JP2619077B2 - 組み換え遺伝子の発現法、発現ベクター及び発現補助ベクター - Google Patents
組み換え遺伝子の発現法、発現ベクター及び発現補助ベクターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アルギニンのAGAコドン及び／又はAGGコド
ンを含む組み換え遺伝子を含有する発現ベクターで形質
転換することにより、E.コリ中で該組み換え遺伝子を発
現させる方法に関する。
ンを含む組み換え遺伝子を含有する発現ベクターで形質
転換することにより、E.コリ中で該組み換え遺伝子を発
現させる方法に関する。
従来の技術 蛋白質又は蛋白質含有遺伝子産物の遺伝子工学的製造
は現代のバイオテクノロジーの主要目的の１つである。
とりわけ原核生物は発酵性が簡単であるため多量の蛋白
質の製造に好適であるので、真核生物の遺伝子を原核生
物中で発現することもたびたび試みられた。しかしその
際に、しばしば真核生物の蛋白質は原核生物の細胞中で
は僅少量でしか製造されずかつ細胞は蛋白質の生産量を
高める際に発酵／成長の困難を示すという点で困難さが
生じる。
は現代のバイオテクノロジーの主要目的の１つである。
とりわけ原核生物は発酵性が簡単であるため多量の蛋白
質の製造に好適であるので、真核生物の遺伝子を原核生
物中で発現することもたびたび試みられた。しかしその
際に、しばしば真核生物の蛋白質は原核生物の細胞中で
は僅少量でしか製造されずかつ細胞は蛋白質の生産量を
高める際に発酵／成長の困難を示すという点で困難さが
生じる。
とりわけ、発現させる際のこのような問題は組織型プ
ラスミノーゲン活性因子（ｔ−PA）で認められる。この
蛋白質の製造については、この蛋白質が臨床実験で梗塞
疾患の治療に好適であるので努力する価値がある。E.コ
リ細胞はプラスミド又はベクターに導入されたｔ−PA−
cDNAを十分な量で発現しかつｔ−PAを産生することがで
きるが、この細胞はバイオマスを形成する際に発酵中に
著しく衰退し、それ故全体的にｔ−PAの製造は、各細胞
の製造から出発する場合に予測できる水準には達しな
い。また、E.コリ細胞中でプラスミド安定性が低く、か
つコード付けプラスミドの損失により生産率は更に低下
する。それ故、従来は全細胞蛋白質の約５％のｔ−PAの
発現を達成し得た〔Rothstein及びBextonis共著、“Gen
e"、61巻、41〜50頁（1987年）〕。
ラスミノーゲン活性因子（ｔ−PA）で認められる。この
蛋白質の製造については、この蛋白質が臨床実験で梗塞
疾患の治療に好適であるので努力する価値がある。E.コ
リ細胞はプラスミド又はベクターに導入されたｔ−PA−
cDNAを十分な量で発現しかつｔ−PAを産生することがで
きるが、この細胞はバイオマスを形成する際に発酵中に
著しく衰退し、それ故全体的にｔ−PAの製造は、各細胞
の製造から出発する場合に予測できる水準には達しな
い。また、E.コリ細胞中でプラスミド安定性が低く、か
つコード付けプラスミドの損失により生産率は更に低下
する。それ故、従来は全細胞蛋白質の約５％のｔ−PAの
発現を達成し得た〔Rothstein及びBextonis共著、“Gen
e"、61巻、41〜50頁（1987年）〕。
発明が解決しようとする課題 本発明は、発現の際に従来公知の方法では宿主細胞の
成長が明らかに悪化しかつプラスミドが不安定になる組
み換え遺伝子を、高収率で発現させることのできる方法
を開示するという課題をベースとする。
成長が明らかに悪化しかつプラスミドが不安定になる組
み換え遺伝子を、高収率で発現させることのできる方法
を開示するという課題をベースとする。
課題を解決するための手段 本発明によりこの課題は、アルギニンのAGA−及び／
又はAGGコドンを含有する組み換え遺伝子を含む発現ベ
クターで形質転換することにより、E.コリ中で前記組み
換え遺伝子を発現させるに当り、E.コリ細胞中に存在す
る、アルギニンを組み込みかつコドンAGG及びAGAを認識
するｔ−RNA量を、通常この細胞中で産生する量の少な
くとも５倍に高めることを特徴とする方法により解決さ
れる。
又はAGGコドンを含有する組み換え遺伝子を含む発現ベ
クターで形質転換することにより、E.コリ中で前記組み
換え遺伝子を発現させるに当り、E.コリ細胞中に存在す
る、アルギニンを組み込みかつコドンAGG及びAGAを認識
するｔ−RNA量を、通常この細胞中で産生する量の少な
くとも５倍に高めることを特徴とする方法により解決さ
れる。
この際に、本発明の範囲では、AGA/AGG−コドンを認
識しかつアルギニンを組み込むｔ−RNAとは、E.コリ中
で産成する相応する天然ｔ−RNAばかりでなく、前記の
特性を有する合成物、変異したもの又はサプレツサーｔ
−RNAも含む。
識しかつアルギニンを組み込むｔ−RNAとは、E.コリ中
で産成する相応する天然ｔ−RNAばかりでなく、前記の
特性を有する合成物、変異したもの又はサプレツサーｔ
−RNAも含む。
本発明方法により、従来は発現の際にE.コリ宿主細胞
の成長が悪いために所望の蛋白質が僅少収率でしか生成
されなかつた組み換え遺伝子を明らかに高められた量で
製造することができる。達成されたこの技術的効果は、
細胞中で蛋白質合成する際に本発明により使用するｔ−
RNAが不足している場合は、外来遺伝子の発現が不良な
はずであるということを前提とすべきであつたし、かつ
そうではなくて実際にそうであるように外来遺伝子は良
好に発現するが細胞の発育が悪いので予想外である。
の成長が悪いために所望の蛋白質が僅少収率でしか生成
されなかつた組み換え遺伝子を明らかに高められた量で
製造することができる。達成されたこの技術的効果は、
細胞中で蛋白質合成する際に本発明により使用するｔ−
RNAが不足している場合は、外来遺伝子の発現が不良な
はずであるということを前提とすべきであつたし、かつ
そうではなくて実際にそうであるように外来遺伝子は良
好に発現するが細胞の発育が悪いので予想外である。
本発明の優れた実施形では、E.コリ細胞中のAGA/AGG
−コドンを認識しかつアルギニンを組み込むｔ−RNA
（以下単にｔ−RNAとも記載する）の量を、このような
ｔ−RNAをコード付けする遺伝子少なくとも１個を細胞
中に導入することにより高める。殊に、これは染色体外
発現ベクター上のｔ−RNA遺伝子１個又は数個を細胞中
に導入することにより行なうことができる。
−コドンを認識しかつアルギニンを組み込むｔ−RNA
（以下単にｔ−RNAとも記載する）の量を、このような
ｔ−RNAをコード付けする遺伝子少なくとも１個を細胞
中に導入することにより高める。殊に、これは染色体外
発現ベクター上のｔ−RNA遺伝子１個又は数個を細胞中
に導入することにより行なうことができる。
E.コリ中でアルギニンを組み込みかつコドンAGA及びA
GGを認識する天然ｔ−RNAはdnaY遺伝子の産物であり、
これはガルシア及びその他共著（Garcia et al），
“セル（Cell）"45巻,453〜459頁（1986年）に記載され
た。この遺伝子の全配列は知られており、それは必須塩
基対118個を含有しかつこの遺伝子を導入することによ
りE.コリ中のｔ−RNAの量を高めるのに使用すると優れ
ている。しかしながら、アルギニンを組み込みかつAGA/
AGG−コドンを認識する合成の、変異した又はサプレツ
サーのｔ−RNAの遺伝子を細胞中に導入することもでき
る。フアージT4からのｔ−RNA遺伝子を使用することも
できる。
GGを認識する天然ｔ−RNAはdnaY遺伝子の産物であり、
これはガルシア及びその他共著（Garcia et al），
“セル（Cell）"45巻,453〜459頁（1986年）に記載され
た。この遺伝子の全配列は知られており、それは必須塩
基対118個を含有しかつこの遺伝子を導入することによ
りE.コリ中のｔ−RNAの量を高めるのに使用すると優れ
ている。しかしながら、アルギニンを組み込みかつAGA/
AGG−コドンを認識する合成の、変異した又はサプレツ
サーのｔ−RNAの遺伝子を細胞中に導入することもでき
る。フアージT4からのｔ−RNA遺伝子を使用することも
できる。
本発明の優れた実施形では同一の発現ベクター上の１
種又は数種のｔ−RNA遺伝子を真核生物の遺伝子と一緒
に細胞中に導入する。この際に、発現ベクターがハイコ
ピープラスミドである場合には、細胞内ｔ−RNA濃度の
十分な上昇が達成され、それ故真核遺伝子の発現の際に
宿主細胞に対するマイナスの作用は認められなかつた。
種又は数種のｔ−RNA遺伝子を真核生物の遺伝子と一緒
に細胞中に導入する。この際に、発現ベクターがハイコ
ピープラスミドである場合には、細胞内ｔ−RNA濃度の
十分な上昇が達成され、それ故真核遺伝子の発現の際に
宿主細胞に対するマイナスの作用は認められなかつた。
他の優れた実施形では、ｔ−RNA遺伝子及び真核生物
遺伝子を異なる発現ベクターに乗せてE.コリ細胞中に導
入する。E.コリ中で組み換え蛋白質を発現させる間にｔ
−RNA Arg（AGG/AGA）を供給することのプラスの作用
は、このｔ−RNAの遺伝子がその都度の発現ベクターの
シス位に存在していることには左右されないことであ
る。このｔ−RNAは第２のベクター上でコード付けされ
ていてもよい（トランス活性）。この付加ベクターはE.
コリ細胞中の発現ベクターと適合性でなければならず、
つまり発現プラスミドとは異なる複製開始点を有すべき
である。
遺伝子を異なる発現ベクターに乗せてE.コリ細胞中に導
入する。E.コリ中で組み換え蛋白質を発現させる間にｔ
−RNA Arg（AGG/AGA）を供給することのプラスの作用
は、このｔ−RNAの遺伝子がその都度の発現ベクターの
シス位に存在していることには左右されないことであ
る。このｔ−RNAは第２のベクター上でコード付けされ
ていてもよい（トランス活性）。この付加ベクターはE.
コリ細胞中の発現ベクターと適合性でなければならず、
つまり発現プラスミドとは異なる複製開始点を有すべき
である。
この際に、発現プラスミドよりも少ないプラスミドコ
ピー数のベクターを使用することもできるが、真核生物
遺伝子が乗つている発現ベクターよりも高いコピー数で
存在するベクターの使用により真核生物遺伝子よりも高
いｔ−RNA濃度を達成することもできる。ｔ−RNA遺伝子
及び真核生物遺伝子を同一の発現ベクター上に乗せる場
合、両方の遺伝子を異なるプロモータの制御下に使用す
ることも、また両方の遺伝子をオペロンの形で同じプロ
モータの制御下に使用することもできる。この場合に、
真核生物遺伝子とｔ−RNA遺伝子との間に終止コドンが
存在することだけは重要であり、それにより転写の際に
融合蛋白質は生成しない。
ピー数のベクターを使用することもできるが、真核生物
遺伝子が乗つている発現ベクターよりも高いコピー数で
存在するベクターの使用により真核生物遺伝子よりも高
いｔ−RNA濃度を達成することもできる。ｔ−RNA遺伝子
及び真核生物遺伝子を同一の発現ベクター上に乗せる場
合、両方の遺伝子を異なるプロモータの制御下に使用す
ることも、また両方の遺伝子をオペロンの形で同じプロ
モータの制御下に使用することもできる。この場合に、
真核生物遺伝子とｔ−RNA遺伝子との間に終止コドンが
存在することだけは重要であり、それにより転写の際に
融合蛋白質は生成しない。
本発明の他の優れた実施形では、１種又は数種のｔ−
RNA遺伝子を宿主細胞の染色体中に組み込む。この場
合、遺伝子が強力なプロモータの下で発現されるように
組込むことは特に優れている。このために、ｔ−RNA遺
伝子１種又は数種を強力なプロモータ（この制御下にｔ
−RNAは発現される）と同時に導入すると有利である。
RNA遺伝子を宿主細胞の染色体中に組み込む。この場
合、遺伝子が強力なプロモータの下で発現されるように
組込むことは特に優れている。このために、ｔ−RNA遺
伝子１種又は数種を強力なプロモータ（この制御下にｔ
−RNAは発現される）と同時に導入すると有利である。
ｔ−RNA遺伝子を染色体中に導入するに当り、この遺
伝子を発現ベクター中に導入するに当りかつ宿主細胞の
形質転換のために公知方法を適用する。染色体中に導入
するためには、トランスポゾン又はフアージの適用下に
かつ組み換え現象の利用下に適用すると有利である。
伝子を発現ベクター中に導入するに当りかつ宿主細胞の
形質転換のために公知方法を適用する。染色体中に導入
するためには、トランスポゾン又はフアージの適用下に
かつ組み換え現象の利用下に適用すると有利である。
細胞中のｔ−RNA量を高めるための他の優れた可能性
は、このｔ−RNAをコード付けする染色体遺伝子の天然
プロモータを、ｔ−RNAが多量に形成さえるように変化
させることである。このためには、全天然プロモータを
より強力な殊に誘導性及び／又は抑制性プロモータに代
えると特に優れている。この種のプロモータは当業者に
公知であり、この場合も殊にトランスポゾン又はフアー
ジの使用下に実施するプロモータ交換法も知られてい
る。
は、このｔ−RNAをコード付けする染色体遺伝子の天然
プロモータを、ｔ−RNAが多量に形成さえるように変化
させることである。このためには、全天然プロモータを
より強力な殊に誘導性及び／又は抑制性プロモータに代
えると特に優れている。この種のプロモータは当業者に
公知であり、この場合も殊にトランスポゾン又はフアー
ジの使用下に実施するプロモータ交換法も知られてい
る。
本発明の他の目的は、アルギニンのAGA−及び／又はA
GG−コドンを有する組み換え遺伝子を含有する発現ベク
ターを用いて形質転換することにより、E.コリ中で前記
組み換え遺伝子を発現させるための方法であり、これは
通常E.コリ中で産生する、コドンAGG及びAGAを認識しか
つアルギニンを形成するｔ−RNAの量の少なくとも５倍
量を含有するE.コリ菌株を選択しかつこの菌株を宿主細
胞として使用することを特徴とする。
GG−コドンを有する組み換え遺伝子を含有する発現ベク
ターを用いて形質転換することにより、E.コリ中で前記
組み換え遺伝子を発現させるための方法であり、これは
通常E.コリ中で産生する、コドンAGG及びAGAを認識しか
つアルギニンを形成するｔ−RNAの量の少なくとも５倍
量を含有するE.コリ菌株を選択しかつこの菌株を宿主細
胞として使用することを特徴とする。
たいていの場合従来公知の菌株は、アルギニンを組み
込みかつコドンAGA/AGGを認識するｔ−RNAを僅少量で含
有するだけであり、かつ外来遺伝子の発現の際に冒頭に
記載した結果がもたらされる。本発明で使用する通常の
僅少量のｔ−RNAを有するE.コリ菌株の標準としては、
例えば菌株DSM3689,DSM2102,HFR3000及びC600（DSM209
3）〔あとの２種はBachmann著，“Bactariol.Rev.",36
巻,180〜230頁に記載されている〕が挙げられる。場合
により、本発明方法により、もともと多量の即ち少なく
とも２倍量のこのｔ−RNAを含有するE.コリ菌株を見つ
け出すことができる。このために、E.コリ細胞の全RNA
を製造しかつこれをｔ−RNAのDNA配列の特異的部分に相
当する、標識したオリゴヌクレオチドに対してハイブリ
ツド形成して選択すると優れている。それ故、ノーザン
ブロツト法（Northern−blot−Technik）を適用すると
優れている。ノーザンブロツト法は当業者に公知であ
り、例えばマニアチス及びその他共著（Maniatis et a
l），“モレキユラール・クローニング（Molecular Clo
ning）”“ア・ラボラトリー・マニユアル（A Laborato
ry Manual）", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York在に記載されている。ハイブ
リツド形成には放射性標識したオリゴヌクレオチドを使
用すると有利であるが、DNAフラグメントの他のすべて
の標識も有利に使用することができる。コドンAGG及び
／又はAGAを認識するｔ−RNAのDNA配列の特異的部分と
は、ｔ−RNA中のアンチコドンに直接隣接する及び直接
隣接中のDNA配列、所謂アンチコドンループである。プ
ソイドウリジン−又はジヒドロウリジンループとは逆に
tRNAのこの領域は他のtRNAに対してあまり相同性ではな
く、それ故配列５′−CACGACTTAGAAGGTCGTTG−３′又は
例えば短い配列５′−GACTTAGAAGGTCGTT−３′のオリゴ
ヌクレオチド並びにそれぞれの相補性オリゴヌクレオチ
ド（５′−CAACGACCTTCTAAGTCGTG−３′），（５′−AA
CGACCTTCTAAGTC−３′）をこのtRNAの検出及び特徴付け
の特異的プローブとして使用することができる。本発明
により、塩基対長さ14〜30であるオリゴヌクレオチドを
使用すると有利である。
込みかつコドンAGA/AGGを認識するｔ−RNAを僅少量で含
有するだけであり、かつ外来遺伝子の発現の際に冒頭に
記載した結果がもたらされる。本発明で使用する通常の
僅少量のｔ−RNAを有するE.コリ菌株の標準としては、
例えば菌株DSM3689,DSM2102,HFR3000及びC600（DSM209
3）〔あとの２種はBachmann著，“Bactariol.Rev.",36
巻,180〜230頁に記載されている〕が挙げられる。場合
により、本発明方法により、もともと多量の即ち少なく
とも２倍量のこのｔ−RNAを含有するE.コリ菌株を見つ
け出すことができる。このために、E.コリ細胞の全RNA
を製造しかつこれをｔ−RNAのDNA配列の特異的部分に相
当する、標識したオリゴヌクレオチドに対してハイブリ
ツド形成して選択すると優れている。それ故、ノーザン
ブロツト法（Northern−blot−Technik）を適用すると
優れている。ノーザンブロツト法は当業者に公知であ
り、例えばマニアチス及びその他共著（Maniatis et a
l），“モレキユラール・クローニング（Molecular Clo
ning）”“ア・ラボラトリー・マニユアル（A Laborato
ry Manual）", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York在に記載されている。ハイブ
リツド形成には放射性標識したオリゴヌクレオチドを使
用すると有利であるが、DNAフラグメントの他のすべて
の標識も有利に使用することができる。コドンAGG及び
／又はAGAを認識するｔ−RNAのDNA配列の特異的部分と
は、ｔ−RNA中のアンチコドンに直接隣接する及び直接
隣接中のDNA配列、所謂アンチコドンループである。プ
ソイドウリジン−又はジヒドロウリジンループとは逆に
tRNAのこの領域は他のtRNAに対してあまり相同性ではな
く、それ故配列５′−CACGACTTAGAAGGTCGTTG−３′又は
例えば短い配列５′−GACTTAGAAGGTCGTT−３′のオリゴ
ヌクレオチド並びにそれぞれの相補性オリゴヌクレオチ
ド（５′−CAACGACCTTCTAAGTCGTG−３′），（５′−AA
CGACCTTCTAAGTC−３′）をこのtRNAの検出及び特徴付け
の特異的プローブとして使用することができる。本発明
により、塩基対長さ14〜30であるオリゴヌクレオチドを
使用すると有利である。
本発明方法はすべての組み変え遺伝子に好適であり、
真核生物遺伝子もしくはそのcDNAを発現させるのに有利
であり、特に多数のAGG及び／又はAGA−コドンを含有す
るものに好適である。これは、例えばヒトウロキナー
ゼ、ｔ−PA又はその誘導体、HIV蛋白質（例えばgp41,p2
4）、酵母からのα−グルコシダーゼである。本発明方
法の大きな利点は、組み換え遺伝子を構成的に発現させ
ることもできることである。
真核生物遺伝子もしくはそのcDNAを発現させるのに有利
であり、特に多数のAGG及び／又はAGA−コドンを含有す
るものに好適である。これは、例えばヒトウロキナー
ゼ、ｔ−PA又はその誘導体、HIV蛋白質（例えばgp41,p2
4）、酵母からのα−グルコシダーゼである。本発明方
法の大きな利点は、組み換え遺伝子を構成的に発現させ
ることもできることである。
本発明方法は、組み換え遺伝子としてｔ−PA遺伝子
〔Pennica及びその他共著、“Nature"、301巻、214〜22
1頁（1983年）〕又はその変異体を発現させてｔ−PAを
製造するには特に優れている。従来技術水準で公知にな
つた、E.コリ全細胞蛋白質当りｔ−PA約５％という発現
率を本発明により30％より高い収率を達成することがで
きる。これは本発明方法を用いると収率が600％上昇す
ることを表わす。
〔Pennica及びその他共著、“Nature"、301巻、214〜22
1頁（1983年）〕又はその変異体を発現させてｔ−PAを
製造するには特に優れている。従来技術水準で公知にな
つた、E.コリ全細胞蛋白質当りｔ−PA約５％という発現
率を本発明により30％より高い収率を達成することがで
きる。これは本発明方法を用いると収率が600％上昇す
ることを表わす。
本発明の他の優れた実施形ではE.コリ中で、ｔ−PAの
遺伝子及びdna Y遺伝子を含有するプラスミドpUBS98.sk
y1,DSM4898を発現させる。
遺伝子及びdna Y遺伝子を含有するプラスミドpUBS98.sk
y1,DSM4898を発現させる。
本発明の他の目的は、組み換え遺伝子及びアルギニン
を構成しかつコドンAGG及び／又はAGAを認識するｔ−RN
A遺伝子を含有する発現ベクターである。両方の遺伝子
はそれぞれ異なるプロモータの制御のもとにあつてもよ
く、その際それぞれの遺伝子に対して均一なあるいはま
た不均一なプロモータが使用可能であり、または本発明
の優れた実施形により共通のプロモータの制御下にオペ
ロンの形で存在してもよい。
を構成しかつコドンAGG及び／又はAGAを認識するｔ−RN
A遺伝子を含有する発現ベクターである。両方の遺伝子
はそれぞれ異なるプロモータの制御のもとにあつてもよ
く、その際それぞれの遺伝子に対して均一なあるいはま
た不均一なプロモータが使用可能であり、または本発明
の優れた実施形により共通のプロモータの制御下にオペ
ロンの形で存在してもよい。
一般にE.コリ中で組み換え遺伝子をクローン化しかつ
発現させるのに使用可能な優れた発現ベクターは −構成性又は調節可能なE.コリ中で転写可能なプロモー
タ〔例えばlac−,tac−,trp−,E.コリ・リボソームプロ
モータ、バチルス・ステアロテルモフイルス（Bacillus
Stearothermophilus）α−ガラクトシダーゼ−プロモ
ータ）、 −続いて選択的に翻訳開始するためのリボソーム結合部
位、 −続いて選択的に翻訳開始コドン（ATGが優れてい
る）、 −続いて発現すべき遺伝子/cDNAをクローン化するため
のポリリンカー、 −続いて選択的にmRNA安定化配列 −続いて転写ターミネータ（殊にfd−ターミネータ）、 −耐性遺伝子（殊にカナマイシン耐性遺伝子）、 −E.コリ中で安定なプラスミド増殖能を有する複製開始
点、 −tRNA Arg（AGG/AGA）の遺伝子 より成る。
発現させるのに使用可能な優れた発現ベクターは −構成性又は調節可能なE.コリ中で転写可能なプロモー
タ〔例えばlac−,tac−,trp−,E.コリ・リボソームプロ
モータ、バチルス・ステアロテルモフイルス（Bacillus
Stearothermophilus）α−ガラクトシダーゼ−プロモ
ータ）、 −続いて選択的に翻訳開始するためのリボソーム結合部
位、 −続いて選択的に翻訳開始コドン（ATGが優れてい
る）、 −続いて発現すべき遺伝子/cDNAをクローン化するため
のポリリンカー、 −続いて選択的にmRNA安定化配列 −続いて転写ターミネータ（殊にfd−ターミネータ）、 −耐性遺伝子（殊にカナマイシン耐性遺伝子）、 −E.コリ中で安定なプラスミド増殖能を有する複製開始
点、 −tRNA Arg（AGG/AGA）の遺伝子 より成る。
本発明により特に優れたプラスミドはpUBS98.Sky1,DS
M4898である。このプラスミドはdna Y遺伝子もｔ−PA遺
伝子も含有する。
M4898である。このプラスミドはdna Y遺伝子もｔ−PA遺
伝子も含有する。
本発明の他の目的は発現補助ベクター（Expressionsh
ilfsvektoren）であり、これはアルギニンを組み込みか
つコドンAGG及び／又はAGAを認識するｔ−RNAの遺伝子
を含有し、かつCol E1−プラスミド及びその誘導体とは
異なる複製開始点を有する。
ilfsvektoren）であり、これはアルギニンを組み込みか
つコドンAGG及び／又はAGAを認識するｔ−RNAの遺伝子
を含有し、かつCol E1−プラスミド及びその誘導体とは
異なる複製開始点を有する。
これによりE.コリ細胞中でCol E1−発現ベクターと一
緒に補助培養（Cokultivierung）が可能である。
緒に補助培養（Cokultivierung）が可能である。
本発明の優れた実施形では、ｔ−RNAの遺伝子はE.コ
リ中のその天然の、従つて均一なプロモータの制御を受
け、他の優れた実施形では不均一なプロモータ、特に有
利にはlac−,tac−,mgl−又はtrp−プロモータもしくは
バチルス・ステアロテルモフイルスからのα−ガラクト
シダーゼプロモータの制御を受ける。
リ中のその天然の、従つて均一なプロモータの制御を受
け、他の優れた実施形では不均一なプロモータ、特に有
利にはlac−,tac−,mgl−又はtrp−プロモータもしくは
バチルス・ステアロテルモフイルスからのα−ガラクト
シダーゼプロモータの制御を受ける。
本発明の他の目的は、前記の発現ベクターをその中に
存在する組み換え遺伝子を発現させるのに使用すること
であり、その際に著しく高い収率が達成され、かつ他の
目的は、遺伝子の発現に好適な組み換えDNAの形でE.コ
リ細胞中に装入される遺伝子の発現で収率を高めるため
に前記の発現補助ベクターを使用することである。この
際に、本発明により構成性プロモータに使用で組み換え
遺伝子を構成発現させることができる。
存在する組み換え遺伝子を発現させるのに使用すること
であり、その際に著しく高い収率が達成され、かつ他の
目的は、遺伝子の発現に好適な組み換えDNAの形でE.コ
リ細胞中に装入される遺伝子の発現で収率を高めるため
に前記の発現補助ベクターを使用することである。この
際に、本発明により構成性プロモータに使用で組み換え
遺伝子を構成発現させることができる。
実施例 次に本発明の実施例を添付図面につき詳説する。
第１図／表Ｉは、発現補助プラスミドを用いて誘導し
かつコトランスフエクシヨンする際の組み換えｔ−PAの
発現効率の上昇及びｔ−PA発現の際に細胞の生活力に対
する発現補助プラスミドのプラスの作用を示している。
かつコトランスフエクシヨンする際の組み換えｔ−PAの
発現効率の上昇及びｔ−PA発現の際に細胞の生活力に対
する発現補助プラスミドのプラスの作用を示している。
例 １ ｔ−PA−発現プラスミドの構成 ａ） プラスミドpePa126.1 改良ｔ−PA−発現プラスミドの構成のための出発プラ
スミドとしてはプラスミドpePa98.1（ヨーロツパ特許公
開第242836号明細書）を使用した。このプラスミド中の
ｔ−PA−cDNAの３′−非翻訳域、長さ約400bpをXho II
−フラグメント、長さ361bpの欠失により約40bpに短か
くした。この生じたプラスミドの名前はpePa126.1であ
り、このプラスミドpePa126.1とpePa98.1とは例えば制
限エンドヌクレアーゼBam HI及びHind IIIでの２重消化
により区別され、pePa98.1においては長さ2234bpと4372
bpとの２つのフラグメントが、pePa126.1においてはこ
れに対して長さ1873bpと4372bpの２つのフラグメントが
検出される。
スミドとしてはプラスミドpePa98.1（ヨーロツパ特許公
開第242836号明細書）を使用した。このプラスミド中の
ｔ−PA−cDNAの３′−非翻訳域、長さ約400bpをXho II
−フラグメント、長さ361bpの欠失により約40bpに短か
くした。この生じたプラスミドの名前はpePa126.1であ
り、このプラスミドpePa126.1とpePa98.1とは例えば制
限エンドヌクレアーゼBam HI及びHind IIIでの２重消化
により区別され、pePa98.1においては長さ2234bpと4372
bpとの２つのフラグメントが、pePa126.1においてはこ
れに対して長さ1873bpと4372bpの２つのフラグメントが
検出される。
ｂ）プラスミドpUBS98.sky1 発現プラスミドpUBS98.sky1はプラスミドpDMの約3000
bpの大きさのDra I−フラグメントを含有し、このフラ
グメントはDra I切断ｔ−PA−発現プラスミド中に挿入
されたｔ−RNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子（dna
Y）を含有し（Garcia等著、Cell、第45巻、1986年、第4
53〜459頁）、これは前記プラスミドpePa126.1のカナマ
イシン耐性誘導体である。pUBS98.sky1はドイツ微生物
保存機関（Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen;D
SM）に寄託番号4898で寄託されている。
bpの大きさのDra I−フラグメントを含有し、このフラ
グメントはDra I切断ｔ−PA−発現プラスミド中に挿入
されたｔ−RNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子（dna
Y）を含有し（Garcia等著、Cell、第45巻、1986年、第4
53〜459頁）、これは前記プラスミドpePa126.1のカナマ
イシン耐性誘導体である。pUBS98.sky1はドイツ微生物
保存機関（Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen;D
SM）に寄託番号4898で寄託されている。
例 ２ 発現補助プラスミドの存在での大腸菌中でのｔ−PAの発
現 ｔ−PNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子を、Col E1−
複製開始点を有するｔ−PA−発現ベクターpePa126.1と
適合性であるプラスミドでクローン化した。
現 ｔ−PNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子を、Col E1−
複製開始点を有するｔ−PA−発現ベクターpePa126.1と
適合性であるプラスミドでクローン化した。
プラスミドpACYC177（Chang及びCohen著、J.Bact.、
第134巻、1978年、第1141〜1156頁）、DSM3693Pをこの
ためにDra Iで切断し、3230pbフラグメントを単離し
た。このフラグメントをdna Y−遺伝子を含有する、プ
ラスミドpDM201からの長さ約3000bpのDra I−フラグメ
ントと連結し、この連結配合物を大腸菌、DSM2102中に
形質転換した。
第134巻、1978年、第1141〜1156頁）、DSM3693Pをこの
ためにDra Iで切断し、3230pbフラグメントを単離し
た。このフラグメントをdna Y−遺伝子を含有する、プ
ラスミドpDM201からの長さ約3000bpのDra I−フラグメ
ントと連結し、この連結配合物を大腸菌、DSM2102中に
形質転換した。
プラスミドpUBS400もしくはpUBS401を含有するカナマ
イシン耐性クローンを、オリゴヌクレオチド〔５′−AG
CAACGACCTTCTAAGTCGTGGG−３′〕を用いてコロニーフイ
ルターハイブリツド化を行なうことにより同定し、単離
した。このようにして単離されたプラスミドpUBS400及
びpUBS401はｔ−RNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子が
そこに存在するDra I−切断位中への3000bp挿入物によ
りpACYCとは区別され、かつpUBS400とpUBS401とはベク
ター中の3000bp−Dra I−挿入物（例１）の方向性にお
いて区別される。
イシン耐性クローンを、オリゴヌクレオチド〔５′−AG
CAACGACCTTCTAAGTCGTGGG−３′〕を用いてコロニーフイ
ルターハイブリツド化を行なうことにより同定し、単離
した。このようにして単離されたプラスミドpUBS400及
びpUBS401はｔ−RNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子が
そこに存在するDra I−切断位中への3000bp挿入物によ
りpACYCとは区別され、かつpUBS400とpUBS401とはベク
ター中の3000bp−Dra I−挿入物（例１）の方向性にお
いて区別される。
pUBS400はHind II−Hind III−二重消化プラスミド−
DNAのサザン分析において約3300bp−フラグメントが合
成オリゴヌクレオチド〔５′−AGCAACGACCTTCTAAGTCGTG
GG−３′〕とハイブリツド化することを特徴とする。pU
BS401は同様に実施される分析において約1700bp−フラ
グメントがハイブリツド化することを特徴とする。
DNAのサザン分析において約3300bp−フラグメントが合
成オリゴヌクレオチド〔５′−AGCAACGACCTTCTAAGTCGTG
GG−３′〕とハイブリツド化することを特徴とする。pU
BS401は同様に実施される分析において約1700bp−フラ
グメントがハイブリツド化することを特徴とする。
プラスミドpIQ500はlac Iq−遺伝子を有するpACYC177
誘導体である。プラスミドpIQ500はiq−プロモーター突
然変異（Calos著、Nature、第274巻、第762〜765頁、19
78年）を有するlac I−遺伝子（P.J.Farabaugh、Natur
e、第274巻、第765〜769頁、1978年）をHind II−フラ
グメント（部分的にpMClから、Calos1978年前記参照）
としてHind II−切断プラスミドpACYC177（Chang及びCo
hen著、J.Bact.、第134巻、1978年、第1141〜1156頁）
中に挿入して含有する。
誘導体である。プラスミドpIQ500はiq−プロモーター突
然変異（Calos著、Nature、第274巻、第762〜765頁、19
78年）を有するlac I−遺伝子（P.J.Farabaugh、Natur
e、第274巻、第765〜769頁、1978年）をHind II−フラ
グメント（部分的にpMClから、Calos1978年前記参照）
としてHind II−切断プラスミドpACYC177（Chang及びCo
hen著、J.Bact.、第134巻、1978年、第1141〜1156頁）
中に挿入して含有する。
pIQ500を含有する大腸菌細胞はカナマイシン耐性であ
り、かつ（pACYC177含有の大腸菌細胞とは異なり）アン
ピシリン感受性であり、かつこのプラスミドを含有しな
い比較可能な大腸菌より著しく高濃度のLac−リプレツ
サー分子（lac I）を含有する。pIQ500は、組換遺伝子
をlac−プロモーター又はその誘導体、例えばtac;trc等
の制御下に転写する限りにおいては、誘発されない状態
で組換遺伝子の抑制を補助するために使用され、かつ発
現プラスミドはpIQ500と適合性である（例えばpKK223−
３−誘導体）。
り、かつ（pACYC177含有の大腸菌細胞とは異なり）アン
ピシリン感受性であり、かつこのプラスミドを含有しな
い比較可能な大腸菌より著しく高濃度のLac−リプレツ
サー分子（lac I）を含有する。pIQ500は、組換遺伝子
をlac−プロモーター又はその誘導体、例えばtac;trc等
の制御下に転写する限りにおいては、誘発されない状態
で組換遺伝子の抑制を補助するために使用され、かつ発
現プラスミドはpIQ500と適合性である（例えばpKK223−
３−誘導体）。
ｔ−RNA−Arg（AGG/AGA）遺伝子のこのプラスミドで
のクローン化はlac Iq−遺伝子に付加的に、大腸菌細胞
が誘発されていない状態で抑制のために必要な量のlac
−リプレツサーだけでなく、真核蛋白質の発現の間に必
要な多量のｔ−RNA Arg（AGG/AGA）を供給することも可
能にする。
のクローン化はlac Iq−遺伝子に付加的に、大腸菌細胞
が誘発されていない状態で抑制のために必要な量のlac
−リプレツサーだけでなく、真核蛋白質の発現の間に必
要な多量のｔ−RNA Arg（AGG/AGA）を供給することも可
能にする。
プラスミドpIQ500をDra Iで切断し、かつ4836bpフラ
グメントを単離する。このフラグメントをdna Y−遺伝
子を有する、プラスミドpDM201からの約3000bpのDra I
−フラグメントと連結し、かつこの連結配合物を大腸菌
DSM2102中に形質転換した。
グメントを単離する。このフラグメントをdna Y−遺伝
子を有する、プラスミドpDM201からの約3000bpのDra I
−フラグメントと連結し、かつこの連結配合物を大腸菌
DSM2102中に形質転換した。
プラスミドpUBS500もしくはpUBS501を含有するカナマ
イシン耐性クローンを合成オリゴヌクレオチド〔５′−
AGCAACGACCTTCTAAGTCGTGGG−３′〕とコロニーフイルタ
ーハイブリツド化することにより同定し、かつ単離し
た。
イシン耐性クローンを合成オリゴヌクレオチド〔５′−
AGCAACGACCTTCTAAGTCGTGGG−３′〕とコロニーフイルタ
ーハイブリツド化することにより同定し、かつ単離し
た。
このように単離されたプラスミドpUBS500及びpUBS501
はｔ−RNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子が存在する、
Dra I−切断位中の3000bpの挿入物によりpIQ500とは異
なつており、プラスミドpUBS500と501とはベクター中の
3000bp−挿入物の配向において異なつている。pUBS500
は、Hind II−消化プラスミド−DNAのサザン分析におい
て約4000bp−フラグメントが合成オリゴヌクレオチド
〔５′−AGCAACGACCTTCTAAGTCGTGGG−３′〕とハイブリ
ツド化することを特徴とする。bUBS501は、同様に実施
する分析において約1700bp−フラグメントがハイブリツ
ト化することを特徴とする。
はｔ−RNA Arg（AGG/AGA）に関する遺伝子が存在する、
Dra I−切断位中の3000bpの挿入物によりpIQ500とは異
なつており、プラスミドpUBS500と501とはベクター中の
3000bp−挿入物の配向において異なつている。pUBS500
は、Hind II−消化プラスミド−DNAのサザン分析におい
て約4000bp−フラグメントが合成オリゴヌクレオチド
〔５′−AGCAACGACCTTCTAAGTCGTGGG−３′〕とハイブリ
ツド化することを特徴とする。bUBS501は、同様に実施
する分析において約1700bp−フラグメントがハイブリツ
ト化することを特徴とする。
発現補助プラスミドpUBS400及びpUBS500は、プラスミ
ドpePa126.1を有するｔ−PA−発現のマイナス効果を、
必要なｔ−RNA Arg（AGG/AGA）を供給することによりト
ランス活性補償することを可能にする。
ドpePa126.1を有するｔ−PA−発現のマイナス効果を、
必要なｔ−RNA Arg（AGG/AGA）を供給することによりト
ランス活性補償することを可能にする。
プラスミドpUBS400又はpUBS500及びpePa126.1での通
常の大腸菌−実験室菌株（例えばＣ−600）の同時形質
転換における発現はpUBS98.skyl.でのｔ−PA−生産にお
けると同様な収量と生活力に導びく。
常の大腸菌−実験室菌株（例えばＣ−600）の同時形質
転換における発現はpUBS98.skyl.でのｔ−PA−生産にお
けると同様な収量と生活力に導びく。
第１表及び第１図は5mM IPTGでの誘発においてpIQ500
（試料Ａ）もしくはpUBS500（試料Ｂ）を用いて同時形
質転換する、大腸菌DSM2102中でのpePa126.1からの組換
ｔ−PAの発現の比較を示す。
（試料Ａ）もしくはpUBS500（試料Ｂ）を用いて同時形
質転換する、大腸菌DSM2102中でのpePa126.1からの組換
ｔ−PAの発現の比較を示す。
例 ３ 大腸菌中でのｔ−PAの発現の比較 プラスミドpePA133（西ドイツ国特許第3613401号明細
書）、pePA126.1（例１）及びpUBS98.skyl、DSM4898をI
q−プラスミドを含有する大腸菌、DSM3689中で形質転換
した。形質転換体をカナマイシン25μg/ml（pePa133及
びpUBS98.stylにおいて）及びアンピシリン50μg/ml（p
ePa126.1において）を有するLB−プレート（Maniatis、
1982年、前記）上で培養する。
書）、pePA126.1（例１）及びpUBS98.skyl、DSM4898をI
q−プラスミドを含有する大腸菌、DSM3689中で形質転換
した。形質転換体をカナマイシン25μg/ml（pePa133及
びpUBS98.stylにおいて）及びアンピシリン50μg/ml（p
ePa126.1において）を有するLB−プレート（Maniatis、
1982年、前記）上で培養する。
プラスミド含有細胞をOD550nm＝0.3までLB中で培養
し、誘発し（IPTG10mmol/の添加）、かつ37℃で発酵
させる。培養物の成長を規則的な間隔で細胞密度（OD55
0）を監視することにより制御する。
し、誘発し（IPTG10mmol/の添加）、かつ37℃で発酵
させる。培養物の成長を規則的な間隔で細胞密度（OD55
0）を監視することにより制御する。
恒温保持４時間後に細胞を収穫し、超音波処理により
破砕する。このようにして得られた細胞−溶解物を電気
泳動分析し（コーマシーブル−着色SDS−ゲル）、ｔ−P
Aをウエスタンブロツト法で山羊からのｔ−PAに対する
ポリクローン抗体を用いて検出し、予め行なつた細胞溶
解物の蛋白質測定によりコーマシー着色SDS−ゲルの密
度法測定値を介して測量した。
破砕する。このようにして得られた細胞−溶解物を電気
泳動分析し（コーマシーブル−着色SDS−ゲル）、ｔ−P
Aをウエスタンブロツト法で山羊からのｔ−PAに対する
ポリクローン抗体を用いて検出し、予め行なつた細胞溶
解物の蛋白質測定によりコーマシー着色SDS−ゲルの密
度法測定値を介して測量した。
第２表は大腸菌DSM3689中での前記プラスミドの発現
における収量及び他のパラメーターの比較を示す。
における収量及び他のパラメーターの比較を示す。
プラスミドpePa133.6でのｔ−PA−発現はすでに西ド
イツ国特許第3613401号明細書に記載されている。
イツ国特許第3613401号明細書に記載されている。
プラスミドpePa126.1での発現はローラー培地5ml中の
生産大腸菌の成長をほとんど損なわないが、発酵尺度
（≧10 １）においては著しく損ない、更に完全ｔ−PA
は僅かな量で生産され、そのかわりにｔ−PA−フラグメ
ントが多量に生産される。
生産大腸菌の成長をほとんど損なわないが、発酵尺度
（≧10 １）においては著しく損ない、更に完全ｔ−PA
は僅かな量で生産され、そのかわりにｔ−PA−フラグメ
ントが多量に生産される。
プラスミドpUBS98.skylを用いる大腸菌中でのｔ−PA
の発現は、生産生物にマイナスの作用を与えることな
く、完全ｔ−PAの著しく高い発現量を可能とする（全蛋
白質の30％）。ｔ−PA生産細胞はこのプラスミドで非常
に迅速に、かつ高い細胞密度まで成長し、ｔ−PAが本質
的に発現される。
の発現は、生産生物にマイナスの作用を与えることな
く、完全ｔ−PAの著しく高い発現量を可能とする（全蛋
白質の30％）。ｔ−PA生産細胞はこのプラスミドで非常
に迅速に、かつ高い細胞密度まで成長し、ｔ−PAが本質
的に発現される。
例 ４ 発現補助プラスミドの存在又は不存在における大腸菌中
での種種の蛋白質の発現の比較 プラスミドpUPA110（シグナルペプチドを有さない人
プローウロキナーゼに関する配列を含有する、Holmes等
著、Biotechnology、第３巻、1985年、第923〜929
頁）、pGP41（人HIV−ヴイールスのp41−蛋白質に関す
るコード付配列を有する、Ratner等著、Nature、第313
巻、1985年、第277〜284頁）、pKK177−3/GLUCPI（酵母
からのα−グルコシダーゼに関する配列を含有、ヨーロ
ツパ特許公開第0300425号公報）、pBT102（DSK2091）
（大腸菌からのα−グルコシダーゼ）及びプラスミドpU
R289（大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼに関する配列
を含有、Ｒther及びMulker著、EMBO J.、第２巻、198
3年、第1791〜1794頁）をIq−プラスミドを含有する大
腸菌DSM3689中に形質転換した。形質転換体の培養並び
に発酵は例３と同様にして実施した。
での種種の蛋白質の発現の比較 プラスミドpUPA110（シグナルペプチドを有さない人
プローウロキナーゼに関する配列を含有する、Holmes等
著、Biotechnology、第３巻、1985年、第923〜929
頁）、pGP41（人HIV−ヴイールスのp41−蛋白質に関す
るコード付配列を有する、Ratner等著、Nature、第313
巻、1985年、第277〜284頁）、pKK177−3/GLUCPI（酵母
からのα−グルコシダーゼに関する配列を含有、ヨーロ
ツパ特許公開第0300425号公報）、pBT102（DSK2091）
（大腸菌からのα−グルコシダーゼ）及びプラスミドpU
R289（大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼに関する配列
を含有、Ｒther及びMulker著、EMBO J.、第２巻、198
3年、第1791〜1794頁）をIq−プラスミドを含有する大
腸菌DSM3689中に形質転換した。形質転換体の培養並び
に発酵は例３と同様にして実施した。
第３表は発現補助プラスミドpUBS500の存在又は不存
在での組換蛋白質の発現の比較を示す。
在での組換蛋白質の発現の比較を示す。
著しく高いAGG−及びAGA−含量を示すプローウロキナ
ーゼ及びHIV−GP41の発現において、発現補助プラスミ
ドの不存在の発現において発現収量及び発現大腸菌の生
活力は明らかに減少している。発現補助プラスミドpUBS
500の添加により非常に高い発現力並びにクローンの高
い生活力が達せられる。
ーゼ及びHIV−GP41の発現において、発現補助プラスミ
ドの不存在の発現において発現収量及び発現大腸菌の生
活力は明らかに減少している。発現補助プラスミドpUBS
500の添加により非常に高い発現力並びにクローンの高
い生活力が達せられる。
α−グルコシダーゼの発現も発現補助プラスミドによ
り上昇する。しかしながら、この遺伝子がプローウロキ
ナーゼ及びHIV−GP41よりAGG/AGA−コドンを僅かに含有
しているので、発現補助プラスミドの添加における観察
された発現上昇はプローウロキナーゼやHIV−GPG1程強
烈ではない。
り上昇する。しかしながら、この遺伝子がプローウロキ
ナーゼ及びHIV−GP41よりAGG/AGA−コドンを僅かに含有
しているので、発現補助プラスミドの添加における観察
された発現上昇はプローウロキナーゼやHIV−GPG1程強
烈ではない。
大腸菌からのα−ガラクトシダーゼに関する遺伝子は
酵母からのα−グルコシダーゼ遺伝子より更に少量のAG
G/AGA−コドンを含有する。従つて、発現補助プラスミ
ドの添加による発現の上昇は比較的わずかであるが、そ
れでもなお明らかにはつきりとしている。
酵母からのα−グルコシダーゼ遺伝子より更に少量のAG
G/AGA−コドンを含有する。従つて、発現補助プラスミ
ドの添加による発現の上昇は比較的わずかであるが、そ
れでもなお明らかにはつきりとしている。
第１図はrec−ｔ−PAを産成するE.コリの生活力が発現
補助プラスミドpUBS500により高められることを示す図
である。
補助プラスミドpUBS500により高められることを示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＤＳＭ ４８９８ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ３６８９ (72)発明者 シユテフアン・フイツシヤー ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・モー スシユトラーセ 27 (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．45，Ｎｏ．３, Ｐ．453−459（1986) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．12，Ｎｏ．17, Ｐ．6663−6671（1984)
Claims (3)
- 【請求項１】目的とする蛋白質をコードしておりそして
アルギニンのAGA−及び／又はAGG−コドンを含む組み換
え遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されたE.コリ中
で該組み換え遺伝子を発現させる方法において、E.コリ
細胞中に存在する、アルギニンを組み込みかつコドンAG
G及びAGAを認識するｔ−RNAの量を通常この細胞中で産
生する量より増加させることにより、目的とする蛋白質
の生産量を、前記ｔ−RNAの量を増加させなかった場合
の生産量に比べて少なくとも５倍に高めることを特徴と
する組み換え遺伝子の発現法。 - 【請求項２】目的とするポリペプチドをコードする組み
換え遺伝子及び、アルギニンを組み込みかつコドンAGG
及び／又はAGAを認識するｔ−RNAの遺伝子を含有するこ
とを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項３】アルギニンを組み込みかつコドンAGG及び
／又はAGAを認識するｔ−RNAの遺伝子を含有しかつ発現
させ、かつColE1−複製開始点を有する発現ベクターと
適合性であることを特徴とするColE1複製開始点以外の
複製開始点を有する発現補助ベクターであって、ColE1
−複製始点を有する発現ベクターと共に使用するのに適
する発現補助ベクター。
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-
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