CN109821053A - 一种可吸收医用缝合线及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供医用材料技术领域的一种可吸收医用缝合线及其制备方法。该可吸收医用缝合线的原料为改造蛛丝蛋白；所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该改造蛛丝蛋白具有蛋白酶酶切位点KSS、DSS、ESS和RSS，制备的缝合线在体内可以渐渐溶解，因此制备的缝合线无需术后拆除，可减轻患者痛苦；同时因该改造蛛丝蛋白具有良好的生物相容性和韧性，制备的缝合线具有良好的机械性能和生物学品质。本发明提供的可吸收医用缝合线原料还包括羟甲基壳聚糖，可促进伤口愈合。本发明还提供一种可吸收医用缝合线的制备方法，具体为：将可吸收医用缝合线的原料溶解得到纺丝原液；对所述纺丝原液湿法纺丝后干燥，得到所述可吸收医用缝合线。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种可吸收医用缝合线及其制备方法。
背景技术
医用缝合线根据其生物可降解性，分为不可吸收医用缝合线和可吸收医用缝合线。非吸收医用缝合线需术后拆除，给患者带来痛苦。可吸收医用缝合线在体内可降解，从而减轻患者痛苦。
目前，市场上常见的可吸收医用缝合线包括聚乙交酯缝合线、乙交酯和丙交酯缝合线、聚对二氧杂环己酮缝合线、壳聚糖缝合线等，不可吸收医用缝合线包括聚丙烯缝合线、聚酰胺缝合线、蚕丝缝合线等。
本发明的目的是提供新型材质的医用缝合材料。
发明内容
本发明提供一种可吸收医用缝合线及其制备方法。具体技术方案为：
一种可吸收医用缝合线，其原料为改造蛛丝蛋白；
所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述可吸收医用缝合线的原料还包括羟甲基壳聚糖。
进一步地，所述改造蛛丝蛋白与羟甲基壳聚糖的质量比为(5:9)-(9:5)。
上述可吸收医用缝合线的制备方法，包括如下步骤：
(1)将可吸收医用缝合线的原料溶解得到纺丝原液；
(2)对所述纺丝原液纺丝后干燥，得到所述可吸收医用缝合线。
进一步地，所述可吸收医用缝合线的原料溶解于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIP)溶剂中得到纺丝原液。
进一步地，所述纺丝原液中改造蛛丝蛋白的重量体积百分比浓度为15％-45％；所述纺丝原液中羟甲基纤维素的重量体积百分比浓度为15％-45％。
进一步地，所述纺丝原液中改造蛛丝蛋白的重量体积百分比浓度为30％；所述纺丝原液中羟甲基纤维素的重量体积百分比浓度为30％。
进一步地，步骤(2)中所述纺丝采用湿法纺丝。
进一步地，所述湿法纺丝的具体步骤为：将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从喷丝头以1-9ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝；将初生长丝取出在空气浴中进一步拉伸。
进一步地，所述凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠1-4％、乙醇4-8％、其余为去离子水。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的可吸收医用缝合线，其以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的改造蛛丝蛋白为原料，该改造蛛丝蛋白具有蛋白酶酶切位点KSS、DSS、ESS和RSS，制备的缝合线在体内可以渐渐溶解，因此制备的缝合线无需术后拆除，可减轻患者痛苦；同时因该改造蛛丝蛋白具有良好的生物相容性和韧性，制备的缝合线具有良好的机械性能和生物学品质。
2.本发明提供的改造蛛丝蛋白，通过在蛋白酶酶切位点中设置丝氨酸，保证了人体内的大部分酶可以酶解所述改造蛛丝蛋白。
3.本发明提供的改造蛛丝蛋白，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列结构为KKKKSSDSSESSRSSSSSS；蛋白酶酶切位点KSSDSSESSRSS的两端加入KKK和SSSS，可以将所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列中的酶切位点与蛛丝蛋白结构域单体间隔开，避免所述改造蛛丝蛋白在降解时，蛛丝蛋白结构域单体完整性受到影响，进而影响蛛丝蛋白结构域单体本身的功能；上述结构的蛋白酶酶切位点，保证了改造蛛丝蛋白的降解性能和改造蛛丝蛋白本身的功能。
4.本发明提供的可吸收医用缝合线原料还包括羟甲基壳聚糖，壳聚糖具有良好的化学惰性、生物相容性、降解能力和一定的抑菌作用，且无毒害性，制备的缝合线可促进伤口愈合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2中的重组蛛丝蛋白MaSp1的SDS-PAGE鉴定图，图中1为M1，2为蛋白MaSp1；
图2是本发明实施例2中的重组蛛丝蛋白MaSp1的Western blotting鉴定图，图中1为M1，2为蛋白MaSp1；
图3是本发明实验例中重组蛛丝蛋白MaSp1纤维的电镜图；
图4是本发明实验例中重组蛛丝蛋白MaSp1薄膜的电镜图。
具体实施方式
下述实施例中的表达载体pET-28a、大肠杆菌BL21、LB培养基、工具酶TEV酶酶液为市售产品。本发明的改造蛛丝蛋白可以委托生物技术公司合成，也可以按照下述的实施例的方法进行制备。
实施例1：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的改造蛛丝蛋白的制备
一、人工合成改造蛛丝蛋白的MaSp1基因的确定
本实施例选择的改造蛛丝蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中蛋白酶酶切位点的氨基酸序列为KKKKSSDSSESSRSSSSSS(上述的字母为常见氨基酸缩写字母)，根据上述选择的改造蛛丝蛋白序列和和大肠杆菌偏爱密码子的使用原则，设计编码与改造蛛丝蛋白氨基酸序列一致的改造蛛丝蛋白的核苷酸序列，见序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
二、人工合成改造蛛丝蛋白的MaSp1基因在大肠杆菌中的高效表达
(1)由基因合成公司合成MaSp1基因，将其克隆至含有T7强启动子的原核生物表达载体pET-28a+中，构建成含有人工合成的MaSp1基因的重组质粒pET-28a+-MaSp1；
(2)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用热休克法(42℃热激45秒)将重组质粒pET-28a+-MaSp1转化至宿主细胞BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株；
(3)将工程菌株接种到LB培养基溶液中，37℃，220rpm摇床培养，当工程菌培养液浓度OD600达到0.6-0.8时，加入0.5mmol/L IPTG，37℃诱导表达6小时，然后进行裂解，将所得的细胞裂解液进行SDS-PAGE鉴定，结果见图1，取所述细胞裂解液进行改造蛛丝蛋白MaSp1的提取、纯化，将纯化后的改造蛛丝蛋白MaSp1进行Western blotting鉴定，结果见图2。
实验例
将实施例1中获得的改造蛛丝蛋白分别进行纯化，干燥，然后进行以下的试验：
(1)韧性和强度检测
a、取干燥后的蛋白样品使用HFIP进行溶解，投料量为15％(wt％)，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液。
b、将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以5ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝。凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠4％、乙醇4％、去离子水92％，电镜观察纤维及薄膜的形貌，如图3和4所示。
c、检测上述形成的纤维和薄膜的最大应力(stress(MPa))和最大应变系数(strain(％))，并检测使上述形成的纤维和薄膜断裂的能量大小(energy to break(MJ/m3))结果如表1所示。
表1 MaSp1纤维和薄膜的最大应力、最大应变系数、断裂能量
| stress(MPa) | strain(％) | energy to break(MJ/m<sup>3</sup>) | |
| MaSp1纤维 | 306±51.26 | 67±10.54 | 54.64±21.26 |
| MaSp1薄膜 | 266±44.59 | 79±8.27 | 69.26±14.33 |
由此可见，本发明的重组蛛丝蛋白可满足湿法纺丝对蛋白的要求，电镜显示，获得的蛋白丝结构均一，具有一定的韧性和强度。
(2)人体内可降解性检测
取上述制备的改造蛛丝蛋白MaSp1纤维加入人的血液中，其中所述血液(由医院提供)用量为0.5ml，所述改造蛛丝蛋白MaSp1纤维为0.5mg，于37℃降解4小时，观察降解情况。结果表明，本发明制备的改造蛛丝蛋白MaSp1纤维在4小时后完全降解。
实施例2
本实施例可吸收医用缝合线，以改造蛛丝蛋白为原料，所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例可吸收医用缝合线的制备包括如下步骤：
(1)将3g改造蛛丝蛋白溶解于10ml 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液；
(2)将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以5ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝，干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线。
凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠4％、乙醇4％、去离子水92％。
实施例3
本实施例可吸收医用缝合线，以改造蛛丝蛋白为原料，所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例可吸收医用缝合线的制备包括如下步骤：
(1)将4.5g改造蛛丝蛋白溶解于10ml 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液；
(2)将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以9ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝，干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线。
凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠3％、乙醇4％、去离子水93％。
实施例4
本实施例可吸收医用缝合线，以改造蛛丝蛋白为原料，所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例可吸收医用缝合线的制备包括如下步骤：
(1)将1.5g改造蛛丝蛋白溶解于10ml 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液；
(2)将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以1ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝，干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线。
凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠1％、乙醇8％、去离子水91％。
实施例5
本实施例可吸收医用缝合线，以改造蛛丝蛋白和羟甲基壳聚糖为原料，所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例可吸收医用缝合线的制备包括如下步骤：
(1)将3g改造蛛丝蛋白和4.5g羟甲基壳聚糖溶解于10ml 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液；
(2)将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以8ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝，干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线。
凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠3％、乙醇4％、去离子水93％。
实施例6
本实施例可吸收医用缝合线，以改造蛛丝蛋白和羟甲基壳聚糖为原料，所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例可吸收医用缝合线的制备包括如下步骤：
(1)将1.5g改造蛛丝蛋白和3g羟甲基壳聚糖溶解于10ml 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液；
(2)将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以8ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝，干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线。
凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠4％、乙醇4％、去离子水92％。
实施例7
本实施例可吸收医用缝合线，以改造蛛丝蛋白和羟甲基壳聚糖为原料，所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例可吸收医用缝合线的制备包括如下步骤：
(1)将4.5g改造蛛丝蛋白和1.5g羟甲基壳聚糖溶解于10ml 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂，60℃搅拌溶解12h，然后快速升温至120℃继续搅拌2h，至溶液均匀透亮，得到纺丝原液；
(2)将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从内径为0.5mm的喷丝头以8ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝，干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线。
干燥后得到本实施例可吸收医用缝合线凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠1％、乙醇8％、去离子水91％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 李春李琳
<120> 一种可吸收医用缝合线及其制备方法
<130> SHA201900052
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 432
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
50 55 60
Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp
85 90 95
Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Gly Gln
100 105 110
Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu
115 120 125
Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys
130 135 140
Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
165 170 175
Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser
195 200 205
Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
210 215 220
Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly
225 230 235 240
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser
245 250 255
Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ala
260 265 270
Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly
275 280 285
Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser
305 310 315 320
Ser Ser Ser Ser Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser
325 330 335
Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu
355 360 365
Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly
370 375 380
Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly
385 390 395 400
Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys
405 410 415
Lys Ser Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser
420 425 430
<210> 2
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgggtgctg gccaaggagg gtatggtggc ttaggatctc agggggccgg tcgtggcgga 60
ttggggggtc aaggcgcagg agcggctgcc gcagcggctg ccgcaaaaaa gaaaaagtcc 120
tcagattcga gtgaaagctc tcgctcctca tcgagtagct ctgggggtgc gggccaggga 180
gggtacggtg gccttggatc ccaaggggct ggtcgaggcg gactcggggg tcagggcgcc 240
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gaatcgagtc ggagctcttc ctcatcgagt ggcggagccg ggcagggtgg ctacggaggg 840
ctaggtagcc aaggcgcagg aagagggggt ctgggcggac agggggcggg tgctgccgca 900
gcggctgccg cagcggctaa aaagaaaaag tcttccgact catcggagag tagcaggtct 960
tcctcatcga gtagcggcgc cggacaaggg ggttatggcg gattagggtc tcagggtgca 1020
ggccgtggag ggttgggtgg ccaaggagcg ggggctgccg cagcggctgc cgcagcgaaa 1080
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gctggacagg ggggttacgg cggacttggg tcccaaggtg ccggccgagg agggctcggt 1200
ggccagggag caggggcggc tgccgcagcg gctgccgcag cgaaaaagaa aaagtcatcg 1260
gacagtagcg agtcttcccg gtcatcgagt agctcttcct aatag 1305
Claims (10)
1.一种可吸收医用缝合线，其特征在于，所述可吸收医用缝合线的原料为改造蛛丝蛋白；
所述改造蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的可吸收医用缝合线，其特征在于，所述可吸收医用缝合线的原料还包括羟甲基壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的可吸收医用缝合线，其特征在于，所述改造蛛丝蛋白与羟甲基壳聚糖的质量比为(5:9)-(9:5)。
4.权利要求1-3任一项所述的可吸收医用缝合线的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将可吸收医用缝合线的原料溶解得到纺丝原液；
(2)对所述纺丝原液纺丝后干燥，得到所述可吸收医用缝合线。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述可吸收医用缝合线的原料溶解于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇溶剂中得到纺丝原液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纺丝原液中改造蛛丝蛋白的重量体积百分比浓度为15％-45％；所述纺丝原液中羟甲基壳聚糖的重量体积百分比浓度为15％-45％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纺丝原液中改造蛛丝蛋白的重量体积百分比浓度为30％；所述纺丝原液中羟甲基壳聚糖的重量体积百分比浓度为30％。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述纺丝采用湿法纺丝。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述湿法纺丝的具体步骤为：将纺丝原液倒入注射器中，纺丝原液从喷丝头以1-9ml/min的纺丝速度恒速挤出，凝固浴中纺丝成型，获得初生长丝；将初生长丝取出在空气浴中进一步拉伸。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述凝固浴各组分按质量百分比包括：氢氧化钠1-4％、乙醇4-8％、其余为去离子水。
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