KR101317420B1 - 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유 - Google Patents

고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 실크 단백질과 거의 유사한 분자량을 가지는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된, 물성이 향상된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질은 거미로부터 생산되는 드래그라인 실크 단백질처럼 고분자량을 가지면서 섬유로 제조 시 천연 실크단백질과 유사하거나 더 우수한 물성을 가지는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유는 거미줄 섬유의 적용이 기대되는 생물공학적 분야 및/또는 의약 분야 등과 같은 다양한 산업적 분야에 사용될 수 있어 매우 유용하다.

Description

고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유{High Molecular Weight Recombinant Silk or Silk-like Proteins and Micro or Nano-spider Silk or Silk-like Fibres Manufactured by Using the Same}
본 발명은 천연 실크 단백질과 거의 유사한 분자량을 가지는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된, 물성이 향상된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유에 관한 것이다.
거미의 생명줄로 쓰이며 방사형 거미줄 형태를 만들 때에 사용하는 드래그라인 거미줄은 그 강도와 탄성도가 크다. 거미줄은 강철보다 단위 질량당 5배의 강도를 가지며, 인간이 만든 고품질의 케플러 섬유보다 3배 단단하다 (Gosline, J. M. et al ., J. Exp . Biol ., 202:3295, 1999; Vollrath, F. & Knight, D. P., Nature 410: 541, 2001). 따라서, 드래그라인 거미줄은 다양한 산업적 응용성을 지닌 재료로서 많은 관심을 받아왔다. 또한 거미줄은 생적합성과 생분해성의 성질을 가지기 때문에, 생의학 분야에서의 많은 응용이 기대된다. 그러나 불행히도, 거미는 영역 보호본능이 강하고 공격적이기 때문에, 자연적인 드래그라인 거미줄은 거미 배양 등으로 쉽게 얻어질 수 없다. 따라서 재조합 드래그라인 실크 단백질을 생산하기 위한 수많은 노력이 있었다 (Lazaris, A. et al ., Science , 295:472, 2002; Teule, F. et al ., Nat . Protoc ., 4: 341, 2009; Arcidiacono, S. et al ., Macromolecules, 35: 1262, 2002; Brooks, A. E. et al . Biomacromolecules , 9: 1506, 2008; Heim, M., Keerl, D. & Scheibel, T., Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., 48: 3584, 2009; Fahnestock, S. R. et al ., Rev . Mol . Biotechnol ., 74: 105, 2000; Scheller, J. et al ., Nat . Biotechnol ., 19: 573, 2001; Widmaier, D. M. et al . Mol . Syst . Biol ., 5: 309, 2009).
현재까지 연구된 모든 거미는 250~320 kDa의 고분자량을 가지는 드래그라인 실크 단백질을 자연적으로 생산해 왔다. 그러나 현재까지 대장균에서 합성된 가장 큰 드래그라인 실크 단백질은 그 분자량이 163kDa으로서 (Fahnestock S.R. & Irwin S.L., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 47:23, 1997), 이는 거미가 만드는 거미줄의 절반이 되는 분자량이다. 더 큰 단백질의 생산이 보고되지 않았던 것은, 단백질 합성 과정 중의 에러 때문에 비균질성 등의 문제가 있기 때문인 것으로 추정된다.
이에 본 발명자는 거미로부터 생산되는 드래그라인 실크 단백질처럼 고분자량을 가지면서 섬유로 제조 시 천연 실크단백질과 유사하거나 더 우수한 물성을 가지는 드래그라인 재조합 실크 단백질을 제공하고자 예의 노력한 결과, 글리신 tRNA를 동시발현시킴으로써 대장균과 같은 박테리아에서 284.9kDa 이상의 고분자량을 가지는 재조합 실크 단백질을 생산한 다음, 이를 방적하여 기존의 천연 거미줄 섬유보다 더 우수한 물성을 가지는 거미줄 섬유로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 천연의 거미 드래그라인 실크 단백질과 같은 고분자량을 가지는 재조합 실크 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고분자량의 재조합 실크 단백질로 방적한, 물성이 향상된 거미줄 섬유를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리신 함량이 10% 이상인 펩타이드가 64~160회 반복되어 있는 구조를 가지는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 펩타이드가 64~160회 반복되어 있는 구조를 가지고, 분자량이 192.8 내지 482kDa인 고분자량의 재조합 실크 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 코딩하는 유전자와 글리신 tRNA를 코딩하는 염기서열을 동시에 발현시키는 것을 특징으로 하는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 포함하는 용액을 방사하는 것을 특징으로 하는 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 펩타이드가 64~160회 반복되어 있는 구조를 가지고, 분자량이 192.8 내지 482kDa인 재조합 실크 단백질을 포함하는 용액을 방사하는 것을 특징으로 하는 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 섬유를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 섬유를 제공한다.
본 발명은 천연 실크 단백질과 거의 유사한 분자량을 가지는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된, 물성이 향상된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 실크 단백질 및 재조합 실크 유사단백질은 거미로부터 생산되는 드래그라인 실크 단백질처럼 고분자량을 가지면서 섬유로 제조 시 천연 실크단백질과 유사하거나 더 우수한 물성을 가지는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 실크 단백질과 재조합 실크 유사단백질, 및 이를 이용하여 제조된 섬유는 거미줄 섬유의 적용이 기대되는 생물공학적 분야 및/또는 의약 분야 등과 같은 다양한 산업적 분야에 사용될 수 있어 매우 유용하다.
도 1은 재조합 실크 단백질 발현을 위한 발현구조와 반복단위체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 16mer, 32mer, 64mer 및 96mer의 재조합 실크단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 분리하여 각 분자량을 나타낸 사진이다.
도 3은 습식방사 방법을 이용하여 20% (w/v) 재조합 실크 단백질 용액으로부터 방적된 섬유의 응력-변형도 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4는 습식방사 방법을 이용하여 20% (w/v) 재조합 실크 단백질 용액으로부터 방적된 섬유의 파괴변형도, 인장강도 및 영계수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 재조합 실크 단백질의 도프 농도에 따른 섬유의 인장 강도, 강도 및 영계수을 나타내는 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "실크 단백질"이란, 천연 실크 단백질과 분자상 및 구조상 프로파일이 거의 근사한 합성 실크단백질로서 재조합 단백질 생산방법에 의해 생합성되는 단백질을 의미하며, 예시적으로 드레그라인 실크 (dragline silk), 실크 피브로인(silk fibroin), 및 편모상 실크(flagelliform silk) 등을 들 수 있다. 아울러, 본원에서 "실크 유사 단백질"이란 실크 단백질과 유사하게 글리신 함량이 10% 이상인 펩타이드를 반복단위로 포함하는, 재조합 단백질 생산방법 등에 의해 생합성되는 단백질로서, 예시적으로 엘라스틴(elastin), 비서스(byssus), 및 콜라겐(collagen) 등을 들 수 있다.
본원에서 "거미줄 섬유"란 합성된 재조합 실크 단백질을 이용하여 제조된, 천연 거미줄 섬유와 거의 유사한 섬유를 의미하며, "거미줄 유사 섬유"란 합성된 재조합 실크 유사 단백질을 이용하여 제조된, 거미줄 섬유와 유사한 물성을 갖는 섬유를 의미한다.
본원에서 "재조합 단백질"이란, 벡터, 즉 자가복제할 수 있는 플라스미드나 바이러스 등으로 삽입되거나, 또는 숙주 (host cell)의 게놈 DNA 내로 삽입되거나, 또는 숙주 내에서 별개의 분자의 형태로 존재하도록 삽입된 핵산 서열에 의하여 코딩되는 단백질로서, 상기 핵산서열이 발현(expression)된 단백질을 의미한다.
본원에서, "숙주세포 (host cell)"란, 다른 세포 또는 기관에서 유래된 기능성 유전자 및/또는 유전자 산물을 발현할 수 있는 임의의 세포를 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 글리신 함량이 10% 이상인 펩타이드가 64~160회 반복되어 있는 구조를 가지는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질에 관한 것이다.
이때, 상기 실크단백질 또는 실크 유사단백질을 구성하는 글리신 함량이 10% 이상인 펩타이드는 드레그라인 실크 (dragline silk), 엘라스틴(elastin), 실크 피브로인(silk fibroin), 비서스(byssus), 편모상 실크(flagelliform silk) 및 콜라겐(collagen)로 구성된 군에서 선택된 단백질을 구성하는 반복단위 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열은 드래그라인 실크단백질의 반복단위 펩타이드이며, 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열은 엘라스틴의 반복단위 펩타이드이며, 서열번호 8의 아미노산 서열은 실크 피브로인의 반복단위 펩타이드이며, 서열번호 9의 아미노산 서열은 비서스의 반복단위 펩타이드이고, 서열번호 10의 아미노산 서열은 편모상 실크의 반복단위 펩타이드이고, 서열번호 11 및 12는 콜라겐의 반복단위 펩타이드이다.
서열번호 1: NH2-SGRGGLGGQGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH
서열번호 2: NH2-GPGQQ-COOH
서열번호 3: NH2-GPGGY-COOH
서열번호 4: NH2-GGYGPGS-COOH
서열번호 5: NH2-GVGVP-COOH
서열번호 6: NH2-VPGG-COOH
서열번호 7: NH2-APGVGV-COOH
서열번호 8: NH2-GAGAGS-COOH
서열번호 9: NH2-GPGGG-COOH
서열번호 10: NH2-GPGGX-COOH
서열번호 11: NH2-GAPGAPGSQGAPGLQ-COOH
서열번호 12: NH2-GAPGTPGPQGLPGSP-COOH
본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 반복단위로 하여 64회 포함하도록 제조된 재조합 실크 단백질 (이하, "64mer"라 합니다)이 약 192.8kDa의 분자량을 가져, 기존에 대장균에서 합성된 가장 큰 드래그라인 실크단백질 (163kDa)보다도 더 큰 분자량을 가지는 재조합 실크 단백질의 생산이 가능함을 입증하였다. 뿐만 아니라, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 반복단위로 하여 96회 포함하도록 제조된 재조합 실크 단백질 (이하, "96mer"라 합니다)의 경우, 그 분자량이 284.9kDa에 달하여, 거미로부터 수득한 천연 실크 단백질의 분자량(250~320kDa)과 거의 유사한 고분자량을 가지는 것을 확인하였다.
다만, 상기 펩타이드 서열을 160회 이상 반복단위로 포함할 경우에는 대장균이 가지는 단백질의 합성범위를 벗어나는바, 본 발명에 따른 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질은 펩타이드가 64~160회 반복되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 80~160회, 더욱 바람직하게는 96~160회 반복되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 반복단위로서 사용되는 아미노산 서열은 상기 서열번호 1 내지 12의 정확한 서열에 제한되지 않는다. 또한, 여기서 아미노산 서열은 변이체들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열은 또한, 삽입, 결실 및 치환에 의하여 달라지는 모든 서열을 포함한다.
바람직하게는, 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체한 결과, 다시 말해 보존성 아미노산 대치(conservative amino acid replacement)이다. 아미노산 치환은 연관된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성(amphipathic) 본성의 유사성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성이 중성인 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하며; 양으로 대전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하며; 음으로 대전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
상기 반복단위 내 "삽입" 또는 "결실"은 전형적으로 약 1 내지 5 아미노산의 범위이며, 바람직하게는 약 1, 2 또는 3 아미노산이다. 이때, 반복단위내 삽입되는 아미노산의 부가로 인하여 증가되는 아미노산의 부가는 전형적으로 100 미만이며, 바람직하게는 80 미만이며, 더욱 바람직하게는 50 미만이며, 가장 바람직하게는 20 아미노산 미만인데, 본 발명의 반복단위내로 삽입되어 단백질 내로 삽입 및/또는 단백질에 부가된다. 본 발명에서는 본 명세서에 기재된 단백질의 요구되는 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는, 그러한 부가만을 고려하고 있음을 유념할 필요가 있다.
허용되는 변형은 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질에 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 체계적으로 실행하고 얻어지는 재조합 변형체의 활동성을 분석함으로서 실험적으로 결정될 수 있다. 이는 당업자로 하여금 통상적인 실험 이상의 것을 요구하는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1과 적어도 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노선 서열을 반복단위로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본원에서, "적어도 90% 이상"의 상동성을 가짐은, 서열번호 1의 서열과 91, 91.5, 92, 92.5, 93, 93.5, 94, 94.5, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99, 99.5%의 일치를 보임을 의미하며, "상동성"이란, 두 아미노산 서열 간의 유사성의 정도를 의미한다. 상동성이 있다는 것은, 서열 및 기능성 유사한 것을 의미한다. 상동성 비교는 육안으로 수행될 수 있으나, 통상적으로는 쉽게 접근가능한 서열 비교 프로그램을 이용하여 2 이상의 서열간 상동성 퍼센트를 계산할 수 있다 (Wilbur, W. J. & Lipman, D. J., Proc. Natl . Acad . Sd. USA., 80:726, 1983).
본 발명에 있어서, 상기 재조합 실크 단백질 또는 재조합 실크 유사 단백질은 서열번호 1 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 64회 내지 160회 반복되어 있는 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 박테리아에서 제조된 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 박테리아를 배양하여 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 회수하는 단계를 포함하고, 서열번호 1 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 64회 내지 160회 반복되어 있는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 이때, 바람직하게는 상기 박테리아는 대장균을 사용할 수 있다. 즉, 종전에 고분자량의 재조합 실크 단백질의 제조가 보고되지 않았던 것과 달리, 본 발명에서는 대장균과 같은 박테리아에서 글리신 tRNA를 코딩하는 염기서열을 서열번호 1의 아미노산 서열을 반복단위로 갖는 실크 단백질을 코딩하는 유전자와 동시발현시킴으로써, 192.8kDa 이상의 고분자량을 가지는 재조합 실크 단백질을 제조하였다. 이에 서열번호 1의 아미노산 서열을 반복단위로 갖는, 본 발명에 따른 실크 단백질은 192.8 내지 482kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 방적하여 제조된 향상된 물성을 가지는 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자량의 재조합 실크 단백질 또는 재조합 실크 유사단백질을 포함하는 도프 용액을 출사돌기를 통하여 방사하여 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 섬유를 생산할 수 있다.
본원에서 "도프 용액(dope solution)"은 실크 단백질을 함유하는 모든 액체 혼합물을 의미하며, 거미줄 섬유의 형성 또는 필름 캐스팅을 위해 압출성형된다. 도프 용액은 또한, 단백질 단위체(single chain) 외에도 이것을 모노머(monomer)로 생각했을 때, 예를 들면, 다이머, 트라이머, 및 테트라머와 같은 고차 응집체(higher order aggregate)를 포함할 수 있다. 보통, 도프 용액은 pH 4.0 - 12.0의 수용액이고, 40% (w/v) 미만의 유기물 또는 카오트로픽제(chaotropic agent)를 갖는다. 바람직하게는, 도프 용액은 유기 용매 또는 카오트로픽제를 전혀 함유하지 않지만, 용액의 보존성, 안정성 또는 작업성을 향상시키기 위한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 도프 용액은 20~80%(w/v)의 재조합 실크 단백질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 습식방사 시, 상기 도프 용액은 액체 응고조로 방적되는 것을 특징으로 할 수 있는데, 바람직하게는 상기 액체 응고조는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴(acetonitrile), 물(water) 및 수용성 황산암모늄(aqueous ammonium sulfate)로 구성된 군에서 선택되는 액체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 제조되는 거미줄 섬유의 직경은 상기 출사돌기의 직경에 의하여 결정되는데, 상기 거미줄 섬유는 직경이 0.6~50㎛으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 습식방사로 제조된 거미줄 섬유의 장력, 영계수 및 파괴변형도와 같은 물리적 특성을 측정하여, 본 발명에 따른 고분자량의 재조합 실크 단백질을 이용하여 향상된 물리적 특성을 갖는 거미줄 섬유의 제공이 가능함을 확인하였다. 특히, 96mer의 재조합 실크단백질로 제조된 섬유는 508 ± 108 MPa의 인장 강도와 15 ± 5%의 파괴변형도를 보였으며, 이는 자연적인 N. clavipes 의 거미 드래그라인 실크 (740-1,200 MPa; 18-27%)와 비교할만하다. 특히, 96mer 섬유의 영계수(Young's modulus)는 21±4 GPa로, 자연적인 드래그라인 실크 (11-14 GPa)의 영계수의 2배였다. 본 발명에서의 96mer 섬유의 인장강도 (508 ± 108 MPa)는 현재까지 보고된 재조합 거미줄 단백질 중 가장 높은 인장강도이다.
아울러, 앞서 언급한 습식방사 방법이외에도 상기 고분자량의 재조합 실크 단백질 또는 재조합 실크 유사단백질을 포함하는 용액에 전압을 가하여 가해진 전기장의 방향으로 분사시키는 전기방사방법으로도 섬유생산이 가능하며, 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 섬유 또는 거미줄 유사섬유를 이와 같은 방법으로 얻을 수 있다.
예를 들어, 재조합 실크 단백질을 각각 상온에서 이틀간 헥사플루오로아이소프로판올(hexafluoroisopropanol (HFIP; Sigma))에 녹여서 12% (w/v) 실크 용액을 얻을 수 있다. 전기방사 과정에서, 백금선 전극이 사용된 유리 피펫 끝의 실크 용액 한 방울에, 12kV의 전압을 가하고, 가해진 전기력이 실크 용액 한 방울의 표면 장력을 넘을 때, 섬유 제트가 형성되어 가해진 장의 방향으로 분사된다. 섬유는 알루미늄으로 덮힌 편평한 판 위의 유리 재질 위에 모을 수 있으며, 어느 정도의 전기방사된 섬유는 베타면 형성을 유발하기 위해 메탄올 처리를 할 수 있다. 이때 24시간 동안 상온에서 배양된 뒤 3일 간 공기 건조된 후에 물성측정을 할 수 있다.
그 다음, 원자력간 현미경 힘 곡선 측정으로부터, 사용된 각 표본의 탄성계수를 계산할 수 있다. 상온 (21℃) 에서 캔틸레버 편향도 전이를 위한 광 감지기의 감도 측정 후, 실리콘 캔틸레버 (FESP, Veeco Instruments Inc.) 와 함께 원자력간 현미경 Dimension V (Veeco Instruments Inc., Plainview, NY) 를 이용하여 힘-거리 곡선이 그려진다. 각 표본에 대해 대략 20번씩 측정이 이루어지는데, 탄성도 측정을 위해, 각각의 힘 곡선에 확장된 헤르츠 모델이 적용될 수 있다 (Hertz, 1882, Sneddon, 1965). 도출된 적용 변수들로부터 곧바로 탄성도가 산출된다. 헤르츠 모델에서, 탄성 계수 E는 다음과 같이 주어진다.
E = pF(1-2)/ (2a 2tana) (식 1)
F = kd (식 2)
여기에서 F, , a, k, d 는 각각 팁에서의 힘, 포이즌의 비율, 표본의 변형, 캔틸레버의 용수철 상수, 캔틸레버의 편향도를 가리킨다. 팁의 모양과 용수철상수, 캔틸러버팁의 종류와 편향도, 표본의 포이즌 비율등의 정보로부터 섬유가 가지는 탄성계수를 구할 수 있다.
한편, 본 명세서에 정의된 재조합 실크단백질/재조합 실크유사단백질 및 이로부터 제조된 섬유, 필라멘트, 필름, 발포체, 구체, 나노피브릴, 하이드로겔 등은 생물공학적 분야 및/또는 의약 분야, 바람직하게는 창상 봉합 또는 피복 시스템의 제조, 신경수술 또는 안과 수술에서 사용하기 위한 봉합사 재료의 제조용으로 사용될 수 있다. 또한, 단백질/실은 대체 재료, 바람직하게는 인공연골 또는 힘줄(tendon) 재료의 생산을 위해 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 거미줄 섬유 또는 거미줄 유사섬유는 의료용 접착 스트립, 피부 이식, 대체 인대, 수술용 체장막(surgicalmesh) 등의 의료 기기; 의류용 직물, 방탄조끼 안감, 컨테이너 직물, 가방 또는 지갑 끈, 케이블, 로프, 접착 결합 재료, 비-접착 결합 재료, 가죽끈 재료, 자동차 커버 및 부품, 항공기 건조(aircraft construction) 재료, 내후성 재료, 유동적인 파티션 재료, 스포츠 장비 등의 넓은 범주의 공업 및 산업 제품의 제조; 및 사실상 요구되는 특성이, 높은 인장 강도 및 탄성인, 거의 모든 섬유 또는 직물의 용도로 사용될 수 있다. 건조 분무코팅, 비드 유사 입자 등과 같은 다른 형태에서 안정한 섬유 제품의 적응성 및 용도, 또는 다른 조성물과 함께 혼합물에서의 사용 또한 본 발명에서 고려된다.
본 발명의 재조합 실크 단백질 및 재조합 실크 유사단백질은 셀룰로오스 및 케라틴 및 콜라겐 제품에 첨가될 수 있으며, 따라서 본 발명은 또한 셀룰로오스 및/또는 케라틴 및/또는 콜라겐 및 본 발명의 재조합 단백질을 포함하는 종이 또는 피부 관리 및 모발 관리 제품에 관한 것이다. 본 발명의 단백질이 도입된, 종이 및 피부 관리 및 모발 관리 제품은 개선된 특성, 특히 개선된 인장 강도 또는 인열 강도(tear strength)를 나타낸다. 또한, 본 발명의 고분자량의 재조합 단백질은 직물 및 가죽 제품의 코팅으로 사용될 수 있으며, 그에 따라 코팅된 제품의 안정성 및 내구성을 부여한다. 실크 단백질은 특히 가죽 제품 코팅에 대한 적용성을 보이는데, 이러한 경우, 무두질(tanning) 및 환경에 대한 악영향을 회피하거나 또는 적어도 감소시킬 수 있기 때문이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 고분자량 재조합 실크 단백질의 발현 벡터 pSH32 , pSH48 , pSH64 , pSH80 및 pSH96 와 글리신 tRNA 를 코딩하는 염기서열의 발현 벡터의 제작 및 다양한 분자량의 재조합 실크 단백질의 제조
1-1: pSH32 , pSH48 , pSH64 , pSH80 및 pSH96 의 제작
유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al ., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 재조합 플라스미드 pSH32를 제작하기 위하여, 플라스미드 pSH16a (Lee et al ., Theories and Applications of Chem . Eng ., 8(2):3969, 2002) (서열번호 13) 를 제한효소 SpeI과 NheI (New England Biolabs, 미국)으로 절단하여 1.7 kb의 조각을 얻어, 제한효소 SpeI으로 처리하고 탈인산화된 플라스미드 pSH16a와 연결시켜서 서열번호 14의 32mer 실크단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 플라스미드 pSH32를 수득하였다. 연결된 삽입된 방향은 제한효소 SpeI과 NheI으로 잘라서 확인하였다. 같은 방법으로, 플라스미드 pSH16a를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 1.7 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH48을, 플라스미드 pSH32를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 3.4 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 서열번호 15의 64mer 실크단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 플라스미드 pSH64를 획득하였다. 각각 연결된 삽입된 방향은 제한효소 SpeI과 NheI으로 잘라서 확인하였다. 더불어,같은 방법으로 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH64에, 각각 pSH16a 또는 pSH32의 SpeI-NheI 로 절단된 DNA 조각을 삽입함으로서, 각각 서열번호 16의 80mer 실크단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 pSH80과 서열번호 17의 96mer 실크단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 pSH96 플라스미드를 제작하였다. 각 플라스미드의 삽입된 방향은 SpeI 과 NheI 로 절단함으로써 확인하였다. 재조합 실크 단백질 발현을 위한 발현구조와 반복단위체의 아미노산 서열은 도 1과 같다. 이때, 서열번호 1의 아미노산 반복단위체에 대응하는 핵산서열은 서열번호 18로 표시되는 핵산서열과 같다.
1-2: pTet - glyVXY 벡터의 제작
유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 글리신 tRNA를 암호화하는 glyVWX 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110 (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic) 균주로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 19: 5'-GCTCGATATCTAACGACGCAGAAATGCGAAA-3'
서열번호 20: 5'-CATTGGATCCTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3'
PCR은 Pfu 폴리머라제 (polymerase) (SolGent, 한국)를 사용하였으며, 반응 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성 (denaturation)은 95℃에서 4 분간 한 번 하였으며, 이 후 두 번째 변성은 95℃에서 20 초간, 결합 (annealing)은 51℃에서 30 초간, 연장 (extension)은 72℃에서 60 초간 수행하였으며, 이를 10 회 반복하였다. 그리고 추가로 95℃에서 20 초간 변성, 60℃에서 30 초간 결합, 72℃에서 60 초간 연장을 19회 반복하였다. 이 후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한 번 수행하였다.
상기 PCR에 의해 얻어진 DNA을 아가로스 젤 전기영동하여, 정제된 479 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 BamHI과 EcoRV (New England Biolabs, 미국)로 동시에 자르고, 지속적으로 발현될 수 있는 테트라사이클린 (tetracycline) 저항 유전자 (tet)의 프로모터를 이용하기 위해, 플라스미드 pACYC184 (New England Biolabs, 미국)도 같은 제한효소들로 절단하였다. 절단한 PCR 산물과 플라스미드를 T4 DNA 리가아제 (ligase) (Roche, 독일)로 연결 (ligation)시키고, 이를 대장균 Top10 (F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)￠0lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG)에 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 포함한 LB 아가 고체배지 (트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, 아가 15 g/L)에서 선택하여, 재조합 플라스미드 pTet-glyVXY를 수득하였다. 제작된 재조합 플라스미드는 제한효소로 잘라서 확인하고, 염기 서열 분석으로 확인하였다.
1-3: 재조합 플라스미드 pTet - gly2 의 제작
유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 글리신 tRNA를 암호화하는 glyVXY 유전자를 더욱 과량 발현시키기 위하여, pTet-glyVXY를 주형으로 하고 서열번호 21, 22의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 21: 5'-GGCTCGCATGCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA-3'
서열번호 22: 5'-ATTGTCGACTGCTGCAGTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3'
PCR은 Pfu 폴리머라제 (polymerase) (SolGent, 한국)를 사용하였으며, 반응 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성 (denaturation)은 95℃에서 3 분간 한 번 하였으며, 이 후 두 번째 변성은 95℃에서 20 초간, 결합 (annealing)은 52℃에서 30 초간, 연장 (extension)은 72℃에서 50 초간 수행하였으며, 이를 10 회 반복하였다. 그리고 추가로 95℃에서 20 초간 변성, 62℃에서 30 초간 결합, 72℃에서 50 초간 연장을 19회 반복하였다. 이 후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한 번 수행하였다.
상기 PCR에 의해 얻어진 DNA을 아가로스 젤 전기영동하여, 정제된 674 bp의 PCR 산물을 얻었다. 647 bp의 PCR 산물과 플라스미드 pTet-glyVXY를 제한효소 SphI과 SalI (New England Biolabs, 미국)으로 각각 절단하고 T4 DNA 리가아제 (ligase) (Roche, 독일)로 연결시킨 후, 이를 대장균 Top10 에 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 포함한 LB 아가 고체배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, 아가 15 g/L)에서 선택하여, 재조합 플라스미드 pTet-gly2를 수득하였다. 제작된 재조합 플라스미드는 제한효소로 잘라서 확인하고, 염기 서열 분석으로 확인하였다.
1-4: 다양한 분자량의 재조합 실크 단백질의 제조
다양한 분자량의 재조합 실크 단백질을 제조하기 위하여, 실시예 1-1에서 제조된 pSH16a 벡터 및 pSH32 벡터는 각각 실시예 1-2에서 수득한 pTet-glyVXY와 대장균 BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB(rB - mB -) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 넣었다. 한편, pSH64 벡터 및 pSH96 벡터는 각각 실시예 1-3에서 수득한 pTetgly2 벡터와 대장균 BL21 (DE3)에 넣었다. 이렇게 형질전환된 균주들을 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 25 mg/L 카나마이신 (kanamycin)이 포함된 LB 액체 배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 지속적으로 흔들어주며 배양하였다. 1% 접종 후 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.2, 0.4 또는 0.6일 때, 1 mM IPTG를 첨가하여 실크 단백질 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 5 시간 후에 배양액을 채취하였다.
제조된 재조합 단백질 분석을 위해, 채취된 배양액을 4℃, 10,000 g에서 10분간 원심분리를 하여 세포 덩어리 (pellet)를 얻고, 이를 TE 완충용액과 5x Laemmli 샘플 완충용액에 녹였다. 같은 양 (0.024 mg)의 샘플을 10% SDS-PAGE를 이용해 분리하고, Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, 미국) 용액으로 염색하여, GS-710 Calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad, 미국)를 이용하여 정량하고, 전체 단백질 양은 Bradford의 단백질 정량법을 따라, Bovine serum albumin을 기준용액으로 계산함으로써 용액 내 해당 단백질의 양을 측정하였다 (Bradford, M. M., Anal . Biochem ., 72:248, 1976).
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 각 16mer (pSH16a 벡터 이용), 32mer (pSH32 벡터 이용), 64mer (pSH64 벡터 이용) 및 96mer(pSH96 벡터 이용)의 재조합 실크단백질이 각각 약 50.4, 100.7, 192.8 및 284.9kDa의 분자량을 가지는 것으로 나타났다. 즉, 현재까지 대장균에서 합성된 가장 큰 드레그라인 실크 단백질은 그 분자량이 163kDa에 불과하였으며 이보다 고분자량을 갖는 실크 단백질의 생산이 어려운 것으로 알려져 있었으나(Fahnestock, S. R. & Irwin, S. L., Appl . Microbiol. Biotechnol., 47:23, 1997; Vendrely, C. & Scheibel, T., Macromol . Biosci., 7:401, 2007; Lazaris, A., et al., Science , 295:472, 2002), 상기와 같이 글리신 tRNA를 코딩하는 염기서열을 발현하는 벡터와 동시에 발현시킴으로써, 192.8kDa 및 284.9kDa과 같은 고분자량의 재조합 실크 단백질의 제공이 가능함을 확인하였다.
실시예 2: 습식방사법에 의한 거미줄 섬유의 제조-분자량이 습식방사된 섬유의 기계적 성질에 미치는 영향
실시예 1-2에서 제조된 고분자량의 재조합 실크 단백질을 각각 방사 용매로 헥사플루오로아이소프로판올(hexafluoroisopropanol (HFIP; Sigma))에 녹여서 방사 도프 용액을 만든 후, 도프 용액을 시간당 1~2ml 속도의 펌프 (KDS100; KD Scientific) 를 이용하여 사출성형하였다. 도프 용액의 농도는 용해성과 탄성의 이유로 인한 자연적 크기의 96mer 단백질의 최대 작동 농도는 20% (w/v)인 바, 모두 농도를 20% (w/v)로 하여 실크 단백질을 방사하였다. 이때, 26 G 시린지 바늘(Korea Vaccine Co., Ltd.)을 통해 1-ml Kovax 시린지로부터 사출되어, 90% (v/v) 메탄올이 포함된 물이 들어있는 응고 배치로 사출 성형되었다.
방사한 후, 방적된 섬유는 응고 배치 내에서 20분간 방치되었고, 손으로 잡아 늘였을 때 각각의 섬유는 원래 길이의 5배까지 늘어났다. 섬유의 응력-변형도 곡선은 도 3에 나타난 바와 같다.
그런 다음 섬유는 상온에서 건조되었고, 측정을 위해 수축을 방지하고 늘어난 길이를 유지해야 하므로 섬유가 받는 장력을 지속시켰다. 시험하기 전에, 표본들 (n=10) 은 상온에서 24시간 동안 50% 상대습도 하에 있었다. 장력 측정은 Universal tensile tester (RB302 ML, R&B Inc.)로 수행하였고, 100 g load cell이 사용되었다. 게이지의 길이는 20 mm였고, cross-head 속도는 분당 10 mm였다. 기계적 성질에 관한 자료들은 (평균값) ± (표준편차) (n=10) 로 표기되었다. Unpaired t-test를 사용하여 통계 테스트를 수행하였으며, P<0.05인 경우에 통계적으로 의미있는 것으로 간주하였다.
측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 실크 단백질의 분자량 증가에 따른 섬유의 파괴변형도, 인장강도, 영계수(Young's modulus)와 같은 기계적 성질의 향상되는 것을 확인할 수 있었다 (32mer: 파괴변형도 3.27±0.32%, 인장강도 202±25MPa, 영계수 8.28±0.85GPa; 64mer: 파괴변형도 4.31±0.64%, 인장강도 252±26MPa, 영계수 10.14±0.67GPa; 96mer: 파괴변형도 15±5%, 인장강도 508±108MPa, 영계수 21±4GPa). 특히 284.9kDa에 달하는 96mer의 재조합 실크 단백질로 제조된 거미줄 섬유의 경우, 64mer 이하의 재조합 실크 단백질로 제조한 거미줄 섬유에서의 증가추세에 비추어 볼 때 파괴변형도, 인장강도 및 영계수 모든 분야에서 예상치 못한 정도로 현저하게 증가된 것으로 나타났다.
즉, 96mer의 재조합 실크단백질로 제조된 섬유는 508 ± 108 MPa의 인장강도와 15 ± 5% 의 파괴변형도를 보였으며, 이는 자연적인 N. clavipes 의 거미 드래그라인 실크 (740-1,200 MPa; 18-27%)와 비교할만하다. 특히, 96mer 섬유의 영계수는 21 ± 4 GPa로, 자연적인 드래그라인 실크 (11-14 GPa)의 영계수의 2 배였다. 본 발명에서의 96mer 섬유의 인장강도 (508 ± 108 MPa)는 현재까지 보고된 재조합 거미줄 단백질 중 가장 높은 인장강도이다.
실시예 3: 도프 농도가 습식방사 섬유의 성질에 미치는 영향
재조합 실크 단백질의 도프 농도가 방사된 섬유의 성질에 미칠 영향을 시험하기 위해, 16mer, 32mer 및 64mer의 단백질을 각각의 최대 작동 농도로 방사하여 실시예 2와 대비하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 16mer의 단백질 농도가 20%에서 최대 농도인 30%까지 증가했을 때, 섬유의 성질이 매우 향상되었으나, 32mer 단백질의 경우, 단백질의 농도가 20%에서 최대 농도인 27%로 증가했을 때, 파괴변형도와 인장강도가 증가하였으나, 통계적으로 의미있는 정도는 아니었으며, 64mer 단백질의 경우, 최대 작동 농도는 23%였으며, 이는 이미 시험한 20%와 크게 다를 바 없는 것으로 나타났다. 즉, 기계적 성질에는 변화가 거의 없었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (17)

  1. 다음의 단계를 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 64회 내지 160회 반복되어 있는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법:
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 64회 내지 160회 반복되어 있는 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터가 박테리아를 배양하여 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 생성하는 단계; 및
    (b) 생성된 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질에 포함된 글리신 함량은 10% 이상인 것을 특징으로 하는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드가 64회 내지 96회 반복되어 있는 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질은 192.8 내지 284.9kD인 것을 특징으로 하는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 드레그라인 실크 (dragline silk) 단백질을 구성하는 반복단위 펩타이드인 것을 특징으로 하는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항의 서열번호 1을 가지는 펩타이드가 64회 내지 160회 반복되어 있는 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질의 제조방법에 의해 제조된 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 포함하는 도프 용액을 방사하는 것을 특징으로 하는 마이크로 크기 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 20~80%(w/v)의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질을 포함하는 도프 용액을 습식방사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 도프 용액은 액체응고조로 방적되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 액체응고조는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴(acetonitrile), 물(water) 및 수용성 황산암모늄(aqueous ammonium sulfate)로 구성된 군에서 선택되는 액체를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제10항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 64회 내지 96회 반복되어있는 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질은 4.3 내지 15.5% 파괴변형도, 226 내지 616MPa 장력 및 9.47 내지 25GPa 영계수를 가지는 것을 특징으로 하는 거미줄 섬유를 제조하는 방법.
KR1020100021934A 2010-03-11 2010-03-11 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유 KR101317420B1 (ko)

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