JP7372678B2 - 成形体及びその製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、成形体及びその製造方法に関する。
シルク繊維は、蚕の繭から得られる天然繊維である。シルク繊維は、優れた機械的特性、吸湿特性及び消臭特性を有し、衣服原料として広く用いられている素材である。シルク繊維は、免疫寛容な天然繊維であり、生体親和性が高いため手術用縫合糸等の用途にも用いられている。
シルク繊維は、湿潤状態において、繊維強度が著しく低下しスレ及びピリングといった素材劣化、並びに著しい寸法変化(収縮)が生じることが知られており、この湿潤状態での劣化等の問題に対処する手段が種々提案されている(例えば、特許文献1)。
特開2012-246580号公報
本発明者らの検討によれば、人為的に製造されたフィブロイン(改変フィブロイン)を成形した成形体(例えば、改変フィブロイン繊維)は、撥水性及び水接触時の収縮性等の耐水性が充分ではないことが明らかとなった。改変フィブロインを含む成形体において、耐水性が問題となることはこれまで知られておらず、これに対処する手段については、未だ充分な検討がなされていないのが現状である。
本発明は、耐水性が向上した改変フィブロインを含む成形体を提供することを目的とする。本発明はまた、耐水性が向上した改変フィブロインを含む成形体の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
[1]
改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む、成形体。
[2]
上記改変フィブロインと上記耐水性付与物質とが共有結合している、[1]に記載の成形体。
[3]
上記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、[1]又は[2]に記載の成形体。
[4]
上記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、[1]~[3]のいずれかに記載の成形体。
[5]
改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程を備える、成形体を製造する方法。
[6]
上記前記成形体に上記耐水性付与物質を結合させる上記工程が、上記前駆成形体に上記耐水性付与物質又は耐水性付与物質の前駆体を接触させた状態でプラズマを照射し、それにより上記改変フィブロインと上記耐水性付与物質とを共有結合させることを含む、[5]に記載の方法。
[7]
上記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、[5]又は[6]に記載の方法。
[8]
上記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、[5]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
改変フィブロイン及び耐水性付与物質を含有する原料を成形して成形体を得る工程を備える、成形体を製造する方法。
本発明によれば、耐水性が向上した改変フィブロインを含む成形体を提供することが可能となる。本発明によればまた、耐水性が向上した改変フィブロインを含む成形体の製造方法を提供するが可能となる。
一実施形態に係る改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。 天然由来のフィブロインのz/w(%)の値の分布を示す図である。 天然由来のフィブロインのx/y(%)の値の分布を示す図である。 一実施形態に係る改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。 一実施形態に係る改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。 成形体の一例としての繊維の一実施形態を示す斜視図である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
成形体
本発明に係る成形体は、改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む。
<改変フィブロイン>
本実施形態に係る改変フィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のN末端側及びC末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列(N末端配列及びC末端配列)が付加されていてもよい。N末端配列及びC末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、100残基程度のアミノ酸からなる。
本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン(人造フィブロイン)を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの(例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの)であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの(例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの)であってもよい。
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域(典型的には、アミノ酸配列の(A)モチーフに相当する。)と非晶領域(典型的には、アミノ酸配列のREPに相当する。)を生じるアミノ酸配列であり、式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、(A)モチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は2~27である。(A)モチーフのアミノ酸残基数は、2~20、4~27、4~20、8~20、10~20、4~16、8~16、又は10~16の整数であってよい。また、(A)モチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は40%以上であればよく、60%以上、70%以上、80%以上、83%以上、85%以上、86%以上、90%以上、95%以上、又は100%(アラニン残基のみで構成されることを意味する。)であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する(A)モチーフは、少なくとも7つがアラニン残基のみで構成されてもよい。REPは2~200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。REPは、10~200アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。mは2~300の整数を示し、10~300の整数であってもよい。複数存在する(A)モチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するREPは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び/又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Nucleic Acid Res.10,6487(1982)、Methods in Enzymology,100,448(1983)等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
天然由来のフィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ(Bombyx mori)、クワコ(Bombyx mandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、楓蚕(Eriogyna pyretorum)、蓖蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、栗虫(Caligura japonica)、チュッサー蚕(Antheraea mylitta)、ムガ蚕(Antheraea assama)等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ(Vespa simillima xanthoptera)の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインL鎖(GenBankアクセッション番号M76430(塩基配列)、及びAAA27840.1(アミノ酸配列))が挙げられる。
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属(Araneus属)に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属(Neoscona属)に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属(Pronus属)に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属(Cyrtarachne属)に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属(Gasteracantha属)に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属(Ordgarius属)に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属(Argiope属)に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属(Arachnura属)に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属(Acusilas属)に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属(Cytophora属)に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属(Poltys属)に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属(Cyclosa属)に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属(Chorizopes属)に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属(Tetragnatha属)に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属(Leucauge属)に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属(Nephila属)に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属(Menosira属)に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属(Dyschiriognatha属)に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属(Latrodectus属)に属するクモ、及びユープロステノプス属(Euprosthenops属)に属するクモ等のアシナガグモ科(Tetragnathidae科)に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、MaSp(MaSp1及びMaSp2)、ADF(ADF3及びADF4)等の牽引糸タンパク質、MiSp(MiSp1及びMiSp2)等が挙げられる。
クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、fibroin-3(adf-3)[Araneus diadematus由来](GenBankアクセッション番号AAC47010(アミノ酸配列)、U47855(塩基配列))、fibroin-4(adf-4)[Araneus diadematus由来](GenBankアクセッション番号AAC47011(アミノ酸配列)、U47856(塩基配列))、dragline silk protein spidroin 1[Nephila clavipes由来](GenBankアクセッション番号AAC04504(アミノ酸配列)、U37520(塩基配列))、major ampullate spidroin 1[Latrodectus hesperus由来](GenBankアクセッション番号ABR68856(アミノ酸配列)、EF595246(塩基配列))、dragline silk protein spidroin 2[Nephila clavata由来](GenBankアクセッション番号AAL32472(アミノ酸配列)、AF441245(塩基配列))、major ampullate spidroin 1[Euprosthenops australis由来](GenBankアクセッション番号CAJ00428(アミノ酸配列)、AJ973155(塩基配列))、及びmajor ampullate spidroin 2[Euprosthenops australis](GenBankアクセッション番号CAM32249.1(アミノ酸配列)、AM490169(塩基配列))、minor ampullate silk protein 1[Nephila clavipes](GenBankアクセッション番号AAC14589.1(アミノ酸配列))、minor ampullate silk protein 2[Nephila clavipes](GenBankアクセッション番号AAC14591.1(アミノ酸配列))、minor ampullate spidroin-like protein[Nephilengys cruentata](GenBankアクセッション番号ABR37278.1(アミノ酸配列)等が挙げられる。
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、NCBI GenBankに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、NCBI GenBankに登録されている配列情報のうちDIVISIONとしてINVを含む配列の中から、DEFINITIONにspidroin、ampullate、fibroin、「silk及びpolypeptide」、又は「silk及びprotein」がキーワードとして記載されている配列、CDSから特定のproductの文字列、SOURCEからTISSUE TYPEに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
本実施形態に係る改変フィブロインは、改変絹(シルク)フィブロイン(カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの)であってもよく、改変クモ糸フィブロイン(クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの)であってもよい。改変フィブロインとしては、改変クモ糸フィブロインが好ましい。
改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン(第1の改変フィブロイン)、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン(第2の改変フィブロイン)、(A)モチーフの含有量が低減された改変フィブロイン(第3の改変フィブロイン)、グリシン残基の含有量、及び(A)モチーフの含有量が低減された改変フィブロイン(第4の改変フィブロイン)、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン(第5の改変フィブロイン)、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン(第6の改変フィブロイン)が挙げられる。
第1の改変フィブロインとしては、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第1の改変フィブロインにおいて、(A)モチーフのアミノ酸残基数は、3~20の整数が好ましく、4~20の整数がより好ましく、8~20の整数が更に好ましく、10~20の整数が更により好ましく、4~16の整数が更によりまた好ましく、8~16の整数が特に好ましく、10~16の整数が最も好ましい。第1の改変フィブロインは、式1中、REPを構成するアミノ酸残基の数は、10~200残基であることが好ましく、10~150残基であることがより好ましく、20~100残基であることが更に好ましく、20~75残基であることが更により好ましい。第1の改変フィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、40%以上であることが好ましく、60%以上であることがより好ましく、70%以上であることが更に好ましい。
第1の改変フィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつC末端配列が配列番号1~3のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号1~3のいずれかに示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
配列番号1に示されるアミノ酸配列は、ADF3(GI:1263287、NCBI)のアミノ酸配列のC末端の50残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号2に示されるアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のC末端から20残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号3に示されるアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のC末端から29残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
第1の改変フィブロインのより具体的な例として、(1-i)配列番号4(recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1)で示されるアミノ酸配列、又は(1-ii)配列番号4で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
配列番号4で示されるアミノ酸配列は、N末端に開始コドン、His10タグ及びHRV3Cプロテアーゼ(Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ)認識サイトからなるアミノ酸配列(配列番号5)を付加したADF3のアミノ酸配列において、第1~13番目の反復領域をおよそ2倍になるように増やすとともに、翻訳が第1154番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号4で示されるアミノ酸配列のC末端のアミノ酸配列は、配列番号3で示されるアミノ酸配列と同一である。
(1-i)の改変フィブロインは、配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
第2の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第2の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともREP中の1又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
第2の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中のGGX及びGPGXX(但し、Gはグリシン残基、Pはプロリン残基、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも1又は複数の当該モチーフ配列中の1つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第2の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、10%以上であってもよい。
第2の改変フィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)モチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列中の全REPに含まれるXGX(但し、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をzとし、上記ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)モチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をwとしたときに、z/wが30%以上、40%以上、50%以上又は50.9%以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。(A)モチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は83%以上であってよいが、86%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることが更に好ましく、100%であること(アラニン残基のみで構成されることを意味する)が更により好ましい。
第2の改変フィブロインは、GGXモチーフの1つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、XGXからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第2の改変フィブロインは、ドメイン配列中のGGXからなるアミノ酸配列の含有割合が30%以下であることが好ましく、20%以下であることがより好ましく、10%以下であることが更に好ましく、6%以下であることが更により好ましく、4%以下であることが更によりまた好ましく、2%以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のGGXからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記XGXからなるアミノ酸配列の含有割合(z/w)の算出方法と同様の方法で算出することができる。
z/wの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのREPから、XGXからなるアミノ酸配列を抽出する。XGXを構成するアミノ酸残基の総数がzである。例えば、XGXからなるアミノ酸配列が50個抽出された場合(重複はなし)、zは50×3=150である。また、例えば、XGXGXからなるアミノ酸配列の場合のように2つのXGXに含まれるX(中央のX)が存在する場合は、重複分を控除して計算する(XGXGXの場合は5アミノ酸残基である)。wは、ドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図1に示したドメイン配列の場合、wは4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230である(最もC末端側に位置する(A)モチーフは除いている。)。次に、zをwで除すことによって、z/w(%)を算出することができる。
ここで、天然由来のフィブロインにおけるz/wについて説明する。まず、上述のように、NCBI GenBankにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、663種類のフィブロイン(このうち、クモ類由来のフィブロインは415種類)が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のGGXからなるアミノ酸配列の含有割合が6%以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、z/wを算出した。その結果を図2に示す。図2の横軸はz/w(%)を示し、縦軸は頻度を示す。図2から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるz/wは、いずれも50.9%未満である(最も高いもので、50.86%)。
第2の改変フィブロインにおいて、z/wは、50.9%以上であることが好ましく、56.1%以上であることがより好ましく、58.7%以上であることが更に好ましく、70%以上であることが更により好ましく、80%以上であることが更によりまた好ましい。z/wの上限に特に制限はないが、例えば、95%以下であってもよい。
第2の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、GGXモチーフ及びGPGXXモチーフにおける1つのグリシン残基を選択してもよいし、またz/wが50.9%以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン(V)残基、ロイシン(L)残基、イソロイシン(I)残基、メチオニン(M)残基、プロリン(P)残基、フェニルアラニン(F)残基及びトリプトファン(W)残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン(Q)残基、アスパラギン(N)残基、セリン(S)残基、リシン(K)残基及びグルタミン酸(E)残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン(V)残基、ロイシン(L)残基、イソロイシン(I)残基及びグルタミン(Q)残基がより好ましく、グルタミン(Q)残基が更に好ましい。
第2の改変フィブロインのより具体的な例として、(2-i)配列番号6(Met-PRT380)、配列番号7(Met-PRT410)、配列番号8(Met-PRT468)若しくは配列番号9(Met-PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(2-ii)配列番号6、配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
(2-i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号6で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号10(Met-PRT313)で示されるアミノ酸配列のREP中の全てのGGXをGQXに置換したものである。配列番号7で示されるアミノ酸配列は、配列番号6で示されるアミノ酸配列から、N末端側からC末端側に向かって2つおきに(A)モチーフを欠失させ、更にC末端配列の手前に[(A)モチーフ-REP]を1つ挿入したものである。配列番号8で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列の各(A)モチーフのC末端側に2つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン(Q)残基をセリン(S)残基に置換し、配列番号7の分子量とほぼ同じとなるようにN末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号9で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中に存在する20個のドメイン配列の領域(但し、当該領域のC末端側の数アミノ酸残基が置換されている。)を4回繰り返した配列のC末端にHisタグが付加されたものである。
配列番号10で示されるアミノ酸配列(天然由来のフィブロインに相当)におけるz/wの値は、46.8%である。配列番号6で示されるアミノ酸配列、配列番号7で示されるアミノ酸配列、配列番号8で示されるアミノ酸配列、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列におけるz/wの値は、それぞれ58.7%、70.1%、66.1%及び70.0%である。また、配列番号10、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列のギザ比率(後述する)1:1.8~11.3におけるx/yの値は、それぞれ15.0%、15.0%、93.4%、92.7%及び89.3%である。
(2-i)の改変フィブロインは、配列番号6、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(2-ii)の改変フィブロインは、配列番号6、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(2-ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(2-ii)の改変フィブロインは、配列番号6、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつREP中に含まれるXGX(但し、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をzとし、上記ドメイン配列中のREPの総アミノ酸残基数をwとしたときに、z/wが50.9%以上であることが好ましい。
第2の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性(結合性、アフィニティ)を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ(Hisタグ)を挙げることができる。Hisタグは、ヒスチジン残基が4から10個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー(chelating metal chromatography)による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列)が挙げられる。
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質(MBP)等のタグ配列を利用することもできる。
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド(エピトープ)をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、HA(インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列)タグ、mycタグ、FLAGタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(2-iii)配列番号12(PRT380)、配列番号13(PRT410)、配列番号14(PRT468)若しくは配列番号15(PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(2-iv)配列番号12、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号16(PRT313)、配列番号12、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号10、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。
(2-iii)の改変フィブロインは、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(2-iv)の改変フィブロインは、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(2-iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(2-iv)の改変フィブロインは、配列番号12、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつREP中に含まれるXGX(但し、Xはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。)からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をzとし、上記ドメイン配列中のREPの総アミノ酸残基数をwとしたときに、z/wが50.9%以上であることが好ましい。
第2の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、(A)モチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第3の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも1又は複数の(A)モチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
第3の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから(A)モチーフを10~40%欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともN末端側からC末端側に向かって1~3つの(A)モチーフ毎に1つの(A)モチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともN末端側からC末端側に向かって2つ連続した(A)モチーフの欠失、及び1つの(A)モチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともN末端側からC末端側に向かって2つおきに(A)モチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
第3の改変フィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含み、N末端側からC末端側に向かって、隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットのREPのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないREPのアミノ酸残基数を1としたとき、他方のREPのアミノ酸残基数の比が1.8~11.3となる隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をxとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をyとしたときに、x/yが20%以上、30%以上、40%以上又は50%以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。(A)モチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は83%以上であってよいが、86%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることが更に好ましく、100%であること(アラニン残基のみで構成されることを意味する)が更により好ましい。
x/yの算出方法を図1を参照しながら更に詳細に説明する。図1には、改変フィブロインからN末端配列及びC末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、N末端側(左側)から(A)モチーフ-第1のREP(50アミノ酸残基)-(A)モチーフ-第2のREP(100アミノ酸残基)-(A)モチーフ-第3のREP(10アミノ酸残基)-(A)モチーフ-第4のREP(20アミノ酸残基)-(A)モチーフ-第5のREP(30アミノ酸残基)-(A)モチーフという配列を有する。
隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットは、重複がないように、N末端側からC末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない[(A)モチーフ-REP]ユニットが存在してもよい。図1には、パターン1(第1のREPと第2のREPの比較、及び第3のREPと第4のREPの比較)、パターン2(第1のREPと第2のREPの比較、及び第4のREPと第5のREPの比較)、パターン3(第2のREPと第3のREPの比較、及び第4のREPと第5のREPの比較)、パターン4(第1のREPと第2のREPの比較)を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
次に各パターンについて、選択した隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニット中の各REPのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を1としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第1のREP(50アミノ酸残基)と第2のREP(100アミノ酸残基)の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第1のREPを1としたとき、第2のREPのアミノ酸残基数の比は、100/50=2である。同様に、第4のREP(20アミノ酸残基)と第5のREP(30アミノ酸残基)の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第4のREPを1としたとき、第5のREPのアミノ酸残基数の比は、30/20=1.5である。
図1中、よりアミノ酸残基数の少ない方を1としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が1.8~11.3となる[(A)モチーフ-REP]ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を1としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が1.8未満又は11.3超となる[(A)モチーフ-REP]ユニットの組は破線で示した。
各パターンにおいて、実線で示した隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる(REPのみではなく、(A)モチーフのアミノ酸残基数もである。)。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値(合計値の最大値)をxとする。図1に示した例では、パターン1の合計値が最大である。
次に、xをドメイン配列の総アミノ酸残基数yで除すことによって、x/y(%)を算出することができる。
第3の改変フィブロインにおいて、x/yは、50%以上であることが好ましく、60%以上であることがより好ましく、65%以上であることが更に好ましく、70%以上であることが更により好ましく、75%以上であることが更によりまた好ましく、80%以上であることが特に好ましい。x/yの上限に特に制限はなく、例えば、100%以下であってよい。ギザ比率が1:1.9~11.3の場合には、x/yは89.6%以上であることが好ましく、ギザ比率が1:1.8~3.4の場合には、x/yは77.1%以上であることが好ましく、ギザ比率が1:1.9~8.4の場合には、x/yは75.9%以上であることが好ましく、ギザ比率が1:1.9~4.1の場合には、x/yは64.2%以上であることが好ましい。
第3の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する(A)モチーフの少なくとも7つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、x/yは、46.4%以上であることが好ましく、50%以上であることがより好ましく、55%以上であることが更に好ましく、60%以上であることが更により好ましく、70%以上であることが更によりまた好ましく、80%以上であることが特に好ましい。x/yの上限に特に制限はなく、100%以下であればよい。
ここで、天然由来のフィブロインにおけるx/yについて説明する。まず、上述のように、NCBI GenBankにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、663種類のフィブロイン(このうち、クモ類由来のフィブロインは415種類)が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、x/yを算出した。ギザ比率が1:1.9~4.1の場合の結果を図3に示す。
図3の横軸はx/y(%)を示し、縦軸は頻度を示す。図3から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるx/yは、いずれも64.2%未満である(最も高いもので、64.14%)。
第3の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、x/yが64.2%以上になるように(A)モチーフをコードする配列の1又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、x/yが64.2%以上になるように1又は複数の(A)モチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から(A)モチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
第3の改変フィブロインのより具体的な例として、(3-i)配列番号17(Met-PRT399)、配列番号7(Met-PRT410)、配列番号8(Met-PRT468)若しくは配列番号9(Met-PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(3-ii)配列番号17、配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
(3-i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号17で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号10(Met-PRT313)で示されるアミノ酸配列から、N末端側からC末端側に向かって2つおきに(A)モチーフを欠失させ、更にC末端配列の手前に[(A)モチーフ-REP]を1つ挿入したものである。配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列は、第2の改変フィブロインで説明したとおりである。
配列番号10で示されるアミノ酸配列(天然由来のフィブロインに相当)のギザ比率1:1.8~11.3におけるx/yの値は15.0%である。配列番号17で示されるアミノ酸配列、及び配列番号7で示されるアミノ酸配列におけるx/yの値は、いずれも93.4%である。配列番号8で示されるアミノ酸配列におけるx/yの値は、92.7%である。配列番号9で示されるアミノ酸配列におけるx/yの値は、89.3%である。配列番号10、配列番号17、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列におけるz/wの値は、それぞれ46.8%、56.2%、70.1%、66.1%及び70.0%である。
(3-i)の改変フィブロインは、配列番号17、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(3-ii)の改変フィブロインは、配列番号17、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(3-ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(3-ii)の改変フィブロインは、配列番号17、配列番号7、配列番号8又は配列番号9で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつN末端側からC末端側に向かって、隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットのREPのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないREPのアミノ酸残基数を1としたとき、他方のREPのアミノ酸残基数の比が1.8~11.3(ギザ比率が1:1.8~11.3)となる隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をxとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をyとしたときに、x/yが64.2%以上であることが好ましい。
第3の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(3-iii)配列番号18(PRT399)、配列番号13(PRT410)、配列番号14(PRT468)若しくは配列番号15(PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(3-iv)配列番号18、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号18、配列番号13、配列番号14及び配列番号15で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号17、配列番号7、配列番号8及び配列番号9で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。
(3-iii)の改変フィブロインは、配列番号18、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(3-iv)の改変フィブロインは、配列番号18、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(3-iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(3-iv)の改変フィブロインは、配列番号18、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつN末端側からC末端側に向かって、隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットのREPのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないREPのアミノ酸残基数を1としたとき、他方のREPのアミノ酸残基数の比が1.8~11.3となる隣合う2つの[(A)モチーフ-REP]ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をxとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をyとしたときに、x/yが64.2%以上であることが好ましい。
第3の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第4の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、(A)モチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第4の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも1又は複数の(A)モチーフが欠失したことに加え、更に少なくともREP中の1又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、上述した第2の改変フィブロインと、第3の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第2の改変フィブロイン、及び第3の改変フィブロインで説明したとおりである。
第4の改変フィブロインのより具体的な例として、(4-i)配列番号7(Met-PRT410)、配列番号8(Met-PRT468)、配列番号9(Met-PRT799)、配列番号13(PRT410)、配列番号14(PRT468)若しくは配列番号15(PRT799)で示されるアミノ酸配列、又は(4-ii)配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号13、配列番号14若しくは配列番号15で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号13、配列番号14又は配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
第5の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する2~4アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)及びアラニン(A)から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
第5の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
第5の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からREP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基)を疎水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基)に置換すること、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
第5の改変フィブロインは、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含み、最もC末端側に位置する(A)モチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をpとし、最もC末端側に位置する(A)モチーフから上記ドメイン配列のC末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をqとしたときに、p/qが6.2%以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標(Hydropathy index:Kyte J,&Doolittle R(1982)“A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”,J.Mol.Biol.,157,pp.105-132)を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標(ハイドロパシー・インデックス、以下「HI」とも記す。)は、下記表1に示すとおりである。
Figure 0007372678000001
p/qの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列から、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列を除いた配列(以下、「配列A」とする)を用いる。まず、配列Aに含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する4アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のHIの総和を4(アミノ酸残基数)で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する4アミノ酸残基について求める(各アミノ酸残基は、1~4回平均値の算出に用いられる。)。次いで、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には1アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がpである。また、配列Aに含まれるアミノ酸残基の総数がqである。
例えば、「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」が20カ所抽出された場合(重複はなし)、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域には、連続する4アミノ酸残基(重複はなし)が20含まれることになり、pは20×4=80である。また、例えば、2つの「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」が1アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域には、7アミノ酸残基含まれることになる(p=2×4-1=7。「-1」は重複分の控除である。)。例えば、図4に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が2.6以上となる連続する4アミノ酸残基」が重複せずに7つ存在するため、pは7×4=28となる。また、例えば、図4に示したドメイン配列の場合、qは4+50+4+40+4+10+4+20+4+30=170である(C末端側の最後に存在する(A)モチーフは含めない)。次に、pをqで除すことによって、p/q(%)を算出することができる。図4の場合28/170=16.47%となる。
第5の改変フィブロインにおいて、p/qは、6.2%以上であることが好ましく、7%以上であることがより好ましく、10%以上であることが更に好ましく、20%以上であることが更により好ましく、30%以上であることが更によりまた好ましい。p/qの上限は、特に制限されないが、例えば、45%以下であってもよい。
第5の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のp/qの条件を満たすように、REP中の1又は複数の親水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基)を疎水性アミノ酸残基(例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基)に置換すること、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のp/qの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び/又はREP中に1又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)及びアラニン(A)が好ましく、バリン(V)、ロイシン(L)及びイソロイシン(I)がより好ましい。
第5の改変フィブロインのより具体的な例として、(5-i)配列番号19(Met-PRT720)、配列番号20(Met-PRT665)若しくは配列番号21(Met-PRT666)で示されるアミノ酸配列、又は(5-ii)配列番号19、配列番号20若しくは配列番号21で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
(5-i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号19で示されるアミノ酸配列は、配列番号7(Met-PRT410)で示されるアミノ酸配列に対し、REP一つ置きにそれぞれ3アミノ酸残基からなるアミノ酸配列(VLI)を2カ所挿入し、かつ配列番号7で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにC末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号20で示されるアミノ酸配列は、配列番号8(Met-PRT468)で示されるアミノ酸配列に対し、REP一つ置きにそれぞれ3アミノ酸残基からなるアミノ酸配列(VLI)を1カ所挿入したものである。配列番号21で示されるアミノ酸配列は、配列番号8で示されるアミノ酸配列に対し、REP一つ置きにそれぞれ3アミノ酸残基からなるアミノ酸配列(VLI)を2カ所挿入したものである。
(5-i)の改変フィブロインは、配列番号19、配列番号20又は配列番号21で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(5-ii)の改変フィブロインは、配列番号19、配列番号20又は配列番号21で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(5-ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(5-ii)の改変フィブロインは、配列番号19、配列番号20又は配列番号21で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をpとし、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をqとしたときに、p/qが6.2%以上であることが好ましい。
第5の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(5-iii)配列番号22(PRT720)、配列番号23(PRT665)若しくは配列番号24(PRT666)で示されるアミノ酸配列、又は(5-iv)配列番号22、配列番号23若しくは配列番号24で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号22、配列番号23及び配列番号24で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号19、配列番号20及び配列番号21で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。
(5-iii)の改変フィブロインは、配列番号22、配列番号23又は配列番号24で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(5-iv)の改変フィブロインは、配列番号22、配列番号23又は配列番号24で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(5-iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]で表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(5-iv)の改変フィブロインは、配列番号22、配列番号23又は配列番号24で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有し、かつ最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、連続する4アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が2.6以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をpとし、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をqとしたときに、p/qが6.2%以上であることが好ましい。
第5の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
第6の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
第6の改変フィブロインは、REPのアミノ酸配列中に、GGXモチーフ及びGPGXXモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
第6の改変フィブロインが、REP中にGPGXXモチーフを含む場合、GPGXXモチーフ含有率は、通常1%以上であり、5%以上であってもよく、10%以上であるのが好ましい。GPGXXモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、50%以下であってよく、30%以下であってもよい。
本明細書において、「GPGXXモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるGPGXXモチーフの個数の総数を3倍した数(即ち、GPGXXモチーフ中のG及びPの総数に相当)をsとし、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)モチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、GPGXXモチーフ含有率はs/tとして算出される。
GPGXXモチーフ含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列」(REPに相当する配列)には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、mが小さい場合(つまり、ドメイン配列が短い場合)、GPGXXモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、REPのC末端に「GPGXXモチーフ」が位置する場合、「XX」が例えば「AA」の場合であっても、「GPGXXモチーフ」として扱う。
図5は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図5を参照しながらGPGXXモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図5に示した改変フィブロインのドメイン配列(「[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフ」タイプである。)では、全てのREPが「最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」(図5中、「領域A」で示した配列。)に含まれているため、sを算出するためのGPGXXモチーフの個数は7であり、sは7×3=21となる。同様に、全てのREPが「最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」(図5中、「領域A」で示した配列。)に含まれているため、当該配列から更に(A)モチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数tは50+40+10+20+30=150である。次に、sをtで除すことによって、s/t(%)を算出することができ、図5の改変フィブロインの場合21/150=14.0%となる。
第6の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が9%以下であることが好ましく、7%以下であることがより好ましく、4%以下であることが更に好ましく、0%であることが特に好ましい。
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をuとし、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)モチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、グルタミン残基含有率はu/tとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
第6の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表1に示すとおりである。
表1に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)アラニン(A)、グリシン(G)、スレオニン(T)、セリン(S)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、プロリン(P)及びヒスチジン(H)から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン(C)、メチオニン(M)及びアラニン(A)から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)及びフェニルアラニン(F)から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
第6の改変フィブロインは、REPの疎水性度が、-0.8以上であることが好ましく、-0.7以上であることがより好ましく、0以上であることが更に好ましく、0.3以上であることが更により好ましく、0.4以上であることが特に好ましい。REPの疎水性度の上限に特に制限はなく、1.0以下であってよく、0.7以下であってもよい。
本明細書において、「REPの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン(改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン)において、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列(図5の「領域A」に相当する配列。)に含まれる全てのREPにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をvとし、最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除き、更に(A)モチーフを除いた全REPのアミノ酸残基の総数をtとしたときに、REPの疎水性度はv/tとして算出される。REPの疎水性度の算出において、「最もC末端側に位置する(A)モチーフからドメイン配列のC末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
第6の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、REP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び/又はREP中の1又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に1又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び/又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
第6の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からREP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び/又はREP中の1又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からREP中の1又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び/又はREP中の1又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
第6の改変フィブロインのより具体的な例として、(6-i)配列番号25(M_PRT888)、配列番号26(M_PRT965)、配列番号27(M_PRT889)、配列番号28(M_PRT916)、配列番号29(M_PRT918)、配列番号30(M_PRT699)、配列番号31(M_PRT698)若しくは配列番号32(Met-PRT966)で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は(6-ii)配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31若しくは配列番号32で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
(6-i)の改変フィブロインについて説明する。配列番号25で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列(Met-PRT410)中のQQを全てVLに置換したものである。配列番号26で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てTSに置換し、かつ残りのQをAに置換したものである。配列番号27で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVLに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。配列番号28で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVIに置換し、かつ残りのQをLに置換したものである。配列番号29で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVFに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。
配列番号30で示されるアミノ酸配列は、配列番号8で示されるアミノ酸配列(Met-PRT468)中のQQを全てVLに置換したものである。配列番号31で示されるアミノ酸配列は、配列番号8で示されるアミノ酸配列中のQQを全てVLに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。
配列番号32で示されるアミノ酸配列は、配列番号7で示されるアミノ酸配列(Met-PRT410)中に存在する20個のドメイン配列の領域を2回繰り返した配列中のQQを全てVFに置換し、かつ残りのQをIに置換したものである。
配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31及び配列番号32で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は9%以下である(表2)。
Figure 0007372678000002
(6-i)の改変フィブロインは、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31又は配列番号32で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(6-ii)の改変フィブロインは、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31又は配列番号32で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(6-ii)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(6-ii)の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が9%以下であることが好ましい。また、(6-ii)の改変フィブロインは、GPGXXモチーフ含有率が10%以上であることが好ましい。
第6の改変フィブロインは、N末端及びC末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、(6-iii)配列番号33(PRT888)、配列番号34(PRT965)、配列番号35(PRT889)、配列番号36(PRT916)、配列番号37(PRT918)、配列番号38(PRT699)、配列番号39(PRT698)若しくは配列番号40(PRT966)で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は(6-iv)配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39若しくは配列番号40で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39及び配列番号40で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31及び配列番号32で示されるアミノ酸配列のN末端に配列番号11で示されるアミノ酸配列(Hisタグ配列及びヒンジ配列を含む)を付加したものである。N末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39及び配列番号40で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が9%以下である(表3)。
Figure 0007372678000003
(6-iii)の改変フィブロインは、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39又は配列番号40で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
(6-iv)の改変フィブロインは、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39又は配列番号40で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。(6-iv)の改変フィブロインもまた、式1:[(A)モチーフ-REP]、又は式2:[(A)モチーフ-REP]-(A)モチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、95%以上であることが好ましい。
(6-iv)の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が9%以下であることが好ましい。また、(6-iv)の改変フィブロインは、GPGXXモチーフ含有率が10%以上であることが好ましい。
第6の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
改変フィブロインは、第1の改変フィブロイン、第2の改変フィブロイン、第3の改変フィブロイン、第4の改変フィブロイン、第5の改変フィブロイン、及び第6の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも2つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
<改変フィブロインの製造方法>
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
改変フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、NCBIのウェブデータベースなどより入手したフィブロインのアミノ酸配列情報をもとに、AKTA oligopilot plus 10/100(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)などで自動合成したオリゴヌクレオチドをPCRなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、改変フィブロインの精製及び/又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のN末端に開始コドン及びHis10タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなる改変フィブロインをコードする核酸を合成してもよい。
調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等)であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質(発現誘導剤)の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはpH値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、改変フィブロインをコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス(Pseudomonas)属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
原核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、pBTrp2(ベーリンガーマンハイム社製)、pGEX(Pharmacia社製)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(特開2002-238569号公報)等を挙げることができる。
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌(カビ等)を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ(Trichoderma)属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110(1972)〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
改変フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該改変フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、15~40℃である。培養時間は、通常16時間~7日間である。培養中の培養培地のpHは3.0~9.0に保持することが好ましい。培養培地のpHの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
発現させた改変フィブロインの単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、改変フィブロインの単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セファロース、DIAION HPA-75(三菱化成社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。当該改変フィブロインが細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該改変フィブロインを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
<耐水性付与物質>
耐水性付与物質は、改変フィブロインを含む成形体の耐水性を向上させ得る物質である。成形体が耐水性付与物質を含むことにより、例えば、成形体の撥水性が向上する、成形体の水接触時の収縮が抑制される等の効果が発揮される。
耐水性付与物質は、例えば、フッ素系ポリマー及びシリコーン系ポリマー、並びにヒドロキシル基含有ポリマーに疎水性官能基が結合することにより形成された修飾ヒドロキシル基含有ポリマーから選ばれる疎水性ポリマーであってもよい。疎水性付与物質が、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を2つ以上有する多官能反応剤(第一の反応剤)、及び、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を1つ以上と機能性基とを有する反応剤から選ばれるタンパク質結合剤であってもよい。。
フッ素系ポリマーとしては、フッ素を含むポリマーであれば特に制限されない。フッ素系ポリマーは、例えば、フッ素を含むオレフィンを重合して得られるポリマーであってよい。フッ素系ポリマーとしては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリトリフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリパーフルオロアルキルビニルエーテル、ポリパーフルオロプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン-パーフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン-エチレン共重合体、及びポリフッ化ビニル-エチレン共重合体が挙げられる。フッ素系ポリマーとしては、例示したポリマーを構成するモノマー2種以上を重合して得られる共重合体(ランダム共重合体、ブロック共重合体又は交互共重合体を含む。)であってもよい。
シリコーン系ポリマーとしては、主鎖としてポリシロキサン構造を有するポリマーであれば特に制限されない。シリコーン系ポリマーは、例えば、シロキサン構造単位を有するモノマー1種又は2種以上を重合して得られる単独重合体又は共重合体(ランダム共重合体、ブロック共重合体又は交互共重合体を含む。)であってよい。シリコーン系ポリマーとしては、シロキサン構造単位を有するモノマー1種又は2種以上と、シロキサン構造単位を有しないモノマー1種又は2種以上とを重合して得られる共重合体(ランダム共重合体、ブロック共重合体又は交互共重合体を含む。)であってもよい。
修飾ヒドロキシル基含有ポリマーは、ヒドロキシル基含有ポリマーに疎水性官能基が結合したポリマーである。修飾ヒドロキシル基含有ポリマーは、例えば、ヒドロキシル基含有ポリマーと、疎水性官能基を有する反応剤とを反応させることで得ることができる。
ヒドロキシル基含有ポリマーは、ヒドロキシル基を有する高分子化合物であれば、特に制限なく使用することができる。ヒドロキシル基含有ポリマーの具体例としては、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ペクチン及びカラギーナン等の多糖類、ポリビニルアルコール(PVA)及びフェノール樹脂等の合成高分子が挙げられる。ヒドロキシル基含有ポリマーとしては、生分解性を有するという観点からは、多糖類が好ましい。ヒドロキシル基含有ポリマーとしては、生分解性を有することに加え溶解性が高いという観点からは、デンプンが好ましい。
疎水性官能基を有する反応剤は、疎水性官能基を有し、更にヒドロキシル基含有ポリマーと結合可能な結合性官能基を有する化合物である。結合性官能基は、ヒドロキシル基含有ポリマーと、水素結合又は共有結合で結合可能であればよいが、ヒドロキシル基含有ポリマーと共有結合で結合可能な官能基であることが好ましく、ヒドロキシル基含有ポリマー中のヒドロキシル基との反応により、ヒドロキシル基含有ポリマーと共有結合で結合可能な官能基であることがより好ましい。疎水性官能基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基等のアルキル基、フェニル基、ナフチル基等の芳香族基、並びにアセチル基、プロパノイル基、ベンゾイル基等のアシル基が挙げられる。疎水性官能基を有する反応剤としては、例えば、疎水性官能基を有するイソシアネート(R-N=C=O:Rは疎水性官能基)、酸無水物(R-C(=O)-O-C(=O)-R:Rは疎水性官能基)、エポキシド、アジリジン及びアルキルハライド等が挙げられる。
タンパク質結合剤としては、例えば、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を2つ以上有する多官能反応剤(第一の反応剤)、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を1つ以上と機能性基とを有する反応剤(機能性反応剤)を挙げることができる。
第一の反応剤は、タンパク質に含まれるアミド基、ヒドロキシル基、フェノール性水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、セレノール基、イミダゾリル基、インドリル基及びグアニジノ基からなる群より少なくとも一種の反応性官能基と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を有する。
第一の反応性基としては、例えば、下記式(A-1)、(A-2)、(A-3)、(A-4)、(A-5)又は(A-6)で表される基が挙げられる。各式中の波線は、各基の結合手を示す。
Figure 0007372678000004
式(A-1)中、Xは酸素原子(O)又は硫黄原子(S)を示す。式(A-3)中、Xは脱離基を示す。式(A-4)中、Xは酸素原子(O)、硫黄原子(S)、-NR-で表される基、又は、-C(R-で表される基を示す。Rは、例えば、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アリール基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニル基、アシル基、又はカーバメート基であってよい。Rは、電子求引性基を示す。式(A-5)中、Xは酸素原子(O)又は硫黄原子(S)を示し、Yはハロゲン原子、ヒドロキシル基、-Rで表される基、-ORで表される基、又は、-OCORで表される基を示す。Rは、例えば、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。式(A-6)中、Xは酸素原子(O)又は硫黄原子(S)を示し、Yは酸素原子(O)、硫黄原子(S)又はNRで表される基を示す。Rは例えば、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシル基、カーバメート基、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。
機能性反応剤は、第一の反応剤と、第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基(1つ)、及び機能性基を有する反応剤(第二の反応剤)とを反応させて得ることができる。
第二の反応性基としては、例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、下記式(B-1)で表される基等が挙げられる。
Figure 0007372678000005
式(B-1)中、Xは酸素原子(O)又は硫黄原子(S)を示す。
機能性基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等の炭化水素基;アリール基、複素環基等の環構造を有する基;保護基で保護された反応性基(ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基等);カルボニル基(-C(=O)-)、エーテル結合(-O-)、アミド結合(>NC(=O)-)、ウレタン結合(>NC(=O)O-)、ウレア結合(>N(C=O)N<)カーボネート結合(-OC(=O)O-)等の構造を有する基;アルコキシシリル基、スルホニル基(-S(=O)-)、カルボキシル基(-C(=O)OH)、スルホン酸基(-S(=O)OH)、及び、第四級アンモニウム基等が挙げられる。
第一の反応剤の具体例としては、ヘキサンジイソアネート(HDI)を挙げることができる。第二の反応剤の具体例としては、ブタノール(BuOH)を挙げることができる。
耐水性付与物質は、成形体の撥水性が向上すると共に水接触時の収縮も抑制できるという観点から、フッ素系ポリマー及びシリコーン系ポリマーが好ましい。
耐水性付与物質は、成形体の質感及び触感等がより一層優れるという観点から、低分子化合物(例えば、分子量500以下)の架橋剤ではないことが好ましい。低分子化合物の架橋剤により改変フィブロインの分子間架橋が形成されると、耐水性及び強度等の向上が図れる一方、成形体の質感及び触感等が充分ではない場合があるからである。
<成形体及びその製造方法>
本実施形態に係る成形体は、改変フィブロインと耐水性付与物質とを少なくとも含むものである。本実施形態に係る成形体は、改変フィブロインと耐水性付与物質とが共有結合しているものであってもよい。
本実施形態に係る成形体は、その形状及び用途等に応じて、更に他の添加剤を含むものであってもよい。添加剤としては、例えば、可塑剤、レベリング剤、架橋剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、及び合成樹脂が挙げられる。添加剤の含有量は、改変フィブロインの全量100質量部に対して、50質量部以下であってよい。
本実施形態に係る成形体の形状は特に限定されず、例えば、繊維、フィルム、多孔質体、モールド成形体等であってよい。本実施形態に係る成形体は、上記繊維を撚る、織る又は編む等した撚糸、織物(織生地を含む。)、編物(編生地を含む。)、組み物、不織布等であってもよい。上記繊維はまた、ロープ、手術用縫合糸、電気部品用の可撓性止め具、さらには移植用生理活性材料(例えば、人工靭帯及び大動脈バンド)等の高強度用途にも応用できる。図6は、成形体の一例としての繊維1の一実施形態を示す斜視図である。
本実施形態に係る成形体は、例えば、改変フィブロイン及び必要に応じて他の添加剤を含む原料(例えば、ドープ液)を成形して前駆成形体を得る工程(前駆成形体形成工程)と、形成された改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程(結合工程)とを備える製造方法(第一の製造方法)により製造することができる。本実施形態に係る成形体はまた、例えば、改変フィブロイン、耐水性付与物質及び必要に応じて他の添加剤を含む原料(例えば、ドープ液)を成形して成形体を得る工程(成形体形成工程)を備える製造方法(第二の製造方法)により製造することもできる。
前駆成形体形成工程及び成形体形成工程では、原料(例えば、ドープ液)を成形して所望の形状を有する前駆成形体又は成形体を形成する。
ドープ液は、改変フィブロインと、必要に応じて耐水性付与物質及び他の添加剤と、溶媒とを少なくとも含む。ドープ液は、更に溶解促進剤を含むものであってもよい。
溶媒としては、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、ヘキサフルオロアセトン(HFA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ギ酸、並びに尿素、グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、臭化リチウム、塩化カルシウム及びチオシアン酸リチウム等を含む水溶液等を挙げることができる。これらの溶媒は、1種単独で使用してもよく、2種以上を混合して使用してもよい。
ドープ液における改変フィブロインの含有量は、ドープ液の全質量を基準として、15質量%以上、30質量%以上、40質量%以上又は50質量%以上であってよい。改変フィブロインの含有量は、ドープ液の製造効率の観点から、ドープ液の全質量を基準として、70質量%以下、65質量%以下又は60質量%以下であってよい。
ドープ液が耐水性付与物質を含む場合、耐水性付与物質の含有量は、ドープ液の全質量を基準として、3質量%以上、6質量%以上、8質量%以上又は10質量%以上であってよい。耐水性付与物質の含有量は、ドープ液の製造効率の観点から、ドープ液の全質量を基準として、14質量%以下、13質量%以下、又は12質量%以下であってよい。
溶解促進剤としては、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン(硝酸イオン、過塩素酸イオン等)、金属オキソ酸イオン(過マンガン酸イオン等)、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。
溶解促進剤の含有量は、タンパク質の全量100質量部に対して、1.0質量部以上、5.0質量部以上、9.0質量部以上、15質量部以上又は20.0質量部以上であってよい。溶解促進剤の含有量は、タンパク質の全量100質量部に対して、40質量部以下、35質量部以下又は30質量部以下であってよい。
ドープ液の製造時に、30~90℃に加温してもよい。使用する溶媒、改変フィブロイン及び耐水性付与物質の種類等に応じて溶解可能な温度を適時設定すればよい。溶解を促進するために振盪、撹拌してもよい。
ドープ液の粘度は、適宜設定してよい。例えば、ドープ液を紡糸液として使用する場合、その粘度は、紡糸方法に応じて適宜設定してよく、例えば、35℃において100~15,000cP(センチポイズ)、40℃において100~30,000cP(センチポイズ)等に設定すればよい。紡糸液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“EMS粘度計”を使用して測定することができる。
フィルム状の前駆成形体及び成形体(フィルム)は、例えば、上述したドープ液の膜を形成し、形成された膜から溶媒を除去する方法により得られる。
繊維状の前駆成形体及び成形体(タンパク質繊維)は、例えば、上述したドープ液を紡糸し、紡糸されたドープ液から溶媒を除去する方法により得られる。
多孔質状の前駆成形体及び成形体(タンパク質多孔質体)は、フィブロイン由来タンパク質より多孔質体を製造する方法が国際公開第2014/175178号に記載されており、基本的にこの方法によって得られる。
前駆成形体及び成形体は、例えば、国際公開第2017/047504号の明細書にフィブロイン由来タンパク質よりモールド成形体を製造する方法が記載されており、基本的にこの方法によって得られる。なお、改変フィブロインから前駆成形体又は成形体を製造する際には、例えば以下の操作が実施される。即ち、まず、改変フィブロインと、必要に応じて耐水性付与物質及び他の添加剤を含む原料組成物を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に原料組成物に対して加圧する。所定の加圧下で原料組成物が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、加熱加圧された原料組成物を得る。次いで、冷却器(例えばスポットクーラー)を用いて金型の温度を下降させ、原料組成物が所定の温度になったところで、内容物を取り出して前駆成形体又は成形体を得る。加熱は、80~300℃で行うことが好ましく、100~180℃がより好ましく、100~130℃が更に好ましい。加圧は、5kN以上で行うことが好ましく、10kN以上がより好ましく、20kN以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間(保温条件)は、0~100分が好ましく、1~50分がより好ましく、5~30分が更に好ましい。
結合工程は、改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程である。結合工程は、例えば、前駆成形体に耐水性付与物質を塗布又は浸漬等の手段により接触させ、必要に応じて加熱又はプラズマ照射等を行い、前駆成形体と耐水性付与物質を結合させることで実施することができる。耐水性付与物質が、例えば、シリコン系ポリマー及びフッ素系ポリマー等の疎水性ポリマーである場合、結合工程は、例えば、前駆成形体に耐水性付与物質又は耐水性付与物質の前駆体(モノマー)を接触させた状態でプラズマを照射して、改変フィブロインと耐水性付与物質とを共有結合させる工程であってよい。耐水性付与物質の前駆体(モノマー)を使用した場合であっても、プラズマの照射により、耐水性付与物質の前駆体(モノマー)が重合して耐水性付与物質(シリコン系ポリマー及びフッ素系ポリマー等の疎水性ポリマー)が形成されるため、改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む成形体を得ることができる。
照射するプラズマは、改変フィブロイン及び耐水性付与物質(又はその前駆体)の種類、前駆成形体の形状等に応じて、適宜設定してよい。放電ガスの流量は、例えば、0.1l/min以上10l/min以下の範囲内であってよい。発生させるプラズマのプラズマ密度は、例えば、1×1013cm-3以上1×1015cm-3以下の範囲内であってよい。放電ガスは、例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン等の希ガス、酸素、窒素等であってよい。放電ガスとして、大気を使用することもできる。
プラズマ照射は、公知のプラズマ照射装置を使用して実施することができる。プラズマ照射装置としては、例えば、Europlasma社製のプラズマ処理装置を使用することができる。
本実施形態に係る成形体は、例えば、繊維、糸、フィラメント、フィルム、発泡体、球体、ナノフィブリル、ヒドロゲル、樹脂及びその等価物からなる群から選択される製品であってもよい。これらは、特開2009-505668号公報、特許第5678283号公報、特許第4638735号公報等に記載の方法に準じて製造することができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
改変フィブロインの製造
(1)発現ベクターの構築
配列番号15で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(PRT799)及び配列番号37で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン(PRT918)を設計した。
設計したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸をそれぞれ合成した。当該核酸には、5’末端にNdeIサイト、終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。これら2種類の核酸をそれぞれクローニングベクター(pUC118)にクローニングした。その後、同核酸をNdeI及びEcoRIで制限酵素処理して切り出した後、それぞれタンパク質発現ベクターpET-22b(+)に組換えて発現ベクターを得た。
(2)改変フィブロインの発現
得られた発現ベクターで、それぞれ大腸菌BLR(DE3)を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液をアンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表4)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまで、約15時間のフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
Figure 0007372678000006
当該シード培養液を500mLの生産培地(表5)を添加したジャーファーメンターにOD600が0.05となるように添加して形質転換大腸菌を植菌した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持した。
Figure 0007372678000007
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液(グルコース455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)を1mL/分の速度で添加した。培養液温度を37℃に保ち、pH6.9で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の20%に維持しながら、20時間培養を行った。その後、1Mのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に対して終濃度1mMになるよう添加し、目的の改変フィブロインを発現誘導させた。IPTG添加後20時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。IPTG添加前とIPTG添加後の培養液から調製した菌体を用いてSDS-PAGEを行い、IPTG添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
(3)改変フィブロンの精製
IPTGを添加してから2時間後に回収した菌体を20mM Tris-HCl buffer(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の菌体を約1mMのPMSFを含む20mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで20mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)で洗浄した。洗浄後の沈殿物を100mg/mLの濃度になるように8M グアニジン緩衝液(8Mグアニジン塩酸塩、10mMリン酸二水素ナトリウム、20mMNaCl、1mMTris-HCl、pH7.0)で懸濁した。懸濁液を60℃で30分間、スターラーで撹拌し、沈殿物を緩衝液に溶解させた。溶解後、透析チューブ(三光純薬株式会社製のセルロースチューブ36/32)を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。
試験例1:織生地(成形体)の製造及び評価
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
濃度4質量%で塩化リチウムを溶解したDMSOを溶媒として用いた。上記で製造した改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末を、濃度24質量%となるように溶媒に添加した。90℃のアルミブロックヒーターで1時間加熱することにより、改変フィブロインを溶媒に溶解させた。溶液から不溶物と泡を取り除き、紡糸液(ドープ液)を得た。
(2)紡糸
紡糸液をリザーブタンクに充填した。紡糸液を0.1又は0.2mm径のモノホールノズルからギアポンプを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は0.01~0.08mL/分に調整した。紡糸液の凝固により形成された繊維を、100質量%メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸した。洗浄及び延伸後、繊維を乾熱板を用いて乾燥させ、得られた原糸(改変フィブロイン繊維)を巻き取った。
(3)織生地の製造
得られた改変フィブロイン繊維から諸撚糸を作製した。作製した諸撚糸を平織りして織生地を得た。
(4)織生地への耐水性付与物質の結合
得られた織生地にフッ素系コーティング用モノマーを塗布した。モノマーが塗布された織生地に対して、プラズマ処理装置(Europlasma社製)を用いてプラズマ処理を施した。プラズマ処理により、フッ素系コーティング用モノマーの重合により形成されたフッ素系ポリマー(耐水性付与物質)が共有結合した織生地を得た。フッ素系コーティング用モノマーとして、Nanofics110(実施例1)及びNanofics120(実施例2)(いずれもEuroplasma社製)を使用した。
(5)撥水性評価
プラズマ処理を施した実施例1及び実施例2の織生地、並びにプラズマ処理を施していない織生地(比較例1)の撥水性を、撥水度試験(スプレー試験)により評価した。撥水度試験(スプレー試験)は、ISO4920:2012に準じて実施した。以下に示す6段階(スコア0~5)の評価基準に従い、目視で撥水性を判定した。
スコア5:表面に湿潤及び水滴の付着がない。
スコア4:表面に湿潤しないが,水滴の付着がある。
スコア3:表面に小さな湿潤がある。
スコア2:湿潤が広がり,いくつかは互いに接続している。
スコア1:水が当たった部分に完全な湿潤を示す。
スコア0:表面全体に湿潤を示す。
結果を表6に示す。プラズマ処理を施していない比較例1の織生地はスコア0であったのに対し、プラズマ処理を施した実施例1及び実施例2の織生地はいずれもスコア4であり、耐水性(撥水性)が付与されていた。
Figure 0007372678000008
(6)触感評価及び収縮性評価
実施例1及び実施例2並びに比較例1の織生地から、一辺5cmの正方形状の試験片をそれぞれ切り出した。試験片の一方の表面に、鉛筆で一辺30mmの正方形の頂点に対応する4点の位置にマークした。各試験片を40℃の水に10分間浸漬した後、次いで室温で真空乾燥させる工程を5サイクル繰り返した。真空乾燥は、真空定温乾燥機(VOS-310C,東京理化器械(株)製)を用いて、設定圧力-0.1MPaで30分間行った。各サイクル終了時に、触感を官能評価すると共に、マークした4点間の距離を測定して収縮率を求めた。
触感は、以下の基準に従って判定した。結果を表7に示す。プラズマ処理を施した実施例1及び実施例2の織生地はいずれもプラズマ処理を施していない比較例1の織生地と比べて触感の低下が抑制されていた。
評点5:オリジナルと同様に良好である。
評点4:良好であるが、オリジナルと比べて若干劣る。
評点3:悪くはないが、やや堅い。
評点2:悪く、かつ堅いが、曲げられる。
評点1:とても悪く、堅く、かつ曲げられない。
Figure 0007372678000009
収縮率は、下記式に従って算出した。「各辺の長さの平均値」は、マークした4点で作られる四角形の各辺の長さの総和を4で割った値である。
収縮率(%)={1-(各辺の長さの平均値(mm)/30mm)}×100
結果を表8に示す。プラズマ処理を施した実施例1及び実施例2の織生地はいずれもプラズマ処理を施していない比較例1の織生地と比べて収縮率が小さかった。
Figure 0007372678000010
試験例2:編生地(成形体)の製造及び評価
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
濃度4質量%で塩化リチウムを溶解したDMSOを溶媒として用いた。上記で製造した改変フィブロイン(PRT918)の凍結乾燥粉末を、濃度24質量%となるように溶媒に添加した。90℃のアルミブロックヒーターで1時間加熱することにより、改変フィブロインを溶媒に溶解させた。溶液から不溶物と泡を取り除き、紡糸液(ドープ液)を得た。
(2)紡糸
紡糸液をリザーブタンクに充填した。紡糸液を0.1又は0.2mm径のモノホールノズルからギアポンプを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出量は0.01~0.08mL/分に調整した。紡糸液の凝固により形成された繊維を、100質量%メタノール洗浄浴槽で洗浄及び延伸した。洗浄及び延伸後、繊維を乾熱板を用いて乾燥させ、得られた原糸(改変フィブロイン繊維)を巻き取った。
(3)編生地の製造
得られた改変フィブロイン繊維を裁断して改変フィブロインステープルを作製した。作製した改変フィブロインステープルを開繊開毛した後、公知の紡績装置により紡績し、紡績糸を得た。得られた紡績糸を、ホールガーメント横編機(MACH2XS,島精機製)を使用して編み、編生地を得た。
(4)編生地への耐水性付与物質の結合
得られた編生地にフッ素系コーティング用モノマーを塗布した。モノマーが塗布された編生地に対してプラズマ処理装置(Europlasma社製)を用いてプラズマ処理を施した。プラズマ処理により、フッ素系コーティング用モノマーの重合により形成されたフッ素系ポリマー(耐水性付与物質)が共有結合した編生地を得た(実施例3)。フッ素系コーティング用モノマーとして、Nanofics120(Europlasma社製)を使用した。
(5)撥水性評価
プラズマ処理を施した実施例3の編生地、及びプラズマ処理を施していない編生地(比較例2)の撥水性を、試験例1と同様の方法の撥水度試験(スプレー試験)によって評価した。結果を表9に示す。プラズマ処理を施していない比較例2の編生地はスコア0であったのに対し、プラズマ処理を施した実施例3の編生地はスコア5であり、耐水性(撥水性)が付与されていた。
Figure 0007372678000011
(6)触感評価及び収縮性評価
実施例3及び比較例2の編生地から、一辺5cmの正方形状の試験片をそれぞれ切り出した。試験片の一方の表面に、鉛筆で一辺30mmの正方形の頂点に対応する4点の位置にマークした。予備処理として、各試験片を40℃の水に10分間浸漬した後、次いで室温で真空乾燥させる工程を5サイクル繰り返した。真空乾燥は、真空定温乾燥機(VOS-310C,東京理化器械(株)製)を用いて、設定圧力-0.1MPaで30分間行った。
次いで、予備処理を経た試験片に対し、洗浄工程、乾燥工程、浸水工程及び乾燥工程をこの順に5サイクル繰り返した。洗浄工程では、パナソニック(株)製洗濯機(NA-VG1100L)を使用し、ライオン(株)製洗剤(トップクリアリキッド)を用いて、試験片に対して、洗浄を5分間行った後、すすぎを2回行い、次いで脱水1分間を行った。乾燥工程では、真空定温乾燥機(VOS-310C,東京理化器械(株)製)を用いて、設定圧力-0.1MPaで30分間、室温で試験片の乾燥を行った。浸水工程では、試験片を40℃の水に10分間浸漬した。各サイクル終了時に、試験例1と同様の基準で、触感を官能評価すると共に、マークした4点間の距離を測定して収縮率を求めた。
触感の官能評価結果を表10に示す。「開始時」は、予備処理後、サイクルを開始する前の評価結果である。プラズマ処理を施した実施例3の編生地は、プラズマ処理を施していない比較例2の編生地と比べて触感の低下が抑制されていた。
Figure 0007372678000012
収縮率の評価結果を表11に示す。プラズマ処理を施した実施例3の編生地は、プラズマ処理を施していない比較例2の編生地と比べて収縮率が小さかった。
Figure 0007372678000013
試験例3:編生地(成形体)の製造及び評価
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
濃度4質量%で塩化リチウムを溶解したDMSOを溶媒として用いた。上記で製造した改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末を、濃度24質量%となるように溶媒に添加した。シェーカーを使用して、改変フィブロインを3時間かけて溶解させた後、溶液中の不溶物(ゴミ等)と泡を取り除き、紡糸液(ドープ液)を得た。ドープ液の溶液粘度は90℃において5000cP(センチポアズ)であった。
(2)紡糸
得られたドープ液と公知の乾湿式紡糸装置とを用いて乾湿式紡糸を行って、改変フィブロインからなるモノフィラメントを得た。ここでは、乾湿式紡糸を下記の条件で行った。
凝固液(メタノール)の温度:5~10℃
延伸倍率:6倍
乾燥温度:80℃
(3)編生地の製造
上記のようにして得た改変フィブロイン繊維を用いて公知の方法により紡績糸を製造し、この改変フィブロイン繊維からなる紡績糸と公知の編機とを用いて、横編みにより5cm角の編生地を得た。改変フィブロイン繊維からなる紡績糸の番手は58.1Nmであり、編機のゲージ数は18であった。
(4)編生地への耐水性付与物質の結合
得られた5cm角の編生地を、ヘキサンジイソアネート(HDI,第一の反応剤)20mL中に浸漬した。次いで、HDIが含浸した編生地をアルミホイルに挟み、130℃で30分加熱した。加熱後、編生地を取り出し、ブタノール(BuOH,第二の反応剤)20ml中に浸漬し、100℃で240分反応させた。反応後の編生地をTHFで洗浄して、耐水性付与物質(第一の反応剤及び第二の反応剤)が結合した、実施例4の編生地を得た。
(3)で得られた5cm角の編生地を、比較例3の編生地として評価した。
(3)で得られた5cm角の編生地を、ヘキサンジイソアネート(HDI,第一の反応剤)20mL中に浸漬した。次いで、HDIが含浸した編生地をアルミホイルに挟み、130℃で30分加熱した。その後、編生地をTHFで洗浄して、第一の反応剤のみが結合した、比較例4の編生地を得た。
(5)収縮性評価
実施例4の編生地、並びに比較例3及び比較例4の編生地について、収縮性を評価した。各編生地に鉛筆で3cm角の正方形を描き、評価サンプルとした。評価サンプルをパナソニック(株)製洗濯機(NA-VG1100L)の洗濯モード「お家クリーニング」で洗濯した。次いで、同じ洗濯機で15分脱水し、120分自然乾燥させた。洗濯前後の正方形の縦横の長さをそれぞれ測定し、縦向及び横方向の収縮率を求めた。同じ試験を3回行い、3回の平均値を評価結果とした。結果を表12に示す。
(6)質感評価
実施例4の編生地、並びに比較例3及び比較例4の編生地について、肌触りを三段階で評価した。比較例3の編生地の肌触りを基準(B)とし、それより風合いに優れる場合をA、肌触りが荒く風合いに劣る場合をCとして評価した。結果を表12に示す。
Figure 0007372678000014
試験例4:繊維(成形体)の製造及び評価
<実施例5>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
デンプン(和光純薬工業株式会社製)200mgを11400mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた溶液にフェニルイソシアネート(東京化成工業株式会社製)400mgを添加し、溶液を90℃で4時間撹拌した。これにより、デンプンのヒドロキシル基とフェニルイソシアネートのイソシアネート基とが反応して、フェニル基(機能性官能基)が、ウレタン結合を介して結合した修飾デンプン(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が100%であった。
反応液を室温まで冷却した後、改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末300mgを反応液に添加した。反応液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを反応液を溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。紡糸液中の修飾デンプンの含有量は、修飾デンプンとデンプンの総含有量を基準として、17質量%である。
(2)改変フィブロインと耐水性付与物質を含む繊維(成形体)の製造
調製した紡糸液を60℃にて目開き5μmの金属フィルターで濾過した。濾過後の紡糸液を30mLのステンレスシリンジ内で静置し、脱泡させた。その後、紡糸液を、ニードル径0.2mmのソリッドノズルから窒素ガスを用い100質量%メタノール凝固浴槽中へ吐出させた。吐出温度は60℃であり、吐出圧は0.3MPaであった。凝固後、形成された原糸を巻き取り速度3.00m/分で巻き取り、自然乾燥させて、改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾デンプン)を含む繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維を長さ約10cmに切断し、水への浸漬前の糸の長さ(cm)を測定した。次いで、糸を40℃の水浴に1分間浸漬した。その後、糸を水浴から取り出して、15分間室温で真空乾燥させた後、乾燥後の糸の長さを測定した。繊維の収縮率を以下の式に従って算出した。結果を表13に示す。
収縮率(%)={1-(浸漬・乾燥後の長さ/浸漬前の長さ)}×100
<実施例6>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
デンプン(和光純薬工業株式会社製)253mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた反応液に無水酢酸(和光純薬工業株式会社製)147mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、デンプンのヒドロキシル基と無水酢酸とが反応して、アセチル基(機能性官能基)が結合した修飾デンプン(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が100%であった。
反応液を室温まで冷却した後、改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末2000mgを反応液に添加した。反応液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを反応液に溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。紡糸液中の修飾デンプンの含有量は、修飾デンプンとデンプンの総含有量を基準として、17質量%である。
(2)改変フィブロインと耐水性付与物質を含む繊維(成形体)の製造
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾デンプン)を含む繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
<実施例7>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
デンプン(和光純薬工業株式会社製)215mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた反応液に無水酢酸(和光純薬工業株式会社製)185mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、デンプンのヒドロキシル基と無水酢酸とが反応して、アセチル基(機能性官能基)が結合した修飾デンプン(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。修飾デンプンは、仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が50%であった。
反応液を室温まで冷却した後、改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末2000mgを反応液に添加した。反応液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを反応液を溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。紡糸液中の修飾デンプンの含有量は、修飾デンプンとデンプンの総含有量を基準として、17質量%である。
(2)改変フィブロインと耐水性付与物質を含む繊維(成形体)の製造
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾デンプン)を含む繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
<実施例8>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
ポリビニルアルコール(PVA)(和光純薬工業株式会社製)128mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。得られた反応液にフェニルイソシアネート(東京化成工業株式会社製)272mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、PVAのヒドロキシル基とフェニルイソシアネートとが反応して、フェニル基(機能性官能基)が、ウレタン結合を介して結合した修飾PVA(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が100%であった。
反応液を室温まで冷却した後、改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末2000mgを反応液に添加した。反応液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを反応液に溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。紡糸液中の修飾PVAの含有量は、修飾PVAとPVAの総含有量を基準として、17質量%である。
(2)改変フィブロインと耐水性付与物質を含む繊維(成形体)の製造
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾PVA)を含む繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
<実施例9>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
ポリビニルアルコール(PVA)(和光純薬工業株式会社製)193mgを7600mgの溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に溶解させた。反応液にフェニルイソシアネート(東京化成工業株式会社製)207mgを添加し、反応液を90℃で4時間撹拌した。これにより、PVAのヒドロキシル基とフェニルイソシアネートとが反応して、フェニル基(機能性官能基)が、ウレタン結合を介して結合した修飾PVA(修飾ヒドロキシル基含有ポリマー)を得た。仕込み比から求めた修飾率(ヒドロキシル基が機能性官能基に変換された割合)が50%であった。
反応液を室温まで冷却した後、改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末2000mgを反応液に添加した。反応液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを反応液に溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。紡糸液中の修飾PVAの含有量は、修飾PVAとPVAの総含有量を基準として、17質量%である。
(2)改変フィブロインと耐水性付与物質を含む繊維(成形体)の製造
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で改変フィブロインと耐水性付与物質(修飾PVA)を含む繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
<比較例5>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末1200mgを溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に添加し、90℃で12時間撹拌して溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。
(2)繊維の製造
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
<比較例6>
(1)紡糸液(ドープ液)の調製
改変フィブロイン(PRT799)の凍結乾燥粉末3000mg、及びデンプン(和光純薬工業株式会社製)600mgを溶媒(4重量%のLiClを含むジメチルスルホキシド(DMSO))に添加した。溶液を90℃で12時間撹拌して改変フィブロインを溶液に溶解させ、透明な紡糸液(ドープ液)を得た。
(2)繊維の製造
調製した紡糸液を使用して、実施例5と同様の手順で繊維を得た。
(3)収縮性評価
得られた繊維について、実施例5と同様の手順で収縮性評価を実施した。結果を表13に示す。
Figure 0007372678000015
改変フィブロインと、耐水性付与物質(ヒドロキシル基含有ポリマー(修飾デンプン又は修飾PVA))を含む成形体(実施例5~9の繊維)は、耐水性付与物質を含まない成形体(比較例5~6の繊維)と比べて、収縮率が低減されていた。

Claims (6)

  1. 改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む、成形体であって、
    前記改変フィブロインと前記耐水性付与物質とが共有結合しており、
    前記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、成形体。
  2. 改変フィブロインと耐水性付与物質とを含む、成形体であって、
    前記改変フィブロインと前記耐水性付与物質とが共有結合しており、
    前記耐水性付与物質が、前記改変フィブロインに結合したヘキサンジイソシアネートと、ブタノールとの反応により形成されたものである、成形体。
  3. 前記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、請求項1又は2に記載の成形体。
  4. 改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程を備え、
    前記前駆成形体に前記耐水性付与物質を結合させる前記工程が、前記前駆成形体に前記耐水性付与物質又は耐水性付与物質の前駆体を接触させた状態でプラズマを照射し、それにより前記改変フィブロインと前記耐水性付与物質とを共有結合させることを含む、
    成形体を製造する方法。
  5. 改変フィブロインを含む前駆成形体に耐水性付与物質を結合させる工程を備え、
    前記耐水性付与物質が、シリコーン系ポリマー及びフッ素系ポリマーから選ばれる少なくとも1種である、成形体を製造する方法。
  6. 前記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、請求項4又は5に記載の方法。
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