Ｃ及びpPFL23A−Ｃと称した。
FL23S−Ｃ及びpPFL23A−Ｃと称した。
これらのベクターはpfl−プロモーター範囲の次の配
分を有する： pPFL23A Pos. −１〜−1364 pPFL23S Pos.−12〜−1364 例７ 表現ベクターpPFL39−Ｃの構成 このプラスミド中には、短縮された５′−位のプロモ
ーターエレメントのみが含有されている（プロモーター
６及び７、fnr−ボツクス１及び２、第１図）。このエ
レメントはp29からの577bpMluI/AflII−フラグメントに
相当し、pfl−開始コドン（ATGのＡ＝＋１）に対して−
819〜1396の位置のpfl−配列を有する。このフラグメン
トをEcoRI−切断部位の上でプラスミドpRM39（例10）か
ら単離し、プラスミドpGH−ＣのEcoRI−部位内に挿入し
た。得られた構成体をpFL−39Cと称した。
分を有する： pPFL23A Pos. −１〜−1364 pPFL23S Pos.−12〜−1364 例７ 表現ベクターpPFL39−Ｃの構成 このプラスミド中には、短縮された５′−位のプロモ
ーターエレメントのみが含有されている（プロモーター
６及び７、fnr−ボツクス１及び２、第１図）。このエ
レメントはp29からの577bpMluI/AflII−フラグメントに
相当し、pfl−開始コドン（ATGのＡ＝＋１）に対して−
819〜1396の位置のpfl−配列を有する。このフラグメン
トをEcoRI−切断部位の上でプラスミドpRM39（例10）か
ら単離し、プラスミドpGH−ＣのEcoRI−部位内に挿入し
た。得られた構成体をpFL−39Cと称した。
例８ pRM23の構成 完全プロモーターフラグメントとlacZ−遺伝子との翻
訳的結合。
訳的結合。
プロモーターフラグメントの単離のために、p29をMlu
Iで切断し、突出末端を全ての4dNTP′ｓの存在下にクレ
ノフで充填させた。引続き、BamHI−リンカー（８−me
r）を連結させ、BamHIで切断した。1791bp−フラグメン
ト（BamHI−リンカーを包含）を単離させ、pRS552のBam
HI−切断部位内に挿入した（第８図）。このpfl−フラ
グメントは、塩基−1396〜＋390（pfl−構造遺伝子の第
１ヌクレオチドに相対的に）より成り、プロモーター１
〜７及びfnr−ボツクス１及び２を有する。
Iで切断し、突出末端を全ての4dNTP′ｓの存在下にクレ
ノフで充填させた。引続き、BamHI−リンカー（８−me
r）を連結させ、BamHIで切断した。1791bp−フラグメン
ト（BamHI−リンカーを包含）を単離させ、pRS552のBam
HI−切断部位内に挿入した（第８図）。このpfl−フラ
グメントは、塩基−1396〜＋390（pfl−構造遺伝子の第
１ヌクレオチドに相対的に）より成り、プロモーター１
〜７及びfnr−ボツクス１及び２を有する。
例９ pRM24の構成 短縮されたプロモーターフラグメントとlacZ−遺伝子
との翻訳的結合。
との翻訳的結合。
プロモーターエレメントを切断部位SspI及びBamHI上
でp29から単離し、切断部位SmaI及びBamHI上でpRS552内
に挿入した。このpfl−フラグメントは塩基−1045〜＋3
90（pfl−開始コドンに相対的に）から成り、プロモー
ター１〜７及びfnr−ボツクス２を有する。
でp29から単離し、切断部位SmaI及びBamHI上でpRS552内
に挿入した。このpfl−フラグメントは塩基−1045〜＋3
90（pfl−開始コドンに相対的に）から成り、プロモー
ター１〜７及びfnr−ボツクス２を有する。
例10 pRM39の構成 短縮された５′−側プロモーターフラグメントとlacZ
−遺伝子との転写結合。
−遺伝子との転写結合。
このプロモーターエレメントを切断位置MluI及びAfII
I上でp29から単離し、EcoRI−リンカー（10−mer）を与
え、pRS551のEcoRI−切断位置内に挿入した。このpfl−
フラグメントは、塩基−819〜−1396（pfl−構造遺伝子
の第１ヌクレオチドに相対的に）から成り、プロモータ
ー６及び７及びfur−ボツクス１及び２を有する。
I上でp29から単離し、EcoRI−リンカー（10−mer）を与
え、pRS551のEcoRI−切断位置内に挿入した。このpfl−
フラグメントは、塩基−819〜−1396（pfl−構造遺伝子
の第１ヌクレオチドに相対的に）から成り、プロモータ
ー６及び７及びfur−ボツクス１及び２を有する。
例11 pRM43の構成 短縮された５′−側プロモーターフラグメントとlacZ
−遺伝子との転写結合。
−遺伝子との転写結合。
プロモーターエレメントを切断位置MluI及びDraI上で
p29から単離し、EcoRI−リンカー（10−mer）を与え、p
RS551のEcoRI−切断位置に挿入した。
p29から単離し、EcoRI−リンカー（10−mer）を与え、p
RS551のEcoRI−切断位置に挿入した。
このpfl−フラグメントは塩基−1075〜−1396（pfl−
構造遺伝子の第１ヌクレオチドに対して相対的に）より
成り、プロモーター７及びfnr−ボツクス２を有する。
構造遺伝子の第１ヌクレオチドに対して相対的に）より
成り、プロモーター７及びfnr−ボツクス２を有する。
例12 pRM46の構成 短縮されたpfl−フラグメントとlacZ−遺伝子との転
写結合。
写結合。
p29から切断位置NlaIII及びBglI上でプロモーターエ
レメントを単離し、EcoRI−リンカーを与え、pRS551のE
coRI−切断位置内に挿入した。このpfl−フラグメント
は、塩基−861〜−1016（このpfl−構造遺伝子の第１ヌ
クレオチドに対して相対的）から成り、プロモーター６
及びfur−ボツクス１を含有する。
レメントを単離し、EcoRI−リンカーを与え、pRS551のE
coRI−切断位置内に挿入した。このpfl−フラグメント
は、塩基−861〜−1016（このpfl−構造遺伝子の第１ヌ
クレオチドに対して相対的）から成り、プロモーター６
及びfur−ボツクス１を含有する。
例13 完全プロモーターフラグメント（プロモーター１〜
７）、fur−ボツクス１及び２）によるピルベート−ホ
ルミエート−リアーゼの表現：相同表現。
７）、fur−ボツクス１及び２）によるピルベート−ホ
ルミエート−リアーゼの表現：相同表現。
嫌気性条件下での全細胞蛋白質の所でピルベート−ホ
ルミエート−リアーゼ分を付与する。測定は、生じたピ
ルベート−ホルミエート−リアーセの特異活性の測定を
介して行なつた。
ルミエート−リアーゼ分を付与する。測定は、生じたピ
ルベート−ホルミエート−リアーセの特異活性の測定を
介して行なつた。
例14 完全プロモーターフラグメントによるピルベートホル
ミエート−リアーゼ−β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白
質の表現（MluI−BamHI、プロモーター１〜７、fnr−ボ
ツクス１及び２）： 翻訳融合。
ミエート−リアーゼ−β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白
質の表現（MluI−BamHI、プロモーター１〜７、fnr−ボ
ツクス１及び２）： 翻訳融合。
例15 短縮されたプロモーターフラグメント（SspI−BamH
I、プロモーター１〜６、fur−ボツクス１）によるピル
ベート−ホルミエート−β−ガラクトシダーゼ−融合蛋
白質の表現： 翻訳結合。
I、プロモーター１〜６、fur−ボツクス１）によるピル
ベート−ホルミエート−β−ガラクトシダーゼ−融合蛋
白質の表現： 翻訳結合。
例16 短縮されたプロモーターフラグメントによるｂ−ガラ
クトシダーゼ−蛋白質の表現（MluI−AflII、プロモー
ター６〜７、fur−ボツクス１及び２）： 転写結合。
クトシダーゼ−蛋白質の表現（MluI−AflII、プロモー
ター６〜７、fur−ボツクス１及び２）： 転写結合。
例17 短縮されたプロモーターフラグメント（MluI−DraI、
プロモーター７、fur−ボツクス２）によるβ−ガラク
トシダーゼ−蛋白質の表現： 転写結合。
プロモーター７、fur−ボツクス２）によるβ−ガラク
トシダーゼ−蛋白質の表現： 転写結合。
例18 短縮されたプロモーターフラグメント（NlaIII−BglI
I、プロモーター６、fur−ボツクス１）によるβ−ガラ
クトシダーゼ−蛋白質の表現： 転写結合。
I、プロモーター６、fur−ボツクス１）によるβ−ガラ
クトシダーゼ−蛋白質の表現： 転写結合。
例19 完全プロモーターフラグメント（プロモーター１〜
７、fur−ボツクス１及び２）によるクレアチナーゼ−
蛋白質の表現：転写結合（クレアチナーゼ遺伝子の翻訳
開始領域）。
７、fur−ボツクス１及び２）によるクレアチナーゼ−
蛋白質の表現：転写結合（クレアチナーゼ遺伝子の翻訳
開始領域）。
FM420（pPFL23S−Ｃ）の醗酵： 第９図に醗酵法の過程におけるクレアチナーゼ−表現の
経過を示す（容量−活性：単位/ml）。
経過を示す（容量−活性：単位/ml）。
醗酵装置:BiofloII（New Brunswick,5l−醗酵槽） 充填容量:4l 培地 ：K2HPO4（3H2O）:8g/l;KH2PO4:2g/l;ペプト
ン:10g/l;酵母エキス（ohly kav）:32.4g/l;MgSO4（1
M）:4ml/l;グルコース:0.4％。温度:32℃ pH:7.2（一定） 攪拌速度（300upm）及び通気速度（4l/min）を全工程
の間一定に保持した。
ン:10g/l;酵母エキス（ohly kav）:32.4g/l;MgSO4（1
M）:4ml/l;グルコース:0.4％。温度:32℃ pH:7.2（一定） 攪拌速度（300upm）及び通気速度（4l/min）を全工程
の間一定に保持した。
書き込み記号の意味： −生長曲線（OD600としての細胞密度） −クレアチナーゼ−表現（U/ml） −培地の溶解酸素含分（DO＝溶解酸素％） この曲線から次のことが判る： −DO−値は細胞密度の増加に伴ない低下する。
−酸素制限条件（DO−値＝０）により、生長状態に負の
影響はない。
影響はない。
−低いDO値でクレアチナーゼ−表現の誘導。
例20 pfl−遺伝子の翻訳開始領域を有する完全プロモータ
ーフラグメント（プロモーター１〜７、fur−ボツクス
１及び２）によるクレアチナーゼ−蛋白質の表現（翻訳
結合）。
ーフラグメント（プロモーター１〜７、fur−ボツクス
１及び２）によるクレアチナーゼ−蛋白質の表現（翻訳
結合）。
定常生長相の細胞を収穫した。
例21 クレアチナーゼ遺伝子の翻訳開始領域を有する短縮さ
れたプロモーターフラグメント（プロモーター６及び
７、fur−ボツクス１及び２）によるクレアチナーゼ−
蛋白質の表現（翻訳結合）。
れたプロモーターフラグメント（プロモーター６及び
７、fur−ボツクス１及び２）によるクレアチナーゼ−
蛋白質の表現（翻訳結合）。
第1A図はプラスミドp29からの切片を示す図、第1B図は
プラスミドp29からの制限酵素の重要な切断部位が記入
されている切片を示す図、第２図はM13−誘導体M13pec2
3の構成を示す図、第３図は、pfl−プロモーターにクレ
アチナーゼ遺伝子を結合するための欠失突然変異誘発を
図式的に示す図、第４図はプラスミドpPFL23S−Ｃ、pPF
L23A−Ｃ及びpPFL39−Ｃからの切片のpfl−クレアチナ
ーゼ−融合を示す図、第５図は、M13pc23Sの例でのM13
からのpfl−クレアチナーゼ−融合体のプラスミドpGH−
Ｃ中への再クローニングを示す図、第6A図は、pBTacIの
プラスミド地図、第6B図はpBT2a−１のプラスミド切
図、第6C図はpBTdtacのプラスミド地図、第6D図は、pGH
−４のプラスミド地図、第7A図は、pRS552のプラスミド
地図、第7B図はpBS551のプラスミド地図、第８図は、完
全なpfl−プロモーターフラグメントをlacZに翻訳連結
するプラスミドpRM23の構成を示す図、第９図は、FM420
（pPFL23S−Ｃ）の生長経過（logOD600としての細胞密
度）、酵素不足とクレアチナーゼ−遺伝子の表現（容量
活性:logU/ml）との関係及び生長経過における溶存酸素
含分（DO:％）を示す曲線図、第10図は、pfl−プロモー
ター領域の配列を示す図、第11図はプロモーター領域１
〜７の配列を示す図である。
プラスミドp29からの制限酵素の重要な切断部位が記入
されている切片を示す図、第２図はM13−誘導体M13pec2
3の構成を示す図、第３図は、pfl−プロモーターにクレ
アチナーゼ遺伝子を結合するための欠失突然変異誘発を
図式的に示す図、第４図はプラスミドpPFL23S−Ｃ、pPF
L23A−Ｃ及びpPFL39−Ｃからの切片のpfl−クレアチナ
ーゼ−融合を示す図、第５図は、M13pc23Sの例でのM13
からのpfl−クレアチナーゼ−融合体のプラスミドpGH−
Ｃ中への再クローニングを示す図、第6A図は、pBTacIの
プラスミド地図、第6B図はpBT2a−１のプラスミド切
図、第6C図はpBTdtacのプラスミド地図、第6D図は、pGH
−４のプラスミド地図、第7A図は、pRS552のプラスミド
地図、第7B図はpBS551のプラスミド地図、第８図は、完
全なpfl−プロモーターフラグメントをlacZに翻訳連結
するプラスミドpRM23の構成を示す図、第９図は、FM420
（pPFL23S−Ｃ）の生長経過（logOD600としての細胞密
度）、酵素不足とクレアチナーゼ−遺伝子の表現（容量
活性:logU/ml）との関係及び生長経過における溶存酸素
含分（DO:％）を示す曲線図、第10図は、pfl−プロモー
ター領域の配列を示す図、第11図はプロモーター領域１
〜７の配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローベルト・ガリイ・ザヴエルス ドイツ連邦共和国ミユンヘン19・フアザ ネリー シユトラーセ 13 (72)発明者 ミヒアエル・ヤルシユ ドイツ連邦共和国バート・ハイルブル ン・ウンターカプフゼー 11 (72)発明者 ローラント・ヘルプスト ドイツ連邦共和国ミユンヘン40・ヒルテ ンシユ ペルガーシユトラーセ 65 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，1988 （170）Ｐ．5330−5336
Claims (5)
- 【請求項１】pf1−プロモーター領域の配列： の−861〜−1016塩基対及び／又は−1075〜−1396塩基
対をレギュレーター領域として含み、このレギュレータ
ー配列の３′−方向に−35/−10プロモーター配列を有
するプロモーター領域少なくとも１個を有し、このレギ
ュレーター領域およびプロモーター領域がPf1−遺伝子
ではない１個の構造遺伝子の発現を制御しうるように該
遺伝子に結合していることを特徴とする、組換えDNA。 - 【請求項２】請求項１に記載の組換えDNAを適当なベク
ター分子内に連結導入して含有する、発現ベクター。 - 【請求項３】pf1−遺伝子を含有する微生物の遺伝子バ
ンクから、その上流領域を有するものを単離し、pf1−
遺伝子の上流の−861〜−1016塩基対又は−1075〜−139
6塩基対を自体公知の方法で入手し、所望の他の配列お
よびプロモーターと結合させることを特徴とする、請求
項１に記載の組換えDNAの製法。 - 【請求項４】単離された組換えDAN−配列を、場合によ
りポリリンカー、シャイン−ダルガルノ配列、スタート
コドン及び／又は場合により他の配列と共に適当なベク
ター中に挿入することを特徴とする、請求項２記載の発
現ベクターの製法。 - 【請求項５】請求項１記載の組換えDNA又は請求項２記
載の発現ベクターを用い、誘導を嫌気性条件でかつピル
ベートにより、そして抑制を酸素により行うことを特徴
とする、フラグメントの誘導可能で抑制可能な発現法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3913201.3 | 1989-04-21 | ||
| DE3913201 | 1989-04-21 | ||
| DE3926076.3 | 1989-08-07 | ||
| DE3926076A DE3926076A1 (de) | 1989-04-21 | 1989-08-07 | Rekombinante dna und expressionsvektor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0380088A JPH0380088A (ja) | 1991-04-04 |
| JP2774989B2 true JP2774989B2 (ja) | 1998-07-09 |
Family
ID=25880155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2103227A Expired - Lifetime JP2774989B2 (ja) | 1989-04-21 | 1990-04-20 | 組換えｄｎａ、その製法、表現ベクター、その製法及びフラグメントの誘導可能で抑制可能な表現法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0393684B1 (ja) |
| JP (1) | JP2774989B2 (ja) |
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| DE (2) | DE3926076A1 (ja) |
| DK (1) | DK0393684T3 (ja) |
| ES (1) | ES2104568T3 (ja) |
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| WO1992015689A1 (en) * | 1991-03-05 | 1992-09-17 | The Wellcome Foundation Limited | Expression of recombinant proteins in attenuated bacteria |
| DE4136389A1 (de) * | 1991-03-18 | 1992-10-08 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von glutarylacylase in grossen mengen |
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|---|---|---|---|---|
| DE3735381A1 (de) * | 1987-03-31 | 1989-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen |
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- 1989-08-07 DE DE3926076A patent/DE3926076A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-04-19 DK DK90107465.8T patent/DK0393684T3/da active
- 1990-04-19 ES ES90107465T patent/ES2104568T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-19 EP EP90107465A patent/EP0393684B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-19 DE DE59010726T patent/DE59010726D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-19 AT AT90107465T patent/ATE154639T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-20 CA CA002015046A patent/CA2015046C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-20 JP JP2103227A patent/JP2774989B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８８（１７０）Ｐ．５３３０−５３３６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE154639T1 (de) | 1997-07-15 |
| CA2015046A1 (en) | 1990-10-21 |
| DK0393684T3 (da) | 1998-01-26 |
| DE59010726D1 (de) | 1997-07-24 |
| ES2104568T3 (es) | 1997-10-16 |
| JPH0380088A (ja) | 1991-04-04 |
| EP0393684A1 (de) | 1990-10-24 |
| CA2015046C (en) | 2003-09-16 |
| DE3926076A1 (de) | 1990-10-25 |
| EP0393684B1 (de) | 1997-06-18 |
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