JPWO2018034111A1 - フィブロイン様タンパク質を含むコンポジット成形組成物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

天然の、又は、人工的に改変されたフィブロイン由来タンパク質に、βシート構造を有するペプチド又はポリアミノ酸を配合させることにより向上した引張強度、ひずみ及び靱性等の特性を有するコンポジットフィルム、コンポジット繊維等のコンポジット成形組成物、該コンポジット成形組成物を製造する方法、並びにフィブロイン由来タンパク質を含むコンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法を提供する。

Description

本発明は、フィブロイン様タンパク質を含むコンポジット成形組成物及びその製造方法に関する。

フィブロインからなる天然のクモの糸は、引張強度(tensile strength)、靱性（toughness)及び伸展性(extensibility)等の物理的な変化に対する特性に優れ、例えば、靱性は同一重量の鉄と比較して約５倍を有するポリペプチド繊維である。また、耐熱性にも優れ、さらに、ポリペプチドで形成されているところから、高い生体適合性(biocompatibility)及び生分解性(biodegradability)を有する。しかし、天然糸を産業上利用するカイコと相違し、クモは大量飼育が困難であるところから、クモの糸を模倣した人工合成繊維を製造し、前記物理的な変化に対する特性、並びに、生体適合性及び生分解性を有する糸、敷布等の素材や材料への応用が試みられている（特許文献１〜５）。しかし、上記の特性について天然のクモ糸に匹敵する人工繊維の製造は、成功していない。

天然のクモ糸は、その構造中にβシート構造を形成するポリアラニンとグリシンを多く含む極性領域とが繰り返されてコア部分となり、その両側に高度に保存された非反復型のアミノ末端とカルボキシル末端ドメインが配置されることにより、ランダムコイル状構造、βシート構造及びへリックス構造を有し、これらの構造の混在が天然のクモ糸の優れた特性の理由と考えられ、その構造的特性が検討されている（非特許文献１〜３）。また、クモの体内で紡糸される際、通常のタンパク質の場合と相違し、クモタンパク質は高濃度で貯蔵されている際には高い可溶性を示すが、必要に応じて極めて丈夫な繊維へと変化する（非特許文献２）。しかし、構造的特性やクモ糸の産生機構が必ずしも明らかにされていない。

本発明者は、ジョロウグモの牽引糸腺における牽引糸の製造過程を明らかにし、クモ糸フィブロインタンパク質のβシート構造による顆粒構造の形成が、クモ糸の物理的特性の発揮に重要であることを明らかにした（特許文献６）。

国際公開公報WO2007/078239 国際公開公報WO2010/123450 国際公開公報WO2011/112046 国際公開公報WO2012/165476 国際公開公報WO2013/065650 国際公開公報WO2017/030197

Numata Kら、Soft Matter 2015年6月30日、11、6335-6342 Hagn Fら、Nature. 2010; 465(7295): 239-242 Teule Fら、Nature Protocols 2009; 4: 341-355

天然のクモの牽引糸のクモ体内での産生機構及び高い特性をもたらす要因を基に、この機構を人工繊維の製造に応用することにより、高い強度及び靱性等の特性を有するフィブロイン様タンパク質を含むコンポジット成形組成物、該組成物を製造する方法、及び、該製造方法で製造されるコンポジット繊維、コンポジットフィルム及びコンポジット樹脂等のコンポジット成形組成物、並びに該コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法を提供する。

本発明者らは、天然フィブロインタンパク質、又は、人工的に製造されたフィブロイン様タンパク質に、βシート構造を有するポリペプチド又はポリアミノ酸を配合し、成形することにより製造したコンポジット成形組成物が、βシート構造を有するポリペプチド又はポリアミノ酸を配合しない成形組成物と比較して、優れた引張強度、ひずみ及び靭性等の物理的特性を発揮することを見出し本発明を完成させた。

具体的には、本発明は、フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物を提供する。

また、前記組成物は、コンポジット成形組成物であって、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合され、成形されている組成物であってもよい。

前記コンポジット成形組成物は、前記ポリペプチド及び／又はポリアミノ酸由来のβシート構造が保持されているコンポジット成形組成物である場合がある。

前記コンポジット成形組成物は、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲル又はコンポジットモールド成形体から選択されるコンポジット成形組成物である場合がある。

また、本発明は、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合されたコンポジット成形組成物であって、
該コンポジット成形組成物は、コンポジット繊維、コンポジットフィルム又はコンポジットゲルから選択され、
(i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを溶解したドープ液を調製するステップ、
(ii) 前記ドープ液よりコンポジット成形組成物を成形するステップ、
を含む製造方法で製造されるコンポジット成形組成物を提供する。

さらに、本発明は、コンポジット成形組成物であって、該コンポジット成形組成物が、コンポジット繊維又はコンポジットフィルムから選択され、
前記ステップ(i)、(ii)に加えて、さらに、
(iii) 前記(ii)で得られたコンポジット成形組成物を溶媒中で延伸し、乾燥するステップ、
を含む製造方法で製造される前延伸コンポジット成形組成物を提供する。

また、本発明は、コンポジット成形組成物であって、前記コンポジット成形組成物は、モールド成形体であって、
(i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを混合し、混合物を調製するステップ、
(ii) 前記混合物に圧力を負荷し、加熱するステップ、
を含む製造方法で製造されるコンポジットモールド成形体であるコンポジット成形組成物を提供する。

本発明のコンポジット成形組成物において、前記フィブロイン由来タンパク質が、
(i) 天然のフィブロイン由来タンパク質、及び／又は、
(ii) 改変されたフィブロイン由来タンパク質
から選択される場合がある。

本発明のコンポジット成形組成物において、前記天然のフィブロイン由来タンパク質が、絹フィブロイン由来のシルクタンパク質（シルクフィブロインタンパク質）、クモ糸フィブロイン由来のクモ糸タンパク質（クモ糸フィブロインタンパク質）、及びホーネットシルクフィブロイン由来のホーネットシルクタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である場合がある。

本発明のコンポジット成形組成物において、前記改変されたフィブロイン由来タンパク質が、下記式(I)で表されるドメイン配列を含む改変されたフィブロイン由来タンパク質であり；

ただし、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されており、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する、改変フィブロインタンパク質：
[式I中、
（Ａ）_ｎモチーフは２〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ、
（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が４０％以上であり、
ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、
ｍは２〜３００の整数であり、
複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、相互に同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよく、
複数存在するＲＥＰは、相互に同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい]
コンポジット成形組成物である場合がある。

本発明のコンポジット成形組成物の前記改変されたフィブロイン由来タンパク質において、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（ただし、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を表す。）から選ばれる少なくとも１つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有し、かつグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、もっとも好ましくは４０％以上である場合がある

前記改変されたフィブロイン由来タンパク質において、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣り合う２つの[（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ]ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としてとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が２〜３．５となる前記隣り合う２つの[（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値をｘとし、前記ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙ（％）の最大値が２０％以上である場合がある。

コンポジット成形組成物は、前記式(I)で表される改変されたフィブロイン由来タンパク質が、配列番号１〜１９で表されるアミノ酸配列を有する改変されたフィブロイン由来タンパク質である場合がある。

本発明のコンポジット成形組成物において、前記フィブロイン由来タンパク質が、前記フィブロイン由来タンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するフィブロイン由来タンパク質である場合がある。

本発明のコンポジット成形組成物において、前記βシート構造を有するポリアミノ酸がポリアラニンである場合がある。

本発明のコンポジット成形組成物において、前記ポリアラニンが、ライナー型ポリアラニン（L-polyAla）又はテレケリック型ポリアラニン（T-polyAla）から選択される場合がある。

また、本発明は、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合された、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲルから選択されるコンポジット成形組成物の製造方法であって、
(i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを溶解したドープ液を調製するステップ、
(ii) 前記ドープ液を紡糸又は延伸することにより前記コンポジット成形組成物を製造するステップ、
を含む製造方法を提供する。

さらに、本発明は、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合された、モールド成形体のコンポジット成形組成物の製造方法であって、
(i) 粉状のフィブロイン由来タンパク質と、粉状のβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを混合し、混合体を調製するステップ、
(ii) 前記混合体に圧力を負荷し、加熱するステップ、
を含む製造方法を提供する。

さらに、本発明は、前延伸コンポジット成形組成物の製造方法であって、
(i) 前記の製造方法で製造されたコンポジット成形組成物を溶媒中で延伸するステップ、及び、
(ii) 延伸されたコンポジット成形組成物を乾燥させるステップ、
を含む製造方法を提供する。

本発明の製造方法において、前記フィブロイン由来タンパク質が、
(i) 天然のフィブロイン由来タンパク質、及び／又は、
(ii) 改変されたフィブロイン由来タンパク質
から選択される場合がある。

本発明の製造方法において、前記天然のフィブロイン由来タンパク質が、絹フィブロイン由来のシルクタンパク質（シルクフィブロインタンパク質）、クモ糸フィブロイン由来のクモ糸タンパク質（クモ糸フィブロインタンパク質）、及びホーネットシルクフィブロイン由来のホーネットシルクタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である場合がある。

本発明の製造方法において、前記改変されたフィブロイン由来タンパク質が、下記式(I)で表されるドメイン配列を含む改変されたフィブロイン由来タンパク質である場合がある；

ただし、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されており、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する、改変フィブロインタンパク質：
[式I中、
（Ａ）_ｎモチーフは２〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ、
（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が４０％以上であり、
ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、
ｍは２〜３００の整数であり、
複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、相互に同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよく、
複数存在するＲＥＰは、相互に同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい]。

本発明の製造方法の前記改変されたフィブロイン由来タンパク質において、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（ただし、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を表す。）から選ばれる少なくとも１つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有し、かつグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上、２０％以上、より好ましくは３０％以上、もっとも好ましくは４０％以上である場合がある。

本発明の製造方法の前記改変されたフィブロイン由来タンパク質において、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣り合う２つの[（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ]ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としてとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が２〜３．５となる前記隣り合う２つの[（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値をｘとし、前記ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙ（％）の最大値が２０％以上である場合がある。

本発明の製造方法において、前記式(I)で表される改変されたフィブロイン由来タンパク質が、配列番号１〜１９で表されるアミノ酸配列を有する改変されたフィブロイン由来タンパク質である場合がある。

前記フィブロイン由来タンパク質が、配列番号１〜１９で表されるフィブロイン由来タンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するフィブロイン由来タンパク質である場合がある。

本発明の製造方法において、前記βシート構造を有するポリアミノ酸がポリアラニンである場合がある。

本発明の製造方法において、前記ポリアラニンが、ライナー型ポリアラニン又はテレケリック型ポリアラニンから選択される場合がある。

さらに、フィブロイン由来タンパク質に、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合させることにより、コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法を提供する。

本発明は、さらに、前記コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法に、さらに、前記コンポジット成形組成物を溶媒中で延伸後、乾燥させることにより、コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法を提供する。

前記コンポジット組成物の物理的特性を向上させる方法において、前記物理的特性の向上が、引張強度の増加、ひずみの増加及び／又は靭性の増加である場合がある。

高い靱性、ひずみ（破断点変位）及び引張強度（応力）等の物理的特性を有するフィブロイン様ポリペプチド繊維を含むコンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲル等のコンポジット成形組成物、及びその製造方法を提供できる。

改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。 天然由来のフィブロインのx/y(%)の値の分布を示す図である。 天然由来のフィブロインのz/w(%)の値の分布を示す図である。 本発明のコンポジット成形組成物であるコンポジット繊維を紡糸するためのドープ液からの紡糸方法の概略を表す図である。 天然カイコ・フィブロインタンパク質にL-polyAla又はT-polyAlaを各種の割合で配合させて製造したコンポジットフィルムを100％の延伸率で前延伸した前延伸コンポジットフィルムについて、引張強度、ひずみ及び靭性の変化を測定した結果を表す図である。 改変クモ糸フィブロインタンパク質であるADF3 Kai-noNRにT-polyAlaを5wt%の割合で配合させて製造したコンポジットフィルムを、メタノール中で各種延伸率で延伸して製造した前延伸コンポジットフィルムについて、引張強度、ひずみ及び靭性の変化を測定した結果を表す図である。 改変クモ糸フィブロインタンパク質であるADF3 Kai-noNRにL-polyAla又はT-polyAlaを各種の割合で配合させて100％の延伸率で前延伸して製造したコンポジットフィルムについて、広角Ｘ線散乱(WAXD）を測定した結果を表す図である。

１．コンポジット成形組成物
１−１．非延伸コンポジット成形組成物
本発明の実施形態の一つは、フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物であり、特に、前記組成物は、コンポジット成形組成物であって、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合され、成形されている組成物である非延伸コンポジット成形組成物である。

本非延伸のコンポジット成形組成物を用い、後に記載する前延伸コンポジット成形組成物を製造することができる。

前記コンポジット成形組成物の例としては、前記ポリペプチド及び／又はポリアミノ酸由来のβシート構造が保持されており、前記コンポジット成形組成物は、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲル又はコンポジットモールド成形体から選択されるコンポジット成形組成物が挙げられる。

（１）フィブロイン由来タンパク質
フィブロインは、昆虫とクモ類等のシルクを構成し、その70％を占める繊維状のタンパク質の総称として知られる。本明細書において、「フィブロイン」とは、昆虫とクモ類の天然のシルク、及び、これらの天然のシルクの組成及び特性を模倣又は指向した人工的に製造される人工的なシルクも含む。本明細書において、「フィブロイン」は、下記のスピドロインI及びII等のスピドロインタンパク質も「フィブロイン」に含まれるが、これらのクモ糸由来のフィブロインのみならず、カイコの絹糸に由来するフィブロイン等も含まれる。天然のフィブロイン以外でも、フィブロインは、遺伝子組換え法により、例えば、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列を製造し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを公知の方法で作製し、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、昆虫細胞等の適当な宿主に導入して形質転換体を作製し、これらを単離精製して利用することができる（国際公開公報WO2012/165476等）。また、フィブロインの一部は、商業的に利用可能であり、例えば、これらを入手して使用できる。

本発明に係るフィブロイン由来タンパク質は、特に限定されるものではなく、天然のフィブロインであってもよいし、或いは遺伝子組換え技術により微生物等で製造したものや合成により製造した、所謂天然フィブロイン由来のタンパク質であってもよい。

また、そのようなフィブロイン由来タンパク質は、例えば、絹フィブロイン由来のシルクタンパク質（シルクフィブロインタンパク質）、クモ糸フィブロイン由来のクモ糸タンパク質（クモ糸フィブロインタンパク質）、及びホーネットシルクフィブロイン由来のホーネットシルクタンパク質からなる群より選択される１種以上であってよい。これらの中でも、クモ糸フィブロイン由来のクモ糸タンパク質が好適に用いられる。

本明細書において、「フィブロイン由来のタンパク質」とは、前記の昆虫とクモ類等の天然由来のフィブロインを構成するタンパク質、これらの天然のタンパク質以外の、例えば、遺伝子組換え法により人工的に製造されるフィブロインと構造及び特性が類似するタンパク質が含まれる。

フィブロインの構造が類似するとは、天然のフィブロインのアミノ酸配列と、そのアミノ酸配列が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質、及び、これらのタンパク質の部分配列を有するタンパク質断片、又は、これらのタンパク質若しくはタンパク質断片と他のタンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質等が含まれる。また、本明細書において、「フィブロイン由来のタンパク質」を、その構造的特性に基づき「フィブロイン由来のポリペプチド」と記載する場合がある。

また、フィブロインと特性が類似するタンパク質とは、天然のフィブロインが有する引張強度、靭性及び伸縮性から選択される少なくとも1つの特性が天然のフィブロインと比較して、少なくとも８０％、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは100％以上の優れた特性を有することをいう。また、本明細書において、このようなフィブロインの構造及び物理的特性に関して記載する場合等に、「フィブロイン様ポリペプチド」又は「フィブロイン様タンパク質」と記載する場合がある。

フィブロインとしては、以下のような改変フィブロインを用いることもできる。改変フィブロインは、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。この式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質については、PCT/JP2017/016917及びPCT/JP2017/016925に詳細に記載され、引用により本明細書に取り込まれる。

本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインとアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。

「改変フィブロイン」は、本発明で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。

本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）_ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）_ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、ｎは２〜２０、好ましくは４〜２０、より好ましくは８〜２０、更に好ましくは１０〜２０、更により好ましくは４〜１６、更によりまた好ましくは８〜１６、特に好ましくは１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが更に好ましく、９０％以上であることが更により好ましく、１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸由来のタンパク質の具体例としては、天然配列の部分配列である配列番号１〜３、天然配列を改変した配列番号４〜１９で示されるアミノ酸配列等を含むタンパク質を挙げることができる。

配列番号６で示されるアミノ酸配列（Met-PRT313）は、天然由来のフィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）のアミノ酸配列における、アラニン残基が連続する領域「（Ａ）_ｎモチーフ」中の連続するアラニン残基の数を５つになるよう欠失する等、アミノ酸残基の改変を行った配列を有する。配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３１３）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。

配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３９９）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフ（（Ａ）_５）を欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものであり、配列番号１３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３９９）はこの配列番号７で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。

配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３８０）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものであり、配列番号１４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３８０）はこの配列番号８で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。

配列番号９で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものであり、配列番号１５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４１０）はこの配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４６８）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列に対し、配列番号６中のポリＡ領域にＡを２残基挿入し、配列番号９で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じになるよう、Ｃ末端側の繰り返し配列２回分を削除し、ＱからＳもしくはＰに１３箇所置換したものであり、配列番号１６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４６８）はこの配列番号１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。

配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域を４回繰り返した配列のＣ末端側の数アミノ酸残基を、配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものであり、配列番号１７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７９９）はこの配列番号１１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。

以上のアミノ酸配列をまとめると以下のとおりである。
配列番号１ Araneus diadematusのアミノ酸配列
配列番号２ Araneus diadematusのアミノ酸配列
配列番号３ Araneus diadematusのアミノ酸配列
配列番号４ recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1のアミノ酸配列
配列番号５ 配列番号４よりHisタグのアミノ酸配列を削除した配列
配列番号６ Met-PRT313: Met-CRY1_L_A5のアミノ酸配列
配列番号７ Met-PRT399: Met-CRY1_L_A5_gizaのアミノ酸配列
配列番号８ Met-PRT380: Met-CRY1_L_A5_QQQのアミノ酸配列
配列番号９ Met-PRT410: Met-CRY1_L_A5_giza_QQQのアミノ酸配列
配列番号１０ Met-PRT468: Met-CRY1_L_A7_giza_QQQのアミノ酸配列
配列番号１１ Met-PRT799: Met-CRY1_200_A5_giza_QQQ_WHis6のアミノ酸配列
配列番号１２ PRT313のアミノ酸配列
配列番号１３ PRT399のアミノ酸配列
配列番号１４ PRT380のアミノ酸配列
配列番号１５ PRT410のアミノ酸配列
配列番号１６ PRT468のアミノ酸配列
配列番号１７ PRT799のアミノ酸配列
配列番号１８ ADF3Kai_noNRのアミノ酸配列
配列番号１９ 配列番号１８のアミノ酸配列よりHisタグを除いたアミノ酸配列
配列番号２０ Hisタグ及びスタートコドンのアミノ酸配列
配列番号２１ Hisタグのアミノ酸配列

改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。

天然由来のフィブロインは、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。

昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。

昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。

クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質（クモ糸タンパク質）が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。

クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。

天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。

改変フィブロインは、改変絹フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。それらのうちでも改変クモ糸フィブロインが、好適に用いられる。

改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン[第１の実施形態に係る改変フィブロイン]、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン［第２の実施形態に係る改変フィブロイン］、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン［第３の実施形態に係る改変フィブロイン］、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン［第４の実施形態に係る改変フィブロイン］が挙げられる。

第１の実施形態に係る改変フィブロインとしては、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の実施形態に係る改変フィブロインは、式(I)中、ｎは３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。第１の実施形態に係る改変フィブロインは、式(I)中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。第１の実施形態に係る改変フィブロインは、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。

第１の実施形態に係る改変フィブロインは、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。

配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。

第１の実施形態に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号４又は配列番号５（配列番号４のアミノ酸配列よりHisタグを除いたアミノ酸配列）で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。前記配列同一性は、１００％であってもよい。

配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号２０）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列と同一である。

（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

第２の実施形態に係る改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。

第２の実施形態に係る改変フィブロインは、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗ（％）が３０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよく、５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であればよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。

第２の実施形態に係る改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の実施形態に係る改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。

ｚ／ｗ（％）の算出方法を更に詳細に説明する。まず、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。

ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗ（％）について説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗ（％）を算出した。その結果を図３に示す。図３の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗ（％）は、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。

第２の実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗ（％）は、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗ（％）の上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。

第２の実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗ（％）が５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。

第２の実施形態に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）_ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号９の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１１で示されるアミノ酸配列は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。

配列番号６で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗ（％）の値は、４６．８％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列、配列番号９で示されるアミノ酸配列、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、及び配列番号１１で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗ（％）の値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号６、８、９、１０及び１１で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙ（％）の値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。

（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上であることが好ましい。

（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗ（％）が５０．９％以上であることが好ましい。

上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。

タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号２１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。

また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。

さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。

さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、７、８、９、１０及び１１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。

（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上であることが好ましい。

（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗ（％）が５０．９％以上であることが好ましい。

上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）_ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）_ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）_ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）_ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙ（％）が２０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよく、５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であればよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。

ｘ／ｙ（％）の算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）_ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）_ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）_ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）_ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）_ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）_ｎモチーフという配列を有する。

隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。

次に各パターンについて、選択した隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。

図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。

各パターンにおいて、実線で示した隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。

次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。

第３の実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙ（％）は、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙ（％）の上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙ（％）は８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙ（％）は７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙ（％）は７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙ（％）は６４．２％以上であることが好ましい。

第３の実施形態に係る改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙ（％）は、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙ（％）の上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。

ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙ（％）について説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙ（％）を算出した。ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合の結果を図２に示す。

図２の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙ（％）は、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。

第３の実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙ（％）が６４．２％以上になるように（Ａ）_ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙ（％）が６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

第３の実施形態に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）_ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号９の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１１で示されるアミノ酸配列は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。

配列番号６で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙ（％）の値は１５．０％である。配列番号７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙ（％）の値は、いずれも９３．４％である。配列番号１０で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙ（％）の値は、９２．７％である。配列番号１１で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙ（％）の値は、８９．３％である。配列番号６、７、９、１０及び１１〜１２で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙ（％）の値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。

（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上である。

（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙ（％）が６４．２％以上であることが好ましい。

上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｖ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６若しくは配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、７、８、９、１０及び１１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。

（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式(I)：［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣り合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙ（％）が６４．２％以上であることが好ましい。

上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

第４の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、上述した第２の実施形態に係る改変フィブロインと、第３の実施形態に係る改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２及び第３の実施形態に係る改変フィブロインで説明したとおりである。

第４の実施形態に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、（４−ｉｉ）配列番号９、配列番号１０若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。

＜タンパク質の製造方法＞
本実施形態に係るタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。

タンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。

調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。

発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。

宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。

原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。

原核生物を宿主とする場合、タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。

真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。

真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。

発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。

タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。

宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。

大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。

また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。

また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

（２）βシート構造を有するポリペプチド及びポリアミノ酸
本発明のコンポジット成形組成物において、上記実施形態は、前記βシート構造を有するポリペプチド又はポリアミノ酸を配合する。この場合、ポリアミノ酸の例としてはポリアラニンが挙げられる。

前記ポリアラニンは、ライナー型ポリアラニン（L-polyAla)又はテレケリック型ポリアラニン（T-polyAla)から選択可能である。ライナー型ポリアラニンは、酵素化学重合法を利用することにより製造可能であり、公知の文献を基に製造し、使用できる（Baker P Jら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951)。また、テレケリック型ポリアラニンは、下記実施例に記載のとおり、酵素化学重合法を利用することにより製造可能であり、Tsuchiya Kら、Macromol. Biosci. 2016, 1001-1008にも記載され、引用によって本明細書に取り込まれる。

（３）フィブロインと、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含むコンポジット成形組成物の製造
本明細書において、「βシート構造を有するポリペプチド」とは、その二次元構造中で、βシート構造を有する限り任意のポリペプチドが含まれ、天然のポリペプチド及び人工的に製造されるポリペプチドが含まれ、好ましくは、人工的に製造されるポリペプチドをいい、より好ましくは下記のポリアミノ酸の配列を含むポリペプチドをいう。

本明細書において、「ポリアミノ酸」とは、アミノ酸又はその誘導体を単量体として、1段の重合反応によって得られる高分子量のアミノ酸重合体をいう。

また、βシート構造を有するポリアミノ酸は、人工的に製造され、L-又はD-アミノ酸の重合体であり、その二次構造でβシート構造を有する任意のポリアミノ酸をいい、好ましくは、ポリアラニン、ポリフェニルアラニン、ポリシステイン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリチロシン、ポリトリプトファン、ポリグルタミン、ポリメチオニン及びそれらの誘導体から選択されるホモポリアミノ酸及びその誘導体、さらに、これらのホモポリアミノ酸及びその誘導体のみならず、アラニン、フェニルアラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、グルタミン、メチオニン等のアミノ酸、並びにそれらの誘導体から選択される複数種、好ましくは2〜5種の、より好ましくは2〜4種の、もっとも好ましくは2又は3種のアミノ酸の共重合体からなるポリアミノ酸を含む。これらのポリアミノ酸は、例えば、化学酵素重合法などの公知の方法によって製造できる（Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545、及び、Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951等）。ポリアミノ酸の重合度は、2〜100の範囲であり、好ましくは5〜50の範囲であり、より好ましくは10〜30、もっとも好ましくは10〜20の範囲である。

本明細書において、ポリアミノ酸、ポリペプチド及びタンパク質の構造は、当業者に周知慣用のアミノ酸の3文字又は１文字による表記法で記述される。明細書においてアミノ酸は、特に記載のない限りL体である。

クモ糸由来のシルクを構成する構造体の一つであり、特に、ナノ小繊維を構成する小型の顆粒状構造体であるナノ顆粒状構造体は、高いアスペクト比を有する顆粒状の形態を有し、シルクに特徴的なグリシン及びアラニンを多く含み、βシート構造を含むペプチド又はポリペプチドを主成分とする構造体をいう。Nephila edulis のクモ絹糸の場合、17％±4％のβシート構造を有すると報告されている(Ling Sら、Biomacromolecules, 2011, 12, 3344-3349)。また、もっとも強いクモ牽引糸は、45〜65%がβシートドメインと報告されている（Vollrath Fら、Polymer, 2009, 50, 5623-5632)。

そこで、本発明のコンポジット成形組成物は、原料であるフィブロイン様タンパク質にβシート構造を多く含むポリペプチド又はポリアミノ酸を混合して溶解したドープ液を調製し、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲル、コンポジット多孔質体、コンポジットパーティクル及びコンポジットモールド成形体等を成形することにより製造することができる。

コンポジットフィルムを製造する場合には、フィブロイン由来タンパク質を原料としフィルムを製造する方法が国際公開公報WO2014/103799に記載されており、基本的にこれに従って製造できる。コンポジット繊維を製造する場合には、フィブロイン由来タンパク質より繊維を紡糸する方法が国際公開公報WO2012/165476に記載されており、基本的にこの方法に従って製造できる。コンポジットゲルを製造する場合には、国際公開公報WO2014/175177にフィブロイン由来タンパク質よりゲルを製造する方法が記載されており、基本的にこの方法に従って製造できる。また、コンポジット多孔質体を製造する場合には、フィブロイン由来タンパク質より多孔質体を製造する方法が国際公開公報WO2014/175178に記載されており、基本的にこの方法に従って製造できる。さらに、コンポジットパーティクルを製造する場合には、フィブロイン由来タンパク質よりパーティクルを製造する方法が国際公開公報WO2014/175179に記載されており、基本的にこの方法に従って製造できる。また、コンポジットモールド成形体を製造する場合には、特願2015-185777の明細書にフィブロイン由来タンパク質よりモールド成形体を製造する方法が記載されており、基本的にこの方法に従って製造できる。

コンポジット成形組成物が、前記ドープ液を使用して製造するコンポジットフィルムの場合には、コーティング方法として、本技術分野で一般に知られる、例えば、キャスティング法、スピン・コーティング法、ディッピング法、スプレー・コーティング法、電界重合法、蒸着法、蒸着重合法、ブラシコーティング法、ブレードコーティング法、ローラコーティング法、グラビアコーティング法及びロール・ツー・ロール法等の方法が使用できる。

また、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合させたドープ液を用いて紡糸する場合には、紡糸工程で勢断応力を負荷しながら、ドープ液のpH、塩の種類及び濃度、湿度又は水分濃度等のクモ糸等のフィブロイン由来のポリペプチド繊維の環境に関連する要素を変化させることにより、フィブロイン由来のコンポジット繊維を製造することができる。これらの要素の1種以上を変化させることにより、又は、複数の要素を組み合わせて変化させることにより、フィブロイン由来のコンポジット繊維を製造することができる。本発明のフィプロイン由来のコンポジット繊維の製造方法として、具体的には、湿式紡糸法、乾式紡糸法、乾湿式紡糸法及び溶融紡糸法等の公知の紡糸方法を挙げることができる。

本発明の態様において、湿式紡糸法や乾湿式紡糸法を用いる場合、繊維軸方向に剪断応力を負荷しながら、ドープ液に凝固剤を添加する、又は、凝固剤を含む溶媒中に前記ドープ液を射出、押し出す又は浸漬することにより、フィブロイン由来のポリペプチド繊維を製造することができる。

湿式防止法や乾湿式紡糸法の凝固剤としては、ドープ液からフィブロイン由来タンパク質等を溶解させた溶媒を除去（脱溶媒ともいう）し得るものであれば特に限定されない。例えば、凝固剤として、メタノール、エタノール、2-プロパノールなどの炭素数1〜5の低級アルコール又はアセトン等を使用してもよい。また、無機塩を含む水溶液を用いてもよい。この無機塩水溶液は、弱酸性〜酸性の溶媒が好ましい。

例えば、コンポジットモールド成形体を製造する場合には、タンパク質を含む組成物（タンパク質のみ、或いは他の成分を含む）を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に組成物に対して加圧する。所定の加圧下でタンパク質粉末が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、加熱加圧された組成物を得る。次いで、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型の温度を下降させ、組成物が所定の温度になったところで、内容物を取り出してモールド成形体を得る。加熱は、８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１００分が好ましく、１〜５０分がより好ましく、５〜３０分が更に好ましい。

例えば、樹脂を製造する場合には、前記の本発明の組成物を溶媒に溶解又は懸濁したドープ液を調製し、当業者に周知慣用の方法で、このドープ液のタンパク質を不溶化することにより、本発明の樹脂を製造できる。溶媒としては、例えば、水若しくは極性有機溶媒又はこれらの混合溶媒が挙げられる。本発明のタンパク質を不溶化する方法として、ドープ液の溶媒の留去、溶媒中の塩の種類及び／又は濃度の変化、イオン強度若しくは塩濃度の変化、及び／又はpHの変化等が挙げられる。

本明細書において、「ドープ液」とは、コンポジット繊維やコンポジットフィルム等のコンポジット成形組成物を製造するための原料であるフィブロイン由来タンパク質及びβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを混合し、溶解した溶液をいう。

前記のドープ液に使用する極性有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド若しくは1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)、蟻酸又は、これらの混合液から選択することができるが、これらに限定されない。

また、ドープ液は、無機塩を更に含有してもよい。無機塩は、タンパク質の溶解促進剤として機能し得る。無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。無機塩の具体例としては、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムが挙げられる。これらのうちの少なくとも１種類の無機塩を溶媒に添加してもよい。

ドープ液に含まれる無機塩の量は、特に限定されず、無機塩の種類、フィブロイン由来タンパク質の量等に応じて適宜に決定される。無機塩の量は、例えば、タンパク質の全量１００質量部に対して、１．０質量部以上、５．０質量部以上、９．０質量部以上、１５質量部以上、２０質量部以上であってもよい。また、無機塩の量は、例えば、タンパク質の全量１００質量部に対して、４０質量部以下、３５質量部以下、３０質量部以下であってもよい。

本明細書において、フィブロイン由来タンパク質に添加するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の添加量は、フィブロイン由来タンパク質と添加するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸との合計重量に対する、ポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の重量の割合で表される。例えば、「polyAla 5 wt%のコンポジット成形組成物」と記載した場合、（フィブロイン由来タンパク質）：（ポリペプチド及び／又はポリアミノ酸）が、重量比で95:5の割合で配合されたコンポジット成形組成物を表す。また、場合によっては、質量に対する割合で表される。

本発明のフィブロインとβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含む組成物は、例えば、フィブロインを溶解したドープ液に、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の水溶液又は水懸濁液を添加し、混合後、成形し、乾燥させることによって製造できる。βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の配合割合は、０．１〜５０．０％の範囲であり、好ましくは０．５〜３０．０％の範囲であり、より好ましくは、１〜１０．０％の範囲であり、もっとも好ましくは1〜5％の範囲である。

βシート構造を有するポリアミノ酸としてポリアラニンを使用する場合には、ポリアラニンの重合度は、2〜100の範囲であり、好ましくは3〜50の範囲であり、より好ましくは10〜30の範囲であり、もっとも好ましくは10〜20の範囲である。また、ポリアラニンの配合率は、0.1〜30.0％の範囲であり、好ましくは0.5〜20.0％の範囲であり、より好ましくは1.0〜10.0％の範囲であり、もっとも好ましくは3.0〜5.0％の範囲である。

１−２．前延伸コンポジット成形組成物
本発明のもう１つの実施形態は、前延伸コンポジット成形組成物である。前延伸コンポジット組成物は、前記コンポジット成形組成物の製造工程に、さらに前延伸を行う工程を含めることにより製造され、非延伸のコンポジット成形組成物と比較して、より優れた物理特性をもたらすことができる。

具体的には、本実施形態の前延伸コンポジット成形組成物は、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合された前延伸コンポジット成形組成物であって、
該コンポジット成形組成物は、繊維又はフィルムから選択され、
(i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とをドープ液を調製するステップ、
(ii) 前記ドープ液よりコンポジット成形組成物を成形するステップ、
さらに、
(iii) 前記(ii)で得られたコンポジット成形組成物を溶媒中で延伸し、乾燥するステップ、
を含む製造方法で製造される前延伸コンポジット成形組成物である。

前延伸工程を追加することにより、引張強度、ひずみ及び／又は靭性等の物理特性はさらに向上する。前延伸工程の例として、湿熱延伸、乾熱延伸等が挙げられる。

湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液又は有機溶剤中、スチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、非延伸繊維又はフィルム（又は前延伸繊維又はフィルム）を、例えば、１〜１０倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。

乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０〜２７０℃であってよく、１６０〜２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、非延伸繊維又はフィルム（又は前延伸繊維又はフィルム）を、例えば、０．５倍から８倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。

湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を関越延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸を行い、二段目延伸を湿熱延伸し、さらに三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。

これらの本発明のコンポジット成形組成物より、例えば、これを使用する糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。これらのコンポジット成形組成物の、耐熱性、高い引張強度、靱性及び／又は伸展性（伸度）等の優れた特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料として使用できる。

２．本発明のコンポジット成形組成物の製造方法
２−１．非延伸コンポジット成形組成物の製造方法
本発明のもう１つの実施形態は、前記コンポジット成形組成物の製造方法である。より具体的には、本発明は、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合された、繊維、フィルム、ゲルから選択されるコンポジット成形組成物の製造方法であって、
(i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を溶解したドープ液を調製するステップ、
(ii) 前記ドープ液を紡糸又は延伸することにより前記コンポジット成形組成物を製造するステップ、
を含む製造方法である。

前記に記載のとおり、例えば、フィブロイン由来タンパク質は、天然のフィブロインタンパク質は商業的に利用可能であり、これを入手して本発明に使用できる。また、前記に記載のとおり遺伝子組換え法によって人工的に作製したDNAを導入した微生物によって製造し、これを単離精製することにより改変されたフィブロイン由来タンパク質を利用できる。これらの方法によって、フィブロインを入手し、別途、例えば、化学酵素重合法等の公知の方法（Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545、及び、Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951等）で、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を製造し、フィブロイン由来タンパク質を含むドープ液にポリペプチド及び／又はポリアミノ酸の水懸濁液を混合後、乾燥等により不溶化させることによって、本発明の組成物を製造できる。

この不溶化の方法としては、乾燥する方法以外にも、例えば、前記コンポジット繊維の製造方法で記載したと同様の方法、具体的には、溶媒中の塩の種類及び／又は濃度の変化、イオン強度若しくは塩濃度の変化、及び／又はpHの変化等方法を使用できる。

さらに、フィブロイン由来タンパク質以外の材料についても、上記コンポジット成形組成物で詳細に説明した各種の材料を使用し、上記で詳細に説明した使用態様で使用することにより、本発明の製造方法を実施できる。

２−２．前延伸コンポジット成形組成物の製造方法
本発明のもう１つの実施形態は、本発明は、前延伸コンポジット成形組成物の製造方法であって、
(i) 前記の製造方法で製造されたコンポジット成形組成物を溶媒中で延伸するステップ、及び、
(ii) 延伸されたコンポジット成形組成物を乾燥させるステップ、
を含む製造方法である。

前延伸工程を追加することにより、引張強度、ひずみ及び／又は靭性等の物理特性はさらに向上する。前延伸工程の例として、湿熱延伸、乾熱延伸等が挙げられる。

湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液又は有機溶剤中、スチーム加熱中で行うことができる。温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、非延伸繊維又はフィルム（又は前延伸繊維又はフィルム）を、例えば、１〜１０倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。

乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０〜２７０℃であってよく、１６０〜２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、非延伸繊維又はフィルム（又は前延伸繊維又はフィルム）を、例えば、０．５倍から８倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。

湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸を行い、二段目延伸を湿熱延伸し、さらに三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。

これらの本発明の製造方法で製造されたコンポジット成形組成物は、さらに、例えば、これを使用する糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。これらのコンポジット成形組成物の、耐熱性、高い引張強度、靱性及び／又は伸展性等の優れた特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料として使用できる。

３．本発明のコンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法
本発明のもう1つの好ましい実施形態は、フィブロイン等のポリペプチドからなるコンポジット成形組成物の引張強度、靭性及び伸展性等から選択される少なくとも1つの物理的特性を向上させる方法である。コンポジット成形組成物の例としては、ポリペプチドからなるコンポジットフィルム、コンポジット繊維、コンポジットゲル、コンポジット多孔質体、コンポジットパーティクル及びコンポジットモールド成形体などが挙げられる。

コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法は、例えば、樹脂、フィルム及び繊維等の成形組成物原料に、ポリアラニン等のβシートを有するポリアミノ酸を配合させてコンポジット成形組成物とすることによる。より具体的には、例えば、、コンポジットフィルム、コンポジット繊維、コンポジットゲル及びコンポジット樹脂等のコンポジット成形組成物を製造するために、フィブロイン等の原料を溶解したドープ液に、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を添加し、混合後、例えば、溶媒を留去し、ポリペプチドを不溶化することによって、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を添加しない成形組成物と比較して、物理的特性が向上したコンポジット成形組成物を取得できる。

本明細書において、コンポジット成形組成物の物理的特性の向上とは、例えば、商業的に利用可能な引張試験機を入手し、引張強度試験を行い、被験試料が破断するときの限界応力を求め、この限界応力の値が比較対象の試料よりも高値を示すときに、引張強度が向上することを意味する。また、靭性が向上するとは、同様に、引張試験機で被験試料を測定し、応力-ひずみ曲線図における曲線の面積の値が、比較対象の試料の面積値よりも高値を示すときに、靭性が向上することを意味する。さらに、伸展性が向上するとは、同様に引張試験機で被験試料の引張試験を行い、被験試料が破断するときのひずみ（延伸率）を求め、比較対象の試料で同様の条件で測定して得られた破断時のひずみよりも被験試料の破断時の延伸率の方が、高値を示すときに、伸展率が向上することを意味する。

本発明の方法で、使用するポリアミノ酸としては、βシート構造を容易に形成するポリアミノ酸が挙げられ、より具体的には、ポリアラニン、ポリシステイン等が挙げられる。これらのポリアミノ酸は、化学酵素合成法等の公知の方法で製造できる（Numata K.ら、Polymer Journal, 2015; 47: 537-545、及び、Baker J. P.ら、Biomacromolecules 2012, 13, 947-951等）。

例えば、フィブロイン由来ポリペプチドからなる成形組成物原料に、ポリアラニンを配合させることによって実施される。コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる場合には、重合度が、2〜100の範囲、好ましくは、5〜50の範囲の、より好ましくは10〜30の範囲の、もっとも好ましくは10〜20の範囲のポリアラニンを、配合率として0.1〜30.0％の範囲、好ましくは0.5〜20.0％の範囲、より好ましくは1.0〜10.0％の範囲、もっとも好ましくは3.0〜5.0％の範囲の配合率でドープ液に配合させる。

本発明の方法を使用することにより、よりその物理的特性が向上した糸、敷布、不敷布、メッシュ及びネット等を製造することができる。これらのコンポジット成形組成物の、耐熱性、高い引張強度、靱性及び／又は伸展性等の優れた特性を活かし、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造に利用できる。また、高強度、高伸展性及び高靱性並びに生分解性及び生互換性を利用した創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料の製造にも使用できる。

なお、本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

天然のカイコ・シルクフィブロインタンパク質又は改変クモ糸フィブロインタンパク質にポリアラニン（L-polyAla又はT-polyAla）を配合したコンポジット成形フィルムの製造とその物理学的特性の評価
１．天然のカイコ・シルクフィブロインタンパク質にポリアラニンを配合したコンポジット成形フィルムの製造
以下に記載の方法で、polyAla(L-polyAla又はT-polyAla)を合成し、天然のカイコ・フィブロインタンパク質（Bombix mori)と下記の方法で製造したポリアラニン（L-polyAlaを5 wt%若しくは10 wt%又はT-polyAlaを1 wt%若しくは2.5 wt%）とを溶解したドープ液を調製し、該ドープ液よりキャスティング法によりコンポジット成形フィルムを製造し、張力変形試験を行い、物理的特性の変化を評価した。

張力変形試験は、小型卓上試験機（EZ -LX型、株式会社島津製作所、京都）で実施された。初期の試料長さは、15.0 mmであり、一定の速度0.5 mm/minで延伸した。結果が記録され、TRAPEZIUM （ver. 1.3.0, 株式会社島津製作所、京都）で解析された。測定は58%湿度、室温下で実施された。

２．polyAla(L-polyAla又はT-polyAla)の製造
(1) テレケリック型ポリアラニン(T-polyAla)の合成
(i) ロイシンイニシエータ(Leu-initiator）を使用した合成
(a) ロイシンイニシエータの合成
ロイシンイニシエータ(Leu-initiator）を使用したテレケリック型ポリアラニンの合成は、パパインを使用する化学酵素合成法で製造した。具体的には、L-ロイシンエチルエステル塩酸塩(6.07g）、トリエチルアミン(9.2 mL)及びジエチルエーテル(100mL)を0℃、窒素環境下のフラスコに添加し、この溶液に塩化スクシニル（1.7 mL）のジエチエルエーテル溶液（50 mL）を30分間で滴下し、0℃で2時間撹拌した。反応液を室温まで温めた後、水を加え、水層がジエチルエーテルで抽出された。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。粗生成物を真空乾燥後、ヘキサン/酢酸エチル=5 : 1(v/v)で再結晶し、ロイシンイニシエータ(Leu-initiator）の黄色針状結晶3.57ｇ（収率60％）を得た。

(b) 化学酵素合成法によるテレケリック型ポリアラニン（T-polyAla）の合成
アラニンエチルエステル塩酸塩（0.645 g）、上記ロイシンイニシエータ（0.080 g）、リン酸緩衝液（2mL、1M、pH 8.0）及びエタノール(1 mL)がガラスチューブに添加され、全ての基質が溶解するまで40℃で撹拌された。この溶液に、パパイン(0.300 g）のリン酸緩衝液(2.2 mL）溶液を一時に注いだ。アラニン及びパパインの最終濃度は、各々0.7 M及び50 mg/mLであった。この混合物を40℃で6時間撹拌した。撹拌後の混合物を室温まで冷却し、遠心分離（7000 rpm、4℃、10分間）で沈殿させた。粗沈殿物を脱イオン水で2回洗浄し、凍結乾燥し、白色固体のオリゴペプチド0.071 gを得た。

(ii) ビス（アラニンエチルエステル）イニシエータを使用したテレケリック型ポリアラニンの合成
(a) ビス（アラニンエチルエステル）イニシエータの合成
ビス（アラニンエチルエステル）イニシエータを使用した合成は、200 mLのフラスコに、アラニンエチルエステル塩酸塩（4.76 g）、トリエチルアミン（9.2 mL）及びクロロホルム（100 mL）を加え、この混合溶液に、塩化スクシニル（1.7 mL）のクロロホルム（50 mL）溶液を、0℃、窒素雰囲気下滴下した。この混合液を0℃、2時間撹拌した後、水を添加し反応を停止させた。この混合物を水、1 M炭酸水素ナトリウム水溶液、塩水(brine)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。粗生成物が、ヘキサン/酢酸エチルで再結晶され、白色の針状結晶3.58 gを得た（収率76％）。
赤外吸収スペクトル及びNMRスペクトル測定並びに燃焼元素分析の結果は以下のとおりである。
Infrared(IR) (neat): ν = 3301, 2991, 1729, 1639, 1545, 1356, 1238, 1204,1168, 1020 cm^-1. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, 25 °C, ppm): δ6.66(s, 2H), 4.53 (m, 2H) 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.57 (m, 4H), 1.40 (d,J = 7.1 Hz, 6H), 1.28 (t, J = 7.1 Hz, 6H). ¹³C NMR (125 MHz,CDCl₃, 25 °C): δ 173.16, 171.73, 61.37, 48.18, 31.55, 17.97, 14.04.Anal. Calcd for C₁₄H₂₄N₂O₆: C, 53.15; H, 7.65; N, 8.86. Found: C, 53.08; H, 7.61; N, 8.85.

(b) 化学酵素合成法によるテレケリック型ポリアラニン（T-polyAla）の合成
10 mLのガラスチューブにアラニンエチルエステル塩酸塩（0.922 g）、上記ビス（アラニンエチルエステル）イニシエータ（0.190 g）、リン酸緩衝液（2.0 mL、1 M、pH 8.0）及びテトラヒドロフラン (1.0 mL)を加え、全ての基質が完全に溶解するまで40℃で撹拌した。パパイン（0.300 g）のリン酸緩衝液溶液(2.0 mL)を一時に注いだ。アラニンエチルエステルとパパインの最終濃度は、各々1 M及び50 mg/mLであった。この混合液を40℃で6時間撹拌した。撹拌後の混合物を室温まで冷却後、遠心分離（7000 rpm、4℃、10分間）で沈殿させた。粗生成物を脱イオン水及びメタノールで２回洗浄後、凍結乾燥し、白色粉末0.221 g(61%)を得た。

(2) ライナー型（直鎖状）ポリアラニンの製造
ビス（アラニンエチルエステル）イニシエータのない条件以外、テレケリック型ポリアラニン(T-polyAla)と同様の方法を使用してライナー型（直鎖状）ポリアラニン（L-polyAla）を合成した。

(3) ポリアラニンの平均重合度と平均分子量の測定
製造されたL-polyAla及びT-polyAlaの平均分子量をNMR（Varian NMR System 500、Varian Medical Systems, Palo Alto, CA、米国）で測定し、算出したところ、L-polyAlaの平均重合度が5.8、平均分子量は531であり、T-polyAlaの平均重合度が5.9、平均分子量は593であった。

このようなのテレケリック型ポリアラニン（T-polyAla）の合成の実施例は例えば、Tsuchiya K.らの文献（Tsuchiya K.ら、Macromol. Biosci. 2016, 16, 1001-1008）に詳細に記載され、開示されており、この開示内容全体が本明細書中に引用によって取り込まれる。

３．改変クモ糸フィブロインタンパク質の製造と、polyAlaを配合したコンポジットフィルムの製造
改変クモ糸フィブロインタンパク質として、遺伝子組換えクモ糸シルクタンパク質（recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1；配列番号４、及び、ADF3Kai_noNR：配列番号：１８）を公知の方法（特開2014-129639号公報）に従って製造し、コンポジット成形フィルムの製造に使用した。

上記の改変クモ糸フィブロインタンパク質を用い、上記天然カイコ・フィブロインタンパク質のコンポジットフィルムの製造と同様の方法で、改変クモ糸フィブロインタンパク質のコンポジットフィルムをキャスティング法で製造した。

４．コンポジットフィルムの張力変形試験
上記のコンポジットフィルムに対して、上記天然フィブロインタンパク質のコンポジットフィルムと同様の方法で、張力変形試験を実施した。

５．前延伸コンポジットフィルムの製造と張力変形試験
上記のシルク（天然フィブロインタンパク質又は改変フィブロインタンパク質）にpolyAla（L-polyAla又はT-polyAla）を配合させたコンポジットフィルムを使用して、以下の方法により前延伸を負荷して製造した前延伸コンポジットフィルムに対して張力変形試験を行った。

シルクのみ、T-polyAla配合シルク、及びL-polyAla配合シルクの3種が小片（3 mm x 15 mm）に切断され、メタノールに5分間浸漬し、緩徐に手動一軸延伸機（IMC-1A11型、井元製作所）を用いて1.25、1.5、1.75又は2倍の長さまで前延伸した（各延伸率は、25%、50%、75%又は100%）。各前延伸されたガラス製ペトリ皿上に両面テープで固定され、室温下、3時間、デシケータで真空乾燥した。各前延伸フィルムを使用し、引張速度0.5 mm/min、25℃、相対湿度55〜60％下、引張試験機（小型卓上試験機 EZ Testシリーズ EZ-LX HS、島津製作所）によって、機械測定され、応力−歪曲線より、最大張力、ひずみ（限界延伸率）及び靭性が算定された。各測定は、5例ずつ実施され、平均値及び標準偏差を求めた。

６．広角Ｘ線回折（WAXD）の測定
100%前延伸された、シルクのみフィルム及びpolyAlaを含むフィルムの広角Ｘ線回折（WAXD）は、BL45XU型ビームライン（SPring-8、播磨）で実施された。

７.結果
(1)天然カイコ・フィブロインタンパク質のコンポジットフィルムに対する張力変形試験結果
天然カイコ・フィブロインタンパク質にライナー型ポリアラニン(L-polyAla）を5 wt％若しくは10 wt％又はテレケリック型ポリアラニン(T-polyAla）を1 wt％若しくは2.5 wt％配合して製造したフィルムの非延伸時の物理的特性の結果をそれぞれ表６、７及び図５に示した。

天然カイコ・フィブロインタンパク質にライナー型ポリアラニン(L-polyAla）を5wt％配合した場合、引張強度、ひずみ及び靭性の向上を認めた。

(2) 天然カイコ(Bombyx mori)シルクフィブロインタンパク質と改変クモ糸フィブロインタンパク質を使用したコンポジットフィルムの物理的特性の比較
カイコシルクフィブロイン(Bombyx. mori fibroin)にL-polyAla 5 wt%又はT-polyAla 1wt%を配合したコンポジットフィルム（表３、５）、及び改変クモ糸タンパク質にL-polyAla 10 wt%又はT-polyAla 1wt%を配合したコンポジットフィルム（表４、６）について、張力変形測定を行い、その物理特性を比較した。

カイコシルクフィブロインにL-polyAla 5 wt%を配合した場合、コンポジットフィルムのひずみが11.1％、靭性が16.9%増加した。一方、改変クモ糸フィブロインタンパク質（ADF Kai-noNR）にT-polyAlaを1 wt%添加した場合、ひずみが66.8％、靭性が133%の増加を認め、顕著な物理特性の向上を示した。

(3) 前延伸を加えたコンポジットフィルムに対する張力変形試験結果
テレケリック型ポリアラニン(T-polyAla）を5％配合して製造したコンポジットフィルムの製造工程で、延伸率0、25、50、75又は100％の前延伸をさらに負荷して製造したコンポジットフィルムに対して張力変形試験を行った結果を図６に示した。前延伸操作を行うことにより、テレケリック型ポリアラニンを添加しないコンポジットフィルムと比較した引張強度、ひずみ及び靭性は、より明確な増加を示した（図６）。

(4) 広角Ｘ線回折（WAXD）の測定結果
L-polyAla又はT-polyAlaを0、1、2.5、5又は10 wt%の割合で配合させたコンポジットフィルムを延伸率100%で前延伸して製造した前延伸コンポジットフィルムのWAXDの結果を、それぞれ図７に示した。図７aはL-poyAlaを添加した場合、図７bは、T-polyAlaを添加した場合のWAXDの変化を表す。

シルクのみのフィルムは、ADF3のβシートに基づく結晶格子の(020), (210), (211)面に由来するピークを示す。それぞれの面間隔dは0.51, 0.45, および0.37 nmである。
T-、L-polyAも同様にβシート結晶に基づくピークを示すが、(210)面の面間隔dは0.43 nmであり、シルクのそれと異なっている。

図７aは、前延伸100%のフィルム間の比較として、L-polyAla添加量を変えて測定した。添加量が増えるに従い、L-polyAの、すべてのβシートに基づくビーク強度が増加した。添加量が5%を超えると、ポリアラニンの(210)面のピークではなく、シルクの(210)面のピーク強度がさらに増加した。本結果は、L-polyAとシルクの、配列の構造上の類似性に起因して、L-polyAlaがシルクの結晶構造に影響を与えていることを示唆している。L-polyAlaによるシルクの結晶成長の促進が、フィルムの応力の向上につながっていると考えられる。

T-polyAlaを添加した場合のWAXDの変化を表す図７bでは、添加量を増やしていくと、ポリアラニンの全てのピーク強度が増加するものの、シルクの(210)面に基づくピークの強度について、顕著な変化は認められなかった。T-polyAlaは、そのテレケリック型の構造のために、シルクのβシートにほとんど影響を与えていないと考えられる。ポリアラニンが単独で結晶をつくり分散して存在するため、わずかな添加量でフィルムの靭性が向上すると思われる。

以上の結果において、改変クモ糸タンパク質に5 wt%のT-polyAlaを配合させたコンポジットフィルムのWAXDは、T-polyAla又はL-polyAlaの配合比率を増加させるに従い、結晶を示すピーク強度は増加した（図７a、b）。T-polyAla又はL-polyAlaがシルク中のβシート結晶の増加を促進し、これが物理的特性に影響を与えていると考えられる。

コンポジット繊維組成物の製造と、その物理学的特性の評価
１．実験材料及び方法
以下に記載する試薬以外の試薬及び溶媒は、和光純薬工業株式会社（大阪）より購入し、使用した。タンパク質粉末（配列番号１７）は、下記の方法により取得した。ドープ液を調製する前に、タンパク質粉末を真空下、１００℃で２時間乾燥した。ドープ液の溶媒としてギ酸を用いた。１型卓上型の紡糸装置（Spiber株式会社、山形）で、同装置のマニュアルに従って紡糸した。紡糸された繊維の直径、引張応力、引張歪み（ひずみ）、靭性が確認された。直径は、ニコン社製（東京）ECLIPSE LV100NDで測定した。応力と歪率は、INSTRON（東京）で測定し、評価した。靭性は、ブルーヒル・ソフトウェア（INSTRON、東京）を使用して計算した。

２．クモ糸タンパク質（ＰＲＴ７９９）の製造
（クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するクモ糸タンパク質（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。

配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたアミノ酸配列に対し、Ｎ末端に配列番号２１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。

設計したＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。

得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表７）ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで約１５時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。

当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（下記表８）添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、ＰＲＴ７９９を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ７９９に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ７９９の発現を確認した。

（クモ糸タンパク質の精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ７９９）を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、ＰＲＴ７９９の凍結乾燥粉末を得た。

得られた凍結乾燥粉末におけるＰＲＴ７９９の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＰＲＴ７９９の精製度は約８５％であった。

上記の方法で製造された改変クモ糸タンパク質（ＰＲＴ７９９、配列番号１７）を下記の実験に使用した。

３．実験方法
（１）ドープ液の調製（L-polyAla及びT-polyAla非添加）
上記のタンパク質粉末を使用した。正確に3.6gの乾燥した粉末を秤量し、透明のバイアルに採取した。ギ酸11.1gをバイアルに添加し、40℃で終夜撹拌し、透明の深黄色の液体を得た。このドープ液においてタンパク質濃度は24 wt%である。

（２）L-polyAla又はT-polyAlaを添加したドープ液の調製
polyAla (L-polyAla又はT-polyAla)の0.036g (上記タンパク質粉末に対して1 wt%）をバイアルに採取し、ギ酸（11.364g）を添加し、40℃で1〜2時間撹拌して溶解した。透明の液体を得た後、タンパク質粉末（3.6g）を添加した。タンパク質粉末が完全に溶解するまで、40℃で激しく撹拌した（通常8〜12時間）。このドープ液においてタンパク質濃度は、24wt%である。

（３）紡糸方法
上記の卓上型紡糸装置を用い、紡糸した（図４参照）。その条件を表９と表１０に示した。バス１には100％エタノール、バス２及び３には100％メタノール、バス４には水（水道水）を入れ、バス５、６は空の状態で紡糸した。紡糸した繊維は、バス４のみで延伸された。

（４）コンポジット繊維組成物の物理学的特性の評価
バスドラフトにおける射出速度に対する引張速度の割合が0.6又は0.5であり、各引張速度割合で洗浄水バス中の引張速度が7.0倍又は7.8倍で紡糸した場合における繊維の直径、引張強度、ひずみ、靭性、引張応力の標準偏差及び引張歪（ひずみ）の標準偏差をそれぞれ表１１及び１２に示した。

バスドラフトにおける引張速度割合（繊維の引張速度/ドープ液射出速度）が小さい程、凝集時間は長くなり、より繊維の凝集が強くなる。上記の結果は、引張速度割合が0.6及び0.5のいずれにおいてもL-polyAla又はT-polyAlaをそれぞれ1％配合したコンポジット繊維は、引張強度、ひずみ及び靭性が向上した。また、洗浄水中での引張速度が7.8倍の場合、表１１及び１２のいずれにおいても、polyAlaを添加しないコントロール群では、紡糸中に繊維が破断した。これらの結果は、L-polyAla又はT-polyAlaをフィブロイン由来タンパク質に配合させることにより、コンポジット繊維の物理的特性を向上させることを示すものである。

＜総括＞
上記で認められた結果は、天然フィブロインタンパク質、又は、人工的に改変され製造されたフィブロイン由来タンパク質のいずれに対しても、βシート構造を有するL-poyAla又はT-polyAlaなどのポリペプチド又はポリアミノ酸を配合させて、コンポジット成形組成物を作成することにより、引張張力、最大引張限界率及び靭性等の物理的特性を向上させることができることを示すものである。また、このコンポジット成形組成物の物理特性の向上は、使用するフィブロイン由来タンパク質の種類によって、最適な特性をもたらすには、βシート構造を有するポリペプチド又はポリアミノ酸の種類が異なることを示すものであった。さらに、引張張力、最大引張限界率及び靭性等の各物理的特性に対して、それぞれ至適な特性をもたらす配合量が相違することを示した。

本結果は、コンポジット成形組成物の所望とする特性に応じて、使用する原料、及び、配合量を変化させることにより、物理的特性が向上したコンポジット成形組成物を取得できることを示すものであった。

また、天然のアミノ酸によって構成されるポリペプチド又はポリアミノ酸以外にも、これらの天然のアミノ酸由来以外のβシート構造を有するポリマーをフィブロイン由来タンパク質に配合させることにより、本発明のコンポジット成形組成物の製造に使用してもよい。

Claims (26)

1. フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを含むことを特徴とする、組成物。
2. 前記組成物がコンポジット成形組成物であって、フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合され、成形されていることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記コンポジット成形組成物は、前記ポリペプチド及び／又はポリアミノ酸由来のβシート構造が保持されていることを特徴とする、請求項２に記載のコンポジット成形組成物。
4. 前記コンポジット成形組成物は、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲル又はコンポジットモールド成形体から選択されることを特徴とする、請求項２又は３に記載のコンポジット成形組成物。
5. フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合されたコンポジット成形組成物であって、
   該コンポジット成形組成物は、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲルから選択され、
   (i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを溶解したドープ液を調製するステップ、
   (ii) 前記ドープ液よりコンポジット成形組成物を成形するステップ、
   を含む製造方法で製造されることを特徴とする、コンポジット成形組成物。
6. コンポジット成形組成物であって、該コンポジット成形組成物は、コンポジット繊維又はコンポジットフィルムから選択され、
   請求項５に記載のステップ(i)、(ii)に加えて、さらに、
   (iii) 前記(ii)で得られたコンポジット成形組成物を溶媒中で延伸し、乾燥するステップ、
   を含む製造方法で製造されることを特徴とする、前延伸コンポジット成形組成物。
7. コンポジット成形組成物であって、前記コンポジット成形組成物は、コンポジットモールド成形体であって、
   (i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを混合し、混合物を調製するステップ、
   (ii) 前記混合物に圧力を負荷し、加熱するステップ、
   を含む製造方法で製造されるモールド成形体であることを特徴とする、コンポジット成形組成物。
8. 前記フィブロイン由来タンパク質が、
   (i) 天然のフィブロイン由来タンパク質、及び／又は、
   (ii) 改変されたフィブロイン由来タンパク質
   から選択されることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載のコンポジット成形組成物。
9. 前記天然のフィブロイン由来タンパク質が、絹フィブロイン由来のシルクタンパク質（シルクフィブロインタンパク質）、クモ糸フィブロイン由来のクモ糸タンパク質（クモ糸フィブロインタンパク質）、及びホーネットシルクフィブロイン由来のホーネットシルクタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項８に記載のコンポジット成形組成物。
10. 前記改変されたフィブロイン由来タンパク質が、下記式(I)で表されるドメイン配列を含む改変されたフィブロイン由来タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載のコンポジット成形組成物；
    

    

    ただし、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されており、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する、改変フィブロインタンパク質：
    [式I中、
    （Ａ）_ｎモチーフは２〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ、
    （Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が４０％以上であり、
    ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、
    ｍは２〜３００の整数であり、
    複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、相互に同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよく、
    複数存在するＲＥＰは、相互に同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい]。
11. 請求項１０に記載の前記改変されたフィブロイン由来タンパク質において、前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（ただし、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を表す。）から選ばれる少なくとも１つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有し、かつグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であることを特徴とする、コンポジット成形組成物。
12. 請求項１０又は１１に記載の前記改変されたフィブロイン由来タンパク質において、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣り合う２つの[（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ]ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としてとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が２〜３．５となる前記隣り合う２つの[（Ａ）_ｎモチーフ−ＲＥＰ]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値をｘとし、前記ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙ（％）の最大値が２０％以上であることを特徴とする、コンポジット成形組成物。
13. 前記式(I)で表される改変されたフィブロイン由来タンパク質が、配列番号１〜１９で表されるアミノ酸配列を有する改変されたフィブロイン由来タンパク質であることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のコンポジット成形組成物。
14. 前記フィブロイン由来タンパク質が、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のフィブロイン由来タンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するフィブロイン由来タンパク質であることを特徴とする、コンポジット成形組成物。
15. 前記βシート構造を有するポリアミノ酸がポリアラニンであることを特徴とする、請求項２〜１４のいずれか1項に記載のコンポジット成形組成物。
16. 前記ポリアラニンが、ライナー型ポリアラニン又はテレケリック型ポリアラニンから選択されることを特徴とする、請求項１５に記載のコンポジット成形組成物。
17. フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合された、コンポジット繊維、コンポジットフィルム、コンポジットゲルから選択されるコンポジット成形組成物の製造方法であって、
    (i) フィブロイン由来タンパク質と、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を溶解したドープ液を調製するステップ、
    (ii) 前記ドープ液を紡糸又は延伸することにより前記コンポジット成形組成物を製造するステップ、
    を含むことを特徴とする、製造方法。
18. フィブロイン由来タンパク質にβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸が配合された、コンポジットモールド成形体の製造方法であって、
    (i) 粉状のフィブロイン由来タンパク質と、粉状のβシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸とを混合し、混合体を調製するステップ、
    (ii) 前記混合体に圧力を負荷し、加熱するステップ、
    を含むことを特徴とする、製造方法。
19. 前延伸コンポジット成形組成物の製造方法であって、
    (i) 請求項１７又は１８に記載の製造方法で製造されたコンポジット成形組成物を溶媒中で延伸するステップ、及び、
    (ii) 延伸されたコンポジット成形組成物を乾燥させるステップ、
    を含むことを特徴とする、製造方法。
20. 前記フィブロイン由来タンパク質が、
    (i) 天然のフィブロイン由来タンパク質、及び／又は、
    (ii) 改変されたフィブロイン由来タンパク質
    から選択されることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
21. 前記天然のフィブロイン由来タンパク質が、絹フィブロイン由来のシルクタンパク質（シルクフィブロインタンパク質）、クモ糸フィブロイン由来のクモ糸タンパク質（クモ糸フィブロインタンパク質）、及びホーネットシルクフィブロイン由来のホーネットシルクタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
22. 前記βシート構造を有するポリアミノ酸がポリアラニンであることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか1項に記載の製造方法。
23. 前記ポリアラニンが、ライナー型ポリアラニン又はテレケリック型ポリアラニンから選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
24. フィブロイン由来タンパク質に、βシート構造を有するポリペプチド及び／又はポリアミノ酸を配合させることを特徴とする、コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法。
25. 請求項２４に記載の方法に、さらに、前記コンポジット成形組成物を溶媒中で延伸後、乾燥させることを特徴とする、コンポジット成形組成物の物理的特性を向上させる方法。
26. 前記物理的特性の向上が、引張強度の増加、ひずみの増加及び／又は靭性の増加であることを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の方法。
    
    

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