CN104946710A

CN104946710A - 蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法

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Publication number: CN104946710A
Application number: CN201510276014.0A
Authority: CN
Inventors: 夏小霞; 杨雁祥; 钱志刚; 钟建江
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2015-09-30

Abstract

一种生物工程领域的蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法，该方法首先在大肠杆菌中构建高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒并表达生产，在蛋白表达生产过程中通过降低培养温度提高蛋白产量；随后在发酵罐的水平上结合高密度发酵和降低培养温度的策略，实现了细胞量和表达水平的双重提高。本发明能够有效克服高度重复的重组蜘蛛牵引丝蛋白在生产发酵过程中表达量低的缺陷；为蜘蛛丝蛋白及类似高度重复序列蛋白的发酵生产研究和应用提供了良好借鉴意义。

Description

蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物领域重复序列蛋白的优化表达方法，具体是指一种络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)的牵引丝蛋白MaSp的表达生产优化。

背景技术

天然蜘蛛牵引丝蛋白，是由蜘蛛体内大悬壶腺体分泌形成的一种蛋白质多聚体，素有“蜘蛛生命线”之称；拥有高强度、高弹性、高断裂功的机械性能，同时具有良好的生物相容性、生物可降解性等优良特性，是自然界中综合性能最好的天然生物材料之一。其主要由两种蛋白质组成，蜘蛛牵引丝蛋白1和蜘蛛牵引丝蛋白2(MaSp1&2)。这两种牵引丝蛋白都是高分子量蛋白，分子量主要分布在250‐350kDa之间；之前研究表明，MaSp1主要负责刚性性能而MaSp2负责弹性性能。两种蜘蛛牵引丝蛋白都是由三部分构成，N‐端的结构域、大分子量高度重复片段、C‐端的结构域，其中的高度重复序列对于其性能起到重要的作用，络新妇属蜘蛛牵引丝蛋白的全基因序列尚未报道，只有部分cDNA核心序列被解析。天然蜘蛛丝蛋白富含丙氨酸和甘氨酸，丙氨酸富集区可以形成疏水的b‐折叠晶体结构，是蜘蛛丝蛋白具有高强度的重要原因。然而，由于蜘蛛的强烈自我保护意识和地域攻击性，难以通过大规模养殖蜘蛛来获得大量蜘蛛丝蛋白。

针对这个问题，人们通过设计氨基酸序列并人工合成氨基酸和基因序列，随后导入到不同的宿主细胞中表达生产重组蜘蛛牵引丝蛋白。特别是从90年代蜘蛛牵引丝蛋白1和2的cDNA序列被部分解析后，人们对这种由蛋白质构成、具有优良特性的新生物合成材料探究和发掘越来越多。随着基因技术和基因化学合成方法的建立和发展，利用活细胞的合成体系创造新蛋白质的基因工程技术日臻完善；国内外许多实验室已进行了人工合成蜘蛛丝蛋白的尝试(1.Lewis R.V.,Hinman M.,Kothakota S.,Fournier M.J.Expression and purification of a spider silkprotein:a new strategy for producing repetitive proteins.Protein expression and purification.1996,7(4):400‐406；2.Fahnestock S.R.,Bedzyk L.A.Production of synthetic spider dragline silkprotein in pichia pastoris.Applied microbiology and biotechnology.1997,47(1):33‐39；3.Arcidiacono S.,Mello C.,Kaplan D.,Cheley S.,Bayley H.Purification and characterization ofrecombinant spider silk expressed in Escherichia coli.Applied microbiology and biotechnology.1998,49(1):31‐38；4.Fahnestock S.R.,Irwin S.L.Synthetic spider dragline silk proteins and theirproduction in Escherichia coli.Applied microbiology and biotechnology.1997,47(1):23‐32；5.LazarisAnthoula,Arcidiacono Steven,Huang Yue,Zhou Jiang‐Feng,DuguayChretienNathalie,Welsh Elizabeth A.Soares,Jason W.,Karatzas Costas N.Spider silk fibers spun from solublerecombinant silk produced in mammalian cells.Science.295(5554):472‐476和6.Scheller Jürgen,Gührs Karl‐Heinz,Grosse Frank,Conrad Udo.Production of spider silk proteins in tobacco andpotato.Nature biotechnology.2001,19(6):573‐577)。

专利文献号WO2004/016641公布了编码来自Euprosthenopssp的MaSp1蛋白的内部重复部分的核苷酸序列，但并没有表达蛋白质。专利文献号WO2003/057727公开了重组蜘蛛丝蛋白多肽在哺乳细胞系中的表达，但分子量较低，不能很好的模拟天然蜘蛛牵引丝的特性。专利文献号EP 2 330 186 B1公布了在大肠杆菌中生产了与天然蜘蛛牵引丝蛋白相媲美的重组蜘蛛牵引丝蛋白1并采取了代谢工程的手段提高了胞内gly‐tRNA的含量实现了产量的数十倍的提高，基因操作较为复杂。

大肠杆菌具有遗传背景研究透彻、易于繁殖培养、细胞易于破碎、成本低廉、基因水平操作简单等特点，是最常用的蛋白表达体系之一。然而，目前已报道的利用大肠杆菌生产蜘蛛丝蛋白存在产量低的问题，尤其是高分子量高重复序列的蜘蛛牵引丝蛋白的表达量低。因此探索一种简单、方便，并显著提高蜘蛛牵引丝蛋白产量的策略具有重大的意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法，在大肠杆菌中首先构建高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒并表达生产，通过降低培养温度提高蛋白产量；随后在发酵罐的水平上结合高密度发酵和降低培养温度的策略，实现了细胞量和表达水平的双重提高。本发明能够有效克服高度重复的重组蜘蛛牵引丝蛋白在生产发酵过程中表达量低的缺陷；为蜘蛛丝蛋白及类似高度重复序列蛋白的发酵生产研究和应用提供了良好借鉴意义。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括以下步骤：

步骤1)设计络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，并使用两个同尾酶NheI和SpeI进行无缝拼接，合成出含有不同长度的蜘蛛牵引丝蛋白的重组质粒，并以大肠杆菌作为宿主表达生成工程菌；

所述的络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，具体是指：络新妇属(Nephilaclavipes)蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1和2，其中MaSp1单体核心序列的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，即：

N’‐GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG‐C’，来源于文献Xu Ming and Randolph V.Lewis*,Structure of a protein superfiber:Spider dragline silk.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990,87,7120–7124。

人工设计的MaSp1单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No.2所示，即：

5’‐GGTCGCGGCGGTCTGGGTGGCCAGGGTGCAGGTGCGGCTGCGGCTGCAGGCGGTGCTGGCCAAGGTGGCTACGGCGGCCTGGGTTCTCAGGGT‐3’。

其中MaSp2单体核心序列的氨基酸序列如Seq ID No.3所示，即：

N’‐GPGGYGPGQQGPSGPGSA₈GPGGYGPGQQ‐C’，来源于文献Micchael B.Hinman and Randolph V.Lewis*,Isolation of a clone encoding a second dragline silk fibroin.The Journal of BiologicalChemistry.1992,267:19320‐19324。

人工设计的MaSp2单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No.4所示，即：

5’‐GGTCCTGGTGGTTATGGTCCAGGTCAACAGGGTCCATCTGGTCCAGGTAGTGCAGCGGCTGCGGCAGCAGCGGCAGGTCCTGGAGGTTATGGTCCTGGTCAGCAA‐3’。

所述的蜘蛛牵引丝蛋白的核心序列的重复数目在8～96之间

步骤2)对步骤1得到的工程菌进行一级种子培养和二级种子培养，然后通过低温培养实现优化量产，具体步骤包括：

2.1)从冷冻状态下将工程菌接种至培养基中常温旋转培养，获得种子液；

所述的培养基为含有抗生素的LB培养基。

所述的常温旋转培养是指：在30℃、220rpm条件下培养14h。

2.2)将种子液接种至培养基中进一步进行二级种子培养。

所述的接种是指：种子液和培养基的体积比为1：100。

所述的培养基为LB培养基或R/2培养基。

所述的R/2培养基的组分含量：2g/L磷酸氢二铵、6.75g/L磷酸二氢钾、0.85g/L柠檬酸、5mL/L微量金属溶液、10g/L葡萄糖、0.7g/L七水硫酸镁。

所述的微量金属溶液成分为：10g/L七水硫酸亚铁、2.25g/L七水硫酸锌，1g/L五水硫酸铜、0.5g/L五水硫酸锰、0.23g/L十水硼酸钠、2g/L二水合氯化钙和0.1g/L钼酸铵。

所述的二级种子培养是指：在30℃、220rpm下培养至对数生长初期OD₆₀₀＝0.4～2.0。

2.3)向菌落中进一步加入诱导剂至终浓度为1mM，然后在不超过25℃、220rpm的环境下进行低温培养。

所述的诱导剂采用异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。

所述的低温培养的温度优选为16℃。

所述的低温培养前优选进一步对二级种子进行发酵罐高密度培养。

附图说明

图1为实施例1示意图；

图中：A为构建重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒方法简图；B为部分构建质粒信息示意图。

图2为MaSp2‐64聚体在不同温度条件下进行表达生产示意图；

图中：A为LB天然培养基条件下不同培养温度的生产情况的示意图，B为R/2合成培养基不同培养温度的生产情况的示意图；其中箭头所指为目标蛋白位置。

图3为不同类型的高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白在不同温度进行表达生产的示意图；

图中：A为MaSp2‐80聚体，B为MaSp1‐96聚体；其中箭头所指为对应目标蛋白位置。

图4为低分子量蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2‐8聚体和MaSp2‐16聚体表达生产示意图；

图中箭头所指为对应目标蛋白位置。

图5为高密度发酵生产重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2‐64聚体示意图；

图中：A为30℃下表达生产，B为16℃下表达生产示意图；其中箭头所指为目标蛋白位置。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例中分别构建重组MaSp1和重组MaSp2两种重组蜘蛛丝蛋白表达载体，其中采用的菌株、质粒、酶与培养基依次为：表达质粒为pET19b和pET‐28a(+)，表达宿主为大肠杆菌Escherichia.coli BL21(DE3)，克隆宿主为大肠杆菌Escherichia.coli DH5；基因操作工具包括：限制性内切酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶；LB培养基。

所述的LB培养基的组分含量为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L氯化钠。

如图1所示，本实施例构建重组质粒方式为：采用“首尾拼接”的策略，即使用两个同尾酶NheI和SpeI，进行无缝拼接，合成出目的蛋白分子量大小在28.3kDa～256.5kDa的蜘蛛牵引丝蛋白，包括MaSp2‐8聚体、MaSp2‐16聚体、MaSp2‐64聚体、MaSp2‐80聚体、MaSp1‐96聚体等，具体操作如Teule等在“A protocol for the production of recombinant spider silk‐likeproteins for artificial fiber spinning”(表达类重组蜘蛛丝蛋白用以人工纤维纺丝的实验方案)中所记载。

实施例2

本实施例是在摇瓶体系中采用不同温度进行重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2‐64聚体表达生产，其中菌株为实施例1中得到的Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a‐MaSp2‐64聚体

本实施例包括以下步骤：

1)从‐80℃取出冻存菌种，即Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a‐MaSp2‐64聚体，接种到2mL LB培养基(含有抗生素浓度为：50mg/mL的卡那霉素)，在30℃、220rpm条件下培养14h左右。

2)取1mL种子液按照1：100比例接种到含有100mL LB培养基或R/2培养基的250mL摇瓶中，30℃、220rpm下培养至对数生长初期(OD₆₀₀＝0.4‐0.5)；

3)加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，分装20mL至4个250mL摇瓶后，分别放置到不同温度条件下摇床下进行培养，具体为：16℃、25℃、30℃、37℃，220rpm。

结果检测：选择6h为取样时间点；从不同表达生产条件下取相同细胞量菌体，于4℃、13000rpm下离心10min，吸去上清，菌体冻存于‐20℃用于后期蛋白表达水平检测。

取出冻存样品，用pH 7.40TE缓冲液悬浮后，加入5×Laemmli溶液，沸水煮15分钟，上蛋白样品至1毫米10％的SDS‐PAGE中；最后使用考马斯亮蓝R‐250对蛋白胶染色，脱色后用GS800扫描蛋白胶，分析实验结果。

如图2所示，通过降低表达生产时的培养温度，高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSpII64聚体在复杂LB培养集中，16℃蛋白的产量比30℃的产量提高近5倍；在无机盐合成培养基中，16℃蛋白的产量比30℃的产量提高近8倍。

实施例3

本实施例中采用菌株为Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a‐MaSp2‐80聚体和BL21(DE3)/pET19b‐MaSp1‐96聚体，种子培养及蛋白生产发酵操作与实施例2相同，其中MaSpI96的抗生素浓度为100mg/mL；样品处理及检测操作与实施例2相同，结果如下：

如图3所示，图3‐A是MaSp2‐80聚体的蛋白表达胶图，图3‐B是MaSp1‐96聚体的蛋白表达胶图。在30℃条件下进行表达生产的重组工程菌在加入IPTG起始表达因子之后，MaSp2‐80和MaSp1‐96蛋白表达量几乎没有；而对比温度培养温度低于25℃(本实施例中采用16℃和25℃)条件下，高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2‐80聚体和MaSp1‐96聚体的产量却很明显能够看出来，有一个明显的提高，说明低温生产高分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白有显著的效果。

实施例4

本实施例中采用菌株为Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a‐MaSp2‐8聚体和BL21(DE3)/pET28a‐MaSp2‐16聚体，种子培养及蛋白生产发酵操作与实施例2相同，样品处理及检测：取样时间点选取在第6h和第18h两个；其余内容与实施例2相同，结果如下：

如图4所示，对于小分子量蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2‐8聚体(约28kDa)，发现培养6h后30℃条件下比16℃表达水平略高；随着培养时间延长，在16℃条件下其产量有提高，而在30℃条件下，蛋白表达水平明显降低。MaSp2‐16聚体结果显示，经过6h诱导后培养温度低于25℃(本实施例采用的是16℃)条件下比30℃条件下表达水平提高约30％；而诱导时间延长后，16℃条件下其产量提高，而30℃也降低。两个结果都与之前高分子量蜘蛛牵引丝蛋白实施例结果类似，表明低温表达生产低分子量重组蜘蛛牵引丝蛋白同样具有较好的效果。

实施例5

本实施例中采用菌株为Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a‐MaSp2‐64聚体，种子及发酵培养为R/2培养基，本实施例步骤如下：

1)一级种子培养：将‐80℃保存甘油菌种转接到3mL LB培养基(含抗生素浓度为50mg/mL卡那霉素)，在30℃、220rpm条件下培养14h左右。

2)二级种子培养：取2mL过夜菌液按照1：100比例接种到含有200mL R/2合成培养基的500mL(含有抗生素浓度为：50mg/mL的卡那霉素)摇瓶中，30℃、220rpm下培养至OD₆₀₀＝2.0附近。

3)发酵罐高密度培养：采用美国New Brunswick Scientific的Bioflo 110系列的3.0L搅拌式反应器，发酵体积为1.6L。按照1:10比例接种，采用pH‐stat补料方式(即在发酵罐上设置pH电级，通过预设pH值，并在发酵过程中随时补料以维持该pH值，从而调节发酵过程)，手动补料溶液；控制溶解氧40％以上，转速800rpm，培养温度30℃。当细胞生长至OD₆₀₀约等于40时，加入IPTG至终浓度为1mM起始蛋白表达生产；此时，降低发酵生产温度低于25℃(本实施例中采用的是16℃)或者保持在30℃条件下，进行蛋白生产过程。

所述的补料溶液成分为：700g/L葡萄糖和20g/L七水硫酸镁。

样品处理及检测：用于SDS‐PAGE表达水平的样品处理和检测方法同实施例2，每隔2或4h取样一次；

细胞生长检测：每隔2或4h，取2mL发酵液细胞于4℃、13000rpm下离心10分钟，吸去上清后，细胞放置在60℃烘箱中干燥烘干至恒重，计算细胞干重。

如图5所示，通过结合细胞高密度发酵和低温表达生产蛋白的策略，目标蛋白在16℃下产量明显高于30℃水平。同时，在低温条件下细胞经过更长时间的培养后，干重明显高于30℃。也就是说，低温诱导策略不仅仅提高了重组高分子蜘蛛牵引丝蛋白MaSp2‐64聚体的表达水平，也提高了细胞量，最终实现了目标蛋白的高效生产。

Claims

1.一种蜘蛛牵引丝蛋白优化表达方法，其特征在于，在大肠杆菌中构建重组蜘蛛牵引丝蛋白质粒并表达生产获得工程菌，然后通过对工程菌进行低温表达生产的方式实现了细胞量和表达水平的双重提高，所述的低温培养具体是指：

1)从冷冻状态下将工程菌接种至培养基中常温旋转培养，获得种子液；

2)将种子液接种至培养基中进一步进行二级种子培养；

3)随后向培养液中加入诱导剂，然后在4～25℃环境下进行低温培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的构建是指：设计络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，并使用两个同尾酶NheI和SpeI进行无缝拼接，合成出不同长度目的蛋白分子量大小在28.3kDa～256.5kDa蜘蛛牵引丝蛋白的重组质粒，并以大肠杆菌作为宿主表达生产工程菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的络新妇属重组蜘蛛丝蛋白，具体是指：络新妇属(Nephilaclavipes)蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1和2，其中：

MaSp1单体核心序列氨基酸序列如Seq ID No.1所示；

人工设计的MaSp1单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No.2所示；

MaSp2单体核心序列氨基酸序列如Seq ID No.3所示；

人工设计的MaSp2单体核心序列的核苷酸序列，如Seq ID No.4所示。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的络新妇属重组蜘蛛丝蛋白MaSp1和2克隆到pT7启动子、pTac启动子或pTrc启动子。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1中所述的培养基为含有抗生素的LB培养基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤2中所述的培养基为LB天然培养基或R/2无机盐合成培养基；

所述的R/2培养基的组分含量：2g/L磷酸氢二铵、6.75g/L磷酸二氢钾、0.85g/L柠檬酸、5mL/L微量金属溶液、10g/L葡萄糖、0.7g/L七水硫酸镁；

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤3中所述的诱导剂采用异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷，其用量为终浓度为0.01～5mM。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤3中所述的低温培养的温度为16℃、220rpm的环境下培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的低温培养前进一步对二级种子进行发酵罐高密度培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征是，所述的发酵罐高密度培养是指：按照1:10比例接种，采用pH‐stat补料方式补料；控制溶解氧40％以上，转速800rpm，培养温度30℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征是，所述的补料溶液成分为：700g/L葡萄糖和20g/L七水硫酸镁。